Summary
تقدم هذه الورقة بروتوكول لمعالجة الصور البرد إم باستخدام مجموعة البرامج سفير. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على ما يقرب من جميع المشاريع إم الجسيمات واحد التي تستهدف قرار شبه الذرية.
Abstract
سفير (سباركس للالمجهر الإلكتروني عالية الدقة) هو رواية مفتوحة المصدر، مجموعة برامج سهلة الاستعمال لمعالجة شبه الآلي من الجسيمات الإلكترونية واحدة البرد المجهري (البرد إم) البيانات. بروتوكول المعروضة هنا يصف بالتفصيل كيفية الحصول على بنية قرار شبه الذرية بدءا من البرد ميك الصور المجهرية من خلال توجيه المستخدمين من خلال جميع الخطوات من خط أنابيب تحديد هيكل الجسيم واحد. يتم التحكم في هذه الخطوات من واجهة المستخدم الرسومية سفير الجديدة وتتطلب الحد الأدنى من تدخل المستخدم. باستخدام هذا البروتوكول ، وقد استمدت بنية Å 3.5 من TcdA1، مجمع تكس تس من لومينزنس فوتورهابدوس ، فقط من 9500 جزيئات واحدة. وهذا النهج مبسطة تساعد المستخدمين المبتدئين دون خبرة معالجة واسعة ومعلومات هيكلية مسبقة ، للحصول على نماذج ذرية خالية من الضوضاء وغير متحيز من المجمعات الجزيئات المنقى في حالتهم الأصلية.
Introduction
بعد تطوير التكنولوجيا الكاشف الإلكترون المباشر، والتقدم الملحوظ في الجسيمات واحد كريو-إم حاليا إعادة تشكيل البيولوجيا الهيكلية 1 . وبالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية، تتطلب هذه التقنية كمية صغيرة فقط من مادة البروتين دون الحاجة إلى التبلور، بينما تفرض في الوقت نفسه قيودا أقل فيما يتعلق بنقاء العينة، ولا تزال تسمح بتحديد الهياكل عند الحل شبه الذري. الأهم من ذلك، يمكن أن تكون تركيبات أو ولايات مختلفة الآن مفصولة حسابيا ويمكن تحديد هيكلية من مختلف التوافقات على مستوى غير مسبوق من التفاصيل. في الآونة الأخيرة، يمكن أن تنتج خرائط الكثافة من الجزيئات الصعبة في القرارات التي تسمح دي نوفو بناء نموذج، وبالتالي فهم عميق من طريقة عملها 2 ، 3 ، 4 ، 5.
تتوفر مجموعة واسعة من حزم برامج معالجة الصور في مجتمع 3DEM (3D إليكترون ميكروسكوبي) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ومعظمها قيد التطوير المستمر. وقد تم التوصل إلى قرار شبه الذرية للبروتينات التي تظهر الأوزان الجزيئية المختلفة والتناظر مع العديد من حزم البرامج المختلفة، بما في ذلك EMAN2 6 ، إيماجيك 7 ، فريلين 8 ، ريليون 9 ، سبايدر 10 ، و سباركس 11 . وتتطلب كل حزمة مستوى مختلفا من خبرات المستعملين وتوفر مستوى مختلفا من توجيهات المستعملين والأتمتة والتمدد. وعلاوة على ذلك، في حين أن بعض البرامج توفر بيئات كاملة لتسهيل جميع خطوات تحليل الصور، فإن بعضها الآخر يهدف إلى تحسين المهام المحددة، مثل صقل معلمات المحاذاة بدءا من r المعروفةهيكل الإيجارات. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من المنصات، بما في ذلك أبيون 12 و سسيبيون 13 ، التي توفر خط أنابيب معالجة واحد يدمج النهج والبروتوكولات من حزم البرامج المختلفة المذكورة أعلاه.
للمساهمة في التنمية الحالية من البرد إم، تم إعادة تطوير سباركس إلى منصة مستقلة جديدة وكاملة لتحليل الجسيمات واحد، ودعا سفير (سباركس للمجهر الإلكتروني عالية الدقة). من أجل زيادة إمكانية الوصول إلى هذه التقنية للباحثين الجدد في هذا المجال، ومعالجة كمية كبيرة من البيانات التي تنتجها المجاهر الإلكترونية الحديثة بالكامل الآلي الآلي، وإعادة تصميم خط الأنابيب وتبسيطها من خلال تقديم وسيلة سهلة الاستخدام واجهة المستخدم الرسومية (غوي) وأتمتة الخطوات الرئيسية لسير العمل. وعلاوة على ذلك، تم إضافة خوارزميات جديدة للسماح سريع، استنساخه وتحديد الآلية الآلي من كريو-إم الصور. وعلاوة على ذلك، تم إدخال التحقق من قبل استنساخه من أجل تجنب القطع الأثرية المشتركة المنتجة خلال تحسين والتحليل عدم التجانس.
وعلى الرغم من أن البرنامج قد تم تعديله على نطاق واسع، فقد تم الإبقاء على سماته الأساسية المقدرة: شفرة المصدر المفتوح المباشرة، والتصميم الحديث الموجه نحو الأشياء، واجهات بايثون لجميع الوظائف الأساسية. وبالتالي، لم يتغير إلى برنامج الصندوق الأسود، مما يتيح للمستخدمين دراسة وسهولة تعديل رمز بايثون، لإنشاء تطبيقات إضافية أو تعديل سير العمل العام. وهذا مفيد بشكل خاص للمشاريع غير القياسية البرد إم.
هنا نقدم بروتوكول للحصول على خريطة كثافة القرار الذري القريب من الصور البرد إم باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من سفير. وهو يصف بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوليد خريطة الكثافة من الخام البرد إم الأفلام كاشف المباشر ولا يقتصر على أي نوع جزيء معين. ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول لتوجيه نيوكيخدش في الميدان من خلال سير العمل وتقديم معلومات هامة حول الخطوات الحاسمة من تجهيز فضلا عن بعض المزالق والعقبات المحتملة. وسيتم وصف المزيد من الميزات المتقدمة والخلفية النظرية وراء سفير في مكان آخر.
Protocol
ملاحظة: لمتابعة هذا البروتوكول، فمن الضروري تثبيت بشكل صحيح سفير على نظام مع تثبيت مبي (حاليا، كتلة لينكس). تحميل سفير و TcdA1 مجموعة البيانات من http://www.sphire.mpg.de واتباع تعليمات التثبيت: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php؟id=howto:download. يقوم هذا الإجراء أيضا بتثبيت EMAN2. يستخدم سفير حاليا e2boxer EMAN2 لتحديد الجسيمات و e2display لعرض ملفات الصور. لتصحيح الجرعة المرجحة الحركة من الأفلام ميكروغراف الخام، يستخدم سفير أونبلور 14 . تحميل البرنامج واتباع تعليمات التثبيت (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur، مختبر غريغوريف). لتصور التفاعلية من الهياكل الناتجة، فإن البروتوكول استخدام برنامج الرسومات الجزيئية كيميرا 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). برنامج تعليمي لطيف للحصول على دراية الميزات المستخدمة في جميع أنحاء هذا البروتوكول يمكن أن يكون فوند هنا: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. يمكن العثور على تعليمات حول كيفية تقديم مهمة موازية إلى مجموعة من واجهة المستخدم الرسومية سفير هنا: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php؟id=howto:submissions. ويوضح الشكل العام للمنظمة الشاملة للواجهات الرسومية سفير والخطوات الرئيسية لسير العمل التي يتم تنفيذها في هذا البروتوكول.
