Summary
Her beskriver vi en protokoll for å vurdere antifungal aktivitet av primære humane immunceller i sanntid ved hjelp av fluorescerende Aspergillus conidia reporter i forbindelse med levende celler videomikroskopi og flowcytometri. Genererte data gir innsikt i verts celle- Aspergillus-interaksjoner så som fungicid virkning, fagocytose, cellemigrering og inhibering av soppvekst.
Abstract
Aspergillus fumigatus er en opportunistisk patogen sopp som forårsaker invasive infeksjoner hos immunkompromitterte verter med en høy letalitet hastighet. Forskning undersøke immunologiske responser mot A. fumigatus har vært begrenset av den manglende konsekvente og pålitelige analyser for måling av den antifungale aktivitet av spesifikke immunceller in vitro. En ny fremgangsmåte beskrives for å vurdere den antifungale aktivitet av primære monocytter og nøytrofile celler fra humane donorer mot A. fumigatus ved å benytte fluorescens Aspergillus reporter (flate) conidia. Disse conidia inneholder en genetisk kodet DsRed reporter, som blir konstitutivt uttrykt av levende FLARE konidier, og er utvendig merket med Alexa Fluor 633, som er motstandsdyktig mot nedbrytning i phagolysosome, og dermed gir et skille mellom levende og døde A. fumigatus sporer. Video mikroskopi og flowcytometri senere blir brukt til å visualisere samhandleion mellom konidier og medfødte immunceller, vurdering av fungicid aktivitet samtidig gi en mengde informasjon om fagocytt migrasjon, fagocytose og inhibering av soppvekst. Denne nye teknikk er allerede gitt spennende ny innsikt i vert-patogen interaksjon av primære immunceller mot A. fumigatus. Det er viktig å være oppmerksom på laboratorieoppsett for å utføre denne analysen, blant annet den nødvendige mikroskopi og flowcytometri anlegg, og evnen til å arbeide med humant donorblod og genetisk manipulerte sopp. Imidlertid er denne analysen stand til å generere store mengder data og kan avsløre detaljert innblikk i den antifungale respons. Denne protokollen har med hell blitt brukt til å studere vert-patogen interaksjon av primære immunceller mot A. fumigatus.
Det er viktig å være oppmerksom på laboratoriet oppsett kreves for å utføre denne analysen, herunder nødvendig mikroskopi og flowcytometri facilities, og evnen til å arbeide med humant donorblod og genetisk manipulerte sopp. Imidlertid er denne analysen stand til å generere store mengder data og kan avsløre detaljert innblikk i den antifungale respons. Denne protokollen har med hell blitt brukt til å studere vert-patogen interaksjon av primære immunceller mot A. fumigatus.
Introduction
Aspergillus fumigatus er en opportunistisk patogen sopp, og den mest vanlige årsak til sopp invasive lungeinfeksjoner i immunforsvar verts 1, 2. Forstå hvordan vertsimmunceller gjenkjenne og eliminere Aspergillus er et viktig område av sopp forskning, men de tilgjengelige soppdrepende analyser har betydelige begrensninger. Vanlig anvendte fremgangsmåter for måling av fungicid aktivitet omfatter kolorimetriske assays og bestemmelse av kolonidannende enheter 3, 4. Imidlertid er slike metoder gir informasjon om sopp levedyktighet ved et enkelt tidspunkt i stedet for å vise det dynamisk interaksjon mellom vert og patogen. Følgelig kan disse metodene ikke tar hensyn til hvorvidt en sopp er blitt drept eller bare (midlertidig) begrenses i vekst eller metabolsk aktivitet. Vi har utviklet en metode som kan observere fungicidal aktivitet direkte samtidig fange detaljert informasjon angående fagocytose, fagocytt migrering og inhibering av soppvekst.
