Summary
Aquí, se describe un protocolo para evaluar la actividad antifúngica de las células inmunes humanas primarias en tiempo real utilizando fluorescente conidias de Aspergillus reportero en conjunción con microscopía de vídeo en vivo de células y citometría de flujo. Los datos generados proporcionan la penetración en hospedantes de célula interacciones de Aspergillus tales como actividad fungicida, la fagocitosis, la migración celular y la inhibición de crecimiento de hongos.
Abstract
Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista por hongos que causan infecciones invasivas en huéspedes inmunocomprometidos con una alta tasa de letalidad. Investigación investigar las respuestas inmunológicas contra de A. fumigatus se ha limitado por la falta de ensayos consistentes y fiables para medir la actividad antifúngica de las células inmunes específicas in vitro. Un nuevo método se describe para evaluar la actividad antifúngica de los monocitos primarios y los neutrófilos de donantes humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescentes Aspergillus reportero conidios (FLARE). Estos conidios contienen un reportero dsRed codificado genéticamente, que se expresa de forma constitutiva por conidios FLARE en vivo, y están etiquetados externamente con Alexa Fluor 633, que es resistente a la degradación dentro del fagolisosoma, permitiendo así una distinción entre conidios A. fumigatus viva y muerta. video microscopía y citometría de flujo se utilizan posteriormente para visualizar el interactúanion entre conidios y las células inmunes innatas, la evaluación de la actividad fungicida mientras que proporciona también una gran cantidad de información sobre la migración de fagocitos, la fagocitosis y la inhibición de crecimiento de hongos. Esta nueva técnica ha proporcionado ya emocionantes nuevos conocimientos sobre la interacción huésped-patógeno de células inmunes primarios contra A. fumigatus. Es importante tener en cuenta la configuración de laboratorio necesario para realizar este ensayo, incluyendo la microscopía y citometría de flujo necesaria instalaciones, y la capacidad de trabajar con sangre de donantes humanos y hongos manipulados genéticamente. Sin embargo, este ensayo es capaz de generar grandes cantidades de datos y puede revelar información detallada de la la respuesta antifúngico. Este protocolo ha utilizado con éxito para estudiar la interacción huésped-patógeno de células inmunes primarios contra A. fumigatus.
Es importante tener en cuenta la configuración de laboratorio necesario para realizar este ensayo, incluyendo la microscopía y citometría de flujo necesaria facilities, y la capacidad de trabajar con sangre de donante humano y hongos manipuladas genéticamente. Sin embargo, este ensayo es capaz de generar grandes cantidades de datos y puede revelar información detallada de la la respuesta antifúngico. Este protocolo ha utilizado con éxito para estudiar la interacción huésped-patógeno de células inmunes primarios contra A. fumigatus.
Introduction
Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista por hongos y la causa fúngica más común de infecciones pulmonares invasivas en el huésped inmunocomprometido 1, 2. La comprensión de cómo las células inmunes del huésped reconocen y eliminan Aspergillus es un área importante de la investigación de hongos, sin embargo, los ensayos de fungicidas actualmente disponibles tienen limitaciones significativas. Métodos comúnmente utilizados para medir la actividad fungicida incluyen ensayos colorimétricos y la determinación de unidades formadoras de colonias 3, 4. Sin embargo, estos métodos proporcionan información sobre la viabilidad de hongos en un solo punto de tiempo en lugar de ver la interacción dinámica entre el huésped y patógeno. Por consiguiente, estos métodos no pueden tener en cuenta si un hongo ha muerto o simplemente (temporalmente) restringido en crecimiento o actividad metabólica. Hemos desarrollado un método capaz de observar fungiciactividad dal directamente, mientras que la captura simultáneamente la información detallada con respecto a la fagocitosis, la migración de fagocitos y la inhibición del crecimiento fúngico.
