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Biochemistry

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

Published: May 16, 2017 doi: 10.3791/55448
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

Summary

यह पत्र सॉफ़्टवेयर सुइट स्पीयर द्वारा क्रियो-ईएम छवियों को प्रसंस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल लगभग सभी एकल कण ईएम परियोजनाओं के लिए लागू किया जा सकता है जो निकट-परमाणु संकल्प को लक्षित करते हैं।

Abstract

स्पीयर (उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए SPARX) एकल कण इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) डेटा के अर्द्ध स्वचालित प्रसंस्करण के लिए एक उपन्यास ओपन-सोर्स, उपयोगकर्ता-अनुकूल सॉफ़्टवेयर सुइट है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन किया गया है कि एकल कण संरचना निर्धारक पाइप लाइन के सभी चरणों के माध्यम से उपयोगकर्ताओं को मार्गदर्शन करके क्रायो-ईएम माइक्रोग्राफ की फिल्मों से शुरू होने वाली निकट-परमाणु संकल्प संरचना कैसे प्राप्त करें। ये चरण नए स्पीयर ग्राफिकल यूजर इंटरफेस से नियंत्रित होते हैं और न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, टीसीडीए 1 की 3.5 आकृति संरचना , फोटोरहाब्सस ल्यूमिनेसस्केंस से एक टीसी टेक्न कॉम्प्लेक्स , केवल 9 00 एकल कणों से प्राप्त हुई थी। यह सुव्यवस्थित दृष्टिकोण अपने मूल राज्य में उनके शुद्ध मैक्रोमोलेकुलर कॉम्प्लेक्स के शोर-मुक्त और निष्पक्ष परमाणु मॉडल को प्राप्त करने के लिए, व्यापक प्रसंस्करण अनुभव और पूर्व प्राथमिक संरचना के बिना नौसिखिया उपयोगकर्ताओं की सहायता करेगा।

Introduction

प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर प्रौद्योगिकी के विकास के बाद, एकल कण क्रायो-ईएम में उल्लेखनीय प्रगति वर्तमान में संरचनात्मक जीव विज्ञान 1 में बदल रही है । एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के मुकाबले, इस तकनीक को क्रिस्टलाइजेशन की आवश्यकता के बिना केवल प्रोटीन सामग्री की एक छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है, जबकि एक साथ नमूना की शुद्धता के बारे में कम प्रतिबंध लग जाता है और अब भी पास-परमाणु रिजोल्यूशन में संरचनाओं को निर्धारित करने की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात, विभिन्न रचनाएं या राज्यों को अब कम्प्यूटेशनल रूप से पृथक किया जा सकता है और अलग-अलग रूपों के निर्धारण का निर्धारण अभूतपूर्व स्तर पर किया जा सकता है। हाल ही में, चुनौतीपूर्ण अणुओं के घनत्व वाले नक्शे, नोवो मॉडल मॉडल की अनुमति के प्रस्तावों पर तैयार किए जा सकते हैं और इस प्रकार उनके क्रिया 2 , 3 , 4 , 5 की गहरी समझ।

इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पैकेज की एक विस्तृत विविधता 3DEM (3D इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) समुदाय (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) में उपलब्ध है और इनमें से अधिकतर निरंतर विकास के अंतर्गत हैं एएमएएन 2 6 , इमैजिक 7 , फ्रीलाइन 8 , रायन 9 , स्पाइडर 10 , और स्पार्क 11 सहित कई अलग-अलग सॉफ़्टवेयर पैकेजों के साथ विभिन्न आणविक भार और सममितियों का प्रदर्शन करने वाले प्रोटीन के लिए परमाणु संकल्प प्राप्त किया गया है। प्रत्येक पैकेज में उपयोगकर्ता विशेषज्ञता का एक अलग स्तर की आवश्यकता होती है और उपयोगकर्ता मार्गदर्शन, स्वचालन और अनुकूलता का एक अलग स्तर प्रदान करता है। इसके अलावा, कुछ कार्यक्रम छवि विश्लेषण के सभी चरणों को सुविधाजनक बनाने के लिए पूर्ण वातावरण प्रदान करते हैं, अन्य विशिष्ट कार्यों को अनुकूलित करने के लिए डिज़ाइन किए जाते हैं, जैसे कि किसी ज्ञात आर से शुरू होने वाले संरेखण पैरामीटरों के शोधनपरिधान संरचना हाल ही में, कई प्लेटफार्मों को विकसित किया गया है, जिसमें एपशन 12 और एससीआईपीआई 13 शामिल है , जो एक एकल प्रसंस्करण पाइपलाइन प्रदान करते हैं जो उपरोक्त सूचीबद्ध विभिन्न सॉफ़्टवेयर संकुल से दृष्टिकोण और प्रोटोकॉल को एकीकृत करता है।

क्रायो-ईएम के वर्तमान विकास में योगदान करने के लिए, SPARX को एकल कण विश्लेषण के लिए एक नया स्टैंड-अलोन और पूर्ण मंच में पुनः विकसित किया गया, जिसे स्पीयर (उच्च-संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए SPARX) कहा जाता है। क्षेत्र में नए शोधकर्ताओं के लिए तकनीक की पहुंच बढ़ाने के लिए और आधुनिक पूरी तरह से स्वचालित उच्च अंत इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी द्वारा उत्पादित बड़ी मात्रा में डेटा से निपटने के लिए, प्रसंस्करण पाइपलाइन को आसान-से-उपयोग शुरू करने के द्वारा बदल दिया गया और सरल किया गया। ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) और कार्यप्रवाह के प्रमुख चरणों को स्वचालित। इसके अलावा, सीआर से तेजी से, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और स्वचालित संरचना निर्धारण की अनुमति देने के लिए नए एल्गोरिदम जोड़े गए थेयो-ईएम चित्र इसके अलावा, शोधन और विविधता विश्लेषण के दौरान उत्पादित सामान्य कलाकृतियों से बचने के लिए पुनरुत्पादन द्वारा सत्यापन शुरू किया गया था।

यद्यपि कार्यक्रम को बड़े पैमाने पर संशोधित किया गया था, इसकी सराहनीय मुख्य विशेषताएं बनाए रखी गई थीं: सीधी खुला ओपन सोर्स कोड, आधुनिक ऑब्जेक्ट ओरिएंटेड डिज़ाइन और पायथन इंटरफेस सभी बुनियादी कार्यों के लिए इस प्रकार, यह एक ब्लैक बॉक्स प्रोग्राम में परिवर्तित नहीं हुआ, जिससे उपयोगकर्ताओं को पढ़ाई और आसानी से पायथन कोड को संशोधित करने, अतिरिक्त एप्लिकेशन बनाने या संपूर्ण वर्कफ़्लो को संशोधित करने में सक्षम बना दिया गया। यह विशेष रूप से गैर-मानक क्रायो-ईएम परियोजनाओं के लिए उपयोगी है।

यहां हम प्राइएआरआई के जीयूआई का इस्तेमाल करते हुए क्रायो-ईएम चित्रों से निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन घनत्व मानचित्र प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह कच्चे क्रॉय-ईएम डायरेक्ट डिटेक्टर फिल्मों के घनत्व के नक्शे को बनाने के लिए आवश्यक सभी चरणों का विवरण देता है और यह किसी भी विशिष्ट macromolecule प्रकार तक सीमित नहीं है। यह प्रोटोकॉल मुख्यतः न्यूक गाइड करने का इरादा रखता हैकार्यप्रवाह के माध्यम से क्षेत्र में omers और प्रसंस्करण के महत्वपूर्ण चरणों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं और साथ ही संभावित कुछ नुकसान और बाधाएं और अधिक उन्नत सुविधाओं और भूतल के पीछे सैद्धांतिक पृष्ठभूमि का कहीं और वर्णन किया जाएगा।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, एमपीआई इंस्टॉलेशन (वर्तमान में, एक लिनक्स क्लस्टर) के साथ सिस्टम पर SPHIRE को ठीक से स्थापित करना आवश्यक है। Http://www.sphire.mpg.de से स्पीयर और टीसीडीए 1 डेटासेट डाउनलोड करें और स्थापना निर्देशों का पालन करें: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download यह प्रक्रिया भी ईएमएएन 2 स्थापित करती है। स्पीयर वर्तमान में छवि फ़ाइलों को प्रदर्शित करने के लिए कण चयन और e2display के लिए EMAN2 के e2boxer का उपयोग करता है। कच्चे माइक्रोफ़ोग्राफ़ फिल्मों की खुराक से भारित गति सुधार के लिए, स्पीयरएयर 14 का उपयोग करता है कार्यक्रम डाउनलोड करें और स्थापना निर्देशों का पालन करें (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, ग्रिगरिएफ लैब)। परिणामस्वरूप संरचनाओं के इंटरैक्टिव विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, प्रोटोकॉल आणविक ग्राफिक्स प्रोग्राम कल्पना 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html) का उपयोग करेगा। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सुविधाओं से परिचित होने के लिए एक अच्छा ट्यूटोरियल हो सकता है fouयहां एन डी: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html स्पीयर जीयूआई से एक क्लस्टर में एक समानांतर नौकरी कैसे सबमिट करें पर निर्देश यहां पा सकते हैं: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions स्पीयर जीयूआई के समग्र संगठन और पूरे प्रोटोकॉल में वर्कफ़्लो के प्रमुख कदम चित्र 1 में दिखाए गए हैं।