Tidligere ble en protokoll som er offentliggjort ved hjelp av sanntids avbildning som et middel for å måle fagocytose av Candida albicans ved en muse-makrofag-cellelinje 5. Dette konseptet har nå blitt videreutviklet til å ta opp kunnskapsgapet i vår forståelse av Aspergillus-interaksjoner med immunceller ved å benytte fluorescerende Aspergillus reporter (flate) conidia 6, 7, 8. Disse sporer uttrykke en rød fluoroforen (DsRed) og er merket med en andre fluorofor (Alexa Fluor 633). Når en fakkel av konidier er drept, stopper den å produsere DsRed og den gjenværende DsRed blekner, mens AF633 forblir fluorescerende og bundet til den konidier. Dette skaper et klart skille mellom levende og døde fungal celler under levende celle avbildning og flowcytometri, og muliggjør sporing av skjebnen til individet konidier etter deres vekselvirkning med immunceller.
De beskrevne analyser tilveiebringer en effektiv metode for å visualisere interaksjonen mellom vertsimmunceller og Aspergillus og vil være av betydelig verdi i å rakne de cellulære signalveier som er ansvarlige for antisopp effektormekanismer i medfødte immunceller. Andre anvendelser inkluderer å visualisere hvordan endringer i Aspergillus vekst, for eksempel overgang fra hvile til hoven konidier, eller fra hoven konidier til hyfer, påvirke fagocytt gjenkjennelse og funksjon.
Den følgende protokollen beskriver i detalj hvordan man skal oppnå humane monocytter og neutrofiler; hvordan å klargjøre signal conidia; og hvordan å fange sine svar med videomikroskopi og flowcytometri. Selv om bruken av humane immunceller isolert fra donorblod er beskrevet her, denneTeknikken har vist seg like effektiv ved bruk av forskjellige murine cellepopulasjoner.
Protocol
Protokollen for oppnåelse av neutrofiler og perifert blod mononukleære celler (PBMC) er basert på tidligere publiserte metoder 9. Bruk av blodprøver fra friske frivillige har blitt godkjent av det menneskelige forskningsetisk komité ved University of Aberdeen. Før du begynner må du kontrollere alle etiske godkjenninger er på plass for å trekke blod fra friske frivillige og / eller pasienter med henblikk på den beskrevne eksperiment. Hold celler på is der det er mulig å øke deres overlevelse.
1. A. fumigatus Kultur og betingelser
- Forbered glukose minimal-agar-medium som er beskrevet 10.
- Juster media til pH 6,5 med 1 M NaOH og autoklav ved 120 ° C i 20 minutter.
- Tillat blandingen å avkjøles til 65 ° C.
- Å arbeide i et sterilt strømningshette, helles 30 ml avkjølt media inn i en T75-kolbe og avkjøl med halsen av kolben hviler på en 25 ml pipette til create en agarskråsubstrat.
- Strek ut DsRed Af293- A. fumigatus belastning på agar og inkuberes i 7 dager ved 37 ° C + 5% CO2. To kolber vil gi omtrent 10 9 sporer i 5 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) for-biotinylering.
2. A. fumigatus Merking og Preparat
Merk: Når utfører denne analysen for første gang, å forberede foreldre Af293- A. fumigatus belastning. Ta prøver av begge stammer i mikrosentrifugerør, og merker bare én av hver stamme som beskrevet nedenfor. Dette vil tillate en å ha kontroll sporer uten farge og sporer med én farge, enten DsRed eller AF633, for å teste oppsettet og utstyr.
- Avling A. fumigatus konidier ved å dyppe kulturen med 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Filtrer den resulterende suspensjonen gjennom et 40 um celle sil inn i et 50 ml rør for å fjerne hyfefragmenter.
- Centrifuge ved 805 xg i ti minutter, fjern supernatanten og vask en gang i 20 ml sterilt PBS. Pool conidia fra to plater av samme stamme under vasketrinnet.
- Etter vasketrinnet, resuspender pelleten i 5 ml PBS og overføre 1 ml alikvoter av Konidiale suspensjon inn i mikrosentrifugerør. 1 ml av suspensjonen av hver stamme er vanligvis tilstrekkelig for levende celle avbildning. Vikle de gjenværende alikvoter i folie og oppbevares ved 4 ° C.