Anteriormente, un protocolo se publicó el uso de imágenes en tiempo real como un medio para medir la fagocitosis de Candida albicans por una línea celular de macrófago de ratón 5. Este concepto ha sido desarrollado para hacer frente a la falta de conocimientos en nuestra comprensión de las interacciones con las células inmunes de Aspergillus mediante la utilización de Aspergillus fluorescentes Reporter (brote) conidios 6, 7, 8. Estos conidios expresan un fluoróforo rojo (dsRed) y están marcados con un segundo fluoróforo (Alexa Fluor 633). Una vez que un conidio FLARE se mata, se deja de producir dsRed y la dsRed restante se desvanece, mientras que el AF633 permanece fluorescente y unido a los conidios. Esto crea una clara distinción entre fu viva y muertaNGAL células durante imágenes de células vivas y la citometría de flujo, y permite el seguimiento del destino de conidios individuales después de su interacción con las células inmunes.
Los ensayos descritos proporcionan un método eficaz de visualizar la interacción entre las células inmunes del huésped y Aspergillus y serán de valor considerable en el descubrimiento de las vías de señalización celulares responsables de los mecanismos efectores antifúngicos en las células inmunes innatas. Otras aplicaciones incluyen la visualización de cómo los cambios en el crecimiento de Aspergillus, tales como el cambio de reposo a conidios hinchada, hinchada o de conidios de hifas, afectan el reconocimiento de los fagocitos y función.
El siguiente protocolo describe en detalle cómo obtener los monocitos y neutrófilos humanos; cómo preparar los conidios FLARE; y la manera de capturar sus respuestas con el microscopio de vídeo y citometría de flujo. Aunque se describe el uso de células inmunes humanas aisladas de sangre del donante aquí, estetécnica ha demostrado igualmente eficaces usando una variedad de poblaciones de células murinas.
Protocol
El protocolo para la obtención de neutrófilos y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se basa en los métodos publicados anteriormente 9. El uso de muestras de sangre de voluntarios sanos ha sido aprobado por el comité de ética de la investigación humana de la Universidad de Aberdeen. Antes de comenzar asegúrese de que todas las aprobaciones éticas están en su lugar para la extracción de sangre de voluntarios y / o pacientes sanos para el propósito del experimento descrito. Mantener las células en hielo cuando sea posible para aumentar su supervivencia.
1. A. fumigatus cultura y Condiciones
- Preparar medio de agar mínimo de glucosa como se describe 10.
- Ajuste de medios a pH 6,5 usando NaOH 1 M y autoclave a 120 ° C durante 20 min.
- Dejar enfriar a 65 ° C.
- Trabajando en una campana de flujo estéril, verter 30 ml de medio enfriadas en un matraz T75 y se deja enfriar con el cuello de la reclinación matraz en una pipeta de 25 ml a crear una pendiente de agar.
- Streak la cepa de A. fumigatus dsRed Af293- en el agar e incubar durante 7 días a 37 ° C + 5% de CO2. Dos frascos producirán aproximadamente 10 9 conidios en 5 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) pre-biotinilación.
2. A. fumigatus Etiquetado y Preparación
Nota: Al realizar este ensayo, por primera vez, preparar el Af293- cepa de A. fumigatus parental. Tomar muestras de ambas cepas en tubos de microcentrífuga y la etiqueta de sólo una de cada cepa como se describe a continuación. Esto permitirá a uno tener conidios de control sin color y conidios con un solo color, ya sea dsRed o AF633, para probar la configuración y el equipo.
- Harvest A. fumigatus conidias sumergiendo el cultivo con 30 ml de PBS + 0,05% de Tween-80. Se filtra la suspensión resultante a través de un filtro de células de 40 m en un tubo de 50 ml para eliminar los fragmentos de hifas.
- doentrifuge a 805 xg durante 10 min, eliminar el sobrenadante y lavar una vez en 20 ml de PBS estéril. Piscina conidios a partir de dos placas de la misma cepa durante la etapa de lavado.
- Después de la etapa de lavado, resuspender el precipitado en 5 ml de PBS y la transferencia de alícuotas de 1 ml de la suspensión conidial en tubos de microcentrífuga. 1 ml de suspensión de cada cepa es generalmente suficiente para imágenes de células vivas. Envolver las alícuotas restantes en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C.
- alícuotas de centrífuga de suspensión de conidios a 9.300 xg durante 10 min a temperatura ambiente y cuidadosamente Extraer el sobrenadante. Resuspender el sedimento de conidios en 1 ml de 0,05 M de NaHCO3, pH 8,3.
