Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

Published: May 16, 2017 doi: 10.3791/55448
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

Summary

Dette papir præsenterer en protokol til behandling af cryo-EM-billeder ved hjælp af softwarepakken SPHIRE. Den nuværende protokol kan anvendes til næsten alle enkeltpartikel-EM-projekter, der er rettet mod nær-atomopløsning.

Abstract

SPHIRE (SPARX til højopløsningselektronmikroskopi) er en ny åben, brugervenlig softwarepakke til halvautomatisk behandling af enkeltpartikelelektronkryomikroskopi (cryo-EM) data. Protokollen, der præsenteres her, beskriver detaljeret, hvordan man opnår en nær-atomopløsningsstruktur startende fra cryo-EM mikrograph-film ved at lede brugerne gennem alle trin i den enkelte partikelstrukturbestemmelsesrørledning. Disse trin styres fra den nye grafiske brugergrænseflade SPHIRE og kræver minimal brugerintervention. Ved anvendelse af denne protokol blev en 3,5 Å struktur af TcdA1, et Tc toxinkompleks fra Photorhabdus luminescens , afledt af kun 9500 enkeltpartikler. Denne strømlinede tilgang vil hjælpe nybegyndere uden omfattende behandlingserfaring og a priori strukturelle oplysninger for at opnå støjfrie og upartiske atommodeller af deres oprensede makromolekylære komplekser i deres oprindelige tilstand.

Introduction

Efter udviklingen af ​​direkte elektrondetektorteknologien omformes de bemærkelsesværdige fremskridt i single particle cryo-EM i øjeblikket om strukturel biologi 1 . Sammenlignet med røntgenkrystallografi kræver denne teknik kun en lille mængde proteinmateriale uden behov for krystallisation, samtidig med at der stilles færre restriktioner for renhed af prøven og stadig tillader bestemmelse af strukturer ved næratomisk opløsning. Vigtigt kan forskellige sammensætninger eller tilstande nu beregnes adskilt, og strukturbestemmelsen af ​​de forskellige konformationer kan udføres ved hidtil uset detaljeringsniveau. For nylig kunne tæthedskort af udfordrende molekyler fremstilles ved opløsninger, der tillod de novo modelbygning og dermed en dyb forståelse af deres virkemåde 2 , 3 , 4 , 5.

En bred vifte af billedbehandlingsprogrammer er tilgængelige i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samfundet (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), og de fleste af dem er under kontinuerlig udvikling. Næratomisk opløsning er opnået for proteiner, der udviser forskellige molekylvægte og symmetrier med flere forskellige softwarepakker, herunder EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 og SPARX 11 . Hver pakke kræver et andet niveau af brugerkompetence og giver et andet niveau af brugervejledning, automatisering og udvidelighed. Desuden, mens nogle programmer giver komplette miljøer til at lette alle trin i billedanalyse, er andre designet til at optimere specifikke opgaver, såsom forfining af justeringsparametre fra en kendt rEference struktur. For nylig er der udviklet flere platforme, herunder APPION 12 og SCIPION 13 , der giver en enkeltbehandlingsrørledning, der integrerer tilgange og protokoller fra de forskellige softwarepakker, der er anført ovenfor.

For at bidrage til den nuværende udvikling af cryo-EM blev SPARX genudviklet til en ny stand-alone og komplet platform for enkeltpartikelanalyse, kaldet SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy). For at øge tilgængeligheden af ​​teknikken til nye forskere på området og at klare den store mængde data, der produceres af moderne fuldt automatiserede high-end elektronmikroskoper, blev behandlingsrørledningen redesignet og forenklet ved at indføre en nem at bruge Grafisk brugergrænseflade (GUI) og automatisering af de vigtigste trin i arbejdsgangen. Derudover blev nye algoritmer tilsat for at tillade hurtig, reproducerbar og automatiseret strukturbestemmelse fra crYo-EM billeder. Endvidere blev validering ved reproducerbarhed indført for at undgå almindelige artefakter produceret under raffinering og heterogenitetsanalyse.

Selv om programmet blev ændret i vid udstrækning, blev dets værdsatte kerneegenskaber opretholdt: ligefrem åben kildekode, det moderne objektorienterede design og Python-grænseflader til alle grundlæggende funktioner. Således blev det ikke ændret til et sort box-program, der gør det muligt for brugerne at studere og nemt ændre Python-koden, for at oprette yderligere applikationer eller ændre den samlede arbejdsgang. Dette er især nyttigt for ikke-standardiserede cryo-EM projekter.

Her præsenterer vi en protokol for at opnå et nær-atomisk opløsningstæthedskort fra cryo-EM-billeder ved hjælp af GUI fra SPHIRE. Det beskriver i detaljer alle trin, der kræves for at generere et tæthedskort fra rå cryo-EM direkte detektorfilm og er ikke begrænset til en bestemt makromolekyltype. Denne protokol har primært til hensigt at lede newcOmers i feltet gennem arbejdsgangen og give vigtige oplysninger om vigtige trin i behandlingen samt nogle af de mulige faldgruber og forhindringer. Mere avancerede funktioner og den teoretiske baggrund bag SPHIRE vil blive beskrevet andetsteds.

Protocol

BEMÆRK: For at følge denne protokol er det nødvendigt at installere SPHIRE korrekt på et system med en MPI-installation (i øjeblikket en Linux-klynge). Download SPHIRE og TcdA1 datasættet fra http://www.sphire.mpg.de og følg installationsvejledningen: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Denne procedure installerer også EMAN2. SPHIRE bruger i øjeblikket EMAN2s e2boxer til partikelvalg og e2display til visning af billedfiler. Til dosisvægtet bevægelseskorrektion af de rå mikrograffilm bruger SPHIRE unblur 14 . Download programmet og følg installationsvejledningen (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). Til interaktiv visualisering af de resulterende strukturer bruger protokollen det molekylære grafikprogram Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). En god tutorial til at blive fortrolig med de funktioner, der anvendes i hele denne protokol, kan være fouNd her: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Instruktioner for, hvordan man indsender et parallel job til en klynge fra SPHIRE GUI kan findes her: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. Den overordnede organisering af SPHIRE GUI og de vigtigste trin i arbejdsgangen udført i hele denne protokol er illustreret i figur 1 .