1. المشروع: تعيين قيم معلمة ثابتة لهذا المشروع
- بدء تطبيق سفير غوي بكتابة " سبير &" ومفتاح إنتر في نافذة الطرفية.
- ضبط المعلمات على نطاق المشروع (على سبيل المثال، حجم بكسل، نصف قطر الجسيمات والتناظر) في حقول الإدخال منها من صفحة إعدادات المشروع ثم قم بتسجيل هذه القيم لجميع الخطوات اللاحقة من سير العمل.
- انقر على الرمز "بروجيكت" الموجود في الجانب السفلي الأيسر من اللوحة اليمنى لفتح صفحة إعدادات المشروع.
- تعيين "حجم مربع الجسيمات" إلى 1.5 مرة على الأقل من حجم الجسيمات. تجنب أحجام النوافذ التي تحتوي على عدد كبير كبير. تذكر أيضا أن خوارزمية صقل 3D تتطلب حاليا حجم مربع حتى مرقمة.
ملاحظة: ينبغي أن تشمل النافذة هامش لحساب أخطاء التمركز الأولية الناتجة عن الانتقاء (الحاجة إلى تحويل الجسيمات داخل النافذة) ولمنطقة خلفية كافية خارج حدود الجسيمات من أجل تصحيح كف الصحيح (أهمية خاصة لقيم التهجير الكبيرة- تعيين "حجم الإطار كتف" إلى أن من "حجم مربع الجسيمات". بالنسبة للمشروعات ذات بيانات التباين المنخفض، استخدم نافذة أكبر للحصول على تقديرات أكثر سلاسة لأطياف الطاقة.
- تعيين "التماثل مجموعة نقطة" من المجمع (على سبيل المثال، "C5"). إذا كان التماثل من بنية الهدف غير معروف، وترك الأمر في "C1" (غير المتماثلة). ومع ذلك، إذا تم تحديد التماثل عالية ترتيب معين في وقت لاحق أثناء المعالجة، تغيير هذا التماثل الإعداد وفقا لذلك وكرر الخطوات بعد محاذاة 2D مع إيساك.
- تعيين "البروتين كتلة الجزيئية" في كيلو دالتون (القيمة التقريبية كافية). اضغط على زر "تسجيل الإعدادات".
2. الفيلم: محاذاة إطارات كل فيلم ميكروغراف لتصحيح الحركة الشاملة للعينة
- بالنسبة لكافة الصور الميكروغرافية السينمائية، قم بحساب x / y-شيفتس لجميع الإطارات ثم قم بإنشاء جرعتها - غير مرجحة وموزونة بالوزن(انظر المناقشة). نلاحظ أن الأول ضروري فقط لتقدير الصندوق الاستئماني لأن التقدير لا يؤدي أداء جيدا مع المتوسطات الجرعة المرجحة في حين أن الأخير يستخدم لجميع الخطوات الأخرى لتحديد الهيكل.
- انقر على أيقونة "موفي" ثم "ميكروغراف فيلم محاذاة" الزر. تعيين "أونبلور مسار قابل للتنفيذ" عن طريق تحديد الملف القابل للتنفيذ. تعيين "إدخال نمط مسار ميكروغراف" عن طريق اختيار ميكروغراف فيلم غير محاذاة الخام واستبدال الجزء المتغير من أسماء الملفات مع حرف البدل "*" (على سبيل المثال، TcdA1 _ *. مرك). حدد مسار "دليل الإخراج".
- تعيين "سوموفي مسار قابل للتنفيذ" عن طريق تحديد الملف القابل للتنفيذ.
- تعيين "عدد من إطارات الفيلم" لعدد الإطارات في كل ميكروغراف الفيلم. تعيين "الجهد المجهر" و "لكل التعرض الإطار" إلى القيم المستخدمة أثناء جمع البيانات. (ل إكسامبإذا كان الجرعة الكلية هي 60 e - / Å 2 مع 20 إطارا تم تسجيلها دون التعرض المسبق، يكون التعرض لكل رتل 60/20 = 3 e - / A 2. ) اضغط على زر "تشغيل الأمر" لمحاذاة إطارات كل ميكروغراف الفيلم.
ملاحظة: هذا سوف تلقائيا إنشاء اثنين من الدلائل الإخراج التي تحتوي على الجرعة غير مرجحة وجرعة مرجحة الحركة التصحيح ميكروغرافس المتوسط، على التوالي.
3. كتر: تقدير معلمات التباين و الاستجماتيزم من كتف
- تقدير المعلمات كتف (ديفوكوس والاستجماتيزم؛ يتم تعيين الآخرين من قبل المستخدم) لكل جرعة - غير ميكروغراف متوسط غير مرجح.
- انقر على أيقونة "كتر" ثم "كتف تقدير" زر. لتعيين "إدخال نمط مسار ميكروغراف"، حدد جرعة غير مرجحة الحركة ميكروغراف تصحيح، ثم استبدال جزء متغير من أسماء الملفات مع حرف البدل"*". أيضا، حدد مسار "دليل الإخراج".
- تعيين "التباين السعة" إلى القيمة المستخدمة روتينيا لنوع البيانات (سمك الجليد هو عامل رئيسي) والجهد المجهر في المختبر (على سبيل المثال، 10٪). القيم النموذجية هي في نطاق 7 - 14٪ 17 .
- تعيين "المجهر انحراف كروية (كس)" و "الجهد المجهر" المستخدمة أثناء جمع البيانات.
- تعيين "أدنى تردد" و "أعلى تردد" من نطاق البحث لنموذج كتف المناسب ل 0.0285 و 0.285 Å -1 (40 - 4 Å)، على التوالي. اضغط على زر "تشغيل الأمر" لتقدير المعلمات كتف.
ملاحظة: سيتم تخزين معلمات كتف تلقائيا في الملف partres.txt في دليل الإخراج المحدد. تم حساب تقدير كتف من 112 ميكروغرافس على 96 النوى وانتهت بعد ~ 3 دقائق على مجموعة لينكس المستخدمة للحصول على النتائج التمثيلية.
4. ويندو: استخراج الجسيمات من الجسيمات المتوسطة متوسط الجرعة
- اختيار الجسيمات يدويا أو تلقائيا من ميكروغرافس مع e2boxer 6 وإنشاء ملفات تنسيق، تحتوي كل منها على قائمة من الجسيمات الإحداثيات زي داخل ميكروغراف المرتبطة بها.