- Preparar 10 mg de biotina / 200 dimetilsulfóxido l solución madre (DMSO) mediante la reconstitución de 25 mg de biotina en 500! L de DMSO. Añadir 10 l de biotina / DMSO solución madre al tubo de microcentrífuga, cubierta en papel de aluminio y se incuba durante 2 h en un agitador a 4 ° C.
- Alícuota el resto de la biotina / DMSO Stock solution y congelar a -20 ° C para su uso en experimentos posteriores.
- Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg y retirar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el sedimento de conidios en 1 ml de 100 mM Tris-HCl pH 8,0 durante 1 h para desactivar biotina libre flotación.
- Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg y retirar con cuidado el sobrenadante. Lavar la pella dos veces con 1 ml de PBS estéril y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS.
- Disolver 1 mg de estreptavidina-AF633 en 0,5 ml de PBS para hacer una solución madre de 2 mg / mL. Añadir 10? L de 2 mg / ml de estreptavidina-AF633 por 1 ml de suspensión conidial y se incuba durante 40 min a temperatura ambiente en un agitador cubierto de papel de aluminio. La estreptavidina-AF633 restante se puede congelar en alícuotas para su uso en experimentos posteriores.
- Centrifugar durante 10 minutos a 9300 xg y retirar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el sedimento de conidios en 1 ml de PBS y contar el conidios usando un hemocitómetro en una dilución 1: 1000 (1: 100 y luego 1:10). Ajustar la concentración de conidios a 3,6 x 10 6 / ml con CO 2 medios de comunicación independientes, envolver en papel de aluminio y se almacenan a 4 ° C.
NOTA: Los conidios son ahora etiquetados con AF633 y serán referidos como conidios bengala. - Opcional: Si es necesaria la estimulación con conidios hinchado, después de contar conidios (paso 2.9), diluir conidios a 7,2 x 10 6 / ml en base nitrogenada de levadura (YNB) medio y añadir 500! L de suspensión conidial a 4,5 ml de medio YNB en un autoclave 50 matraz Erlenmeyer. Tapar y colocar el matraz en un incubador con agitación (200 rpm a 37 ° C) durante 6 h.
- Pasar el medio a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 805 xg durante 10 min a temperatura ambiente y lavar una vez en PBS. Centrifugar de nuevo y resuspender el sedimento en 1 ml CO 2 medio independiente, dando 3,6 x 10 6 conidios / ml.
Nota: Las conidias se aglutinan con frecuencia después de que se hinchan haciendo precisa contar difícil, se aconseja para calcular la cnúmeros ounted de reposo conidios utilizados.
- Pasar el medio a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 805 xg durante 10 min a temperatura ambiente y lavar una vez en PBS. Centrifugar de nuevo y resuspender el sedimento en 1 ml CO 2 medio independiente, dando 3,6 x 10 6 conidios / ml.
3. Aislamiento de neutrófilos y monocitos humanos
- Dibujar 20 ml de sangre venosa de voluntarios sanos en dos 10 tubos de sangre ml que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Para cada donante por separado, verter 20 ml de sangre en un tubo de 50 ml y se diluye con 15 ml de PBS.
- UNDERLAY la sangre con 15 ml de una solución de aislamiento de linfocitos (densidad 1,077 g / ml) con una aguja de jeringa y hierro. Coloque la aguja en la parte inferior del tubo y forzar suavemente la solución de aislamiento de linfocitos a cabo. Centrifugar a 630 xg durante 20 min sin freno y bajo aceleración.
- Preparar PBS, enfriado en hielo.
NOTA: Los pasos 3.4 y 3.5 se debe seguir simultáneamente para generar monocitos (3.4) y neutrófilos (3.5). - El uso de un pastette, cosechar la capa de PBMC. Esta es la capa en el centro entre el suero amarillo (superior) y la solución transparente de linfocitos aislamiento capa (inferior), ytransferir a un tubo nuevo 50 ml.
- Llenar el tubo con la PBMC hasta 50 ml con PBS frío y se centrifuga a 582 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces con PBS frío y resuspender en 1 ml de PBS por 20 ml de sangre del donante utilizados inicialmente.