1. PROJEKT: Indstil konstante parameterværdier for dette projekt

  1. Start SPHIRE GUI-applikationen ved at skrive " sphire &" og ENTER-tasten i et terminalvindue .
  2. Juster de projektorienterede parametre ( fx pixelstørrelse, partikeldiameter og symmetri) i de respektive indtastningsfelter på projektindstillingssiden, og registrer derefter disse værdier for alle efterfølgende trin i arbejdsgangen.
    1. Klik på "PROJECT" -ikonet nederst til højre på venstre panel for at åbne projektindstillingssiden.
      2. fx hvis en partikel er 200 Å lang, og pixelstørrelsen er 1,2 Å / pixel, så er den længste akse af partiklen 200 / 1,2 = ~ 166 pixels og radius 166/2 = 83 pixels).
    2. Indstil "Partikelboksstørrelse" til mindst 1,5 gange partikelstørrelsen. Undgå vinduestørrelser med stort primtal. Husk også, at 3D-raffinementalgoritmen i øjeblikket kræver en lige nummereret bokstørrelse.
      BEMÆRK: Vinduet skal indeholde en margin for at tage højde for initial centreringsfejl som følge af plukning (behovet for at skifte partikler inde i vinduet) og for den tilstrækkelige baggrundsregion uden for partikelgrænsen for en korrekt CTF-korrektion (især vigtig for store defokusværdier
    3. Indstil "CTF-vinduestørrelse" til "af partikelboksstørrelse". For projekter med lav kontrastdata skal du bruge et større vindue til at opnå jævnere estimater af effektspektre.
    4. Indstil "Point-group symmetri" af komplekset ( f.eks. "C5"). Hvis symmetrien for målstrukturen ikke er kendt, lad den stå ved "C1" (asymmetrisk). Men hvis en specifik højordenssymmetri er identificeret senere under behandlingen, skal du ændre denne symmetriindstilling i overensstemmelse hermed og gentage trinene efter 2D-justering med ISAC.
    5. Indstil "Proteinmolekylmasse" i kDa (omtrentlig værdi er tilstrækkelig). Tryk på knappen "Registrer indstillinger".

2. MOVIE: Juster rammerne for hver filmmikrografi for at korrigere prøvens samlede bevægelse

  1. For alle film mikrografer beregner du x / y-skiftene for alle rammer og derefter opretter deres dosis uvægtede og dosisvægtede moKorrigeret gennemsnit (se diskussion). Bemærk, at førstnævnte kun er nødvendig til CTF estimeringen, fordi estimeringen ikke fungerer godt med de dosisvægtede gennemsnit, mens sidstnævnte anvendes til alle de andre trin i strukturbestemmelsen.
    1. Klik på "MOVIE" ikonet og derefter "Micrograph Movie Alignment" knappen. Angiv "Unblur eksekverbar sti" ved at vælge den eksekverbare fil. Indstil "Input micrograph path pattern" ved at vælge en rå unaligned movie micrograph og erstatte den variable del af filnavne med wildcard "*" ( f.eks. TcdA1 _ *. Mrc). Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Indstil "Summovie eksekverbar sti" ved at vælge den eksekverbare fil.
    3. Indstil "Antal filmrammer" til antallet af rammer i hver filmmikrograf. Indstil "Microscope voltage" og "Per frame exposure" til de værdier, der bruges under dataindsamling. (For eksempelLe, hvis den samlede dosis er 60 e / / 2 med 20 billeder optaget uden foreksponering, er eksponeringen for hver ramme 60/20 = 3 e / A 2. ) Tryk på "Kør kommando" knappen for at justere Rammer af hver film mikrografi.
      BEMÆRK: Dette skaber automatisk to outputkataloger, der indeholder henholdsvis dosis uvægtet og dosisvægtet bevægelseskorrigeret gennemsnitlig mikrograf.

3. CTER: Vurder CTF's defokus og astigmatismeparametre

  1. Estimere CTF parametrene (defokus og astigmatisme; de ​​andre er indstillet af brugeren) for hver dosis uvægtet gennemsnit mikrografi.
    1. Klik på "CTER" -ikonet og derefter på knappen "CTF Estimation". For at indstille "Input micrograph path pattern", vælg en dosis uvægtet bevægelsesrettet micrograph, og erstat derefter den variable del af filnavne med jokertegnet"*". Angiv også banen til "Output-mappe".
    2. Indstil "Amplitudkontrast" til den værdi, der rutinemæssigt anvendes til typen af ​​data (istykkelse er en stor faktor) og mikroskopspænding i laboratoriet ( f.eks. 10%). Typiske værdier er i området 7-14% 17 .
    3. Indstil "Mikroskop sfærisk aberration (Cs)" og "Mikroskop spænding", der anvendes under dataindsamling.
    4. Indstil "Laveste frekvens" og "Højeste frekvens" af søgeområdet for CTF-modeltilpasningen til henholdsvis 0,0285 og 0,285 Å -1 (40-4 Å). Tryk på knappen "Kør kommando" for at estimere CTF-parametrene.
      BEMÆRK: CTF-parametrene gemmes automatisk i filen partres.txt i den angivne outputkatalog. CTF estimeringen af ​​de 112 mikrografer blev beregnet på 96 kerner og afsluttet efter ~ 3 minutter på Linux-klyngen, der blev brugt til at opnå de repræsentative resultater.