1. प्रोजेक्ट: इस परियोजना के लिए लगातार पैरामीटर मान सेट करें

  1. एक टर्मिनल विंडो पर " स्प्रिअर एंड" और एन्टर कुंजी टाइप करके स्पीयर जीयूआई एप्लीकेशन को प्रारंभ करें
  2. प्रोजेक्ट सेटिंग्स पृष्ठ के संबंधित इनपुट क्षेत्रों में प्रोजेक्ट-चौड़े पैरामीटर ( जैसे, पिक्सेल आकार, कण त्रिज्या और समरूपता) को समायोजित करें और फिर इन मानों को वर्कफ़्लो के सभी अगले चरणों के लिए पंजीकृत करें।
    1. परियोजना सेटिंग्स पृष्ठ खोलने के लिए बाएं पैनल के नीचे दाईं ओर स्थित "PROJECT" आइकन पर क्लिक करें
      2. उदाहरण के लिए, यदि कण 200 ली लंबा और पिक्सेल का आकार 1.2 Å / पिक्सेल होता है तो इकाई को पिक्सल में परिवर्तित करने के लिए ध्यान रखें , तो कण का सबसे लंबा अक्ष 200 / 1.2 = ~ 166 पिक्सल और त्रिज्या 166/2 = 83 पिक्सल)।
    2. कण आकार के कम से कम 1.5 गुना "कण बॉक्स का आकार" सेट करें। बड़े प्रधान संख्या वाले विंडो आकारों से बचें इसके अलावा, याद रखें कि 3 डी शोधन एल्गोरिदम को वर्तमान में एक भी संख्याबद्ध बॉक्स आकार की आवश्यकता है।
      नोट: खिड़की में उचित सीटीएफ सुधार के लिए कण सीमा के बाहर पर्याप्त पृष्ठभूमि क्षेत्र (चुनिंदा खिड़की के भीतर कणों को स्थानांतरित करने की आवश्यकता) के चयन से प्रारंभिक सेंटरिंग त्रुटियों के लिए एक मार्जिन शामिल होना चाहिए (विशेष रूप से बड़े डिफोकस मूल्यों के लिए महत्वपूर्ण
    3. "कण बॉक्स आकार" की "CTF विंडो आकार" सेट करें कम विपरीत डेटा वाली परियोजनाओं के लिए, बिजली स्पेक्ट्रा के चिकनी अनुमान प्राप्त करने के लिए एक बड़ी विंडो का उपयोग करें।
    4. जटिल के "बिंदु-समूह समरूपता" सेट करें ( उदाहरण के लिए, "C5")। यदि लक्ष्य संरचना की समरूपता ज्ञात नहीं है, तो इसे "सी 1" (असममित) पर छोड़ दें। हालांकि, अगर किसी विशिष्ट उच्च-क्रम समरूपता को प्रसंस्करण के दौरान बाद में पहचान लिया जाता है, तो इस समरूपता को तदनुसार परिवर्तित करना और ISAC के साथ 2 डी संरेखण के बाद चरणों को दोहराएं।
    5. केडीए में "प्रोटीन आणविक द्रव्यमान" सेट करें (अनुमानित मूल्य पर्याप्त होगा)। "रजिस्टर सेटिंग्स" बटन दबाएं

2. फिल्म: नमूना के समग्र मोशन को सही करने के लिए प्रत्येक मूवी माइक्रोग्राफ के फ्रेम्स को संरेखित करें

  1. सभी मूवी micrographs के लिए, सभी फ़्रेमों के लिए एक्स / वाई-शिफ्ट की गणना करें और फिर उनकी खुराक-खुली और खुराक-वेटेड मो बनाएंTion-corrected average (चर्चा देखें) ध्यान दें कि पूर्व केवल सीटीएफ आकलन के लिए आवश्यक है क्योंकि अनुमान ढेर-भारित औसत के साथ अच्छा प्रदर्शन नहीं करता है, जबकि बाद के ढांचे के सभी अन्य चरणों के लिए उपयोग किया जाता है।
    1. "MOVIE" आइकन पर क्लिक करें और फिर "माइक्रोफ़ोग्राफ मूवी संरेखण" बटन पर क्लिक करें। निष्पादन योग्य फ़ाइल का चयन करके "निष्कासन योग्य पथ" सेट करें। एक कच्चे अनअनदीखित मूवी माइक्रोग्राफ का चयन करके और वाइल्डकार्ड "*" ( उदाहरण के लिए, TcdA1 _ *। Mrc) के साथ फाइल नामों के चर भाग की जगह "इनपुट माइक्रोग्राफ पथ पैटर्न" सेट करें। "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. निष्पादन योग्य फ़ाइल का चयन करके "समोवि एक्जीक्यूटेबल पथ" सेट करें।
    3. प्रत्येक फिल्म माइक्रोग्राफ में फ़्रेम की संख्या के लिए "मूवी फ्रेम की संख्या" सेट करें डेटा संग्रह के दौरान उपयोग किए गए मानों के लिए "माइक्रोस्कोप वोल्टेज" और "प्रति फ्रेम एक्सपोज़र" सेट करें। (एक्ज़म के लिएयदि पूर्व खुराक के बिना रिकॉर्ड किए गए 20 फ़्रेम के साथ समग्र खुराक 60 ई - / 2 है , तो प्रत्येक फ्रेम के लिए एक्सपोजर 60/20 = 3 ई - / ए 2 है ।) को संरेखित करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं प्रत्येक मूवी माइक्रोग्राफ के फ्रेम
      नोट: यह स्वचालित रूप से क्रमशः दो आउटपुट निर्देशिका बनाती है जिसमें खुराक रहित और खुराक भारित गति-सही औसत माइक्रोग्राफ होते हैं।

3. सीटीआर: सीटीएफ के डिफोकस और एसिग्माटिज्म पैरामीटर्स का आकलन करें

  1. प्रत्येक खुराक वाले औसत माइक्रोग्राफ के लिए सीटीएफ़ पैरामीटर (डिफोकस और एसिग्मेटिज्म; अन्य लोगों को उपयोगकर्ता द्वारा सेट किया गया है) का अनुमान करें
    1. "सीटीआर" आइकन पर क्लिक करें और फिर "सीटीएफ अनुमान" बटन "इनपुट माइक्रोग्राफ पथ पैटर्न" सेट करने के लिए, एक खुराक रहित मोशन-सही माइक्रोग्राफ चुनें, फिर वाइल्डकार्ड के साथ फ़ाइल नामों के चर भाग को प्रतिस्थापित करें"*"। साथ ही, "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. प्रयोगशाला में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले मूल्य (बर्फ मोटाई एक प्रमुख कारक है) और प्रयोगशाला में माइक्रोस्कोप वोल्टेज ( जैसे, 10%) के लिए "आयाम के विपरीत" सेट करें। विशिष्ट मूल्य 7 - 14% श्रेणी 17 में हैं
    3. डेटा संग्रह के दौरान "माइक्रोस्कोप गोलाकार विपथन (सीएस)" और "माइक्रोस्कोप वोल्टेज" सेट करें।
    4. क्रमशः 0.0285 और 0.285 Å -1 (40 - 4 Å) के लिए CTF मॉडल फिटिंग के लिए खोज श्रेणी की "न्यूनतम आवृत्ति" और "उच्चतम आवृत्ति" सेट करें CTF पैरामीटर का अनुमान लगाने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं
      नोट: सीटीएफ पैरामीटर निर्दिष्ट आउटपुट डायरेक्टरी में partres.txt फ़ाइल में स्वचालित रूप से संग्रहीत हो जाएगा। 112 माइक्रोग्राफ के सीटीएफ आकलन की गणना 96 कोर पर की गई थी और लीनक्स क्लस्टर पर प्रतिनिधि परिणामों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए गए ~ 3 मिनट के बाद समाप्त हो गया था।