- انقر على أيقونة "نافذة" ثم زر "الجسيمات قطف". اضغط على زر "تشغيل الأمر" لبدء e2boxer 6 واختيار جزيئات كل ميكروغراف يدويا أو تلقائيا 18 (انظر مناقشة ). تخزين الإحداثيات الجسيمات النهائية لكل ميكروغراف في شكل ملف EMAN1 (.box). بدلا من ذلك، استيراد ملفات الإحداثيات من برامج أخرى بعد تحويلها إلى تنسيق EMAN1.
- إنشاء مداخن الجسيمات عن طريق استخراج الصور الجسيمات من الجسيمات المرجحة الجرعة (في سفير، كومة الجسيمات هو أوفتإن تسمى ببساطة "كومة").
- اضغط على زر "استخراج الجسيمات". حدد "إدخال نمط ميكروغراف مسار" عن طريق اختيار ميكروغراف تصحيح الحركة الجرعة المرجحة ثم استبدال الجزء المتغير من أسماء الملفات مع حرف البدل "*" (على سبيل المثال، TcdA1 _ *. مرك). وبالمثل، قم بتعيين "نمط مسار إحداثيات الإدخال" عن طريق تحديد ملف إحداثيات (على سبيل المثال، مربع TcdA1 _ *). حدد مسار "دليل الإخراج".
- تعيين "مصدر المعلمات كتف" عن طريق تحديد ملف المعلمة كتف (partres.txt المنتجة في الخطوة 3.1). اضغط على زر "تشغيل الأمر".
- الجمع بين مكدس صورة الجسيمات المستخرجة في واحد واحد.
- انقر على زر "كومة الجسيمات". تحديد المسار إلى "إخراج الصورة الظاهرية المكدس" باستخدام تنسيق مسار ملف بدب (على سبيل المثال، "بدب: الجسيمات / كومة"، حيث تشير "الجسيمات" إلى ثe دليل يحتوي على دليل قاعدة بيانات بدب الذي هو دائما اسم EMAN2DB و "كومة" يشير إلى كومة صورة معينة ضمن قاعدة البيانات هذه). حدد "إدخال نمط صورة صورة بدب" عن طريق تحديد دليل يبدأ ب "mpi_proc" ثم استبدال جزء المتغير من أسماء الدليل مع حرف البدل "*" (على سبيل المثال، الجسيمات / mpi_proc_000 إلى الجسيمات / mpi_proc_ *). اضغط على زر "تشغيل الأمر".
5. إيساك: تصنيف صور الجسيمات في 2D
- حساب متوسطات الطبقة 2D من خلال محاذاة الجسيمات وتكتلتها وفقا لمظهر 2D بهم.
ملاحظة: المتوسطات 2D الناتجة لديها نسبة إشارة إلى الضوضاء المحسنة (شنر) مقارنة مع الصور الجسيمات الفردية وبالتالي فهي تستخدم لتقييم بصريا نوعية وتغاير مجموعة البيانات، وكذلك لفرز الصور غير مرغوب فيها من كومة (على سبيل المثال، بلورات الثلج، حواف الكربون،المجاميع، شظايا، وما إلى ذلك ) 19 . وعلاوة على ذلك، سيتم استخدامها لاحقا لتحديد نموذج 3D الأولي.- انقر على أيقونة "إيزاك" ثم "إيساك - 2D تجميع" button.Set "إدخال كومة الصورة" عن طريق تحديد ملف المكدس التي تحتوي على الجسيمات المستخرجة. حدد مسار "دليل الإخراج".
- استخدام 200 - 1000 ل "الصور لكل فئة". اختيار العدد المناسب النظر في العدد المتوقع من الطبقات 2D (العدد الإجمالي للجسيمات مقسوما على عدد الصور في كل فئة). ضبط هذه المعلمة اعتمادا على شنر وحجم مجموعة البيانات. زيادة عدد الأعضاء لكل فئة في حالة مجموعة البيانات صاخبة بشكل مفرط. تقليل عدد عندما يكون عدد قليل من الجسيمات المتاحة.
ملاحظة: نظرا لقيود الذاكرة، لمجموعات البيانات الكبيرة بدلا (> 100000 الجسيمات)، تقسيم مجموعة البيانات الكاملة إلى مجموعات فرعية، أداء إيساك لكل مجموعة فرعية بشكل مستقل، والجمع بينالنتائج في نهاية المطاف. وترد التعليمات التفصيلية لسيناريو المعالجة هذا في http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php. - حدد مربع الاختيار "فليب-فليب". الحفاظ على القيم الافتراضية ل "نصف قطرها الجسيمات الهدف" و "الهدف حجم صورة الجسيمات" من أجل تسريع العملية عن طريق تقليص تلقائيا جميع الصور الجسيمات مع هذه الإعدادات. اضغط على زر "تشغيل الأمر" لحساب متوسطات الطبقة 2D.
ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب حسابيا ويزيد وقت التشغيل بشكل ملحوظ مع عدد من الجسيمات والطبقات وكذلك نصف قطرها المستهدف وحجم الصورة. على الكتلة مع 96 عملية، تصنيف 2D من ~ 10،000 جسيمات الانتهاء بعد حوالي 90 دقيقة.
- عرض وتفحص بصريا الناتج إيساك 2D المتوسطات للتأكد من أن جودتها مرضية (انظر المناقشة).
- اضغط على زر "عرض البيانات" تحت "وتيليتيز". جلس "؛ ملفات الإدخال "عن طريق تحديد الملف الذي يحتوي على متوسطات إيساك 2D (class_average.hdf المنتجة في الخطوة 5.1) .اضغط على زر" تشغيل الأمر "لعرض متوسطات الفصل النهائية التي يمكن استنساخها والتحقق منها من قبل إيساك.
- إنشاء كومة جديدة بما في ذلك فقط أعضاء الجسيمات من المتوسطات الطبقة التحقق منها.
- اضغط على زر "إنشاء كومة فرعية". اضبط "كومة إدخال الصورة" عن طريق تحديد ملف المكدس نفسه كما هو موضح في الخطوة 5.1.1. تعيين "متوسطات إيساك" عن طريق تحديد المتوسطات إيساك 2D (class_arates.hdf المنتجة في الخطوة 5.1). حدد مسار "دليل الإخراج". اضغط على زر "تشغيل الأمر".
6. فيبر: حساب نموذج 3D الأولي
- حدد مجموعة صغيرة من متوسطات الطبقة (≥100 صورة) عن طريق حذف جميع متوسطات الطبقة السيئة وطرق مماثلة للجسيمات (انظر المناقشة) واستخدامها لحساب مندوبنموذج الأولي القابلة للتوليد باستخدام فيبر. تذكر أن التحديد يجب أن يحتوي على ما لا يقل عن 60-80 متوسطات عالية الجودة مع ~ 200-500 عضو لكل منهما.
- انقر على أيقونة "فيبر" ثم الزر "عرض البيانات". قم بتعيين "ملفات الإدخال" عن طريق تحديد المتوسطات 2D إيساك (class_arates.hdf المنتجة في الخطوة 5.1). اضغط على زر "تشغيل الأمر".