4. vindue: ekstraher partikler fra de dosevægtede gennemsnitlige mikrografer

  1. Vælg partikler manuelt eller automatisk fra mikrografier med e2boxer 6 og opret koordinatfiler, der hver indeholder en liste over partikel xy-koordinater i den tilknyttede mikrograf.
    1. Klik på "WINDOW" ikonet og derefter på "Particle Picking" knappen. Tryk på knappen "Kør kommando" for at starte e2boxer 6 og vælg partiklerne for hver mikrografi manuelt eller automatisk 18 (se Diskussion ). Gem de endelige partikelkoordinater for hver mikrografi i EMAN1 filformat (.box). Alternativt kan du importere koordinatfiler fra andre programmer efter at have konverteret dem til EMAN1-format.
  2. Opret partikelstabler ved at ekstrahere partikelbilleder fra de dosebelagte mikrografer (i SPHIRE er partikelstaben ofteEn kaldes simpelthen "stack").
    1. Tryk på knappen "Partikeludvinding". Angiv "Input micrograph path pattern" ved at vælge en dosisvægtet bevægelsesrettet mikrograph og derefter erstatte den variable del af filnavnet med wildcard "*" ( f.eks. TcdA1 _ *. Mrc). Tilsvarende skal du indstille "Input coordinates path pattern" ved at vælge en koordinatfil ( f.eks. TcdA1 _ *. Boks). Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Indstil "CTF parametre kilde" ved at vælge parameteren CTF parameter (partres.txt produceret i trin 3.1). Tryk på knappen "Kør kommando".
  3. Kombiner de ekstraherede partikelbilledstabler i en enkelt.
    1. Klik på "Particle Stack" knappen. Angiv stien til "Output virtual image stack" ved hjælp af et BDB filformat ( f.eks. "Bdb: Partikler / stak", hvor "Partikler" peger påE-mappe, der indeholder en BDB-databasekatalog, hvis navn altid er EMAN2DB, og "stack" refererer til en bestemt billedstabel i denne database). Angiv "Input BDB image stack pattern" ved at vælge en mappe der starter med "mpi_proc" og derefter erstatte den variable del af katalognavne med wildcard "*" ( fx Partikler / mpi_proc_000 til Partikler / mpi_proc_ *). Tryk på knappen "Kør kommando".

5. ISAC: Klassificering af partikelbilleder i 2D

  1. Beregn 2D klasse gennemsnit ved at tilpasse partikler og clustere dem i overensstemmelse med deres 2D udseende.
    BEMÆRK: De resulterende 2D-gennemsnit har et forbedret signal-støjforhold (SNR) sammenlignet med de enkelte partikelbilleder og bruges således til visuelt at vurdere kvaliteten og heterogeniteten af ​​datasættet samt at sortere uønskede billeder fra stakken ( Fx iskrystaller, kulkanter,Aggregater, fragmenter og osv. ) 19 . Desuden vil de efterfølgende blive brugt til at bestemme en indledende 3D-model.
    1. Klik på ikonet "ISAC" og derefter på "ISAC - 2D Clustering" knappen. Sæt "Input image stack" ved at vælge stakken fil, der indeholder de ekstraherede partikler. Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Brug 200 - 1000 for "Billeder pr. Klasse". Vælg det passende antal i betragtning af det forventede antal 2D-klasser (det samlede antal partikler divideret med antallet af billeder pr. Klasse). Juster denne parameter afhængigt af SNR og størrelsen af ​​datasættet. Forøg antallet af medlemmer pr. Klasse, hvis datasættet er for støjende. Reducer nummeret, når et lavt antal partikler er til rådighed.
      BEMÆRK: På grund af hukommelsesbegrænsninger deles det fulde datasæt i delgrupper for ret store datasæt (> 100.000 partikler), udfører ISAC for hver delsæt uafhængigt og kombinererResultaterne i slutningen. Detaljerede instruktioner til dette behandlingsscenarie findes på http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. Marker afkrydsningsfeltet "Fase-flip". Hold standardværdierne for "Målpartikelradius" og "Mål partikelbilledstørrelse" for at fremskynde processen ved automatisk at krympe alle partikelbilleder med disse indstillinger. Tryk på "Kør kommando" knappen for at beregne 2D klasse gennemsnit.
      BEMÆRK: Dette trin er computationally krævende, og løbetiden stiger signifikant med antallet af partikler og klasser samt målradius og billedstørrelse. På en klynge med 96 processer blev 2D-klassifikationen på ~ 10.000 partikler færdig efter ca. 90 minutter.
  2. Vis og visuelt inspicere de resulterende ISAC 2D-gennemsnit for at sikre, at deres kvalitet er tilfredsstillende (se Diskussion).
    1. Tryk på knappen "Display Data" under "UTILITIES". Indstil "; Indtast filer "ved at vælge filen indeholdende ISAC 2D-gennemsnitene (class_averages.hdf produceret i trin 5.1). Tryk på knappen" Kør kommando "for at få vist de endelige reproducerbare og validerede klasse-gennemsnit, der leveres af ISAC.
  3. Opret en ny stak, der kun omfatter partikelmedlemmerne i de validerede klassemiddeldata.
    1. Tryk på knappen "Create Stack Subset". Indstil "Input image stack" ved at vælge den samme stack-fil som i trin 5.1.1. Indstil "ISAC-gennemsnit" ved at vælge ISAC 2D-gennemsnitene (class_averages.hdf produceret i trin 5.1). Angiv stien for "Output-mappe". Tryk på knappen "Kør kommando".