4. खिड़की: खुराक-भारित औसत माइक्रोस्ट्रॉप्स से कण निकालें

  1. ई 2 बॉक्सर 6 के साथ माइक्रोग्राफ से मैन्युअल रूप से स्वत: या स्वचालित रूप से कणों को चुनें और समन्वयित फ़ाइलों को बनाएं, प्रत्येक में जुड़े माइक्रोग्राफ के भीतर कण xy- निर्देशांक की सूची होती है।
    1. "विंडो" आइकन पर क्लिक करें और फिर "कण उठा" बटन पर क्लिक करें E2boxer 6 को शुरू करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं और मैन्युअल रूप से या स्वचालित रूप से प्रत्येक माइक्रोग्राफ के कणों को 18 ( प्रेस देखें) दबाएं । EMAN1 फ़ाइल स्वरूप (.box) में प्रत्येक माइक्रोग्राफ के अंतिम कण निर्देशांक को स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य प्रोग्राम्स से उन्हें एएमएएनए प्रारूप में कनवर्ट करने के बाद निर्देशांक फ़ाइलों को आयात करें।
  2. खुराक-वेटेड माइक्रोग्राफ से कण की छवियों को निकालने से कण का ढेर बनायें (स्पीयर में, कण स्टैक बहुधा हैएन बस "स्टैक" कहा जाता है)
    1. प्रेस "कण निष्कर्षण" बटन। एक खुराक-वेटेड गति-सही माइक्रोग्राफ चुनकर "वाइल्ड कार्ड" * ( जैसे, टीसीडीए 1 _ *। एमआरसी) के साथ फ़ाइल नामों के चर भाग की जगह "इनपुट माइक्रोग्राफ पथ पैटर्न" निर्दिष्ट करें। इसी प्रकार, एक निर्देशांक फ़ाइल ( उदाहरण के लिए, TcdA1 _ *। बॉक्स) का चयन करके "इनपुट निर्देश पथ पथ" सेट करें। "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. CTF पैरामीटर फाइल (चरण 3.1 में उत्पादित partres.txt) का चयन करके "CTF पैरामीटर स्रोत" सेट करें। "रन कमांड" बटन दबाएं
  3. एक एकल में निकाले गए कण छवि स्टैक को मिलाएं।
    1. "कण स्टैक" बटन पर क्लिक करें "आउटपुट वर्चुअल इमेज स्टैक" का पथ एक BDB फ़ाइल पथ प्रारूप का उपयोग करके निर्दिष्ट करें ( उदाहरण के लिए, "बीडीबी: कण / स्टैक", जहां "कणों" अंक को इंगित करता हैई निर्देशिका जिसमें एक BDB डेटा बेस निर्देशिका है जिसका नाम हमेशा EMAN2DB है और "स्टैक" इस डेटाबेस के भीतर एक विशेष छवि स्टैक को संदर्भित करता है)। "Mpi_proc" से शुरू होने वाली एक निर्देशिका का चयन करके "इनपुट BDB छवि स्टैक पैटर्न" निर्दिष्ट करें और फिर वाइल्डकार्ड "*" ( जैसे कणों / mpi_proc_000 को कण / mpi_proc_ *) के साथ निर्देशिका नामों के चर भाग की जगह। "रन कमांड" बटन दबाएं

5. आईएसएसी: 2 डी में कण छवियों का वर्गीकरण

  1. कणों को संरेखित करके 2 डी कक्षा औसत की गणना करें और उनके 2 डी रूप के अनुसार क्लस्टरिंग करें।
    नोट: परिणामस्वरूप 2 डी औसत में अलग-अलग कण छवियों की तुलना में बेहतर संकेत-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) है और इस तरह डेटासेट की गुणवत्ता और विविधता का आकलन करने के साथ-साथ स्टैक से अवांछनीय छवियों को ठीक करने के लिए उपयोग किया जाता है ( जैसे, बर्फ क्रिस्टल, कार्बन-किनारों,समुच्चय, टुकड़े, और आदि ) 19 इसके अलावा, इन्हें बाद में एक प्रारंभिक 3 डी मॉडल निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाएगा।
    1. "ISAC" आइकन पर क्लिक करें और फिर "ISAC - 2D क्लस्टरिंग" बटन। निकाले गए कणों वाली स्टैक फ़ाइल का चयन करके "इनपुट छवि स्टैक" सेट करें "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. "प्रति वर्ग छवियाँ" के लिए 200 - 1000 का उपयोग करें 2 डी कक्षाओं की अपेक्षित संख्या (प्रति कक्षा में छवियों की संख्या से विभाजित कणों की कुल संख्या) पर उचित संख्या चुनें। SNR और डेटासेट के आकार के आधार पर इस पैरामीटर को समायोजित करें। यदि डेटासेट अत्यधिक शोर है तो प्रति वर्ग में सदस्यों की संख्या में वृद्धि। कम संख्या में कण उपलब्ध होने पर संख्या घटाएं।
      नोट: मेमोरी सीमाओं के कारण, बड़े डेटासेट (> 100,000 कणों) के लिए, सबसेट्स में पूर्ण डाटासेट को विभाजित किया जाता है, स्वतंत्र रूप से प्रत्येक सबसेट के लिए आईएसएसी का प्रदर्शन करता है, और गठबंधन करता हैअंत में परिणाम इस प्रसंस्करण परिदृश्य के लिए विस्तृत निर्देश http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php में दिए गए हैं।
    3. "चरण-फ्लिप" चेकबॉक्स की जांच करें इन सेटिंग्स के साथ सभी कण चित्रों को स्वचालित रूप से सिकुड़ कर प्रक्रिया को गति देने के लिए "लक्ष्य कण त्रिज्या" और "लक्ष्य कण छवि आकार" के लिए डिफ़ॉल्ट मान रखें। 2 डी कक्षा औसत की गणना करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं।
      नोट: यह कदम कम्प्यूटेशनल की मांग है और चलने का समय कणों और कक्षाओं की संख्या के साथ-साथ लक्ष्य त्रिज्या और छवि आकार में काफी बढ़ जाता है। 96 प्रक्रियाओं के साथ एक क्लस्टर पर, ~ 10,000 कणों के 2 डी वर्गीकरण लगभग 90 मिनट के बाद समाप्त हो गया
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि उनकी गुणवत्ता संतोषजनक (चर्चा देखें) बनाने के लिए परिणामस्वरूप आईएसएसी 2 डी की औसत का प्रदर्शन और नेत्रहीन रूप से निरीक्षण करें।
    1. "उपयोगिताओं" के अंतर्गत "प्रदर्शन डेटा" बटन दबाएं सेट "; आईआईएसएसी 2 डी की औसत वाली फ़ाइल का चयन करके "इनपुट फ़ाइलें" (चरण 5.1 में उत्पादित वर्ग_एवारे। एचडीएफ)। आईएसएसी द्वारा वितरित अंतिम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मान्य वर्ग की औसत प्रदर्शित करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं।
  3. मान्य वर्ग औसत के केवल कण सदस्यों सहित एक नया स्टैक बनाएं
    1. "स्टैक सब्सैट बनाएं" बटन दबाएं चरण 5.1.1 में समान स्टैक फ़ाइल को चुनकर "इनपुट छवि स्टैक" सेट करें आईएसएसी 2 डी की औसत (चरण 5.1 में उत्पादित वर्ग_एिवजेज एचडीएफ) का चयन करके "आईएसएसी औसत" सेट करें। "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें "रन कमांड" बटन दबाएं