- اضغط على زر الأوسط الماوس في مكان ما على نافذة الرسومات من e2display، وتفعيل زر "ديل" في النافذة المنبثقة. حذف جميع متوسطات الطبقة السيئة وجهات النظر متطابقة من الجسيمات (انظر المناقشة ). اضغط على زر "حفظ" لتخزين متوسطات الفئة 2D المتبقية إلى ملف جديد.
- من متوسطات إيساك المحددة، إنشاء مرجع أولي لصقل 3D لاحق.
- انقر على زر "النموذج الأولي 3D - رفيبر". تعيين "إدخال الصور المكدس" عن طريق اختيار الطبقة فحصهاالمتوسطات (المنتجة في الخطوة 6.1). حدد مسار "دليل الإخراج".
- تأكد من استخدام نفس القيمة ل "نصف قطر الجسيمات المستهدفة" كخطوة إيساك 5.1.3. اضغط على زر "تشغيل الأمر" لتوليد أب نموذج أولي 3D استنساخه.
ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب حسابيا ويزيد وقت التشغيل بشكل ملحوظ مع عدد من المتوسطات وحجم الجسيمات. على مجموعة مع 96 عملية، هذه المهمة (~ 100 فئة المتوسطات) الانتهاء بعد ~ 15 دقيقة.
- تحقق مما إذا كان نموذج 3D الناتج معقولة من خلال الأخذ بعين الاعتبار متوسطات الطبقة وبالإضافة إلى سلامتها الهيكلية ( أي قطع قطع الغيار و / أو التحف الاتجاه). لعرض الخريطة، استخدم برنامج تشيميرا 15 . عند هذه النقطة، إجراء مقارنة الأولى مع بنية وضوح الشمس من بروتين مثلي أو مجال من البروتين من الفائدة إذا كان موجودا (مثال يظهر في القسم ريبريزنتاتيف النتائج).
- للحصول على التصحيح ثلاثي الأبعاد اللاحق، قم بإنشاء مرجع ثلاثي الأبعاد أولي وقناع ثلاثي الأبعاد من نموذج أب أولي ثلاثي الأبعاد عن طريق إزالة الضوضاء المحيطة به وإعادة تغييره ليتناسب مع حجم البكسل الأصلي.
- انقر على الزر "إنشاء مرجع ثلاثي الأبعاد". اضبط "حجم الإدخال" عن طريق اختيار نموذج أب إنيتيال 3D (متوسط_volume.hdf المنتج في الخطوة 6.2). حدد مسار "دليل الإخراج".
- قم بتعيين "ريسمبل راتيو سورس" عن طريق تحديد ملف نسبة تقليص إيساك (README_shrink_ratio.txt المنتج في الخطوة 5.1). اضغط على زر "تشغيل الأمر".
7. ميريديان: تحسين حجم 3D الأولي
- قم بتحسين مستوى الصوت ثلاثي الأبعاد بدءا من النموذج ثلاثي الأبعاد الأولي.
- انقر على أيقونة "ميريدين"، ثم زر "صقل 3D". تعيين "كومة الإدخال الصورة" و "مرجع 3D الأولي" بواسطة سيلكتيغ كومة الجسيمات و أب النموذج الأولي 3D (المنتجة في الخطوة 5.3 و 6.4، على التوالي). حدد مسار "دليل الإخراج".
- تعيين "قناع 3D" عن طريق اختيار ملف قناع 3D (المنتجة في الخطوة 6.4). دائما استخدام قناع 3D ولكن، وخاصة في مرحلة مبكرة من التحليل، واستخدام قناع كروي أو قناع لينة الحواف تركيبها بشكل فضفاض إلى مرجع لتجنب إدخال التحيز من اخفاء غير صحيح.
- تحقق من مربع الاختيار "تطبيق قناع 2D الثابت". تعيين "قرار البدء" إلى قيمة تردد قطع بين 20-25 Å. نضع في اعتبارنا أن مرشح تمريرة منخفضة مع هذا التردد قطع سيتم تطبيقها على الهيكل 3D الأولي للحد من التحيز النموذج الأولي.
- تحقق من مواصفات الكتلة المستخدمة لهذه العملية ثم قم بتعيين "الذاكرة لكل عقدة" إلى الذاكرة المتوفرة في غيغابايت. اضغط على زر "تشغيل الأمر" لتنقيح حجم 3D بدءا من نموذج 3D الأولي بطريقة مؤتمتة بالكامل.
- إنشاء قناع 3D لينة الحواف من حجم المكرر لخطوة شحذ لاحقة.
- انقر على زر "التكيف 3D قناع". تعيين "حجم الإدخال" عن طريق اختيار واحد من نصف حجم غير المرشحة (المنتجة في الخطوة 7.1). حدد مسار "قناع الإخراج".
- عين قيمة "عتبة الاستهداف". استخدام الكيميرا للتأكد من أنه، عند هذه العتبة معينة، والضجيج هو واضح خارج حجم الاهتمام في منطقة المذيبات من نصف الخرائط التي لم تتم تصفيتها وكافة كثافة البروتين لا تزال جأونكتد لبعضها البعض. اضغط على زر "تشغيل الأمر" لإنشاء قناع 3D لينة الحافة.
ملاحظة: الجسم الرئيسي للقناع الناتجة (تتكون من فوزيلس قيمها> 0.5) يجب أن تناسب بشكل صارم هيكل الجسيمات ولكن لا تزال ترفق جميع كثافة من الفائدة. يجب أن يكون سقوط الحافة الناعمة 8-10 بكسل على الأقل.
- دمج اثنين من نصف حجم غير المرشحة التي تم الحصول عليها من قبل صقل 3D. ثم، شحذ حجم دمج عن طريق ضبط الطيف الطاقة على أساس وظيفة نقل التشكيل (متف) للكاشف، والعامل B المقدرة، و فسك (فورييه شل الارتباط) تقدير القرار.
- حدد زر "شحذ". اضبط "نصف الحجم الأول غير المرشح" و "النصف الثاني غير المصفى الثاني" عن طريق اختيار الملفات المطابقة (vol_0_unfil.hdf و vol_1_unfil.hdf المنتجة في الخطوة 7.1). دائما استخدام "B- عامل تعزيز". عادة، الحفاظ على القيمة الافتراضية من أجل هتحصي قيمة عامل B من مجموعة بيانات الدخل باستخدام المدى بين تردد القرار النهائي و 10 Å. بدلا من ذلك، حدد قيمة مخصصة (على سبيل المثال، -100).
- احتفظ بالقيمة الافتراضية ل "تردد فلتر منخفض التمرير" لتطبيق عامل تصفية يستند إلى فسك.
- تعيين "قناع المستخدم المقدمة" عن طريق اختيار قناع 3D (المنتجة في الخطوة 7.2). تذكر أن القرار المبلغ عنه سيتم تحديده باستخدام فسك مع هذا القناع. اضغط على زر "تشغيل الأمر" لشحذ حجم 3D المكرر.