- Hacer diluciones 1:10 para contar mediante la adición de 20 l de la suspensión celular a 160 l de PBS y 20 l de azul de tripano. Recuento de células con un hemocitómetro.
- Preparar una solución tampón mediante la adición de 26 ml de suero inactivado por calor de ternera fetal (FCS) y 2,1 ml de 0,5 M EDTA a 500 ml de HBSS. Centrifugar las células durante 10 min a 515 xg y resuspender en 40 l de solución tampón por células 1 x 10 7.
- Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y añadir 10 l de microperlas CD14 por las células 1 x 10 7, mezclar bien y se incuba durante 15 min a 4 ° C, asegurándose de mezclar los tubos de cada 5 min.
- Lavar las células mediante la adición de 1 ml de solución tampón por 1 x 10 7 células y CENtrifuge a 515 xg durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender completamente hasta 1 x 10 8 células en 500 l de solución tampón.
- Coloque la columna 1 por muestra en un separador magnético de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En primer lugar lavar la columna una vez con 500 l de solución tampón.
- Pipetear los 500 l de suspensión celular a través de la columna, esperar a que la columna se seque y luego lavar repitiendo esto tres veces con solución tampón.
- Colocar un nuevo tubo de 15 ml debajo de la columna y tomar la columna fuera del separador magnético. Luego enjuagar las células fuera de la columna en el tubo con 1 ml de solución tampón.
- Añadir 4 ml de solución tampón y se centrifuga a 515 xg durante 10 min, y luego volver a suspender en 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio.
- Hacer diluciones 1:10 para contar mediante la adición de 20 l de la suspensión celular a 160 l de PBS y 20 l de azul de tripano. Contar las células con unahemocitómetro.
- Ajustar la concentración de células a 6 x 10 5 / ml con RPMI y semilla de 200! L en un plato de formación de imágenes basada en vidrio 35 mm. Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO2.
- Al día siguiente, antes de la imagen, eliminar el RPMI y añadir 200 l de CO 2 medio independiente.
Nota: Estos monocitos también pueden diferenciarse en varios subconjuntos de macrófagos antes de la formación de imágenes. Si esta es una técnica para ser explorado, un excelente punto de partida es el reciente documento por Ohradanova-Repic et al. 1 1.
- Después de cosechar la capa de PBMC, eliminar todo el suero y la mayoría de la solución de aislamiento de linfocitos, pero tener cuidado de no eliminar la pequeña banda blanca en la parte superior de la pastilla roja como este contendrá la mayor parte de los neutrófilos.
- Preparar una reserva de estabilización 10x lisis hipotónica mediante la adición de 83 g de NH 4 Cl y 10 g de KHCO3 en 1 L de agua estéril. Almacenar a 4 °DO.
- Diluir esta 10x con agua estéril y añadirlo a los tubos. Luego, invierta cuidadosamente 3 veces y se incuban en hielo durante 15 min.
- Centrifugar a 394 xg durante 10 min y resuspender en tampón de lisis hipotónico durante 10 min en hielo.
- Centrifugar a 394 xg y lavar dos veces con PBS frío. Resuspender en 1 ml de CO 2 medio independiente por donante.
- Hacer diluciones 1:10 para contar mediante la adición de 20 l de la suspensión celular a 160 l de PBS y 20 l de azul de tripano. Contar las células con un hemocitómetro.
- Para citometría de flujo, ajustar la concentración a 6 x 10 5 / ml y añadir la suspensión de células 400! L a una placa de 24 pocillos. Para la microscopía, añadir 200 l de la misma suspensión celular a una placa de formación de imágenes basada en vidrio 35 mm.
Nota: las imágenes de neutrófilos o citometría de flujo se debe iniciar inmediatamente debido a su propensión a sufrir apoptosis si se deja sin estimular. Si esto no es posible neutrófilos deben mantenerse enhielo y utilizado tan pronto como sea posible (dentro del mismo día).