6. विशाल: एक प्रारंभिक 3 डी मॉडल की गणना करें

  1. सभी खराब वर्ग की औसत और कणों के समान विचार (चर्चा देखें) को हटाकर और एक प्रतिनिधि की गणना करने के लिए उनका उपयोग करके कक्षा औसत (≥100 चित्र) का एक छोटा समूह चुनेंप्रायोगिक प्रारंभिक मॉडल VIPER का उपयोग करते हुए याद रखें कि चयन में प्रत्येक ~ 200-500 सदस्यों के साथ कम से कम 60-80 उच्च गुणवत्ता औसत होने चाहिए।
    1. "VIPER" आइकन पर क्लिक करें और फिर "प्रदर्शन डेटा" बटन पर क्लिक करें आईएसएसी 2 डी की औसत (चरण 5.1 में उत्पादित वर्ग_एवारे। एचडीएफ) का चयन करके "इनपुट फ़ाइलें" सेट करें। "रन कमांड" बटन दबाएं
    2. E2display के ग्राफ़िक्स विंडो पर माउस के बीच का बटन कहीं दबाएं, और पॉप-अप विंडो में "DEL" बटन को सक्रिय करें। सभी खराब वर्ग की औसत और कण के समान विचार हटाएं ( चर्चा देखें)। शेष 2 डी कक्षा की औसत को एक नई फ़ाइल में स्टोर करने के लिए "सहेजें" बटन दबाएं।
  2. चयनित आईएसएसी औसत से, बाद में 3 डी शोधन के लिए एक प्रारंभिक संदर्भ उत्पन्न करते हैं।
    1. "प्रारंभिक 3D मॉडल - RVIPER" बटन पर क्लिक करें स्क्रीनिंग क्लास का चयन करके "इनपुट इमेज स्टैक" सेट करेंऔसत (चरण 6.1 में उत्पादित) "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. ISAC चरण 5.1.3 के रूप में "लक्ष्य कण त्रिज्या" के लिए समान मूल्य का उपयोग करना सुनिश्चित करें। एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एब initio 3D मॉडल उत्पन्न करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं।
      नोट: यह कदम कम्प्यूटेशनल की मांग है और चलने का समय कणों की औसत और आकार की संख्या के साथ काफी बढ़ जाता है। 96 प्रक्रियाओं वाले क्लस्टर पर, यह नौकरी (~ 100 कक्षा औसत) ~ 15 मिनट के बाद समाप्त हो जाती है
  3. जांच लें कि परिणामस्वरूप 3 डी मॉडल को कक्षा की औसत और इसके संरचनात्मक अखंडता ( यानी कोई डिस्कनेक्ट किए गए भागों और / या दिशात्मक कलाकृतियों) को ध्यान में रखते हुए उचित है या नहीं। नक्शे को प्रदर्शित करने के लिए, कार्यक्रम का उपयोग करें कल्पना 15 इस बिंदु पर, एक मुताबिक़ प्रोटीन की क्रिस्टल संरचना या ब्याज की प्रोटीन के एक डोमेन के साथ पहली तुलना करें यदि यह मौजूद है (एक उदाहरण खंड Represe में दिखाया गया हैNtative परिणाम)
  4. इसके बाद के 3 डी शोधन के लिए, इसके आस-पास के शोर को निकालकर और मूल पिक्सेल आकार के मिलान के लिए इसे पुन: स्केल करके एक प्रारंभिक 3 डी संदर्भ और एक एडीआईटीआई 3 डी मॉडल से 3 डी मुखौटा उत्पन्न करें।
    1. "3D संदर्भ बनाएं" बटन पर क्लिक करें एबी इनिटियो 3 डी मॉडल का चयन करके "इनपुट वॉल्यूम" सेट करें (चरण 6.2 में उत्पादित औसत_विमोच्च। एचडीएफ)। "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. ISAC shrink अनुपात फ़ाइल (चरण 5.1 में उत्पादित README_shrink_ratio.txt) का चयन करके "रेस्पलेम अनुपात स्रोत" सेट करें। "रन कमांड" बटन दबाएं

7. मेरिडियन: प्रारंभिक 3D वॉल्यूम परिशोधित करें

  1. प्रारंभिक 3 डी मॉडल से शुरू होने वाले 3D वॉल्यूम को परिशोधित करें
    1. "मिरिडीन" आइकन पर क्लिक करें, फिर "3D शोधन" बटन पर क्लिक करें। सील द्वारा "इनपुट छवि स्टैक" और "आरंभिक 3D संदर्भ" सेट करेंकण स्टैक और एबी इनिटियो 3 डी मॉडल को क्रमशः (क्रमशः 5.3 और 6.4 में उत्पादित किया गया) "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. 3 डी मुखौटा फ़ाइल (चरण 6.4 में उत्पादित) का चयन करके "3 डी मुखौटा" सेट करें। हमेशा एक 3D मुखौटा का उपयोग करें, लेकिन विशेषकर विश्लेषण के शुरुआती चरण में, एक गोलाकार मुखौटा या नरम-धार वाले मुखौटा का उपयोग ढीले से गलत मास्किंग के पूर्वाग्रह को शुरू करने से बचने के संदर्भ में लगाया जाता है।
    3. "हार्ड 2 डी मुखौटा लागू करें" चेकबॉक्स को चेक करें। 20 - 25 Å के बीच कटऑफ आवृत्ति मूल्य के लिए "संकल्प शुरू" सेट करें। ध्यान रखें कि इस कटऑफ आवृत्ति के साथ एक लो-पास फिल्टर आरंभिक 3 डी संरचना के लिए प्रारंभिक मॉडल पूर्वाग्रह को कम करने के लिए लागू किया जाएगा।
    4. इस प्रक्रिया के लिए प्रयुक्त क्लस्टर के विनिर्देशों की जांच करें और फिर गीगाबाइट में उपलब्ध स्मृति में "मेमोरी प्रति नोड" सेट करें। पूरी तरह से स्वचालित ढंग से प्रारंभिक 3 डी मॉडल से शुरू होने वाले 3D वॉल्यूम को परिष्कृत करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं।
  2. बाद में तीखे चरण के लिए परिष्कृत मात्रा से नरम-धार वाला 3D मुखौटा बनाएं।
    1. "अनुकूली 3 डी मास्क" बटन पर क्लिक करें एक अनफ़िल्टर्ड आधा मात्रा (चरण 7.1 में उत्पादित) में से एक का चयन करके "इनपुट वॉल्यूम" सेट करें "आउटपुट मास्क" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. "बिनराइज़ेशन थ्रेसहोल्ड" का मान निर्धारित करें यह सुनिश्चित करने के लिए कल्पना का प्रयोग करें कि, इस विशेष दहलीज पर, शोर स्पष्ट रूप से अनफ़िल्टर्ड आधा मानचित्रों के विलायक क्षेत्र में ब्याज की मात्रा के बाहर है और प्रोटीन की सभी घनत्व अभी भी गएक दूसरे से जुड़े नरम-किनारे 3 डी मास्क बनाने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं
      नोट: परिणामस्वरूप मुखौटा का मुख्य निकाय (वोक्सल से मिलकर होता है जिसका मूल्य> 0.5 है) कण कण संरचना में कसकर फिट होना चाहिए, लेकिन फिर भी सभी घनत्वों को ब्याज में लगा देना चाहिए। नरम-किनारे गिरने से कम से कम 8-10 पिक्सेल चौड़ा होना चाहिए।
  3. 3 डी शोधन द्वारा प्राप्त दो अनफ़िल्टर्ड आधे संस्करणों को मिलाएं। फिर, डिज़ार्ट के मॉडुलन ट्रांसफर फ़ंक्शन (एमटीएफ), अनुमानित बी-कारक और एफएससी (फूरियर शैल सहसंबंध) के संकल्प के आधार पर बिजली स्पेक्ट्रम का समायोजन करके मर्ज किए गए मात्रा को तेज करें।
    1. "शार्पनिंग" बटन का चयन करें संबंधित फाइलों (वॉल्यूम_अनफिल एचडीएफ और वॉल्यूम_निफिल एचडीएफ चरण 7.1 में उत्पादित) का चयन करके "पहले अनफ़िल्टर्ड आधे-मात्रा" और "दूसरा अनफ़िल्टर्ड आधा-आकार" सेट करें। हमेशा "बी-कारक वृद्धि" का उपयोग करें आमतौर पर, ई के लिए डिफ़ॉल्ट मान रखेंअंतिम रिज़ॉल्यूशन आवृत्ति और 10 ए के बीच की सीमा का उपयोग करके इनपुट डेटासेट से बी-फॅक्टर वैल्यू का आकलन करें वैकल्पिक रूप से, एक विज्ञापन-हॉक वैल्यू निर्दिष्ट करें ( जैसे, -100)।
    2. एक FSC- आधारित फ़िल्टर लागू करने के लिए "निम्न-पास फ़िल्टर आवृत्ति" के लिए डिफ़ॉल्ट मान रखें
    3. 3D मुखौटा (चरण 7.2 में उत्पादित) का चयन करके "उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान की गई मुखौटा" सेट करें। याद रखें कि रिपोर्ट का प्रस्ताव इस मुखौटा के साथ FSC का उपयोग करके निर्धारित किया जाएगा। परिष्कृत 3D वॉल्यूम को तेज करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं
  4. ऊपर दिए गए 3D रिफ़ाइनमेंट स्टेप के अनुमान के सभी कणों के प्रक्षेपण निर्देशों से 3D एंगलियर डिस्ट्रीब्यूशन मैप उत्पन्न करें।
    1. "कोणीय वितरण" बटन पर क्लिक करें फ़ाइल को चुनकर "संरेखण पैरामीटर फाइल" सेट करें (चरण 7.1 में निर्मित अंतिम_परम। Txt), और "रन कमांड" बटन दबाएं
  5. ची के उपयोग से तेज 3D मॉडल का निरीक्षण करेंमेरा। सुनिश्चित करें कि प्राप्त समाधान ( संरचना देखें) पर विचार उचित लगता है ।
  6. नेत्रहीन काइमरी का उपयोग करके कल्पना का निरीक्षण किया। सत्यापित करें कि वितरण लगभग संपूर्ण 3D कोणीय अंतरिक्ष को कवर करता है। ध्यान रखें कि, सममित ढांचे के लिए, वितरण अद्वितीय असममित त्रिकोण के भीतर सीमित है।