- توليد خريطة التوزيع الزاوي 3D من اتجاهات الإسقاط من جميع الجسيمات التي تقدرها خطوة صقل 3D أعلاه.
- انقر على زر "توزيع الزاوي". قم بتعيين "ملف معلمة المحاذاة" عن طريق تحديد الملف (final_params.txt المنتج في الخطوة 7.1)، ثم اضغط على زر "تشغيل الأمر".
- فحص بصريا نموذج 3D شحذ باستخدام تشيميرا. تأكد من أن الهيكل يبدو معقولا بالنظر إلى القرار الذي تم تحقيقه (انظر المناقشة ).
- تفقد بصريا توزيع الزاوي باستخدام الكيميرا. تحقق من أن التوزيع يغطي تقريبا بالتساوي كامل الفضاء الزاوي 3D. ضع في اعتبارك أنه بالنسبة للبنى المتماثلة، فإن التوزيع مقيد داخل المثلث غير المتماثل الفريد.
8. SORT3D: فرز عدم التجانس 3D من خلال التركيز على المناطق المتغيرة للغاية
- حساب خريطة التباين 3D من كومة الجسيمات المستخدمة في صقل 3D.
- انقر على الرمز "SORT3D" ثم الزر "تقدير التقلب ثلاثي الأبعاد". اضبط "كومة إدخال الصورة" عن طريق تحديد كومة الجسيمات التي تم فحصها والتي تعطى لخطوة التصحيح ثلاثية الأبعاد 7.1.1. حدد مسار "دليل الإخراج".
- احتفظ بالقيمة الافتراضية ل "عدد الإسقاطات".
ملاحظة: الصور من الجار الزاويسوف تستخدم غطاء محرك السيارة لتقدير التباين 2D في كل زاوية الإسقاط 3D. وكلما كان العدد أكبر، كلما كان التقدير أقل صاخبا ولكن كلما انخفض القرار والتحف التناوبية أكثر وضوحا. - حدد مربع الاختيار "استخدام حساب كتف". اضغط على زر "تشغيل الأمر".
- استخدم خريطة التقلب ثلاثية الأبعاد لإنشاء قناع تركيز لخطوة التجميع ثلاثية الأبعاد أدناه.
- حدد زر "ثنائي قناع 3D". تعيين "حجم الإدخال" عن طريق تحديد خريطة التقلب 3D (المنتجة في الخطوة 8.1). حدد مسار الملف ل "قناع الإخراج".
- تعيين "عتبة الاستقطاب" باستخدام إخراج حقل "المستوى" في "عارض حجم" من الكيميرا. اضغط على زر "تشغيل الأمر".
- فرز الصور الجسيمات إلى مجموعات هيكلية متجانسة من خلال التركيز على المناطق ذات الهيكلية العالية متغير الهيكليا.
- اضغط على زر "3D تجميع - RSORT3D".اضبط "دليل الإدخال ثلاثي الأبعاد للإدخال" عن طريق تحديد دليل الإخراج للصقل ثلاثي الأبعاد (الذي تم إنتاجه في الخطوة 7.1). حدد مسار "دليل الإخراج".
- تعيين "قناع 3D" عن طريق اختيار لينة 3D حافة قناع (المنتجة في الخطوة 7.2). تعيين "قناع 3D التركيز" عن طريق تحديد خريطة التباين 3D بيناريزد (المنتجة في الخطوة 8.2).
- بالنسبة إلى مجموعات البيانات الكبيرة، استخدم ما لا يقل عن 5000-10000 ل "الصور لكل مجموعة". ضع في اعتبارك أن البرنامج يحافظ دائما على عدد الصور لكل مجموعة أقل من هذا الإعداد. ضبط القيمة من خلال النظر في العدد المتوقع من المجموعات 3D (العدد الإجمالي للجسيمات مقسوما على قيمة "الصور لكل مجموعة")، ومجموعة البيانات، و شنر، ودرجة عدم التجانس. تبدأ مع ~ 5-10 مجموعات 3D الأولية، إذا كان عدد كاف من الجسيمات هو متاح، إلا إذا كان من المتوقع عدد أكبر من الدول الهيكلية متميزة في مجموعة البيانات.
- استخدام ما لا يقل عن 3،000-5،000 الجسيمات ل "أصغر حجم المجموعة".لاحظ أن البرنامج سوف تجاهل المجموعات التي تتألف من عدد أقل من الصور من إعداد "أصغر حجم المجموعة". اضغط على زر "تشغيل الأمر" لتنفيذ التجميع ثلاثي الأبعاد.
ملاحظة: يتم تقسيم RSORT3D إلى خطوتين. أول "type3d" خطوة يفرز من عدم التجانس 3D. ثم، فإنه يعيد بناء أحجام كل مجموعة هيكلية متجانسة باستخدام المعلمات المحاذاة 3D التي تحددها خطوة صقل 3D أعلاه. الخطوة الثانية "rsort3d" يجد أعضاء استنساخ كل مجموعة من خلال إجراء مقارنة في اتجاهين من اثنين من فرز الفرز مستقلة. ثم، فإنه يعيد بناء هياكل متجانسة باستخدام فقط الجسيمات المخصصة استنساخه. على كتلة مع 96 النوى، هذه المهمة (~ 8000 الجسيمات، 352 حجم مربع) الانتهاء بعد حوالي 3 ساعات.
- بعد الانتهاء من البرنامج، استخدم الكيميرا لتحديد مجموعة 3D متجانسة. حدد هيكل أعلى قرار واضح، وعادة ما يرتبط مع معظم بوبولوس. تأكد من أن الهيكل المحدد هو معقول من الناحية البصرية من خلال الأخذ بعين الاعتبار متوسطات الطبقة 2D والجوانب البيولوجية للبروتين من الفائدة (انظر المناقشة ). إذا كان هناك مجلدات أخرى لها بنية متطابقة تقريبا في قرار مماثل، والنظر إليها على أنها الناشئة من مجموعة 3D متجانسة واحدة.
- إجراء صقل المحلية ضد أعضاء الجسيمات من مجموعة 3D الأكثر تجانسا (مع أعلى دقة).
- انقر على الزر "صقل المجموعة الفرعية المحلية". قم بتعيين "مسار ملف النص الفرعي" عن طريق تحديد الملف النصي الذي يحتوي على معرفات الجسيمات للمجموعة المحددة (على سبيل المثال، Cluster0.txt المنتج في الخطوة 8.3). اضبط "دليل الصقل ثلاثي الأبعاد" من خلال تحديد دليل الإخراج للصقل ثلاثي الأبعاد السابق (الذي تم إنتاجه في الخطوة 7.1).
- تعيين "إعادة تشغيل التكرار" إلى واحد حيث يتم تحقيق أعلى دقة في صقل 3D السابقة. اضغط علىزر "تشغيل الأمر" لإجراء صقل المحلية من السكان المحدد من الجسيمات.
- على غرار الخطوة 7.2، إنشاء قناع 3D لينة الحواف من نصف نصف النهائي لم تتم تصفيته أعيد بناؤها من قبل صقل المجموعة الفرعية المحلية.