- Sentrifuger aliquoter av Konidiale suspensjon ved 9300 xg i 10 min ved romtemperatur og fjern supernatanten. Resuspender pellet Konidiale i 1 ml 0,05 M NaHCO3, pH 8,3.
- Forbered 10 mg biotin / 200 ul dimetylsulfoksid (DMSO) stamløsning ved rekonstituering av 25 mg biotin i 500 ul DMSO. Tilsett 10 ul biotin / DMSO-stamløsning til mikrosentrifugerør dekk i aluminiumsfolie og inkuberes i 2 timer på et vippe ved 4 ° C.
- Alikvot resten av biotin / DMSO lager løsning;n og fryses ved -20 ° C for bruk i etterfølgende forsøk.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 9300 xg og fjern supernatanten forsiktig. Resuspender pellet Konidiale i 1 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,0 i 1 time for å deaktivere frittflytende biotin.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 9300 xg og fjern supernatanten forsiktig. Vask pelleten to ganger med 1 ml steril PBS og resuspender pelleten i 1 ml PBS.
- Oppløs 1 mg streptavidin-AF633 i 0,5 ml PBS for å lage en 2 mg / ml stamløsning. Tilsett 10 ul 2 mg / ml streptavidin-AF633 per 1 ml Konidiale suspensjon og inkuber i 40 minutter ved romtemperatur på en vippe dekket med aluminiumsfolie. De resterende streptavidin-AF633 kan fryses i porsjoner for bruk i senere eksperimenter.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 9300 x g og fjern supernatanten forsiktig. Resuspender pellet Konidiale i 1 ml PBS og tell conidia ved hjelp av et hemocytometer ved en 1: 1000 fortynning (1: 100 og deretter 01:10). Juster Konidiale konsentrasjonen til 3,6 x 10 6 / mL med CO2-frie medier, pakk i folie og oppbevares ved 4 ° C.
MERK: Sporene er nå merket med AF633 og vil bli referert til som FLARE sporer. - Valgfritt: Ved stimulering med hoven konidier er nødvendig, etter teller konidier (trinn 2.9), fortynn konidier til 7,2 x 10 6 / ml i gjærnitrogenbase (YNB) medium og tilsett 500 ul Konidiale suspensjonen til 4,5 ml YNB-medium i en autoklavert 50 ml erlenmeyerkolbe. Dekk og plassere kolben i en rysteinkubator (200 opm ved 37 ° C) i 6 timer.
- Overfør medium til et 15 ml rør. Sentrifuger ved 805 xg i 10 minutter ved romtemperatur og vaskes en gang i PBS. Sentrifuger igjen og resuspender pelleten i 1 ml CO 2 uavhengig medium, noe som gir 3,6 x 10 6 sporer / ml.
Merk: Sporer ofte klumpe seg etter at de blir hovne gjør nøyaktig telling vanskelig, er det anbefales å beregne med counted antall hviler conidia brukt.
- Overfør medium til et 15 ml rør. Sentrifuger ved 805 xg i 10 minutter ved romtemperatur og vaskes en gang i PBS. Sentrifuger igjen og resuspender pelleten i 1 ml CO 2 uavhengig medium, noe som gir 3,6 x 10 6 sporer / ml.
3. Isolering av humane neutrofiler og monocytter
- Tegn 20 ml venøst blod fra friske frivillige i to 10 ml blod rør inneholdende etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). For hver donor for seg, helles 20 ml blod i et 50 ml rør og fortynn med 15 ml PBS.
- Lå til grunn blod med 15 ml av en lymfocytt- isolasjon oppløsning (densitet 1,077 g / ml) med en sprøyte og nål jern. Plassere nålen på bunnen av røret og forsiktig tvinge lymfocyttisolasjonsmetoder løsningen ut. Sentrifuger ved 630 xg i 20 min med ingen brems og lav akselerasjon.
- Fremstill PBS, avkjølt på is.