8. सॉर्ट 3 डी: अत्यधिक चर क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करके 3 डी विविधता को सॉर्ट करें

  1. 3D शोधन में उपयोग किए गए कण स्टैक से 3 डी परिवर्तनशीलता मानचित्र की गणना करें
    1. "SORT3D" आइकन पर क्लिक करें और फिर "3D परिवर्तनीयता अनुमान" बटन पर क्लिक करें 3 डी शोधन कदम 7.1.1 को दी गई स्क्रीनिंग कण स्टैक का चयन करके "इनपुट इमेज स्टैक" सेट करें। "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. "अनुमानों की संख्या" के लिए डिफ़ॉल्ट मान रखें
      नोट: कोणीय पड़ोसी से चित्रहर 3 डी प्रोजेक्शन कोण पर 2 डी विचरण का आकलन करने के लिए हुड का उपयोग किया जाएगा संख्या जितनी बड़ी होगी, कम शोर का अनुमान है, लेकिन कम संकल्प और घूर्णी कलाकृतियों को अधिक स्पष्ट किया जाता है।
    3. "CTF का उपयोग करें" चेकबॉक्स देखें "रन कमांड" बटन दबाएं
  2. नीचे 3 डी क्लस्टरिंग चरण के लिए फ़ोकस मुखौटा बनाने के लिए 3D परिवर्तनीयता मानचित्र का उपयोग करें।
    1. "बाइनरी 3 डी मास्क" बटन का चयन करें 3D परिवर्तनीयता मानचित्र (चरण 8.1 में उत्पादित) को चुनकर "इनपुट वॉल्यूम" सेट करें "आउटपुट मास्क" के लिए फ़ाइल पथ निर्दिष्ट करें
    2. कल्पना के "वॉल्यूम व्यूअर" में "स्तर" फ़ील्ड के आउटपुट का उपयोग करके "बिराइनरण थ्रेशोल्ड" सेट करें "रन कमांड" बटन दबाएं
  3. संरचनात्मक रूप से अत्यधिक चर क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करके समरूप संरचनात्मक समूहों में कण छवियों को क्रमबद्ध करें।
    1. "3D क्लस्टरिंग - RSORT3D" बटन दबाएं3 डी शोधन की आउटपुट निर्देशिका (चरण 7.1 में उत्पादित) चुनकर "इनपुट 3D परिष्करण निर्देशिका" सेट करें। "आउटपुट डायरेक्टरी" के लिए पथ निर्दिष्ट करें
    2. नरम-धार वाले 3 डी मुखौटा (चरण 7.2 में उत्पादित) का चयन करके "3D मुखौटा" सेट करें। Binarized 3D परिवर्तनशीलता मानचित्र (चरण 8.2 में उत्पादित) का चयन करके "फोकस 3D मुखौटा" सेट करें।
    3. बड़े डेटासेट के लिए, "छवि प्रति समूह" के लिए कम से कम 5,000-10,000 का उपयोग करें ध्यान रखें कि कार्यक्रम हमेशा इस सेटिंग से कम प्रति समूह की छवियों की संख्या रखता है। 3 डी समूहों की अपेक्षित संख्या ("छवि प्रति समूह" मूल्य से विभाजित कणों की कुल संख्या) डेटासेट, एसएनआर, और विविधता की डिग्री पर विचार करके मूल्य समायोजित करें। ~ 5-10 के शुरुआती 3 डी समूह से शुरू करें, यदि कणों की पर्याप्त संख्या उपलब्ध है, जब तक डेटासेट में अलग-अलग संरचनात्मक राज्यों की अपेक्षा नहीं की जाती है।
    4. "सबसे छोटा समूह आकार" के लिए कम से कम 3,000-5,000 कणों का उपयोग करेंध्यान दें कि कार्यक्रम "सबसे छोटा समूह आकार" की सेटिंग के मुकाबले कम संख्या में छवियों के समूह में शामिल नहीं करेगा। 3D क्लस्टरिंग को चलाने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं
      नोट: RSORT3D को दो चरणों में विभाजित किया गया है। पहला "सॉर्ट 3 डी" चरण 3 डी विविधता से बाहर है इसके बाद, यह प्रत्येक समरूप संरचनात्मक समूह की मात्रा को पुनर्रचना करता है, जो 3 डी के परिशोधन कदम से निर्धारित 3D संरेखण पैरामीटर का उपयोग करता है। दूसरा "rsort3d" चरण दो स्वतंत्र सॉर्टिंग रनों की दो-तरफा तुलना करके प्रत्येक समूह के प्रोड्यूसबिलबल सदस्यों को पता चलता है। फिर, यह केवल पुनरुत्पादित रूप से सौंपा कणों का उपयोग करके सजातीय ढांचे का पुनर्निर्माण करता है। 96 कोर के साथ एक क्लस्टर पर, यह काम (~ 8,000 कण, 352 बॉक्स आकार) लगभग 3 घंटे बाद समाप्त हो गया।
  4. कार्यक्रम समाप्त होने के बाद, एक समानतीय 3D समूह का चयन करने के लिए कल्पना का उपयोग करें। सबसे अधिक स्पष्ट रिज़ॉल्यूशन की संरचना का चयन करें, जो आमतौर पर सबसे पो के साथ जुड़ा हुआ हैदलदल समूह सुनिश्चित करें कि चयनित संरचना हित के प्रोटीन ( चर्चा देखें) के 2 डी कक्षा औसत और जैविक पहलुओं को ध्यान में रखते हुए नेत्रहीन उचित है। यदि समान खंड में लगभग समान संरचना वाले अन्य संस्करण हैं, तो उन्हें एक एकसनी 3D समूह से उभरकर देखें।
  5. सबसे सजातीय 3 डी समूह के कण सदस्यों (उच्चतम संकल्प के साथ) के खिलाफ स्थानीय शोधन करना।
    1. "स्थानीय सबसेट रिफ़ाइनमेंट" बटन पर क्लिक करें चयनित समूह के कण आईडी ( उदाहरण के लिए, चरण 8.3 में उत्पादित क्लस्टर0.txt) वाली पाठ फ़ाइल का चयन करके "सबसेट टेक्स्ट फ़ाइल पथ" सेट करें। पिछले 3 डी शोधन की आउटपुट निर्देशिका (चरण 7.1 में उत्पादित) का चयन करके "3D शोधन निर्देशिका" सेट करें।
    2. "पुनरारंभ पुनरारंभरण" को उस स्थान पर सेट करें जहां उच्चतम रिज़ॉल्यूशन पिछले 3 डी शोधन में हासिल किया गया है। दबाएंकणों की चयनित जनसंख्या के स्थानीय शोधन करने के लिए "कमांड चलाएं" बटन
  6. चरण 7.2 के समान, स्थानीय उपसंशोधन शोधन द्वारा पुननिर्मित एक अनफ़िल्टर्ड अंतिम आधा मात्रा से नरम-धार वाला 3D मुखौटा बनाएं।
  7. चरण 7.3 के समान, स्थानीय बहिष्कृत शोधन द्वारा प्राप्त किए गए दो अनफ़िल्टर्ड अंतिम आधे संस्करणों को मिलाएं और मर्ज किए गए वॉल्यूम को तेज करें। हालांकि, तेज बार इस समय फ़िल्टर न करें।
    नोट: चरण 8.4 में विविधता विश्लेषण, तुलनात्मक संकल्प पर कई अलग-अलग राज्यों को इंगित करना चाहिए, किसी एक को अलग-अलग राज्यों को स्वतंत्र रूप से परिष्कृत करना चाहिये।