6. VIPER: Beregn en indledende 3D-model

  1. Vælg et lille sæt af klassens gennemsnit (≥100 billeder) ved at slette alle dårlige klasse gennemsnit og identiske visninger af partiklen (se Diskussion) og brug dem til at beregne en repRoducible initial model ved hjælp af VIPER. Husk at udvælgelsen skal indeholde mindst 60-80 højkvalitets gennemsnit med ~ 200-500 medlemmer hver.
    1. Klik på "VIPER" ikonet og derefter "Display Data" knappen. Indstil "Input-filer" ved at vælge ISAC 2D-gennemsnitene (class_averages.hdf produceret i trin 5.1). Tryk på knappen "Kør kommando".
    2. Tryk på midterste knap et eller andet sted i grafikvinduet på e2displayet, og aktiver "DEL" -knappen i pop op-vinduet. Slet alle dårlige klasse gennemsnit og identiske syn på partiklen (se Diskussion ). Tryk på "Save" knappen for at gemme de resterende 2D klasse gennemsnit til en ny fil.
  2. Fra de udvalgte ISAC-gennemsnit skaber en initial reference til den efterfølgende 3D-raffinement.
    1. Klik på knappen "Initial 3D Model - RVIPER". Indstil "Input images stack" ved at vælge den screenede klasseGennemsnit (produceret i trin 6.1). Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Sørg for at bruge samme værdi for "Målpartikelradius" som ISAC trin 5.1.3. Tryk på knappen "Kør kommando" for at generere en reproducerbar ab initio 3D-model.
      BEMÆRK: Dette trin er computationally krævende, og løbstiden stiger signifikant med antallet af gennemsnit og partikelstørrelsen. På en klynge med 96 processer blev dette job (~ 100 klasse gennemsnit) færdig efter ~ 15 min.
  3. Kontroller, om den resulterende 3D-model er rimelig ved at tage hensyn til klassens gennemsnit og desuden dens strukturelle integritet ( dvs. ingen afbrydede dele og / eller retningsgenstande). For at vise kortet skal du bruge programmet Chimera 15 . På dette tidspunkt udfører en første sammenligning med en krystalstruktur af et homologt protein eller et domæne af proteinet af interesse, hvis det eksisterer (et eksempel er vist i afsnittet RepreseNtative resultater).
  4. Til den efterfølgende 3D-raffinement genererer du en indledende 3D-reference og en 3D-maske fra en ab initio 3D-model ved at fjerne dens omgivende støj og omskalere den for at matche den oprindelige pixelstørrelse.
    1. Klik på knappen "Create 3D Reference". Indstil "Input volume" ved at vælge ab initio 3D model (average_volume.hdf produceret i trin 6.2). Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Indstil "Resample ratio source" ved at vælge ISAC shrink ratio fil (README_shrink_ratio.txt produceret i trin 5.1). Tryk på knappen "Kør kommando".

7. MERIDIEN: Definer den indledende 3D-lydstyrke

  1. Definer 3D-volumenet fra den oprindelige 3D-model.
    1. Klik på "MERIDIEN" ikonet, og derefter knappen "3D Refinement". Indstil "Input image stack" og "Initial 3D reference" af seleCting partikelstakken og ab initio 3D-modellen (produceret i henholdsvis trin 5.3 og 6.4). Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Indstil "3D-maske" ved at vælge 3D-maskefilen (produceret i trin 6.4). Brug altid en 3D-maske, men især i et tidligt stadium af analysen skal du bruge en sfærisk maske eller en blødkantet maske, der er løst monteret til referencen, for at undgå at introducere forstyrrelse af forkert maskering.
    3. Marker afkrydsningsfeltet "Anvend hard 2D maske". Indstil "Startopløsning" til en cutoff-frekvensværdi mellem 20 og 25 Å. Husk, at et lavpasfilter med denne cutoff-frekvens vil blive anvendt til den indledende 3D-struktur for at reducere den oprindelige model-bias.
    4. Kontroller specifikationerne for klyngen, der bruges til denne proces, og angiv derefter "Memory per node" til den tilgængelige hukommelse i gigabyte. Tryk på knappen "Kør kommando" for at finpudse 3D-volumenet fra den oprindelige 3D-model på en fuldstændig automatiseret måde.
  2. Opret en blødkantet 3D-maske fra det raffinerede volumen til det efterfølgende skærpningstrin.
    1. Klik på knappen "Adaptive 3D Mask". Indstil "Indgangsvolumen" ved at vælge en af ​​de ufiltrerede halvvolumener (fremstillet i trin 7.1). Angiv stien for "Output mask".
    2. Indstil en værdi af "Binarization threshold". Brug chimera for at sikre, at støjen ved denne særlige tærskel er klart uden for mængden af ​​interesse i opløsningsmiddelområdet i de ufiltrerede halvkort, og alle densiteter af proteinet er stadig cUbehæftet med hinanden. Tryk på knappen "Kør kommando" for at oprette 3D-masken med blød kant.
      BEMÆRK: Hovedkroppen af ​​den resulterende maske (bestående af voxels, hvis værdier er> 0,5), skal passe tæt på partikelstrukturen, men indesluter alligevel alle densiteter af interesse. Soft-edge-faldet skal være mindst 8-10 pixel bredt.
  3. Flett de to ufiltrerede halvvolumener opnået ved 3D-raffinement. Derefter skærp det fusionerede volumen ved at justere effektspektret baseret på detektorens modulationstransferfunktion (MTF), den estimerede B-faktor og FSC (Fourier Shell Correlation) estimatet af opløsningen.
    1. Vælg knappen "Skarphed". Indstil "Første ufiltreret halvvolumen" og "Andet ufiltreret halvvolumen" ved at vælge de tilsvarende filer (vol_0_unfil.hdf og vol_1_unfil.hdf produceret i trin 7.1). Brug altid "B-faktor ekstraudstyr". Hold normalt standardværdien for at eStig B-faktorværdien fra input-datasættet ved hjælp af intervallet mellem den endelige opløsningsfrekvens og 10 Å. Du kan også angive en ad hoc- værdi ( f.eks. -100).
    2. Hold standardværdien for "Lavpasfilterfrekvens" for at anvende et FSC-baseret filter.
    3. Indstil "Brugerdefineret maske" ved at vælge 3D-masken (produceret i trin 7.2). Husk at den rapporterede opløsning vil blive bestemt ved hjælp af FSC med denne maske. Tryk på knappen "Kør kommando" for at skærpe det raffinerede 3D-volumen.
  4. Generer 3D-vinkelfordelingskortet fra projektionsretningerne for alle partikler estimeret af 3D-raffinementstrinet ovenfor.
    1. Klik på knappen "Vinkelfordeling". Indstil "Justering parameter fil" ved at vælge filen (final_params.txt produceret i trin 7.1), og tryk på "Kør kommando" knappen.
  5. Visuelt inspicere den skarpe 3D-model ved hjælp af Chimera. Sørg for, at strukturen ser rimelig ud i betragtning af den opnåede opløsning (se Diskussion ).
  6. Visuelt inspicere vinkelfordelingen ved hjælp af Chimera. Kontroller, at fordelingen dækker omtrent det samme hele 3D-vinkelrummet. Husk på, at for symmetriske strukturer er fordelingen begrænset inden for den unikke asymmetriske trekant.