MERK: Trinn 3,4 og 3,5 må følges samtidig for å generere monocytter (3.4) og nøytrofile (3,5). - Ved hjelp av en pastette, høste PBMC-lag. Dette er laget i midten mellom den gule serum (øvre) og det transparente lymfocyttisolasjonsmetoder løsning (nederste) lag, ogoverføre til en frisk 50 ml tube.
- Fyll røret med PBMC opp til 50 ml med kald PBS og sentrifuger ved 582 xg i 10 min. Fjern supernatanten og vask to ganger med kald PBS og resuspendert i 1 ml PBS pr 20 ml av donorblod som anvendes i utgangspunktet.
- Lage 1:10 fortynninger for å telle ved å tilsette 20 ul av cellesuspensjonen til 160 ul av PBS og 20 ul av trypanblått. Cellene telles med et hemocytometer.
- Fremstill en bufferløsning ved tilsetning av 26 ml varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS) og 2,1 ml 0,5 M EDTA til 500 ml med HBSS. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 515 x g og resuspendert i 40 mL av bufferløsning per 1 x 10 7 celler.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og tilsett 10 ul av CD14-mikroperler pr 1 x 10 7 celler, bland godt og inkuber i 15 minutter ved 4 ° C, noe som gjør at å blande rørene hver 5 min.
- Vask cellene ved tilsetning av 1 ml av bufferløsning per 1 x 10 7 celler og CENtrifuge ved 515 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender helt opp til 1 x 10 8 celler i 500 ul bufferoppløsning.
- Plasser en kolonne per prøve på en magnetisk separator i henhold til produsentens instruksjoner. Vask kolonnen én gang med 500 pl bufferoppløsning.
- Pipetter 500 pl cellesuspensjon gjennom kolonnen, vente på kolonnen for å tørke og deretter vaskes ved å gjenta dette tre ganger med bufferoppløsning.
- Plasser en ny 15 ml tube under kolonnen og ta kolonnen av den magnetiske separator. Spyl cellene ut av kolonnen inn i røret med 1 ml bufferløsning.
- Tilsett 4 ml bufferløsning og sentrifuger ved 515 xg i 10 min, og deretter resuspendering i 1 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
- Lage 1:10 fortynninger for å telle ved å tilsette 20 ul av cellesuspensjonen til 160 ul av PBS og 20 ul av trypanblått. Tell cellene med enhemocytometer.
- Juster cellekonsentrasjonen til 6 x 10 5 / ml med RPMI og frø i 200 ul på en 35 mm glass-basert avbildning tallerken. Inkuber over natten ved 37 ° C med 5% CO2.
- Den neste dag, før avbildning, fjerne RPMI og tilsett 200 ul CO to uavhengige medium.
Merk: Disse monocytter kan også bli differensiert i forskjellige undergrupper makrofag før avbildning. Hvis dette er en teknikk som skal undersøkes, er et utmerket utgangspunkt i nyere artikkel av Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Etter høsting PBMC-lag, fjerner alt av serumet, og det meste av lymfocytt isolasjon løsning, men være forsiktig for ikke å fjerne det lille hvite bånd på toppen av det røde pellet, da dette vil inneholde mesteparten av de nøytrofile celler.
- Fremstill en 10x hypoton lyseringsbuffer lager ved tilsetning av 83 g NH4CI og 10 g KHCO3 i 1 liter sterilt vann. Oppbevares ved 4 °C.
- Fortynn denne aksjen 10x med sterilt vann og legge den til rørene. Deretter nøye invertere 3 ganger og inkuberes på is i 15 min.
- Sentrifuger ved 394 xg i 10 min og resuspendert i hypotonisk lyseringsbuffer i 10 minutter i is.
- Sentrifuger ved 394 xg og vask to ganger med kald PBS. Gjensuspender i 1 ml av CO 2-uavhengig medium pr donor.
- Lage 1:10 fortynninger for å telle ved å tilsette 20 ul av cellesuspensjonen til 160 ul av PBS og 20 ul av trypanblått. Tell cellene med et hemocytometer.
- For flow-cytometri, justere konsentrasjonen til 6 x 10 5 / ml og tilsett 400 ul cellesuspensjon til en 24-brønners plate. For mikroskopering, tilsett 200 ul av den samme cellesuspensjonen til en 35 mm glass-basert avbildning tallerken.