9. स्थानीय: अंतिम 3D वॉल्यूम के स्थानीय संकल्प का आकलन करें

  1. कणों के एकसमान समूह से प्राप्त 3 डी की मात्रा के स्थानीय संकल्प का आकलन करें।
    1. "LOCALRES" आइकन पर क्लिक करें और फिर "स्थानीय संकल्प" बटन दबाएं। "पहले आधा मात्रा" और "दूसरा आधा सेट करें"-वॉल्यूम "स्थानीय उपसंबद्ध परिष्करण (चरण 8.5 में उत्पादित) के अनफ़िल्टर्ड अंतिम आधे संस्करणों का चयन करके चरण 8.6 में उत्पादित नरम-धार वाले 3 डी मुखौटा का चयन करके" 3D मास्क "सेट करें।" आउटपुट वॉल्यूम "के लिए फ़ाइल पथ निर्दिष्ट करें ।
    2. "FSC विंडो आकार" के लिए 7 पिक्सल का डिफ़ॉल्ट मान रखें याद रखें कि यह सेटिंग विंडो के आकार को परिभाषित करती है जहां स्थानीय-वास्तविक-अंतरिक्ष सहसंबंध गणना की जाती है; बड़ी खिड़की के आकार स्थानीय संकल्पकता की कीमत पर चिकनी संकल्प नक्शे का उत्पादन करते हैं।
    3. रिज़ॉल्यूशन मानदंड के लिए "रेज़ोल्यूशन कट ऑफ" का डिफ़ॉल्ट मान 0.5 रखें।
      नोट: प्रत्येक voxel के लिए, कार्यक्रम स्थानीय संकल्प की आवृत्ति के रूप में रिपोर्ट करेगा जिस पर स्थानीय FSC चयनित रिज़ॉल्यूशन सीमा से नीचे चला जाता है। 0.5 से कम थ्रेशोल्ड की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि कम सहसंबंध मूल्यों में उच्च सांख्यिकीय अनिश्चितता है। इसलिए, संबंधित स्थानीय संकल्प वॉक्सल्स के बीच दृढ़ता से भिन्न होंगे
    4. "ओवरा के लिएLl संकल्प ", स्थानीय सबसेट शोधन (चरण 8.7) के बाद धारण करने में अनुमानित पूर्ण संकल्प सेट करें। वॉल्यूम के स्थानीय समाधान की गणना करने के लिए" रन कमांड "बटन दबाएं।
  2. 3 डी स्थानीय रिज़ॉल्यूशन नक्शे का उपयोग करके स्थानीय सबसेट रिफाइनमेंट के बाद 3 डी लोकल फ़िल्टर को तीव्रता वाले वॉल्यूम पर लागू करें।
    1. "3D लोकल फ़िल्टर" बटन पर क्लिक करें तीखे लेकिन अनफ़िल्टर्ड 3D वॉल्यूम (चरण 8.7 में उत्पादित) का चयन करके "इनपुट वॉल्यूम" सेट करें। इसी प्रकार, "स्थानीय रिज़ॉल्यूशन फ़ाइल" और "3 डी मुखौटा" सेट करें (क्रमशः 9.1 और 8.6 में उत्पादित)। याद रखें कि 3 डी मुखौटा उस क्षेत्र को परिभाषित करता है जहां स्थानीय फ़िल्टरिंग लागू होगी। "आउटपुट वॉल्यूम" के लिए फ़ाइल पथ निर्दिष्ट करें 3D स्थानीय फ़िल्टर को लागू करने के लिए "रन कमांड" बटन दबाएं
  3. अंतिम 3 डी मॉडल और 3 डी स्थानीय संकल्प नक्शे का निरीक्षण करने के लिए कल्पना का उपयोग करें (चरण 9,2 और 9.1 में उत्पादित, respectively)। स्थानीय संकल्प के अनुसार 3D वॉल्यूम को रंगाने के लिए "सतह का रंग" विकल्प चुनें। ध्यान रखें कि स्थानीय संकल्प का वितरण चिकना होना चाहिए ( चर्चा देखें)।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को Photorhabdus luminescens टीसी परिसर (टीसीडीए 1) 20 , 21 , 22 के ए घटक के 112 प्रत्यक्ष डिटेक्टर फिल्मों से शुरू किया गया था। यह डाटासेट सीएस-रिकॉर्डेड इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोप पर उच्च-चमक क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक (एक्सएफईजी) के साथ दर्ज किया गया था, जो 300 केवी के त्वरण वोल्टेज पर संचालित होता है। नमूने पैमाने पर 1.14 ए के पिक्सेल आकार में 60 ई - / ए -2 की कुल खुराक के साथ छवियों को स्वचालित रूप से अधिग्रहण किया गया था। मूवी फ्रेम (प्रोटोकॉल चरण 2 ) के संरेखण के बाद, परिणामी गति-सुधारित औसत में उच्च-रिज़ॉल्यूशन ( चित्रा 2 ए ) तक पहुंचने वाले थियो रिंगों के एओट्रॉफिक थे। व्यक्तिगत कण आसानी से दिखाई और अच्छी तरह से अलग थे ( चित्रा 2 बी )। कणों को तब ई-बॉक्सर के झुंड टूल का उपयोग करके चुना गयाLass = "xref"> 18 ( प्रोटोकॉल चरण 4.1 )। इस स्थिति में, अधिक उपयुक्त विकल्प ( चित्रा 2 सी ) का उपयोग करके एक उचित सीमा तय की गई थी। 112 डिजिटल माइक्रोग्राफ 9,652 कण मिले थे। निकाले गए छवियों (प्रोटोकॉल चरण 4.2 ) के अधिकांश में अच्छी तरह से परिभाषित कण थे और उनके बॉक्स आकार की सिफारिश की गई थी ( चित्रा 2 डी ), कण आकार से 1.5 गुना अधिक है। इसके बाद, आईएसएसी का उपयोग करके, 2 डी विविधता विश्लेषण किया गया था (प्रोटोकॉल चरण 5 )। यह 98 वर्गों की औसत ( चित्रा 3 ए ) उत्पन्न हुई । इन 2 डी कक्षा की औसत का उपयोग करते हुए, एक एबी इनिटियो मॉडल का इंटरमीडिएट रिजोल्यूशन ( चित्रा 3 बी ) पर VIPER (प्रोटोकॉल चरण 6 ) का उपयोग करके गणना की गई थी। यह मॉडल TcdA1 की क्रिस्टल संरचना के साथ उत्कृष्ट समझौता दिखाता है जो पहले 3. 9 ए संकल्प 22 ( चित्रा 3 सी ) पर हल हुआ था। यह अ initio मॉडल एक प्रारंभिक tem के रूप में इस्तेमाल किया गया था प्लेट के लिए 3 डी शोधन (मेरिडेन), 3.5 ए (0.143 मानदंड) पुनर्निर्माण (प्रोटोकॉल चरण 7 ) केवल ~ 40,000 असममित इकाइयों ( चित्रा 4 ) से उपज। यह निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन मानचित्र 24 घंटे के भीतर प्राप्त किया गया था, जो कि कई कोर से लाभ वाले वर्कफ़्लो के चरण के लिए 96 सीपीयू तक का उपयोग करता है।

3 डी परिवर्तनशीलता विश्लेषण ( प्रोटोकॉल चरण 8) के लिए, प्रत्येक समूह में केवल 2,000 कण छवि चरण 8.3.3 ( अर्थात 5 आरंभिक 3 डी समूह के साथ शुरू होती है) और 200 छवियों के लिए चरण 8.3.4 में सबसे छोटी समूह आकार के लिए उपयोग की गई थी कणों की छोटी संख्या (~ 10,000) विश्लेषण ने मुख्य रूप से परिसर के एन-टर्मिनल क्षेत्र में स्थानीयकृत लचीलेपन का खुलासा किया जिसमें शुद्धिकरण ( चित्रा 5 ए ) के लिए इस्तेमाल किया गया उनका टैग शामिल है। दरअसल, बारह एन टर्मिनल अवशेषों और उनका टैग TcdA1 के पहले प्रकाशित क्रिस्टल संरचना में हल नहीं किया गया"> 22 और यह शायद सबसे ज्यादा बेदखल क्षेत्र मौजूदा क्रायो-ईएम घनत्व में लचीलापन के कारण अनसुलझे रह गया है। संभवतः इसके लचीलेपन के कारण अतिरिक्त परिवर्तनशीलता रिसेप्टर बाध्यकारी डोमेन और बीसी-बाध्यकारी डोमेन ( चित्रा 5 ए ) में हुई थी। संरचना का संतोषजनक समाधान और डाटासेट के बजाय छोटे आकार, इस विविधता को सहनीय होने का निर्णय लिया गया था और इसलिए एक केंद्रित 3 डी वर्गीकरण 23 का प्रदर्शन नहीं किया गया था। अंत में, अंतिम घनत्व के मानचित्र का स्थानीय संकल्प गणना (प्रोटोकॉल चरण 9.1, चित्रा 5b ) और तीव्रता वाला 3 डी नक्शा स्थानीय रूप से फ़िल्टर्ड (प्रोटोकॉल 9.2 कदम) था । इस गुणवत्ता का एक वॉल्यूम Coot 24 या किसी अन्य शोधन उपकरण ( चित्रा 6 ) का उपयोग करके नोवो मॉडल बिल्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