8. SORT3D: Sorter 3D-heterogenitet ved at fokusere på de meget variable regioner

  1. Beregn 3D-variabilitetskortet fra partikelstakken, der anvendes i 3D-raffinementet.
    1. Klik på "SORT3D" ikonet og derefter "3D Variability Estimation" knappen. Indstil "Input image stack" ved at vælge den samme screenede partikelstabel givet til 3D raffinement trin 7.1.1. Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Hold standardværdien for "Antal fremskrivninger".
      BEMÆRK: Billederne fra den vinklede naboHood bruges til at estimere 2D variansen ved hver 3D projektionsvinkel. Jo større tallet er, jo mindre støjende estimatet, men jo lavere opløsningen og rotationsartefakterne er mere udtalt.
    3. Marker afkrydsningsfeltet "Brug CTF". Tryk på knappen "Kør kommando".
  2. Brug 3D-variabilitetskortet til at oprette en fokusmaske til 3D-clusteringstrinnet nedenfor.
    1. Vælg knappen "Binary 3D Mask". Indstil "Input Volume" ved at vælge 3D-variabilitetskortet (produceret i trin 8.1). Angiv filstien for "Output mask".
    2. Indstil "Binarization threshold" ved at bruge output fra feltet "Level" i "Volume Viewer" af Chimera. Tryk på knappen "Kør kommando".
  3. Sorter partikelbilleder i homogene strukturelle grupper ved at fokusere på strukturelt stærkt variable regioner.
    1. Tryk på knappen "3D Clustering - RSORT3D".Indstil "Input 3D-raffinementskatalog" ved at vælge outputkatalogen for 3D-raffinement (fremstillet i trin 7.1). Angiv stien for "Output-mappe".
    2. Indstil "3D-maske" ved at vælge den bløde kantede 3D-maske (fremstillet i trin 7.2). Indstil "Focus 3D mask" ved at vælge det binæriserede 3D-variabilitetskort (produceret i trin 8.2).
    3. For store datasæt skal du bruge mindst 5.000-10.000 for "Billeder pr. Gruppe". Husk, at programmet altid holder antallet af billeder pr. Gruppe lavere end denne indstilling. Juster værdien ved at overveje det forventede antal 3D-grupper (det samlede antal partikler divideret med værdien "Billeder pr. Gruppe"), datasættet, SNR og graden af ​​heterogenitet. Start med ~ 5-10 indledende 3D-grupper, hvis et tilstrækkeligt antal partikler er til rådighed, medmindre der forventes et højere antal forskellige strukturelle tilstande i datasættet.
    4. Brug mindst 3.000-5.000 partikler til "Mindste gruppestørrelse".Bemærk, at programmet vil se bort fra grupper med et lavere antal billeder end indstillingen "Mindste gruppestørrelse". Tryk på knappen "Kør kommando" for at udføre 3D-clustering.
      BEMÆRK: RSORT3D er opdelt i to trin. Det første "sort3d" trin sorterer ud 3D heterogenitet. Derefter rekonstruerer den volumenerne af hver homogen strukturkoncern ved anvendelse af 3D-justeringsparametrene bestemt ved 3D-raffinementstrinet ovenfor. Det andet trin "rsort3d" finder ud af reproducerbare medlemmer af hver gruppe ved at udføre en tovejs sammenligning af de to uafhængige sorteringsruter. Derefter rekonstruerer det homogene strukturer under anvendelse af kun de reproducerbart tildelte partikler. På en klynge med 96 kerner sluttede dette job (~ 8.000 partikler, 352 kasse størrelse) efter ca. 3 timer.
  4. Når programmet er færdigt, skal du bruge Chimera til at vælge en homogen 3D-gruppe. Vælg strukturen af ​​den højeste tilsyneladende opløsning, typisk forbundet med de mest poPulous gruppe. Sørg for, at den valgte struktur er visuelt rimelig ved at tage højde for 2D-klassens gennemsnit og biologiske aspekter af proteinet af interesse (se Diskussion ). Hvis der er andre volumener, der har en næsten ensartet struktur ved tilsvarende opløsning, betragter dem som at komme ud fra en enkelt homogen 3D-gruppe.
  5. Udfør en lokal forfining mod partikelmedlemmerne i den mest homogene 3D-gruppe (med den højeste opløsning).
    1. Klik på knappen "Local Subset Refinement". Indstil "Subset Text File path" ved at vælge tekstfilen indeholdende partikel-ID'erne for den valgte gruppe ( f.eks. Cluster0.txt produceret i trin 8.3). Indstil "3D-raffinementskatalog" ved at vælge outputkatalogen i den tidligere 3D-raffinement (fremstillet i trin 7.1).
    2. Sæt "Genstart iteration" til den, hvor den højeste opløsning er opnået i den foregående 3D-raffinement. Tryk påKnappen "Kør kommando" for at udføre en lokal forfining af den valgte population af partikler.
  6. I lighed med trin 7.2 opretter du en blødkantet 3D-maske fra et ufiltreret endelige halvvolumen rekonstrueret af den lokale delmængdefinement.
  7. I lighed med trin 7.3 sammenfletes to ufiltrerede endelige halvvolumener, der er afledt af den lokale subsætraffinering og skærper det fusionerede volumen. Filtrer ikke skærpet lydstyrke denne gang.
    BEMÆRK: Hvis heterogenitetsanalysen i trin 8.4 angiver flere forskellige stater ved sammenlignelig opløsning, kan man selvstændigt forfine alle forskellige tilstande.