Merk: nøytrofile avbildning eller flowcytometri bør igangsettes umiddelbart på grunn av deres tilbøyelighet til å gjennomgå apoptose hvis venstre stimulert. Hvis dette ikke er mulig nøytrofile bør holdes påis og brukes så snart som mulig (innen samme dag).
4. flowcytometrisystemer
- Tilsett 200 pl av 1,2 x 10 6 / mL FLARE konidier til cellene i 24-brønners plate, og det tilsettes 100 ul av 20 ug / ml vorikonazol. Tilsett 300 ul av RPMI og inkuber i 16 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: Vorikonazol er tilsatt for å hindre Konidiale spiring. - Tilsett 25 pl av en 1 mM Calcofluor white-stamløsning til hver brønn til en endelig konsentrasjon på 25 uM og inkuber i 10 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Sentrifuger ved 582 xg i 10 min. Fjern supernatanten og vask to ganger med PBS.
- For å høste adherente celler (monocytter), tilsett 1 ml PBS med 3 mM EDTA til hver brønn og inkuber i 10 minutter ved 37 ° C med 5% CO2. Vask forsiktig celler av platen ved pipettering og samle celler i et rør.
- Vask en gang i FACS-buffer (2% føtalt kalveserum til PBS), og deretter resuspender i FACS-buffer for FACS-analyse.
- For FACS-analyse, først innstille kompensatorkretsen parametrene for strømningscytometer og satt positive porter ved bruk av enkeltfargede kompensasjon rør, inkludert konidier med ingen farge: DsRed + konidier, AF633 + konidier, og Calcofluor hvit + conidia (generert som i 4.2).
- Satt fri sporer gate basert på fremover og sidespredning ved hjelp av sporer uten farge. Sett celle gate på fremover og sidespredning ved å utelukke den frie sporer gate.
- Analyser prøverør ved å registrere 10.000 hendelser.
MERK: Celler assosiert med levende sporer vil bli DsRed + og AF633 +. Celler assosiert med døde sporer vil være bare AF633 +. Tilskuer celler som ikke har engasjert sporer vil være dsRed- og AF633-. Konidiene-engasjert cellepopulasjoner blir videre analysert for Calcofluor hvite flekker på Pacific blå kanal. Sporer som forblir utenfor cellene vil være Calcofluor hvit +, og sporer som har blitt internalisert vil væreCalcofluor White-.
5. Levende Cell Video Mikroskopi
Merk: Valg av mikroskop vil være avhengig av hva som er tilgjengelig lokalt, men mikroskop oppsettet vil måtte omfatte en invertert trinn, et miljøkammer oppvarmet til 37 ° C og hensiktsmessig eksitasjon / emisjonsfiltre for DsRed (532/561 nm) og AF633 (633 nm). Flare sporer ikke fungere med 488 nm laser i stedet for 532/561 nm laser for DsRed. Ved utførelse av dette forsøk for første gang, med styrekonidier uten farge og én farge for å teste for bakgrunnsfluorescens og gjennomslag mellom DsRed og AF633 kanaler.
- Slå på mikroskopet varmeren før forsøket og gi tilstrekkelig tid til omgivelsesstyrekammer for oppvarming til 37 ° C. Den tiden det tar for kammeret å stabilisere temperaturen vil variere for forskjellige mikroskop oppsett.
- Slå på mikroskopet og datamaskinen, og loannonse bildebehandlingsprogrammer. Monter avbildning fatet på objektbordet og justere fokus for å finne humane nøytrofile celler eller monocytter.
- For DsRed og AF633, sette laseren makt til 10% og eksponeringstid på 1 s på oppkjøps innstillinger.
- Fjern bilde sleiden og tilsett 100 pl av 3 x 10 6 / mL FLARE Konidiale suspensjon til de passende brønnene (totalvolum 300 pl / brønn). Spill tiden at blusse sporer blir lagt til parabolen.