4. Citometría de Flujo
- Añadir 200! L de 1,2 x 10 6 / conidios FLARE ml a las células en la placa de 24 pocillos, y a continuación, añadir 100 l de 20 mg / ml voriconazol. Añadir 300! L de RPMI y se incuba durante 16 h a 37 ° C con 5% de CO2.
El voriconazol se añade para evitar la germinación de conidias: NOTA. - Añadir 25 l de una solución madre 1 mM Calcofluor-blanco a cada pocillo para una concentración final de 25 mM y se incuba durante 10 min a 37 ° C con 5% de CO2.
- Centrifugar a 582 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces con PBS.
- Para cosechar las células adherentes (monocitos), añadir 1 ml de PBS con EDTA 3 mM a cada pocillo y se incuba durante 10 min a 37 ° C con 5% de CO2. lavar suavemente las células de la placa por pipeteado y recoger las células en un tubo.
- Lavar una vez en tampón FACS (2% de suero de ternera fetal al PBS) y, a continuación, volver a suspender en tampón FACS para el análisis FACS.
- Para el análisis FACS, ajustar primero los parámetros de compensación del citómetro de flujo y establecer puertas positivos utilizando tubos de compensación de un solo color, incluyendo conidios sin color: dsRed + conidios, AF633 + conidios, y Calcofluor Blanco + conidios (generado como en 4.2).
- Establecer puerta de conidios libre basado en dispersión frontal y lateral con conidios sin color. Establecer puerta de celda de dispersión frontal y lateral mediante la exclusión de la puerta conidios libre.
- Analizar tubo de muestra mediante el registro de 10.000 eventos.
Nota: las asociadas con conidios en directo se DsRed + y + AF633. Células asociadas con conidios muertos serán solamente AF633 +. células espectadoras que no han participado conidios será dsRed- y AF633-. Las poblaciones de células conidios-comprometido se analizan adicionalmente para la tinción Calcofluor blanco en el canal azul Pacífico. Conidios que quedan fuera de las células será Calcofluor blanco +, y conidios que se han internalizado seránCalcoflúor Blanco-.
5. vivo celular microscopía de vídeo
Nota: La elección de microscopio dependerá de lo que está disponible a nivel local, pero la configuración microscopio necesitará incluir una fase invertida, una cámara ambiental calentada a 37 ° C y los filtros de excitación / emisión apropiados para dsRed (532/561 nm) y AF633 (633 nm). conidios FLARE no funcionan con el láser de 488 nm en lugar del láser 532/561 nm para dsRed. Al realizar este experimento para esta primera vez, utilizar los conidios de control sin color y el color único para la prueba de fluorescencia de fondo y sangrar a través entre el dsRed y canales AF633.
- Encender el calentador de microscopio antes del experimento y permitir tiempo suficiente para que la cámara de control del medio ambiente se caliente a 37 ° C. El tiempo necesario para temperatura de la cámara para estabilizar variará para diferentes configuraciones de microscopio.
- A su vez en el microscopio y el ordenador, y he aquíanuncio del software de imágenes. Montar el plato de imagen en la platina del microscopio y ajustar el enfoque para encontrar los neutrófilos o monocitos humanos.
- Para dsRed y AF633, establecer la potencia del láser para el 10% y el tiempo de exposición a 1 s en la configuración de adquisición.
- Retire la corredera de formación de imágenes y añadir 100 l de 3 x 10 6 / ml FLARE suspensión de conidios a los pocillos apropiados (volumen total 300! L / pocillo). Registre el tiempo que estallan conidios se añaden al plato.
- Devolver el carro a la escena y ajustar la sensibilidad de la cámara para dsRed y AF633 de ver con claridad los conidios pero no sobreexponer la imagen. Configurar una lista de puntos de etapa si se requiere la adquisición de múltiples puntos.
- Comenzar la formación de imágenes cuando todos los puntos están en foco, los canales están optimizadas y se establece el tiempo de ciclo y la duración. El tiempo del ciclo y la duración de las imágenes dependen de la cuestión experimental. El objetivo es mantener el tiempo de ciclo lo más corto posible (≤2 min) con 1 min permitiendo un análisis en profundidad de UPTake dinámica.