- على غرار الخطوة 7.3، دمج اثنين من نصف المجلدات النهائية التي لم تتم تصفيتها المستمدة من صقل المجموعة الفرعية المحلية وشحذ حجم المدمجة. ومع ذلك، لا تصفية حجم شحذ هذه المرة.
ملاحظة: إذا كان تحليل عدم التجانس في الخطوة 8.4 تشير إلى عدة حالات متميزة في قرار مماثل، قد يرغب المرء في صقل جميع الولايات المختلفة بشكل مستقل.
9. لوكالرز: تقدير الدقة المحلية من حجم 3D النهائي
- تقدير القرار المحلي من حجم 3D الحصول عليها من مجموعة متجانسة من الجسيمات.
- انقر على أيقونة "لوكالرز" ثم الزر "حل محلي". تعيين "أول نصف حجم" و "النصف الثاني-الخطوة "عن طريق اختيار أحجام النصف النهائية غير المرشحة من صقل المجموعة الفرعية المحلية (التي تنتج في الخطوة 8.5.) قم بتعيين" قناع 3D "عن طريق اختيار قناع 3D ذو حواف ناعمة المنتج في الخطوة .6.6 حدد مسار الملف ل" حجم الإخراج " .
- الحفاظ على القيمة الافتراضية من 7 بكسل ل "حجم إطار فسك". تذكر أن هذا الإعداد يحدد حجم النافذة حيث يتم حساب الارتباط المحلي الحقيقي الفضاء؛ أحجام النوافذ الكبيرة تنتج خرائط قرار أكثر سلاسة على حساب قابلية الحل المحلي.
- الحفاظ على القيمة الافتراضية 0.5 من "قطع القرار" لمعيار القرار.
ملاحظة: بالنسبة لكل فوكسل، سيقوم البرنامج بالإبلاغ عن القرار المحلي باعتباره التردد الذي ينخفض فيه فسك المحلي دون عتبة القرار المحددة. ولا يوصى باستخدام عتبة أدنى من 0.5، لأن قيم الارتباط الأدنى لها درجة عالية من عدم اليقين الإحصائي. لذلك، فإن القرار المحلي المقابلة تختلف بقوة بين فوزيلس. - ل "أوفيراليرة لبنانية القرار "، تعيين القرار المطلق يقدر في شحذ بعد صقل مجموعة فرعية المحلية (الخطوة 8.7) اضغط على زر" تشغيل الأمر "لحساب القرار المحلي من وحدة التخزين.
- تطبيق مرشح المحلية 3D إلى حجم شحذ بعد صقل المجموعة الفرعية المحلية باستخدام خريطة القرار المحلي 3D.
- انقر على الزر "فلتر محلي ثلاثي الأبعاد". تعيين "حجم الإدخال" عن طريق اختيار حجم 3D شحذ ولكن لم تتم تصفيته (المنتجة في الخطوة 8.7). وبالمثل، تعيين "ملف القرار المحلي" و "قناع 3D" (المنتجة في الخطوة 9.1 و 8.6، على التوالي). تذكر أن قناع 3D يحدد المنطقة حيث سيتم تطبيق الترشيح المحلي. حدد مسار الملف ل "حجم الإخراج". اضغط على الزر "تشغيل الأمر" لتطبيق الفلتر المحلي ثلاثي الأبعاد.
- استخدام الكيميرا لفحص البصر نموذج 3D النهائي وخريطة القرار المحلي 3D (المنتجة في الخطوة 9،2 و 9،1، ريسبectively). حدد الخيار "لون السطح" لتلوين حجم 3D وفقا للقرار المحلي. ضع في اعتبارك أن توزيع القرار المحلي يجب أن يكون سلسا (انظر المناقشة ).
Representative Results
تم تنفيذ البروتوكول الموصوف أعلاه بدءا من 112 أفلام الكشف المباشر للمكون A من فوتورهابدوس لومينزنس تك مجمع (TcdA1) 20 ، 21 ، 22 . تم تسجيل مجموعة البيانات هذه على المجهر الإلكتروني المجهز بالكرومونات المجهزة بطبقة عالية من السطوع (شفيغ)، والتي تعمل بجهد تسارع 300 ك.ف. تم الحصول على الصور تلقائيا مع جرعة إجمالية قدرها 60 ه - / Å -2 في حجم بكسل 1.14 Å على مقياس العينة. بعد محاذاة إطارات الفيلم ( بروتوكول الخطوة 2 )، كان المتوسطات تصحيح الحركة الناتجة الخواص ثون خواتم تمتد إلى عالية الدقة ( الشكل 2A ). الجسيمات الفردية كانت مرئية بسهولة وفصلها جيدا ( الشكل 2B ). ثم تم اختيار الجسيمات باستخدام أداة سرب من e2boxerلاس = "كريف"> 18 ( بروتوكول الخطوة 4.1 ). في هذه الحالة، تم تعيين عتبة مناسبة باستخدام الخيار أكثر انتقائية ( الشكل 2C ). وقد أسفرت المجهرية الرقمية 112 عن 9652 جسيمات. غالبية الصور المستخرجة ( بروتوكول الخطوة 4.2 ) تحتوي على جسيمات محددة جيدا وحجمها مربع ~ 1.5 مرات أكبر من حجم الجسيمات، على النحو الموصى به ( الشكل 2D ). بعد ذلك، باستخدام إيساك، تم إجراء تحليل عدم التجانس 2D ( بروتوكول الخطوة 5 ). أنها حققت 98 متوسطات الطبقة ( الشكل 3A ). باستخدام هذه المتوسطات الطبقة 2D، تم حساب نموذج أب الأول باستخدام فيبر ( بروتوكول الخطوة 6 ) في قرار وسيطة ( الشكل 3B ). هذا النموذج يظهر اتفاق ممتاز مع هيكل الكريستال TCDA1 حلها سابقا في 3.9 Å قرار 22 ( الشكل 3C ). وقد تم استخدام هذا النموذج الأولي كقالب أولي (ميريديان)، مما أسفر عن إعادة إعمار 3.5 Å (0.143 معيار) ( بروتوكول الخطوة 7 ) من وحدات فقط غير المتناظرة ~ 40،000 ( الشكل 4 ). تم الحصول على هذه الخريطة قرار شبه الذرية في غضون 24 ساعة، وذلك باستخدام ما يصل إلى 96 وحدة المعالجة المركزية لخطوات سير العمل التي تستفيد من النوى متعددة.