- Returner lysbildet til scenen og justere kameraets følsomhet for DsRed og AF633 tydelig se sporer, men ikke overeksponere bildet. Sett opp en scene punkter listen hvis flere punkter oppkjøpet er nødvendig.
- Begynne å avbilde når alle punkter er i fokus blir kanalene optimalisert og syklustiden og varighet er angitt. Syklus tid og varighet for avbildning avhenge av den eksperimentelle spørsmålet. Målet er å holde syklustiden så kort som mulig (≤2 min) med 1 min for å tillate grundig analyse av UPTAKE dynamikk.
Representative Results
Representative resultater er vist å følge den beskrevne protokoll. Figur 1 viser en representativ 6 timer levende celle-video med humane neutrofiler og fakkel konidier. DsRed (rød) uttrykkes ved sporer seg selv mens de har vært merket med AF633 (Magenta).
Figur 2 er et bilde fra et enkelt tidspunkt fra en tilsvarende film som vist i figur 1, som illustrerer forskjellen mellom levende og døde FLARE conidia. Døde sporer skilles fra levende sporer ved å miste sin DsRed (rød) signal og samtidig opprettholde en lys AF633 (magenta) fluorescens. A. fumigatus sporer ofte overleve innenfor fagocytter i over 6 timer. Derfor, for å effektivt å kvantifisere drepe strømningscytometri plott er vist for en 16 timers inkuberingsperiode på figur 3. Disse data ble oppnådd med en alveolar makrofager cell linje som et eksempel, men kan utføres med en hvilken som helst celletype. I figur 4 migrasjonen er vist i den første timen av stimulering av humane nøytrofiler, så vel som deres hastighet og retningsbevegelse. Figur 5 viser prosentandelen av nøytrofiler og monocytter som har inntatt 1, 2, 3 eller flere sporer mens figur 6 viser antallet av sporer som spirer til hyfer.
Figur 1: Levende celler video mikroskopi film av humanneutrofiler og fakkel sporer. Nøytrofiler ble isolert fra humant blod og sådd sammen med bluss konidier in CO to uavhengige medium i et forhold på 1: 3, henholdsvis. Imaging ble initiert direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Bildene ble tatt i 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Skala bar = 10 mikrometer.En zoomet inn video er vist med kanaler er adskilt for å klargjøre rollen til fakkelkonidier med DIC i øvre venstre, DsRed (rød) øverst til høyre, AF633 (grønn) i bunnen til venstre og den fusjonerte video i høyre . Klikk her for å laste ned denne videoen.
Figur 2: Single tidspunkt bilde demonstrere forskjellen mellom levende og døde FLARE sporer. Humane nøytrofiler ble stimulert med bluss konidier og avbildes med en roterende skive konfokalt mikroskop. Et bilde ble tatt fra de genererte filmer. Døde sporer skiller seg fra hyfer av å ha mistet sin DsRed (red: øverst til høyre) signal samtidig opprettholde sin AF633 fluorescens (grønn: nederst til venstre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering og validering av fagocytose og dreping av A. fumigatus konidier. Muse alveolare makrofagceller (MH-S) ble inkubert med bluss konidier ved et 1: 1 forhold i 16 timer i nærvær av vorikonazol. MH-S-celler assosiert med levende konidier er vist i den røde porten (DsRed + AF633 +). MH-S-celler er forbundet med død konidier er vist i den blå gate (DsRed-AF633 +). Bystander MH-S-celler er vist i gull gate. Calcofluor White et celle-ugjennomtrengelig fluorescerende fargestoff som binder seg til soppcelleveggen, blir brukt til å skjelne ekstracellulære konidier (Calcofluor hvit +) fra intracellulære conidia (Calcofluor White-). Som en ekstra validerings til fremgangsmåten, er det vist at behandling med 2 uM cytokalasin D hemmer Konidiale opptak av MH-S-celler.