Representative Results
Los resultados representativos se muestran siguiendo el protocolo descrito. La Figura 1 ilustra un 6 h de vídeo en vivo de células representativo con neutrófilos humanos y conidios FLARE. dsRed (rojo) se expresa por los propios conidios mientras que han sido etiquetados con AF633 (Magenta).
La Figura 2 es una imagen de un solo punto de tiempo de una película similar a la mostrada en la Figura 1, que ilustra la diferencia entre conidios FLARE viva y muerta. conidios muertos se distinguen de los conidios en vivo por la pérdida de su señal dsRed (rojo), mientras que el mantenimiento de una fluorescencia brillante AF633 (magenta). A. fumigatus conidias menudo sobrevivir dentro de los fagocitos durante más de 6 h. Por lo tanto, para cuantificar eficazmente matar, citometría de flujo parcelas se muestran para un período de incubación de 16 h en la Figura 3. Estos datos se obtuvieron con un ce macrófago alveolarlínea ll como un ejemplo, pero se puede realizar con cualquier tipo de célula. En la figura 4 la migración se muestra en la primera hora de la estimulación de los neutrófilos humanos, así como su velocidad y movimiento direccional. La Figura 5 muestra el porcentaje de neutrófilos y monocitos que han ingerido 1, 2, 3 o más conidios mientras que la figura 6 muestra el número de conidios que germinan en hifas.
Figura 1: Células vivas película microscopía de vídeo de los neutrófilos humanos y conidios bengala. Los neutrófilos se aislaron de sangre humana y se sembraron junto con conidios FLARE en CO 2 medio independiente en una proporción de 1: 3, respectivamente. Imaging se inició directamente a 37 ° C con un microscopio de hilatura disco confocal. Las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min y 55 s en un período de 6 h. Barra de escala = 10 m.Un zoom de vídeo se muestra con los canales separados para aclarar el papel de los conidios FLARE con DIC en la parte superior izquierda, dsRed (rojo) en la parte superior derecha, AF633 (verde) en la parte inferior izquierda y el vídeo resultante de la concentración en la parte inferior derecha . Haga clic aquí para descargar el vídeo.
Figura 2: Imagen solo punto de tiempo que demuestra la diferencia entre conidios FLARE viva y muerta. Los neutrófilos humanos se estimularon con conidios FLARE y la imagen con un microscopio confocal de giro del disco. Una imagen fue tomada de las películas generadas. conidios muertos se distinguen de las hifas por haber perdido su dsRed (rojo: arriba a la derecha) de la señal de fluorescencia y manteniendo su AF633 (verde: abajo a la izquierda). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación y validación de fagocitosis y destrucción de conidios A. fumigatus. células de macrófagos alveolares de ratón (MH-S) se incubaron con conidios FLARE en una proporción 1: 1 durante 16 h en presencia de voriconazol. MH-S células asociadas con conidios en vivo se muestran en la puerta roja (dsRed + AF633 +). MH-S células asociadas con conidios muertas se muestran en la puerta azul (dsRed-AF633 +). células Bystander MH-S se muestran en la puerta de oro. Calcofluor White, un colorante fluorescente impermeable a las células que se une a la pared celular fúngica, se utiliza para distinguir conidios extracelular (Calcofluor Blanco +) a partir de conidios intracelular (Calcofluor White-). Como una validación adicional para el método, se demuestra que el tratamiento con 2 M citocalasina D inhibe la captación de conidias por células MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg">Please clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La migración de los neutrófilos y monocitos humanos contra conidios A. fumigatus. Los neutrófilos se aislaron de sangre humana y se sembraron junto con conidios FLARE en CO 2 medio independiente en una proporción de 1: 3, respectivamente. Imaging se inició directamente a 37 ° C con un microscopio de hilatura disco confocal. Las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min y 55 s en un período de 6 horas. La migración de todos los neutrófilos humanos individuales por campo fue manualmente rastreados utilizando software de seguimiento contra reposo (A) e hinchada (B) conidios durante 1 h. Los datos representan 1 marco de las células para cada condición del mismo donante. El factor de meandros (C), una medida de directiomovimiento nal, y la velocidad (D) fueron luego cuantificados usando el mismo software. Media ± SEM para 3 se muestran los donantes con 30 células por donante más de 2 experimentos independientes. *: P <0,05 (t prueba corregida de Welch). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La fagocitosis de conidios A. fumigatus por los neutrófilos y monocitos humanos. Los neutrófilos y monocitos se aislaron de sangre humana y se sembraron junto con conidios FLARE en CO 2 medio independiente en una proporción de 1: 3, respectivamente. Imaging se inició directamente a 37 ° C con un microscopio de hilatura disco confocal. Las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min y 55 s en un período de 6 h. La fagocitosis se midió como la cantidad de células contienening conidios FLARE después de 4 h de estimulación. Los datos se presentan como media ± SEM de 3 donantes y 3 fotogramas por donantes mayores de 2 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inhibición de la germinación de los conidios A. fumigatus por los neutrófilos y monocitos. Los neutrófilos y monocitos se aislaron de sangre humana y se sembraron junto con conidios FLARE en CO 2 medio independiente en una proporción de 1: 3, respectivamente. Imaging se inició directamente a 37 ° C con un microscopio de hilatura disco confocal. Las imágenes se capturaron a intervalos de 1 min y 55 s en un período de 6 horas. La inhibición de la germinación de hongos fue examinado midiendo el porcentaje de conidios que tenía el germeninated después de 2, 4 y 6 h de co-cultivo. Los datos se presentan como media ± SEM de 3 donantes y 3 fotogramas por donantes mayores de 2 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este método describe un innovador método in vitro para estudiar la actividad antifúngica de fagocitos primarios humanos contra A. fumigatus utilizando fluorescentes Aspergillus Reporter (FLARE) conidios, imágenes de células vivas y citometría de flujo. Estudios anteriores han demostrado el valor añadido de la utilización de conidios FLARE tanto in vivo de la infección fúngica experimental murina y en la evaluación in vitro de la inmunidad antifúngica 6, 7. Combinando conidios con destellos con esta técnica de imagen de células vivas próxima generación permite una configuración para medir la viabilidad de los conidios individuales durante las interacciones dinámicas in vitro.
El método descrito tiene el potencial para investigar los papeles específicos y la importancia de ciertos procesos celulares de las células inmunes en sus respuestas antifúngicos. Además, las respuestas antifúngicas de los fagocitos de pacientes específicos que sufren dedefectos de componentes individuales definidos en su sistema inmune se pueden evaluar en mayor detalle. Muy tempranas y respuestas iniciales antifúngicos pueden ser estudiados en gran detalle más de 6 h de la imagen continua. Esto permite incluso diferencias sutiles para ser detectados, tales como la velocidad de la migración de fagocitos hacia el hongo, las tasas de internalización, dinámica de los acontecimientos fungicidas 12, lo que sería indistinguible utilizando métodos fagocitosis convencionales.
Cualquier tipo de célula podría ser utilizado con este método; Se seleccionaron los tipos de células utilizados aquí porque estos fagocitos constituyen la primera y segunda líneas de defensa en las vías respiratorias humanas contra A. fumigatus 13. Curiosamente, las diferencias muy claras se pueden observar entre cómo los monocitos y los neutrófilos se acoplan con reposo y conidios hinchado y hifas. Los monocitos migran a casi conidios, mientras que los neutrófilos muestran una actividad mucho más migratoria. mar fluorescente adicionalkers tales como marcadores-vivos muertos sobre las células inmunes pueden ser incluidos en el ensayo para proporcionar información sobre la supervivencia de los fagocitos siguiente interacciones con Aspergillus. Interés potenciales futuras aplicaciones de esta tecnología incluyen la co-cultivo de diferentes tipos de células huésped, las consecuencias para respuestas antifúngicos (por ejemplo, macrófagos en una monocapa epitelial, las células dendríticas derivadas de monocitos, junto con los neutrófilos), y la medición en tiempo real de reactivo la producción de especies de oxígeno o la formación de trampa extracelular de neutrófilos después de la estimulación con Aspergillus.
Unos pocos puntos necesitan ser observado para utilizar este protocolo, ante todo, la configuración de laboratorio requerido: un microscopio con una etapa invertida, una cámara ambiental estable a 37 ° C, y de excitación / filtros de emisión para dsRed (532/561 nm) y AF633 ( 633 nm). La capacidad del microscopio para mantener las células en el enfoque y retener el aceite de inmersión (especialmente relevante durante multi-punto de adquisición) se debe supervisar periódicamente debido a la larga duración de formación de imágenes. Para la cuantificación de la actividad fungicida de citometría de flujo se requieren instalaciones. Además, las aprobaciones institucionales y éticas apropiadas necesitan estar en lugar de trabajar con donante sano y las muestras de sangre del paciente derivada y hongos manipuladas genéticamente. Se recomienda encarecidamente el uso de muestras de sangre fresca (uso en el mismo día) para aumentar la viabilidad celular y preservar la funcionalidad. Idealmente, el aislamiento de las células se realiza inmediatamente después de dibujar las muestras de sangre y los neutrófilos se obtuvieron imágenes inmediatamente después del aislamiento.
En conclusión, una técnica de imágenes de células vivas próxima generación para evaluar en gran actividad antifúngica detalle fagocito contra se describe A. fumigatus. Esta tecnología puede proporcionar una visión única de las interacciones célula fúngica individuales en las primeras defensas inmunitarias innatas contra Aspergillus.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido financiado por el MRC y la Universidad de Aberdeen (MRC Centro de Micología Médica) y por el Premio Estratégica Wellcome Trust - Micología Médica hongos Inmunología (SFB, JMB, JK, AW). Un agradecimiento especial se da al apoyo del fondo Chloe. TMH es apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Salud (NIH, código 093808 SR1) y el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering es apoyado por el NIH CA008748 P30 subvención. Además, TMH es un investigador en la patogénesis de la enfermedad infecciosa apoyado por el Fondo Burroughs Wellcome. Deseamos agradecer al Aberdeen Microscopía y Fondo Histología por su ayuda y apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma | G6279 | http://www.sigmaaldrich.com |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658 175 | http://www.greinerbioone.com/ |
| PBS | Gibco | 20012-019 | https://www.thermofisher.com/ |
| Tween-80 | Fisher Scientific | 10592955 | https://nl.fishersci.com/ |
| 40 µm filter | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | https://www.thermofisher.com/ |
| 15 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 188 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| 50 mL Falcon tube | Greiner Bio-One | 227 261 | http://www.greinerbioone.com/ |
| MilliQ | Millipore | QGARD00R1 | Nanopure water works similarly. http://www.merckmillipore.com/ |
| Biotin | Molecular Probes | B-6352 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| DMSO | Sigma | D5879 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Streptavidin-AF633 | Molecular Probes | S-21375 | AF633 is the only tested fluorophore so far that remains visible in phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html |
| EDTA blood tubes | Greiner Bio-One | 455036 | Any blood tubes with an anti-coagulating agent should work. http://www.greinerbioone.com/en/start/ |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | http://www3.gehealthcare.com/ |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | SV3008401 | https://www.thermofisher.com/ |
| HBSS | Gibco | 14170112 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CD14 microbeads | Myltenyi Biotec | 130-050-201 | Other monocyte isolation methods can be used as well, we prefer this method as it gives a consistent high purity of monocytes without being labor intensive. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| MS Columns | Myltenyi Biotec | 130-042-201 | See comment at CD14 microbeads. http://www.miltenyibiotec.com/en/ |
| RPMI + Glutamax | Gibco | 72400-021 | https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html |
| CO2 independent medium | Thermo Fisher Scientific | 18045054 | Necessary if there is not sufficient CO2 exchange during imaging. https://www.thermofisher.com/uk/en/home |
| µ-slide 8 well glass bottom | Ibidi | 80827 | This is the imaging dish that we use, however any glass imaging dish of proper size should work. http://ibidi.com/ |
| UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System | Perkin Elmer | L7267000 | Includes volocity software for acquisition and analysis. http://www.perkinelmer.com/ |
| Calcofluor white | Sigma | 18909 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Voriconazole | Sigma | PZ0005 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| BD LSRII | BD Biosciences | Flowcytometer used. https://www.bdbiosciences.com/ |
References
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