9. LOCALRES: Estimér den lokale opløsning af den endelige 3D-volumen

  1. Estimere den lokale opløsning af 3D-volumenet opnået fra det homogene sæt af partikler.
    1. Klik på "LOCALRES" -ikonet og derefter på knappen "Lokal opløsning". Indstil "Første halvvolumen" og "Anden halvdel-volumen "ved at vælge de ufiltrerede endelige halvvolumener af den lokale subset-raffinement (fremstillet i trin 8.5). Indstil" 3D-maske "ved at vælge den bløde kantede 3D-maske produceret i trin 8.6. Angiv filstien for" Output volume " .
    2. Hold standardværdien på 7 pixel for "FSC-vinduestørrelse". Husk, at denne indstilling definerer størrelsen af ​​vinduet, hvor den lokale reale rumskorrelation beregnes; Større vinduestørrelser giver jævnere opløsningskort på bekostning af lokal opløselighed.
    3. Hold standardværdien 0,5 af "Resolution cut-off" for opløsningskriterium.
      BEMÆRK: For hver voxel vil programmet rapportere den lokale opløsning som den frekvens, hvormed den lokale FSC falder under den valgte opløsningstærskel. En tærskel lavere end 0,5 anbefales ikke, fordi lavere korrelationsværdier har høj statistisk usikkerhed. Derfor vil den tilsvarende lokale opløsning variere stærkt mellem voxels.
    4. For "OveraLl opløsning ", indstil den absolutte opløsning, der anslås i skæringen efter den lokale delmængdeforbedring (trin 8.7). Tryk på knappen" Kør kommando "for at beregne den lokale opløsning af lydstyrken.
  2. Anvend det lokale 3D-filter til lydstyrken, der skærpes efter den lokale sub-raffinement, ved hjælp af det lokale 3D-opløsningskort.
    1. Klik på knappen "3D Local Filter". Indstil "Input volume" ved at vælge det skærpet men ufiltreret 3D-volumen (produceret i trin 8.7). Tilsvarende skal du angive "Local Resolution File" og "3D mask" (produceret i henholdsvis trin 9.1 og 8.6). Husk at 3D-masken definerer den region, hvor den lokale filtrering skal anvendes. Angiv filstien for "Output volume". Tryk på knappen "Kør kommando" for at anvende det lokale 3D-filter.
  3. Brug chimera til visuelt at inspicere den endelige 3D-model og det lokale 3D-opløsningskort (produceret i trin 9,2 og 9,1 resp.ectively). Vælg indstillingen "Overfladefarve" for at farve 3D-volumenet i henhold til den lokale opløsning. Husk, at fordelingen af ​​lokal opløsning skal være glat (se Diskussion ).

Representative Results

Protokollen beskrevet ovenfor blev udført ud fra 112 direkte detektorfilm fra A-komponenten af Photorhabdus luminescens Tc-komplekset (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Dette datasæt blev optaget på et Cs-korrigeret elektronkryo-mikroskop med en højlysstyrkefeltemissionskanon (XFEG), der drives ved en accelerationsspænding på 300 kV. Billederne blev erhvervet automatisk med en samlet dosis på 60 e - / Å -2 ved en pixelstørrelse på 1,14 Å på prøve skalaen. Efter justering af filmrammerne ( Protokol Trin 2 ) havde de resulterende bevægelseskorrigerede middelværdier isotrope Thon-ringe, der strækker sig til høj opløsning ( figur 2a ). De enkelte partikler var let synlige og godt separerede ( figur 2b ). Partikler blev plukket ved anvendelse af sværktøjet af e2boxerLass = "xref"> 18 ( Protokol Trin 4.1 ). I dette tilfælde blev der fastsat en passende tærskel ved hjælp af den mere selektive indstilling ( figur 2c ). De 112 digitale mikrografer gav 9.652 partikler. Størstedelen af ​​de ekstraherede billeder ( Protokol Trin 4.2 ) indeholdt veldefinerede partikler, og deres kasse størrelse var ~ 1,5 gange større end partikelstørrelsen som anbefalet ( figur 2d ). Ved anvendelse af ISAC blev der derefter udført en 2D heterogenitetsanalyse ( Protokol Trin 5 ). Det gav 98 klasse gennemsnit ( figur 3a ). Ved hjælp af disse 2D klasse gennemsnit blev en ab initio model beregnet ved hjælp af VIPER ( Protocol Step 6 ) ved mellemliggende opløsning ( Figur 3b ). Denne model viser fremragende aftale med krystalstrukturen af ​​TcdA1, der tidligere er løst ved 3,9 Å opløsning 22 ( figur 3c ). Denne ab initio model blev brugt som en indledende tem Plade til 3D-raffinement (MERIDIEN), der giver en 3,5 Å (0,143 kriterium) rekonstruktion ( Protokol Trin 7 ) fra kun ~ 40.000 asymmetriske enheder ( Figur 4 ). Dette kort over atomopløsning blev opnået inden for 24 timer, idet der blev brugt op til 96 CPU'er til trinene i arbejdsgangen, der har gavn af flere kerner.

Til 3D-variabilitetsanalysen ( protokolstrin 8) blev kun 2.000 partikelbilleder pr. Gruppe anvendt i trin 8.3.3 ( dvs. processen starter med 5 indledende 3D-grupper) og 200 billeder for den mindste gruppestørrelse i trin 8.3.4 på grund af Det lille antal partikler (~ 10.000). Analysen afslørede lokaliseret fleksibilitet hovedsageligt i det N-terminale område af komplekset, der indeholder His-mærket anvendt til oprensning ( Figur 5a ). Faktisk blev tolv N-terminale rester og His-mærket ikke løst i den tidligere offentliggjorte krystalstruktur af TcdA1"> 22 og denne sandsynligvis forstyrrede region forblev uopløst i den nuværende cryo-EM-densitet, sandsynligvis på grund af dens fleksibilitet. Yderligere variabilitet blev detekteret ved receptorbindende domæner og BC-bindingsdomænet ( Figur 5a ). Tilfredsstillende opbygning af strukturen og datasættets ret lille størrelse, blev denne heterogenitet besluttet at være tolerabel, og derfor blev en fokuseret 3D klassifikation 23 ikke udført. Endelig blev den lokale opløsning af slutdensitetskortet beregnet ( protokol trin 9.1, figur 5b ) og det skarpe 3D-kort blev lokalt filtreret ( protokol trin 9.2) . Et volumen af ​​denne kvalitet kan anvendes til de novo- modelbygning ved anvendelse af Coot 24 eller ethvert andet raffineringsværktøj ( figur 6 ).