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Migrering av humane neutrofiler og monocytter mot A. fumigatus sporer. Nøytrofiler ble isolert fra humant blod og sådd sammen med bluss konidier in CO to uavhengige medium i et forhold på 1: 3, henholdsvis. Imaging ble initiert direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Bildene ble tatt i 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Migrering av alle individuelle humane neutrofiler per felt ble manuelt spores ved hjelp av sporing mot hvilende (A) og svellet (B) konidier i 1 time. Dataene representerer en ramme av celler for hver tilstand av den samme donor. Den buktende faktor (C), et mål for retningen pånal bevegelse, og hastigheten (D) ble deretter kvantifisert ved anvendelse av den samme programvare. Gjennomsnitt ± SEM for 3 donorer er vist med 30 celler pr donor enn 2 uavhengige eksperimenter. *: P <0,05 (Welch er korrigert t test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Fagocytose av A. fumigatus konidier av humane neutrofiler og monocytter. Nøytrofiler og monocytter ble isolert fra humant blod og sådd sammen med bluss konidier in CO to uavhengige medium i et forhold på 1: 3, henholdsvis. Imaging ble initiert direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Bildene ble tatt i 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Fagocytose ble målt som mengden av celler inneholdering FLARE conidia etter 4 timer med stimulering. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra 3 donorer og 3 rammer per donor enn 2 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Hemming av spiring av A. fumigatus konidier av neutrofiler og monocytter. Nøytrofiler og monocytter ble isolert fra humant blod og sådd sammen med bluss konidier in CO to uavhengige medium i et forhold på 1: 3, henholdsvis. Imaging ble initiert direkte ved 37 ° C med en roterende skive konfokalt mikroskop. Bildene ble tatt i 1 min og 55 s intervaller over en periode på 6 timer. Hemning av sopp spiring ble undersøkt ved å måle prosentandelen av konidier som hadde bakterieinated etter 2, 4 og 6 timer av ko-kulturen. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra 3 donorer og 3 rammer per donor enn 2 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne fremgangsmåten beskriver en in vitro metode for å studere den antifungale aktivitet av humane primære fagocytter mot A. fumigatus ved å benytte fluorescens Aspergillus reporter (flate) conidia, levende celle avbildning og flowcytometri. Tidligere studier har demonstrert den ekstra fordel ved bruk av FLARE konidier både in vivo i mus eksperimentelt soppinfeksjon og in vitro-evaluering av anti-sopp immunitet 6, 7. Ved å kombinere FLARE konidier med denne neste generasjon levende celle avbildningsteknikk gjør det mulig for et oppsett for å måle levedyktigheten til individuell konidier under dynamisk interaksjon in vitro.
Den beskrevne metode har potensial til å undersøke de spesifikke roller og viktigheten av visse cellulære prosesser av immunceller på deres soppdrepende responser. I tillegg, soppdrepende responser av fagocytter fra bestemte pasienter som liderdefinerte enkeltkomponent-defekter i immunsystemet kan bli vurdert i nærmere detalj. Svært tidlig og initielle soppdrepende responser kan studeres i detalj i løpet av 6 timer med kontinuerlig avbildning. Dette gjør det mulig for selv små forskjeller som skal detekteres, slik som hastigheten av fagocytt vandring mot sopp, internalisering priser, dynamikken i fungicide arrangementer 12, som ville være undistinguishable ved hjelp av konvensjonelle metoder fagocytose.
En hvilken som helst celletype som kan brukes med denne metode; celletyper som brukes her ble valgt fordi disse fagocytter utgjør den første og andre forsvarslinjer i de humane luftveier mot A. fumigatus 13. Interessant, kan meget tydelige forskjeller observeres mellom hvordan monocytter og nøytrofile i inngrep med hvile og hoven conidia og hyfer. Monocytter neppe migrere til sporer, mens nøytrofile vise mye mer vandrende aktivitet. Tilleggs fluorescerende markers som lever-død markører på immunceller kan bli inkludert i analysen for å gi innsikt i fagocytt overlevelse etter interaksjon med Aspergillus. Interessante potensielle fremtidige anvendelser for denne teknologi omfatter ko-kultur av ulike vertscelletyper, er konsekvensene for soppdrepende responser (for eksempel makrofager på en epitel monolag, monocytt-avledede dendrittceller sammen med neutrofiler), og måling i sanntid av reaktive oksygenarter produksjon eller nøytrofil ekstracellulære felle dannelse etter stimulering med Aspergillus.