وبالنسبة لتحليل التباين الثلاثي الأبعاد (بروتوكول الخطوة 8)، لم يستخدم سوى 2000 صورة جزئية لكل مجموعة في الخطوة 8.3.3 ( أي تبدأ العملية ب 5 مجموعات ثلاثية الأبعاد أولية) و 200 صورة لأصغر حجم للمجموعة في الخطوة 8.3.4 بسبب وعدد قليل من الجسيمات (~ 10،000). كشف التحليل المرونة المحلية أساسا في المنطقة N- محطة من المجمع الذي يحتوي على علامته المستخدمة لتنقية ( الشكل 5A ). في الواقع، لم يتم حل اثني عشر بقايا N- محطة والعلامة له في هيكل الكريستال المنشورة سابقا من TCDA1"> 22 وظلت هذه المنطقة الأكثر اختلالا دون حل في الكثافة الحالية البرد إم، ويرجع ذلك على الأرجح إلى مرونتها.وقد تم الكشف عن التباين إضافية في المجالات ملزمة مستقبلات ومجال بك ملزمة ( الشكل 5A ) وقرار مرضي للهيكل وحجم صغير نوعا ما من مجموعة البيانات، وقد تقرر هذا التغاير أن تكون مقبولة، وبالتالي لم يتم تنفيذ تصنيف 3D تركز 23. وأخيرا، تم حساب القرار المحلي لخريطة الكثافة النهائية ( بروتوكول الخطوة 9.1، الشكل 5 ب ) وتم ترشيح خريطة 3D شحذ محليا ( بروتوكول الخطوة 9.2) ويمكن استخدام حجم من هذه النوعية لبناء نموذج نوفو باستخدام كوت 24 أو أي أداة أخرى صقل ( الشكل 6 ).
<سترونغ> الشكل 1: معالجة الصور باستخدام سفير. ( أ ) واجهة المستخدم الرسومية لحزمة برمجيات سفير. يمكن تنشيط خطوة معينة من سير العمل من خلال تحديد الرسم التوضيحي الخاص به على الجانب الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية ("خطوة سير العمل"). ستظهر الأوامر والمرافق المرتبطة بهذه الخطوة من سير العمل في المنطقة المركزية من واجهة المستخدم الرسومية. بعد اختيار أحد الأوامر، يتم عرض المعلمات ذات الصلة على المنطقة اليمنى من واجهة المستخدم الرسومية. عادة لا تتطلب المعلمات المتقدمة تعديل القيم الافتراضية المحددة مسبقا. ( ب ) المراحل في سير العمل لمعالجة صورة الجسيمات المفردة باستخدام واجهة المستخدم الرسومية سفير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصحيح الحركة والخاصةلي استخراج. ( أ ، ب ) نموذجية عالية الجودة، جرعة منخفضة، المجهرية الرقمية الانجراف تصحيحها سجلت في تباطؤ 1.7 ميكرون. لاحظ حلقات ثون متناحية يمتد إلى قرار من 2.7 Å في الطيف السلطة (أ) والجسيمات واضحة جيدا في صورة 2D ( ب ). ( ج ) اختيار الجسيمات باستخدام e2boxer. الدوائر الخضراء تشير إلى الجسيمات المختارة. ( د ) الجسيمات الخام النموذجية المستخرجة من الجسيمات المجهرية المرجحة بالجرعة. مقياس الحانات = 20 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجميع ثنائي الأبعاد وتوليد النموذج الأولي. ( أ ) معرض متوسطات الصف الثانى، حيث تمثل الأغلبية وجهات نظر جانبية o f الجسيمات. مقياس شريط = 20 نانومتر. ( ب ) أب أول خريطة 3D TCDA1 الحصول عليها باستخدام رفيبر من المتوسطات فئة خالية من المرجعية. ( ج ) تركيب الجسم الصلب للهيكل البلوري TCDA1 (أشرطة) (بدب-إد 1VW1) في كثافة البرد-إم الأولية (رمادي شفاف). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: كريو-إم 3D هيكل TCDA1. ( أ ، ب ) النهائي 3.5 Å كثافة خريطة TCDA1 محسوبة باستخدام ~ 9،500 صور الجسيمات: ( أ ) الجانب و ( ب ) أعلى عرض. ( ج ) المناطق التمثيلية للكثافة إم البرد ل α الحلزون و β ورقة.arge.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل التباين والقرار المحلي. ( أ ) سطح خريطة TryA1 كريو-إم شحذ (الرمادي) وخريطة التباين (الأخضر). للحصول على وضوح أفضل، كانت خريطة التباين منخفضة تمرير تصفيتها إلى 30 Å. ( ب ) تقديم السطح من TCDA1 شحذ خريطة كريو-إم الملونة وفقا للقرار المحلي (Å). لاحظ الاتفاق الطوبولوجي بين المناطق ذات التباين العالي وانخفاض القرار المحلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: وزارة الدفاع 3Dبناء TCDA1 باستخدام كوت. يتم عرض المناطق التمثيلية للكثافة إم البرد والنموذج الذري ل α الحلزون. تم بناء النموذج الذري دي نوفو باستخدام كوت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وقد أظهرت الجسيمات واحد البرد- إم التطور السريع في السنوات الأخيرة، وسلمت العديد من هياكل القرار الذرية من المجمعات الجزيئية ذات الأهمية البيولوجية الكبرى 25 . من أجل دعم عدد كبير من المستخدمين المبتدئين الذين يدخلون حاليا الحقل، قمنا بتطوير منصة تحليل صورة الجسيمات واحد سفير وتقديم هنا من خلال بروتوكول المشي من خلال سير العمل بأكمله بما في ذلك محاذاة الفيلم، واختيار الجسيمات، تقدير كتف، النموذج الأولي حساب، 2D و 3D تحليل عدم التجانس، عالية الدقة 3D صقل وتقدير القرار المحلي والتصفية.
ويهدف البروتوكول الموصوفة هنا كدليل قصير لتحديد هيكل 3D باستخدام ميكروغرافس البرد إم من البروتين من الفائدة وبمساعدة من الأدوات الحسابية التي تقدمها واجهة المستخدم الرسومية المستقلة من سفير.
السمة الرئيسية لسير العمل هو أن معظممن الإجراءات تحتاج إلى تشغيل مرة واحدة فقط، لأنها تعتمد على مفهوم التحقق من صحة من قبل استنساخ 19 ولا تتطلب المعلمة التغيير والتبديل. هذه الآلية التلقائية للتحقق من الصحة هي الميزة الرئيسية ل سفير على حزم البرامج الأخرى منذ النتائج تميل إلى أن تكون موضوعية وكذلك استنساخه، والأهم من ذلك، يمكن الحصول عليها بتكلفة حسابية مقبولة. ويوفر خط الأنابيب بالإضافة إلى ذلك ثروة من المعلومات التشخيصية للمستخدمين ذوي الخبرة لإجراء مزيد من التحقق المستقل والتقييم مع الأساليب الخاصة. ومع ذلك، يجب أن يكون المستخدم المبتدئ الذي لديه على الأقل الخلفية النظرية عنصري في علم الأحياء الهيكلي والمجهر الإلكتروني قادرة على الحصول على هياكل قرار شبه الذرية باستخدام البيانات الخاصة وإجراءات التحقق الآلي.
ومع ذلك، فإن الحصول على بنية قرار شبه الذرية ليست دائما واضحة وسوف تعتمد النتيجة إلى حد كبير على نوعية العينة ودات المدخلاتا. وفيما يتعلق بالإجراءات المعروضة هنا، يفترض أن عددا كافيا من أفلام إم الخام غير المحاذاة عالية الجودة متوافرة، مع أن متوسطاتها تظهر جسيمات مفردة متجانسة ومميزة بشكل عشوائي. بشكل عام، لا توجد قيود على التماثل أو الحجم أو الشكل العام للجزيء، ولكن الوزن الجزيئي المنخفض يمكن أن يكون عاملا محددا، خاصة عندما يكون للبروتين شكل كروي بدون سمات. وعادة ما يكون تحليل الجسيمات الأكبر حجما والمرتبة جيدا مع التماثل العالي بين النقاط أقل تطلبا. ولذلك، فمن المستحسن للمستخدمين المبتدئين لتشغيل البروتوكول الحالي لأول مرة مع مجموعة بيانات كريو-إم جيدا. إما البيانات التعليمية سفير (هتب: /sphire.mpg.de) أو واحدة من إمبيار مجموعات البيانات المقدمة (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) مع الأفلام الخام هي نقطة انطلاق جيدة .
عند معالجة البيانات الخاصة، فمن المرجح جدا أن بعض مجموعات البيانات أو بعض الصور لن يرضي بعض كواليتي. في هذا السياق، بالإضافة إلى الشيكات الاستقرار الآلي والتكاثر، التي يؤديها البرنامج للخطوات الرئيسية لسير العمل، فإنه لا يزال يوصي للمستخدمين لفحص بصريا النتائج في بعض "نقاط التفتيش" من البروتوكول، وخاصة إذا كان إعادة الإعمار النهائي ليست مرضية.
يمكن إجراء الفحص البصري الأول على مستوى ميكروغراف بعد محاذاة الفيلم ( بروتوكول الخطوة 2 ) وتقدير كتف ( بروتوكول الخطوة 3 ). وينبغي أن تظهر المعدلات المصححة الناتجة عن الحركة جسيمات مفردة واضحة المعالم وذات فصل جيد، وينبغي أن تظهر أطياف الطاقة الخاصة بها حلقات ثون واضحة ومتنوعة. ويعرف التردد المكاني الذي تكون فيه مرئية، في معظم الحالات، أعلى درجة يمكن أن يحددها الهيكل من حيث المبدأ في نهاية المطاف. وترد أمثلة لمتوسط تصحيح الحركة من نوعية كافية وطيف الطاقة في القسم & #34؛ نتائج الممثل "، ويمكن إزالة الصور الخارجة التي قد يكون لها تأثير سلبي على النتيجة النهائية بمساعدة سفير الانجراف و كتف تقييم أدوات واجهة المستخدم الرسومية (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
وفيما يتعلق بفحص الجسيمات، فإن الخطوة الحاسمة في خط أنابيب سفير هي التصنيف 2D باستخدام إيساك ( بروتوكول الخطوة 5.2) . هنا، يجب على المستخدم التحكم في أن المتوسطات الطبقة 2D استنساخه التي يتم تحديدها تلقائيا من قبل البرنامج تعتمد مجموعة من التوجهات كافية لتغطية شبه بالتساوي الفضاء الزاوي. إذا كانت جودة المتوسطات الصفية غير مرضية (صاخبة و / أو صور ضبابية) و / أو عدد متوسطات الطبقة القابلة للتكرار منخفضة جدا، فكر في تحسين جودة التقاط السيارات، وتحسين تصوير مجموعة البيانات أو إعداد العينات. في معظم الحالات، لا يمكن حساب إعادة بناء موثوق بها من مجموعة بيانات لا تعطي متوسطات جيدة للصف الثاني. أمثلة على جودة عالية 2D الطبقة أفيتظهر في القسم "نتائج الممثل".
مطلوب ما لا يقل عن 100 المتوسطات الطبقة للحصول على نموذج 3D الأولي موثوق بها باستخدام رفيبر بطريقة تلقائية ( بروتوكول الخطوة 6.1 ). لهذه الخطوة، يجب على المستخدم تحديد المتوسطات بأعلى مستويات الجودة وتشمل العديد من التوجهات المختلفة للجسيمات ممكن. جودة النموذج الأولي أمر بالغ الأهمية لنجاح اللاحقة عالية الدقة 3D صقل.
في حزم البرمجيات الأخرى، يتم تنفيذ تصنيف 3D أحيانا لإزالة جزيئات "سيئة" 8 ، 9 . ومع ذلك، في سفير معظم هذه الجسيمات تلقائيا القضاء بالفعل خلال تصنيف 2D باستخدام إيساك. وبالتالي، فمن المستحسن لأداء خطوة مكثفة حسابيا من 3D الفرز إلا إذا كان إعادة الإعمار وتحليل التباين 3D تشير إلى عدم التجانس من مجموعة البيانات.
الأهم من ذلك، يجب على المستخدم دائما فحص بعناية أحجام 3D الناتجة بعناية ( بروتوكول الخطوة 9.3 )، وتؤكد أن ملامح كثافة منها تتفق بشكل جيد مع القرار الاسمي. في قرار من <9 Å، وكثافات تشبه قضيب المقابلة α-هيليسس تصبح مرئية. في قرار <4.5 Å، الكثافات المقابلة للخيوط في β-صحائف عادة ما تكون منفصلة بشكل جيد والأحماض الأمينية ضخمة تصبح مرئية. يجب أن تظهر خريطة عالية الدقة (<3 Å) سلاسل جانبية واضحة المعالم، مما يسمح ببناء نموذج ذري دقيق.
النتائج التي تم الحصول عليها حتى الآن تبين أنه، بمساعدة الاختبارات استنساخ الآلي سفير والحد الأدنى من عمليات التفتيش البصرية، والبروتوكول الحالي ينطبق عموما على أي نوع من الجسيمات واحد مشروع البرد إم. يتم عرض نتائج ممثل كل خطوة معالجة لإعادة إعمار TCDA1 السمفوتورهابدوس لومينزنس 21 ، والتي تم حلها إلى قرار شبه الذرية. ويمكن استخدام خرائط الكثافة ذات النوعية المتشابهة لبناء نماذج ذرية موثوقة من خلال تعقب العمود الفقري دي نوفو ، فضلا عن الصقل المتبادل أو الفضاء الحقيقي، وبالتالي توفير إطار هيكلي متين لفهم الآليات الجزيئية المعقدة.
أكسيون كوديس:
الإحداثيات لهيكل إم والأفلام غير المجهزة قد أودعت في البنك بيانات المجهر الإلكتروني والميكروسكوب التجريبي صورة أرشيف تحت أرقام الانضمام إمد-3645 و إمبيار-10089، على التوالي.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر D. روديرر ل تزويدنا TcdA1 ميكروغرافس. نشكر ستيف لودتك على دعمه المستمر للبنية التحتية EMAN2. وأيد هذا العمل أموال من جمعية ماكس بلانك (إلى ريال) والمجلس الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) (منحة رقم 615984) (إلى ريال) ومنحة من المعاهد الوطنية الصحة R01 GM60635 إلى باب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
References
- Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
- Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
- von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
- Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
- Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
- Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
- Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
- Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
- Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
- Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
- Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
- Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
- Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).