figur 1
<Strong> Figur 1: Billedbehandling ved hjælp af SPHIRE. ( A ) GUI i SPHIRE softwarepakken. Et bestemt trin i workflow kan aktiveres ved at vælge det respektive piktogram på venstre side af GUI'en ("workflow-trin"). Kommandoer og hjælpeprogrammer, der er knyttet til dette trin i arbejdsgangen, vises i det centrale område af GUI'et. Efter at have valgt en af ​​kommandoerne, vises de respektive parametre i det højre område af GUI'en. Avancerede parametre kræver normalt ikke ændring af de forudindstillede standardværdier. ( B ) Stages i arbejdsprocessen for enkeltpartikel billedbehandling ved hjælp af SPHIRE GUI. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Bevægelseskorrektion og partiskLe ekstraktion. ( A , b ) Typisk højkvalitets, lavdosis, drift-korrigeret digital mikrograf registreret ved en defokus på 1,7 μm. Bemærk, at de isotropiske Thon-ringe strækker sig til en opløsning på 2,7 Å i effektspektret (a) og de velkendte partikler i 2D-billedet ( b ). ( C ) Partikelvalg ved anvendelse af e2boxer. Grønne cirkler angiver udvalgte partikler. ( D ) Typiske råpartikler ekstraheret fra den dosisvægtede mikrograf. Skalestænger = 20 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: 2D Clustering og Initial Model Generation. ( A ) Galleri med 2D klasse gennemsnit, med de fleste repræsentative sidevisninger o F partiklen. Skalbjælke = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-kort over TcdA1 opnået ved hjælp af RVIPER fra referencefrit klasse gennemsnit. ( C ) Kropsbygning af TcdA1-krystalstrukturen (bånd) (pdb-id 1VW1) i den oprindelige kryo-EM-tæthed (gennemsigtig grå). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Cryo-EM 3D struktur af TcdA1. ( A , b ) Endelig 3,5 Å tæthedskort over TcdA1 beregnet ved brug af ~ 9.500 partikelbilleder: ( a ) side og ( b ) ovenfra. ( C ) Repræsentative områder af cryo-EM-densiteten for en a-helix og en β-ark.Arge.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: Variabilitetsanalyse og lokal opløsning. ( A ) Overflade af den skærpet TcdA1 cryo-EM-kort (grå) og variabilitetskortet (grønt). For bedre klarhed blev variabilitetskortet lavpasfiltreret til 30 Å. ( B ) Overfladegengivelse af TcdA1-skærpet cryo-EM-kort farvet i henhold til lokal opløsning (Å). Bemærk den topologiske aftale mellem områder med høj variabilitet og lav lokal opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6
Figur 6: 3D ModEl Bygning af TcdA1 ved hjælp af Coot. Repræsentative regioner af cryo-EM-densiteten og atommodellen er vist for en a-helix. Atommodellen blev bygget de novo ved hjælp af Coot. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Enkeltpartikelkryo-EM har vist en hurtig udvikling i de seneste år og leveret talrige atomopløsningsstrukturer af makromolekylære komplekser med stor biologisk betydning 25 . For at understøtte det store antal nybegyndere, der aktuelt kommer ind i feltet, udviklede vi single-particle image analyse platformen SPHIRE og præsenterer her en gennemgangsprotokol for hele workflowen herunder filmjustering, partikelplukning, CTF estimering, indledende model Beregning, 2D og 3D heterogenitetsanalyse, høj opløsning 3D raffinement og lokal opløsning estimering og filtrering.

Den her beskrevne protokol er beregnet som en kort vejledning til 3D-strukturbestemmelse ved anvendelse af cryo-EM mikrografer af proteinet af interesse og ved hjælp af beregningsværktøjer tilvejebragt af SPHIRE's stand-alone GUI.

Hovedtræk i arbejdsgangen er det mestAf procedurerne skal kun køres én gang, da de er afhængige af begrebet validering ved reproducerbarhed 19 og ikke kræver parameterjustering. Denne automatiske valideringsmekanisme er en hovedfordel ved SPHIRE over andre softwarepakker, da resultaterne er tilbøjelige til at være objektive såvel som reproducerbare og vigtigst af alt opnåelige til en acceptabel beregningskostnad. Rørledningen giver desuden et væld af diagnostiske oplysninger for erfarne brugere at foretage yderligere uafhængig validering og vurdering med egne metoder. Ikke desto mindre skal en nybegynder bruger, der har mindst elementær teoretisk baggrund i strukturbiologi og elektronmikroskopi, kunne opnå strukturer med nær atomopløsning ved brug af egne data og de automatiske valideringsprocedurer.

At opnå en nær-atomopløsningsstruktur er imidlertid ikke altid ligetil, og resultatet vil højst afhænge af kvaliteten af ​​prøven og input-dataen. For de procedurer, der præsenteres her, antages det, at der er til rådighed et tilstrækkeligt antal ukorrekte råmiljøer af høj kvalitet, med deres gennemsnit, der viser klart synlige homogene og tilfældigt orienterede enkeltpartikler. Generelt er der ingen begrænsninger med hensyn til symmetri, størrelse eller overordnet form af molekylet, men en lavmolekylær vægt kan være en begrænsende faktor, især når proteinet har en featurløs kugleform. Normalt er analyse af større, velordnede partikler med højpunkts-gruppesymmetri mindre krævende. Derfor anbefales det kraftigt for nybegyndere at køre den nuværende protokol først med et velkendetegnet cryo-EM datasæt. Enten SPHIRE-tutorial-dataene (http: /sphire.mpg.de) eller et af EMPIAR-indsendte datasæt (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råfilm er et godt udgangspunkt .