Noen punkter må være kjent for å bruke denne protokollen, fremst laboratorieoppstilling kreves et mikroskop med en invertert trinn, et miljøkammer stabil ved 37 ° C, og eksitasjon / emisjonsfiltre for DsRed (532/561 nm) og AF633 ( 633 nm). Evnen av mikroskopet for å holde cellene i fokus og beholde oljeneddyppingsobjektivet (særlig relevant i løpet av multi-punkt acquisition) bør overvåkes periodisk på grunn av den lange varighet av bildebehandling. For kvantifisering av fungicid aktivitet flowcytometri anlegg er nødvendig. I tillegg er passende institusjonelle og etiske godkjennelser må være på plass for å arbeide med frisk donor og pasient avledet blodprøver og genetisk manipulerte sopp. Det anbefales sterkt å bruke friske blodprøver (bruk på samme dag) for å øke cellelevedyktigheten og bevare funksjonalitet. Ideelt sett er isolering av celler utføres umiddelbart etter trekking blodprøvene og neutrofiler avbildes umiddelbart etter isolasjon.
Som konklusjon, til en neste generasjon levende celle avbildningsteknikk med fordypninger i stor detalj fagocytt antifungal aktivitet mot A. fumigatus, er beskrevet. Denne teknologien kan gi en unik innsikt i enkelte celle-sopp interaksjoner i tidlige medfødte immunforsvaret mot Aspergillus.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet har vært støttet av MRC og Universitetet i Aberdeen (MRC Senter for medisinsk mykologi) og ved Wellcome Trust Strategisk Award - Medisinsk mykologi Fungal immunologi (SFB, JMB, JK, AW). En spesiell takk gis til støtte fra Chloe fondet. TMH er støttet av en bevilgning fra National Institute of Health (NIH, kode RO1 093808) og Memorial Sloan Kettering Cancer Center støttes av NIH bevilgning P30 CA008748. I tillegg er TMH en undersøker i patogenesen av Infectious Disease understøttet av Burroughs Wellcome Fund. Vi ønsker å takke Aberdeen Mikroskopi og histologi Facility for deres hjelp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
- Kosmidis, C., Denning, D. W. The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis. Thorax. 70 (3), 270-277 (2015).
- Warris, A. The biology of pulmonary Aspergillus infections. J Infect. 69 (Suppl 1), S36-S41 (2014).
- Henriet, S. S., et al. Human leukocytes kill Aspergillus nidulans by reactive oxygen species-independent mechanisms. Infect Immun. 79 (2), 767-773 (2010).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. J Vis Exp. (71), e50196 (2013).
- Heung, L. J., Jhingran, A., Hohl, T. M. Deploying FLAREs to Visualize Functional Outcomes of Host-Pathogen Encounters. PLoS Pathog. 11 (7), e1004912 (2015).
- Jhingran, A., et al. Tracing conidial fate and measuring host cell antifungal activity using a reporter of microbial viability in the lung. Cell Rep. 2 (6), 1762-1773 (2012).
- Espinosa, V., et al. Inflammatory monocytes orchestrate innate antifungal immunity in the lung. PLoS Pathog. 10 (2), e1003940 (2014).
- English, D., Andersen, B. R. Single step separation of red blood cells, granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradient of ficoll hypaque. J Immunol Met. 5 (3), 249-252 (1974).
- Shimizu, K., Keller, N. P. Genetic involvement of a cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans. Genetics. 157 (2), 591-600 (2001).
- Ohradanova-Repic, A., Machacek, C., Fischer, M. B., Stockinger, H. Differentiation of human monocytes and derived subsets of macrophages and dendritic cells by the HLDA10 monoclonal antibody panel. Clin Transl Immunology. 5 (1), e55 (2016).
- Lewis, L. E., et al. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69 (3), 617-631 (1982).