आकृति 1
<मजबूत> चित्रा 1: छवि प्रसंस्करण का उपयोग कर SPHIRE। ( ए ) स्पीयर सॉफ्टवेयर पैकेज का जीयूआई वर्कफ़्लो का एक विशिष्ट कदम GUI ("कार्यप्रवाह कदम") के बाईं ओर संबंधित चित्रचित्र को चुनकर सक्रिय किया जा सकता है। वर्कफ़्लो के इस चरण से जुड़े कमांड और उपयोगिताओं GUI के केंद्रीय क्षेत्र में दिखाई देंगे। एक आदेश को चुनने के बाद, संबंधित पैरामीटर जीयूआई के सही क्षेत्र पर दिखाए जाते हैं। उन्नत पैरामीटर को आमतौर पर पूर्व निर्धारित डिफ़ॉल्ट मानों के संशोधन की आवश्यकता नहीं होती है। ( बी ) स्पीयर जीयूआई का उपयोग करके एकल कण छवि प्रसंस्करण के कार्यप्रवाह में चरण। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: मोशन सुधार और आंशिकले एक्सट्रैक्शन ( ए , बी ) 1.7 माइक्रोन के डिफोकस पर दर्ज की गई विशेष उच्च गुणवत्ता, कम खुराक, बहाव-सही डिजिटल माइक्रोग्राफ। बिजली के स्पेक्ट्रम (ए) और 2 डी छवि ( बी ) में अच्छी तरह से देखे जाने वाले कणों में 2.7 Å के संकल्प के लिए विस्तार करने वाले आईओट्रॉपीक थान रिंगों को ध्यान दें। ( सी ) कण चयन e2boxer का उपयोग कर हरे रंग की मंडलियां चयनित कणों का संकेत देती हैं ( डी ) खुराक भारित माइक्रोग्राफ से निकाले गए विशिष्ट कच्चे कण। स्केल सलाखों = 20 एनएम इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: 2 डी क्लस्टरिंग और प्रारंभिक मॉडल पीढ़ी। ( ए ) 2 डी कक्षा की औसत गैलरी, बहुमत वाले पक्ष विचारों के साथ ओ क कण स्केल बार = 20 एनएम ( बी ) टीसीडीए 1 के एबी इनिटियो 3 डी मानचित्र को संदर्भ-मुक्त वर्ग औसत से आरवीआईपीईआर प्राप्त करना। ( सी ) टीसीडीए 1 क्रिस्टल संरचना (रिबन) (पीडीबी-आईड 1VW1) की प्रारंभिक क्रायो ईएम घनत्व (पारदर्शी ग्रे) में कठोर शरीर फिटिंग। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: टीसीडीए 1 का क्रायो-ईएम 3 डी संरचना। ( ए , बी ) टीसीडीए 1 का अंतिम 3.5 ए घनत्व का नक्शा ~ 9,500 कण छवियों का उपयोग करके गणना किया गया है: ( ए ) तरफ और ( बी ) शीर्ष दृश्य ( सी ) α-हेलिक्स और एक बी-चादर के लिए क्रायो-ईएम घनत्व के प्रतिनिधि क्षेत्रोंArge.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: परिवर्तनशीलता विश्लेषण और स्थानीय संकल्प ( ए ) तेज TcdA1 cryo-EM नक्शा (ग्रे) और परिवर्तनशीलता मानचित्र (हरा) की सतह। बेहतर स्पष्टता के लिए, परिवर्तनशीलता का नक्शा न्यूनतम पास 30 Å तक फ़िल्टर्ड था। ( बी ) स्थानीय संकल्प (ए) के अनुसार टीसीडीए 1 तीक्ष्ण क्रायो-ईएम नक्शा रंग की सतह प्रतिपादन। उच्च परिवर्तनशीलता और कम स्थानीय संकल्प के क्षेत्रों के बीच सामरिक समझौता ध्यान दें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्र 6: 3 डी मॉडकुट का उपयोग करते हुए टीसीडीए 1 की एल बिल्डिंग क्रायो-ईएम घनत्व और परमाणु मॉडल के प्रतिनिधि क्षेत्रों को एक α-हेलिक्स के लिए दिखाया गया है। परमाणु मॉडल Coot का उपयोग करके नो नोवो बनाया गया था इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

एकल कण cryo-EM हाल के वर्षों में तेजी से विकास दिखाया है और प्रमुख जैविक महत्व 25 के macromolecular परिसरों के कई परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को वितरित किया है। वर्तमान में क्षेत्र में प्रवेश करने वाले बड़ी संख्या में नौसिखिए उपयोगकर्ताओं को समर्थन देने के लिए, हमने एकल कण छवि विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म स्पीयर विकसित किया है और यहां फिल्म संरेखण, कण चयन, सीटीएफ आकलन, प्रारंभिक मॉडल सहित पूरे वर्कफ़्लो के लिए एक चलने वाला प्रोटोकॉल पेश किया है गणना, 2 डी और 3 डी विविधता विश्लेषण, उच्च संकल्प 3 डी शोधन और स्थानीय संकल्प अनुमान और फ़िल्टरिंग

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल ब्याज की प्रोटीन के cryo-EM micrographs और SPHIRE के स्टैंड-अलोन जीयूआई द्वारा उपलब्ध कराए गए कम्प्यूटेशनल औजारों की सहायता से 3 डी संरचना निर्धारण के लिए एक संक्षिप्त गाइड के रूप में लक्षित है।

वर्कफ़्लो की मुख्य विशेषता यह है कि सबसे ज्यादाप्रक्रियाओं को केवल एक बार चलाने की जरूरत है, क्योंकि वे प्रत्यावर्तनीयता 1 9 द्वारा मान्यता की अवधारणा पर भरोसा करते हैं और पैरामीटर टेक्कींग की आवश्यकता नहीं होती है। यह स्वत: प्रमाणीकरण तंत्र अन्य सॉफ्टवेयर संकुलों के ऊपर स्पीयर का मुख्य लाभ है क्योंकि इसके परिणाम के रूप में साथ ही प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और, सबसे महत्वपूर्ण, एक स्वीकार्य कम्प्यूटेशनल लागत पर प्राप्य प्राप्य होते हैं। पाइपलाइन अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए अपने स्वयं के तरीकों के साथ और अधिक स्वतंत्र सत्यापन और मूल्यांकन करने के लिए नैदानिक ​​जानकारी के अतिरिक्त धन प्रदान करता है। फिर भी, एक नौसिख़ उपयोगकर्ता जो संरचनात्मक जीव विज्ञान और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में कम से कम मौलिक सैद्धांतिक पृष्ठभूमि वाले हैं, स्वयं के डेटा और स्वचालित सत्यापन प्रक्रियाओं के उपयोग से निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए।

हालांकि, निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करना हमेशा सीधा नहीं होता है और परिणाम बहुत नमूना की गुणवत्ता और इनपुट डेटा पर निर्भर करेगाए। यहां प्रस्तुत प्रक्रियाओं के लिए यह माना जाता है कि उच्च गुणवत्ता वाले अनारक्षित कच्चे ईएम फिल्मों की पर्याप्त संख्या उपलब्ध है, उनकी औसत के साथ स्पष्ट रूप से स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है सजातीय और बेतरतीब ढंग से केंद्रित कणों। सामान्य तौर पर, अणु के समरूपता, आकार या संपूर्ण आकार के संबंध में कोई प्रतिबंध नहीं है, लेकिन कम आणविक भार एक सीमित कारक हो सकता है, खासकर जब प्रोटीन में एक अनन्य गोलाकार आकार होता है। आमतौर पर, उच्च बिंदु-समूह समरूपता वाले बड़े, सु-ऑर्डर किए गए कणों का विश्लेषण कम मांग है। इसलिए, यह जोरदार ढंग से नौसिखिए उपयोगकर्ताओं के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से क्रू-ईएम डेटासेट के साथ चलाने के लिए अनुशंसा करता है। या तो स्पियर ट्यूटोरियल डेटा (http: /sphire.mpg.de) या एक EMPIAR प्रस्तुत डेटासेट (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) कच्ची फिल्मों के साथ एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है ।

जब स्वयं का डेटा प्रसंस्करण होता है, तो यह बहुत संभावना है कि कुछ डेटासेट या कुछ छवियां कुछ विशेषताओं को संतुष्ट नहीं करती हैंTy मापदंड इस संदर्भ में, वर्कफ़्लो के प्रमुख चरणों के लिए प्रोग्राम द्वारा निष्पादित स्वचालित स्थिरता और पुनरुत्पादन की जांच के अतिरिक्त, यह अभी भी सिफारिश करता है कि उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल के कुछ "चेकपॉइंट" पर नज़र आए, खासकर अगर अंतिम पुनर्निर्माण संतोषजनक नहीं है

फिल्म संरेखण (प्रोटोकॉल चरण 2 ) और सीटीएफ आकलन (प्रोटोकॉल चरण 3 ) के बाद पहली दृश्य निरीक्षण माइक्रोग्राफ स्तर पर किया जा सकता है। परिणामस्वरूप गति-सुधारित औसत स्पष्ट रूप से स्पष्ट और स्पष्ट रूप से पृथक एकल कणों को दिखाना चाहिए और उनकी शक्ति स्पेक्ट्रा को स्पष्ट रूप से दिखना चाहिए, आइसोट्रोपिक थान रिंग्स। स्थानिक आवृत्ति जो वे दिखाई दे रहे हैं, ज्यादातर मामलों में, सर्वोच्च संकल्प जिसे संरचना सिद्धांत रूप में अंततः निर्धारित किया जा सकता है। पर्याप्त गुणवत्ता के एक गति-सही औसत के उदाहरण और इसके पावर स्पेक्ट्रम अनुभाग और # में दिखाए गए हैं34; प्रतिनिधि परिणाम "। बाहरी छवियां जिन पर अंतिम परिणाम पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है, उन्हें SPHIRE के बहाव और सीटीएफ मूल्यांकन GUI टूल (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php) की मदद से हटाया जा सकता है।

कण स्क्रीनिंग के संबंध में, स्पीयर पाइपलाइन में महत्वपूर्ण कदम ISAC (प्रोटोकॉल चरण 5.2) का उपयोग कर 2 डी वर्गीकरण है। यहां, उपयोगकर्ता को यह नियंत्रित करना चाहिए कि प्रोग्राम द्वारा स्वचालित रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने वाली 2 डी कक्षा की औसत स्वचालित रूप से आकलन के लिए पर्याप्त दूरी के तरीकों को अपनाने के लिए कोयोलर स्पेस को कवर करती है। अगर क्लास एवरेज की गुणवत्ता संतोषजनक (शोर और / या धुँधली छवियों) नहीं है और / या पुन: उत्पादक वर्ग की औसत संख्या की संख्या बहुत कम है, तो ऑटो-पिकिंग की गुणवत्ता में सुधार, डेटासेट इमेजिंग को अनुकूलित करने या नमूना तैयार करने पर विचार करें। ज्यादातर मामलों में, एक डाटासेट से विश्वसनीय पुनर्निर्माण की गणना करना संभव नहीं है जो कि 2 डी कक्षा की औसत औसत प्राप्त नहीं करता है। उच्च गुणवत्ता 2 डी कक्षा एवे के उदाहरणक्रोध "प्रतिनिधि परिणाम" अनुभाग में दिखाए गए हैं

स्वचालित तरीके से आरवीआईपीईआर (प्रोटोकॉल चरण 6.1 ) का उपयोग करके एक विश्वसनीय प्रारंभिक 3 डी मॉडल प्राप्त करने के लिए कम से कम 100 कक्षा औसत की आवश्यकता है। इस चरण के लिए, उपयोगकर्ता को उच्चतम गुणवत्ता के साथ औसत का चयन करना चाहिए और संभवतः कण के कई अलग-अलग झुकावों को शामिल करना चाहिए। प्रारंभिक मॉडल की गुणवत्ता बाद के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी शोधन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है।

अन्य सॉफ़्टवेयर संकुल में, "बेड़े" कण 8 , 9 को हटाने के लिए कभी-कभी 3 डी वर्गीकरण किया जाता है। हालांकि, स्पीयर में, इन कणों में से अधिकांश अपने आप ही आईएसएसी का इस्तेमाल करते हुए 2 डी वर्गीकरण के दौरान समाप्त हो जाते हैं। इस प्रकार, 3 डी सॉर्टिंग के कम्प्यूटेशनल गहन चरण को केवल अगर पुनर्निर्माण और 3 डी वैरिएबिलिटी विश्लेषण डेटासेट की विविधता दर्शाते हैं, तो यह अनुशंसा की जाती है।

सबसे महत्वपूर्ण बात, उपयोगकर्ता को ध्यान से परिणामस्वरूप 3 डी वॉल्यूम का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करना चाहिए (प्रोटोकॉल 9.3 चरण ), और पुष्टि करें कि संबंधित घनत्व की विशेषताएं नाममात्र संकल्प के साथ अच्छी तरह सहमत हैं। <9 Å के एक संकल्प पर, α-helices के अनुरूप रॉड-जैसी घनत्व दिखाई दे। एक संकल्प <4.5 Å पर, β-शीट में किस्में के अनुरूप घनत्व सामान्य रूप से अलग होते हैं और भारी अमीनो एसिड दिखाई देते हैं। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र (<3 Å) स्पष्ट रूप से स्पष्ट साइड चेन दिखाना चाहिए, इस प्रकार इस प्रकार एक सटीक परमाणु मॉडल का निर्माण करने की अनुमति हो।

तिथि से प्राप्त परिणाम दर्शाते हैं कि, स्पीयर के स्वचालित प्रजनन परीक्षणों और न्यूनतम दृश्य निरीक्षण की सहायता से, वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर किसी भी प्रकार के एकल कण क्रायो-ईएम परियोजना पर लागू होता है। प्रत्येक प्रसंस्करण चरण के प्रतिनिधि परिणाम TcdA1 के पुनर्निर्माण के लिए दिखाए जाते हैंPhotorhabdus luminescens 21 , जो निकट-परमाणु संकल्प को हल किया गया है इसी तरह की गुणवत्ता के घनत्व के नक्शे का उपयोग नवा रीढ़ की ट्रेसिंग के साथ-साथ पारस्परिक या वास्तविक-स्थान शोधन द्वारा विश्वसनीय परमाणु मॉडल के निर्माण के लिए किया जा सकता है, और इस प्रकार जटिल आणविक तंत्र की समझ के लिए एक ठोस संरचनात्मक ढांचा प्रदान करता है।

अभिलेख कोड:

ईएम संरचना और अनप्रोसेड फिल्मों के निर्देशांक को क्रमशः इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा बैंक और इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी पाइलट इमेज आर्काइव में क्रमशः संख्या ईएमडी -3645 और एएमपीआईएआर -100 9 8 के तहत जमा किया गया है।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

हम डी। रोधर को धन्यवाद प्रदान करते हैं, जो हमें टीसीडीए 1 माइक्रोग्राफ प्रदान करते हैं। हम ईएमएएन 2 अवसंरचना के चल रहे समर्थन के लिए स्टीव लडटके का धन्यवाद करते हैं। यह काम मैक्स प्लैंक सोसाइटी (एसआर) और यूरोपीय परिषद के यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (एफपी 7 / 2007-2013) (अनुदान संख्या 615 9 4) (एसआर के अधीन) और राष्ट्रीय संस्थानों पीएपी के लिए स्वास्थ्य R01 GM60635)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPHIRE Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas  http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera University of California, San Francisco http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur Janelia Farm Research Campus, Ashburn http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot MRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridge http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2 Baylor College of Medicine, Houston http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 cores Max Planck Institute of Molecular Physiology Linux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope  FEI 300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detector FEI
EPU (automated data acquisition software) FEI https://www.fei.com/software/epu/

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Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M., Merino, F., Voicu, H., Huang, Z., Penczek, P. A., Raunser, S., Gatsogiannis, C. High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE. J. Vis. Exp. (123), e55448, doi:10.3791/55448 (2017).

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