Ved behandling af egne data er det meget sandsynligt, at nogle datasæt eller nogle af billederne ikke vil tilfredsstille visse kvalifikationerTy kriterier. I denne sammenhæng ud over den automatiske stabilitet og reproducerbarhedskontrol, der udføres af programmet til større trin i arbejdsgangen, anbefales det stadig for brugerne at visuelt inspicere resultaterne ved visse "kontrolpunkter" i protokollen, især hvis den endelige rekonstruktion Er ikke tilfredsstillende.

Den første visuelle inspektion kan udføres på mikrografniveau efter filmjusteringen ( protokol trin 2 ) og CTF estimationen ( protokol trin 3 ). De resulterende bevægelseskorrigerede middelværdier bør vise klart synlige og velafskilte enkeltpartikler, og deres effektspektre skal vise klart synlige, isotrope Thon-ringe. Den rumlige frekvens, som de er synlige, definerer i de fleste tilfælde den højeste opløsning, som strukturen i princippet i sidste ende kan bestemmes af. Eksempler på et bevægelseskorrigeret gennemsnit af tilstrækkelig kvalitet og dens effektspektrum er vist i afsnittet & #34; Repræsentative resultater. "Outlier-billeder, der kan have en negativ indvirkning på det endelige resultat, kan fjernes ved hjælp af SPHIREs GUI-værktøjer til drift og CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

Med hensyn til partikel screening er det afgørende trin i SPHIRE-rørledningen 2D-klassifikationen ved brug af ISAC ( protokol trin 5.2) . Her skal brugeren kontrollere, at de reproducerbare 2D-klassemiddeldata identificeres automatisk ved hjælp af programmet, idet der vedtages en række orienteringer, der er tilstrækkelige til at dække vinkelrummet på lige fod. Hvis kvaliteten af ​​klassens gennemsnit ikke er tilfredsstillende (støjende og / eller uskarpe billeder) og / eller antallet af reproducerbare klasse gennemsnit er meget lavt, overveje at forbedre automatisk plukningskvalitet, optimere datasæt billeddannelse eller prøve forberedelse. I de fleste tilfælde er det ikke muligt at beregne en pålidelig rekonstruktion fra et datasæt, der ikke giver gode 2D klasse gennemsnit. Eksempler på høj kvalitet 2D klasse aveRaser vises i afsnittet "repræsentative resultater".

Mindst 100 klasse gennemsnit er påkrævet for at opnå en pålidelig indledende 3D model ved hjælp af RVIPER på en automatiseret måde ( Protokol trin 6.1 ). For dette trin skal brugeren vælge gennemsnitene med højeste kvalitet og inddrage så mange forskellige orienteringer af partiklen som muligt. Kvaliteten af ​​den oprindelige model er afgørende for succesen med den efterfølgende højopløsnings 3D-raffinement.

I andre softwarepakker udføres der undertiden 3D-klassificering for at fjerne "dårlige" partikler 8 , 9 . I SPHIRE elimineres de fleste af disse partikler automatisk allerede under 2D-klassificering ved brug af ISAC. Det anbefales derfor at udføre det beregningsintensive trin med 3D sortering, hvis rekonstruktionen og 3D variabilitetsanalysen angiver datasætets heterogenitet.

Vigtigst bør brugeren omhyggeligt inspicere de resulterende 3D-mængder omhyggeligt ( protokol trin 9.3 ) og bekræfte, at funktionerne i den pågældende densitet stemmer overens med den nominelle opløsning. Ved en opløsning på <9 Å bliver stanglignende densiteter svarende til a-helixer synlige. Ved en opløsning <4.5 Å er densiteter svarende til tråde i β-ark normalt godt adskilte og omfangsrige aminosyrer bliver synlige. Et kort med høj opløsning (<3 Å) skal vise tydelige sporbare sidekæder, hvilket gør det muligt at opbygge en nøjagtig atommodel.

Resultater opnået til dato viser, at den foreliggende protokol ved anvendelse af SPHIREs automatiske reproducerbarhedsprøver og minimal visuelle inspektioner generelt er anvendelig for enhver type enkeltpartikel-cryo-EM-projekt. Repræsentative resultater af hvert behandlingstrin vises for rekonstruktionen af ​​TcdA1-toksinet afPhotorhabdus luminescens 21 , som er blevet løst til nær-atomopløsning. Tæthedskort af tilsvarende kvalitet kan bruges til at konstruere pålidelige atommodeller ved hjælp af de novo backbone-sporing samt gensidig eller reel rumforfining og således tilvejebringe en solid strukturel ramme for forståelsen af ​​komplekse molekylære mekanismer.

ACCESSION CODES:

Koordinaterne til EM-strukturen og de ubehandlede film er blevet deponeret i Electron Microscopy Data Bank og Electron Microscopy Pilot Image Archive under tiltrædelsesnummer EMD-3645 og EMPIAR-10089.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker D. Roderer for at give os TcdA1 mikrografier. Vi takker Steve Ludtke for hans løbende støtte til EMAN2-infrastrukturen. Dette arbejde blev støttet af midler fra Max Planck Society (til SR) og Det Europæiske Råd under EU's syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) (tilskud nr. 615984) (til SR) og tilskud fra National Institutes of Sundhed R01 GM60635 til PAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPHIRE Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas  http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera University of California, San Francisco http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur Janelia Farm Research Campus, Ashburn http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot MRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridge http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2 Baylor College of Medicine, Houston http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 cores Max Planck Institute of Molecular Physiology Linux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope  FEI 300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detector FEI
EPU (automated data acquisition software) FEI https://www.fei.com/software/epu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Tags

Biochemistry strukturel biologi elektronmikroskopi elektronkryomikroskopi cryo-EM TEM enkeltpartikel billedbehandling softwareudvikling enkeltpartikelanalyse Tc-toksin
High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M.,… More

Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M., Merino, F., Voicu, H., Huang, Z., Penczek, P. A., Raunser, S., Gatsogiannis, C. High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE. J. Vis. Exp. (123), e55448, doi:10.3791/55448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter