Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

Published: May 16, 2017 doi: 10.3791/55448
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

Summary

I detta papper presenteras ett protokoll för bearbetning av cryo-EM-bilder med hjälp av programvarupaketet SPHIRE. Det föreliggande protokollet kan tillämpas för nästan alla enskilda partikel-EM-projekt som riktar sig mot när-atomupplösning.

Abstract

SPHIRE (SPARX för högupplösande elektronmikroskopi) är en ny öppen källkod, användarvänlig mjukvarusupport för halvautomatiserad behandling av data med enkelpartikelelektronkryo-mikroskopi (cryo-EM). Protokollet som presenteras här beskriver i detalj hur man erhåller en närbildsupplösningsstruktur som startar från cryo-EM mikrograph-filmer genom att styra användarna genom alla steg i bestämningsrörledningen för enkelpartikelstruktur. Dessa steg styrs från det nya grafiska användargränssnittet SPHIRE och kräver minst användarintervention. Med användning av detta protokoll härleddes en 3,5 Å-struktur av TcdAl, ett Tc- toxinkomplex från Photorhabdus luminescens , från endast 9500 enskilda partiklar. Detta strömlinjeformade tillvägagångssätt kommer att hjälpa nybörjare utan omfattande behandlingserfarenhet och a priori strukturell information, för att erhålla bullerfria och opartiska atommodeller av sina renade makromolekylära komplex i sitt ursprungsland.

Introduction

Efter utvecklingen av direktelektrondetektortekniken omformar den anmärkningsvärda framstegen i single particle cryo-EM för närvarande strukturella biologi 1 . Jämfört med röntgenkristallografi kräver denna teknik endast en liten mängd proteinmaterial utan behov av kristallisation, samtidigt som det ställer färre restriktioner avseende provets renhet och tillåter fortfarande bestämning av strukturer vid näratomisk upplösning. Viktigt är att olika kompositioner eller tillstånd nu kan beräknas separeras från varandra och strukturbestämning av de olika konformationerna kan utföras vid en aldrig tidigare skådad detaljnivå. Nyligen kunde täthetskartor av utmanande molekyler framställas vid resolutioner som möjliggjorde de novo modellbyggnad och därigenom djup förståelse av deras handlingssätt 2 , 3 , 4 , 5.

Ett brett utbud av programvarupaket för bildbehandling finns i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samhället (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) och de flesta av dem är under kontinuerlig utveckling. Nära atomupplösning har uppnåtts för proteiner som uppvisar olika molekylvikter och symmetrier med flera olika mjukvarupaket, inklusive EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 och SPARX 11 . Varje paket kräver en annan nivå av användarkunskap och ger en annan nivå av användarvägledning, automatisering och utökningsbarhet. Dessutom, medan vissa program ger fullständiga miljöer för att underlätta alla steg med bildanalys, är andra utformade för att optimera specifika uppgifter, såsom förfining av anpassningsparametrar som börjar från en känd rFördelstruktur. Mer nyligen har flera plattformar utvecklats, inklusive APPION 12 och SCIPION 13 , som tillhandahåller en enda bearbetningsrörledning som integrerar tillvägagångssätt och protokoll från de olika mjukvarupaket som anges ovan.

För att bidra till den nuvarande utvecklingen av kryo-EM, utvecklades SPARX till en ny fristående och komplett plattform för enkelpartikelanalys, kallad SPHIRE (SPARX för högupplösande elektronmikroskopi). För att öka tillgängligheten till tekniken för nya forskare inom fältet och hantera den stora mängd data som produceras av moderna helautomatiska avancerade elektronmikroskop, redigerades och förenklades bearbetningsrörledningen genom att introducera en enkel att använda Grafiskt användargränssnitt (GUI) och automatisering av de viktigaste stegen i arbetsflödet. Dessutom tillsattes nya algoritmer för att tillåta snabb, reproducerbar och automatiserad strukturbestämning från crYo-EM-bilder. Vidare infördes validering genom reproducerbarhet för att undvika vanliga artefakter producerade under förfining och heterogenitetsanalys.

Även om programmet var omfattande modifierat, behölls dess uppskattade kärnfunktioner: enkel öppen källkod, den moderna objektorienterade designen och Python-gränssnittet för alla grundläggande funktioner. Således blev det inte ändrat till ett svart lådprogram, vilket gör det möjligt för användare att studera och enkelt modifiera Python-koden, skapa ytterligare applikationer eller ändra det övergripande arbetsflödet. Detta är särskilt användbart för icke-standardiserade cryo-EM-projekt.

Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla en nära-atomisk upplösningstäthetskarta från cryo-EM-bilder med hjälp av GUI av SPHIRE. Det beskriver i detalj alla steg som krävs för att generera en täthetskarta från råcryo-EM direktdetektorfilmer och är inte begränsad till någon speciell makromolekyltyp. Detta protokoll avser främst att styra newcOmers i fältet genom arbetsflödet och ge viktig information om viktiga steg i behandlingen samt några av de möjliga fallgroparna och hindren. Mer avancerade funktioner och den teoretiska bakgrunden bakom SPHIRE kommer att beskrivas någon annanstans.

Protocol

OBS! För att följa detta protokoll är det nödvändigt att installera SPHIRE på ett system med en MPI-installation (för närvarande ett Linux-kluster). Ladda ner SPHIRE och TcdA1 dataset från http://www.sphire.mpg.de och följ installationsanvisningarna: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Denna procedur installerar också EMAN2. SPHIRE använder för närvarande EMAN2s e2boxer för partikelval och e2display för visning av bildfiler. För dosvägd rörelsekorrigering av de råa mikrographfilmerna använder SPHIRE unblur 14 . Ladda ner programmet och följ installationsanvisningarna (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). För interaktiv visualisering av de resulterande strukturerna kommer protokollet använda molekylärgrafikprogrammet Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). En bra handledning för att bli bekant med de funktioner som används i hela detta protokoll kan vara fouNd här: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Instruktioner för hur man skickar ett parallellt jobb till ett kluster från SPHIRE GUI kan hittas här: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. Den övergripande organisationen av SPHIRE GUI och de viktigaste stegen i arbetsflödet som utförs genom detta protokoll illustreras i Figur 1 .

1. PROJEKT: Ställ in parametervärden för detta projekt

  1. Starta SPHIRE GUI-applikationen genom att skriva " sphire &" och ENTER- tangenten i ett terminalfönster .
  2. Justera de projektövergripande parametrarna ( t.ex. pixelstorlek, partikelradie och symmetri) i respektive inmatningsfält på projektinställningssidan och registrera sedan dessa värden för alla efterföljande steg i arbetsflödet.
    1. Klicka på "PROJEKT" -ikonen längst ner till höger på vänsterpanelen för att öppna projektinställningssidan.
      2. t.ex. om en partikel är 200 Å lång och pixelstorleken är 1,2 Å / pixel, så är partikelns längsta axel 200 / 1,2 = ~ 166 pixlar och radien 166/2 = 83 pixlar).
    2. Ställ in "partikelboxstorlek" till minst 1,5 gånger partikelstorleken. Undvik fönsterstorlekar som innehåller stort huvudnummer. Kom också ihåg att 3D-raffineringsalgoritmen för närvarande kräver en jämn numrerad rutans storlek.
      OBS! Fönstret bör innehålla en marginal för att ta hänsyn till initiala centreringsfel som uppstår vid plockning (behovet att byta partiklar i fönstret) och för den tillräckliga bakgrundsregionen utanför partikelgränsen för en korrekt CTF-korrigering (särskilt viktigt för stora defokusvärden
    3. Ställ in "CTF-fönsterstorlek" till den för "Partikelboxstorlek". För projekt med låg kontrastdata, använd ett större fönster för att få smidigare uppskattningar av effektspektra.
    4. Ange "Punktgruppsymmetri" för komplexet ( t.ex. "C5"). Om symmetrin för målstrukturen inte är känd, lämna den vid "C1" (asymmetrisk). Om emellertid en specifik högordenssymmetri identifieras senare under bearbetningen, ändra den här symmetriinställningen i enlighet därmed och upprepa stegen efter 2D-anpassning med ISAC.
    5. Ange "molekylmassa" i kDa (ungefärligt värde räcker). Tryck på knappen "Registrera inställningar".

2. FILM: Justera ramarna för varje filmmikrografi för att korrigera provets totala rörelse

  1. För alla filmmikrografer beräknar du x / y-skiften för alla ramar och skapar sedan sin dosviktiga och dosviktade moTionskorrigerat genomsnitt (se Diskussion). Observera att det förstnämnda är nödvändigt endast för CTF-uppskattningen, eftersom uppskattningen inte fungerar bra med de dosvägda genomsnittsvärdena medan den senare används för alla andra steg i strukturbestämningen.
    1. Klicka på "MOVIE" -ikonen och sedan på "Micrograph Movie Alignment" -knappen. Ange "Unblur exekverbar sökväg" genom att välja den körbara filen. Ställ in "Input micrograph path pattern" genom att välja en rå, oanpassad filmmikrograf och ersätta den rörliga delen av filnamnen med jokerteckenet "*" ( t ex TcdA1 _ *. Mrc). Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Ange "Summovie körbar sökväg" genom att välja den körbara filen.
    3. Ställ in "Antal filmbilder" till antalet ramar i varje filmmikrograf. Ställ in "Mikroskopspänning" och "Exponering per ram" till de värden som används vid datainsamling. (För exampLe, om den totala dosen är 60 e / / 2 med 20 bilder inspelade utan förexponering är exponeringen för varje ram 60/20 = 3 e / A 2. ) Tryck på "Run Command" knappen för att rikta in Ramar av varje filmmikrograf.
      OBS! Det här skapar automatiskt två utdatabibliotek som innehåller dosviktiga respektive dosvägda rörelsereglerade genomsnittliga mikrografer.

3. CTER: Uppskatta CTF: s defokus och astigmatismsparametrar

  1. Uppskatta CTF-parametrarna (defokus och astigmatism, de andra ställs in av användaren) för varje dosviktad medelmikrografi.
    1. Klicka på ikonen "CTER" och sedan "CTF Estimation" knappen. För att ställa in "Input micrograph path pattern", välj en dosviktad rörelsejusterad mikrograph, ersätt sedan den variabla delen av filnamnen med jokerteckenet"*". Ange också sökvägen för "Output-katalog".
    2. Ställ in "Amplitudkontrast" till det värde som används rutinmässigt för typen av data (istjocklek är en viktig faktor) och mikroskopspänning i laboratoriet ( t ex 10%). Typiska värden ligger i området 7-14% 17 .
    3. Ange "Mikroskop sfärisk avvikelse (Cs)" och "Mikroskopspänning" som används vid datainsamling.
    4. Ange "Lägsta frekvens" och "Högsta frekvens" av sökområdet för CTF-modellmontering till respektive 0,0285 respektive 0,285 Å -1 (40-4 Å). Tryck på "Run command" knappen för att uppskatta CTF parametrarna.
      OBS: CTF-parametrarna lagras automatiskt i filen partres.txt i den angivna utmatningskatalogen. CTF-estimeringen av de 112 mikrograferna beräknades på 96 kärnor och avslutades efter ~ 3 min på Linux-clustret som användes för att erhålla representativa resultat.

4. Fönster: extrahera partiklar från de dosbaserade medelmikrograferna

  1. Välj partiklar manuellt eller automatiskt från mikrografer med e2boxer 6 och skapa koordinatfiler, var och en med en lista över partikel xy-koordinater i den tillhörande mikrografen.
    1. Klicka på "WINDOW" -ikonen och sedan på "Partikelplockning" -knappen. Tryck på "Run command" knappen för att starta e2boxer 6 och plocka partiklarna i varje mikrografi manuellt eller automatiskt 18 (se Diskussion ). Förvara de slutliga partikelkoordinaterna för varje mikrografi i EMAN1-filformatet (.box). Alternativt kan du importera koordinatfilerna från andra program efter att ha konverterat dem till EMAN1-formatet.
  2. Skapa partikelstaplar genom att extrahera partikelbilder från de dosvägda mikrograferna (i SPHIRE är partikelstapeln oftaEn kallas helt enkelt "stack").
    1. Tryck på knappen "Partikeluttryckning". Ange "Input micrograph path pattern" genom att välja en dosvägd rörelsekorrigerad mikrograph och sedan byta den variabla delen av filnamnen med wildcard "*" ( t ex TcdA1 _ *. Mrc). På samma sätt, sätt "Input koordinater bana mönster" genom att välja en koordinater fil ( t.ex. TcdA1 _ *. Box). Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Ange "CTF-parametrar källa" genom att välja parametervärdet CTF (partres.txt producerad i steg 3.1). Tryck på "Run command" knappen.
  3. Kombinera de extraherade partikelbildstaplarna i en enda.
    1. Klicka på "Partikelstack" -knappen. Ange sökvägen till "Output virtuell bildstapel" med ett BDB-filvägsformat ( t.ex. "bdb: partiklar / stapel", där "partiklar" pekar påE-katalogen som innehåller en BDB databas katalog vars namn är alltid EMAN2DB och "stack" avser en viss bildstapel i denna databas). Ange "Input BDB image stack pattern" genom att välja en katalog som börjar med "mpi_proc" och sedan ersätta den variabla delen av katalognamnen med jokerteckenet "*" ( t.ex. Partiklar / mpi_proc_000 till Partiklar / mpi_proc_ *). Tryck på "Run command" knappen.

5. ISAC: Klassificering av partikelbilder i 2D

  1. Beräkna 2D-klassmedelvärden genom att anpassa partiklar och klustra dem enligt deras 2D-utseende.
    OBS: De resulterande 2D-genomsnitten har ett förbättrat signal-brusförhållande (SNR) jämfört med de enskilda partikelbilderna och används således för att visuellt bedöma kvaliteten och heterogeniteten i datasetet samt att sortera bort oönskade bilder från stapeln ( T.ex. iskristaller, kolkanter,Aggregat, fragment och etc. ) 19 . Dessutom används de senare för att bestämma en initial 3D-modell.
    1. Klicka på "ISAC" -ikonen och sedan på knappen "ISAC - 2D Clustering". Ange "Input image stack" genom att välja stapelfilen som innehåller de extraherade partiklarna. Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Använd 200 - 1000 för "Bilder per klass". Välj lämpligt tal med tanke på det förväntade antalet 2D-klasser (det totala antalet partiklar dividerat med antalet bilder per klass). Justera denna parameter beroende på SNR och storleken på datasetet. Öka antalet medlemmar per klass om datasetet är alltför högljudd. Minska antalet när ett lågt antal partiklar är tillgängligt.
      OBS! På grund av minnesbegränsningar, för ganska stora dataset (> 100 000 partiklar), dela upp hela databasen i deluppsättningar, utför ISAC för varje delmängd självständigt och kombineraResultaten i slutet. Detaljerade anvisningar för detta behandlingsscenario finns på http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. Markera kryssrutan "Phase-flip". Håll standardvärdena för "Target particle radius" och "Target particle image size" för att påskynda processen genom att automatiskt krympa alla partikelbilder med dessa inställningar. Tryck på "Run command" knappen för att beräkna 2D klassen medelvärden.
      OBS! Detta steg är beräknat för beräkning och körtiden ökar betydligt med antalet partiklar och klasser samt målradie och bildstorlek. På ett kluster med 96 processer slutade 2D-klassificeringen av ~ 10 000 partiklar efter ca 90 min.
  2. Visa och visuellt inspektera de resulterande ISAC 2D-medelvärdena för att se till att deras kvalitet är tillfredsställande (se Diskussion).
    1. Tryck på knappen "Display Data" under "UTILITIES". Uppsättning "; Input-filer "genom att välja den fil som innehåller ISAC 2D-medelvärdena (class_averages.hdf producerad i steg 5.1). Tryck på" Kör kommandot "-knappen för att visa de slutliga reproducerbara och validerade klassmedelvärdena som levereras av ISAC.
  3. Skapa en ny stapel med endast partikelmedlemmarna i de validerade klassens medelvärden.
    1. Tryck på "Create Stack Subset" -knappen. Ange "Input image stack" genom att välja samma stapelfil som i steg 5.1.1. Ange "ISAC-medelvärden" genom att välja ISAC 2D-medelvärdena (class_averages.hdf producerad i steg 5.1). Ange sökvägen för "Output-katalog". Tryck på "Run command" knappen.

6. VIPER: Beräkna en inledande 3D-modell

  1. Välj ett litet uppsättning av klassmedelvärdena (≥100 bilder) genom att radera alla dåliga klassmedelvärden och identiska synpunkter på partikeln (se Diskussion) och använd dem för att beräkna en repRoducible initialmodell med VIPER. Kom ihåg att urvalet ska innehålla minst 60-80 högkvalitetsmedel med ~ 200-500 medlemmar vardera.
    1. Klicka på "VIPER" -ikonen och sedan på "Display Data" -knappen. Ange "Input-filer" genom att välja ISAC 2D-medelvärdena (class_averages.hdf producerad i steg 5.1). Tryck på "Run command" knappen.
    2. Tryck på mittenknappen någonstans i grafikfönstret i e2displayen och aktivera "DEL" -knappen i popupfönstret. Ta bort alla dåliga klassmedelvärden och identiska synpunkter på partikeln (se Diskussion ). Tryck på "Spara" -knappen för att lagra de återstående 2D-klassens medelvärden till en ny fil.
  2. Från de valda ISAC-medelvärdena genererar en initial referens för den efterföljande 3D-raffinementen.
    1. Klicka på knappen "Initial 3D Model - RVIPER". Ställ in "Input images stack" genom att välja den visade klassenMedelvärden (producerad i steg 6.1). Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Se till att använda samma värde för "Target particle radius" som ISAC steg 5.1.3. Tryck på "Run command" -knappen för att generera en reproducerbar ab initio 3D-modell.
      OBS! Detta steg är beräknat för beräkning och körtiden ökar betydligt med antal medelvärden och partikelstorlek. På ett kluster med 96 processer slutade detta jobb (~ 100 klassmedelvärden) efter ~ 15 min.
  3. Kontrollera om den resulterande 3D-modellen är rimlig genom att ta hänsyn till klassens medelvärden och dessutom dess strukturella integritet ( dvs inga bortkopplade delar och / eller riktningsartiklar). För att visa kartan, använd programmet Chimera 15 . Vid denna punkt, utför en första jämförelse med en kristallstruktur av ett homologt protein eller en domän av proteinet av intresse om det existerar (ett exempel visas i avsnittet RepreseNtativa resultat).
  4. För den efterföljande 3D-raffinementen, generera en initial 3D-referens och en 3D-mask från en ab initio 3D-modell genom att ta bort det omgivande bruset och omskaldera det så att det matchar den ursprungliga pixelstorleken.
    1. Klicka på "Create 3D Reference" -knappen. Ange "Input volym" genom att välja ab initio 3D-modellen (average_volume.hdf som produceras i steg 6.2). Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Ange "Resample Ratio Source" genom att välja ISAC-krympförhållandefilen (README_shrink_ratio.txt producerad i steg 5.1). Tryck på "Run command" knappen.

7. MERIDIEN: Förbättra den ursprungliga 3D-volymen

  1. Förfinera 3D-volymen från början 3D-modellen.
    1. Klicka på "MERIDIEN" ikonen, sedan knappen "3D Refinement". Ange "Input image stack" och "Initial 3D reference" av seleCting partikelstacken och ab initio 3D-modellen (framställd i steg 5.3 respektive 6.4). Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Ställ in "3D-mask" genom att välja 3D-maskfilen (producerad i steg 6.4). Använd alltid en 3D-mask, men använd en sfärisk mask eller en mjukkantad mask som är löst anpassad till referensen, särskilt vid ett tidigt analysintervall, för att undvika att införa förvrängning av felaktig maskering.
    3. Markera kryssrutan "Använd hård 2D-mask". Ställ in "Startupplösning" till ett avstängningsfrekvensvärde mellan 20 och 25 Å. Tänk på att ett lågpassfilter med denna cutofffrekvens kommer att appliceras på den ursprungliga 3D-strukturen för att minska initialmodellförspänning.
    4. Kontrollera specifikationerna för klustret som används för denna process och sätt sedan "Minne per nod" till tillgängligt minne i gigabyte. Tryck på "Run command" -knappen för att förbättra 3D-volymen från den ursprungliga 3D-modellen på ett helt automatiserat sätt.
  2. Skapa en mjukkantad 3D-mask från den raffinerade volymen för det efterföljande skärpningssteget.
    1. Klicka på knappen "Adaptive 3D Mask". Ange "Inmatningsvolym" genom att välja en av de ofiltrerade halvvolymerna (producerad i steg 7.1). Ange sökvägen för "Utmatningsmask".
    2. Ange ett värde av "Binarization threshold". Använd chimera för att se till att vid detta speciella tröskelvärde är ljudet tydligt utanför volymen av intresse i lösningsområdet för de ofiltrerade halvkartorna och alla densiteter av proteinet är fortfarande cOskadd mot varandra. Tryck på "Kör kommandot" -knappen för att skapa den mjuka 3D-masken.
      OBS: Huvuddelen av den resulterande masken (bestående av voxel vars värden är> 0,5) bör passa partikelstrukturen tätt men ändå omsluta alla densiteter av intresse. Mjuk kantavfall bör vara minst 8-10 pixel bred.
  3. Slå samman de två ofiltrerade halvvolymerna som erhållits genom 3D-förfining. Därefter skärpa den sammanslagna volymen genom att justera effektspektret baserat på detektorens överföringsfunktion (MTF), den uppskattade B-faktorn och FSC (Fourier Shell Correlation) uppskattning av upplösningen.
    1. Välj "Skärpa" -knappen. Ställ in "Första ofiltrerad halvvolym" och "Andra ofiltrerad halvvolym" genom att välja motsvarande filer (vol_0_unfil.hdf och vol_1_unfil.hdf producerad i steg 7.1). Använd alltid "B-factor enhancement". Typiskt behåll standardvärdet för att eSkifta B-faktorvärdet från ingångsdata med hjälp av intervallet mellan slutupplösningsfrekvensen och 10 Å. Alternativt ange ett ad hoc- värde ( t ex -100).
    2. Håll standardvärdet för "Lågpassfilterfrekvens" för att tillämpa ett FSC-baserat filter.
    3. Ställ in "Användarmanual" genom att välja 3D-masken (producerad i steg 7.2). Kom ihåg att den rapporterade upplösningen bestäms med FSC med denna mask. Tryck på "Run command" -knappen för att skärpa den raffinerade 3D-volymen.
  4. Generera 3D-vinkeldistributionskartan från projektionsriktningarna för alla partiklar uppskattade genom 3D-raffineringsteget ovan.
    1. Klicka på knappen "Angular Distribution". Ange "Alignment parameter file" genom att välja filen (final_params.txt producerad i steg 7.1) och tryck på "Run command" knappen.
  5. Visuellt inspektera den skärpa 3D-modellen med hjälp av ChiMera. Se till att strukturen är rimlig med tanke på den uppnådda upplösningen (se Diskussion ).
  6. Visuellt inspektera vinkelfördelningen med Chimera. Verifiera att fördelningen täcker ungefär jämnt hela 3D-vinkelutrymmet. Tänk på att för symmetriska strukturer är distributionen begränsad inom den unika asymmetriska triangeln.

8. SORT3D: Sortera 3D-heterogenitet genom att fokusera på de högvariabela regionerna

  1. Beräkna 3D-variabilitetskartan från den partikelstapel som används i 3D-raffinementen.
    1. Klicka på "SORT3D" -ikonen och sedan "3D Variabilitetsberäkning" -knappen. Ställ in "Input image stack" genom att välja samma skärmad partikelstack som ges till 3D-raffineringsteget 7.1.1. Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Håll standardvärdet för "Antal prognoser".
      OBS! Bilderna från den vinklade grannenHuva används för att uppskatta 2D-variansen vid varje 3D-projektionsvinkel. Ju större antal, desto mindre bullriga uppskattningen men desto lägre upplösning och rotationsartefakter är mer uttalade.
    3. Markera kryssrutan "Använd CTF". Tryck på "Run command" knappen.
  2. Använd 3D-variabilitetskartan för att skapa en fokusmask för 3D-klustringssteget nedan.
    1. Välj "Binary 3D Mask" -knappen. Ange "Inmatningsvolym" genom att välja 3D-variabilitetskartan (producerad i steg 8.1). Ange filvägen för "Utmatningsmask".
    2. Ställ in "Binariseringsgränsen" genom att använda utgången i fältet "Nivå" i "Volymvisaren" av Chimera. Tryck på "Run command" knappen.
  3. Sortera partikelbilder i homogena strukturella grupper genom att fokusera på strukturellt högvarliga regioner.
    1. Tryck på knappen "3D Clustering - RSORT3D".Ange "Input 3D-raffinementskatalog" genom att välja utmatningskatalogen för 3D-raffinering (producerad i steg 7.1). Ange sökvägen för "Output-katalog".
    2. Ange "3D-mask" genom att välja den mjuka kanterna 3D-masken (framställd i steg 7.2). Ställ in "Focus 3D mask" genom att välja den binära 3D-variabilitetskartan (producerad i steg 8.2).
    3. För stora dataset, använd minst 5 000-10 000 för "Bilder per grupp". Tänk på att programmet alltid håller antalet bilder per grupp lägre än den här inställningen. Justera värdet genom att beakta det förväntade antalet 3D-grupper (det totala antalet partiklar dividerat med värdet "Bilder per grupp"), datasetet, SNR och graden heterogenitet. Börja med ~ 5-10 initial 3D-grupper om ett tillräckligt antal partiklar är tillgängliga, om inte ett högre antal distinkta strukturella tillstånd i datamängden förväntas.
    4. Använd minst 3 000-5 000 partiklar för "Minsta gruppstorlek".Observera att programmet kommer att bortse från grupper som innehåller ett lägre antal bilder än inställningen för "Minsta gruppstorlek". Tryck på "Run command" knappen för att utföra 3D-gruppering.
      OBS: RSORT3D är indelad i två steg. Det första "sort3d" -steget sorterar ut 3D-heterogenitet. Därefter rekonstruerar det volymerna för varje homogen strukturkoncern med användning av 3D-inriktningsparametrarna bestämda av 3D-raffineringssteget ovan. Det andra "rsort3d" -steget finner ut reproducerbara medlemmar i varje grupp genom att utföra en tvåvägs jämförelse mellan de två oberoende sorteringsbanorna. Sedan rekonstruerar den homogena strukturer med endast de reproducerbart tilldelade partiklarna. På ett kluster med 96 kärnor slutade detta jobb (~ 8 000 partiklar, 352 lådstorlek) efter ca 3 h.
  4. När programmet är klart använder du Chimera för att välja en homogen 3D-grupp. Välj strukturen av den högsta uppenbara upplösningen, som vanligtvis är associerad med de flesta poPulousgrupp. Se till att den valda strukturen är visuellt rimlig genom att ta hänsyn till 2D-klassens medelvärden och biologiska aspekter av proteinet av intresse (se Diskussion ). Om det finns andra volymer som har en nästan identisk struktur med liknande upplösning, betrakta dem som en följd av en enda homogen 3D-grupp.
  5. Utför en lokal förfining mot partikelmedlemmarna i den mest homogena 3D-gruppen (med högsta upplösning).
    1. Klicka på knappen "Local Subset Refinement". Ange "Subset Text File path" genom att välja textfilen som innehåller partikel-ID: erna för den valda gruppen ( t.ex. Cluster0.txt producerad i steg 8.3). Ange "3D-raffinementskatalog" genom att välja utmatningskatalogen för den tidigare 3D-raffinementen (producerad i steg 7.1).
    2. Ställ in "Omstart av iteration" till den där den högsta upplösningen uppnås i föregående 3D-raffinering. tryck på"Kör kommando" -knappen för att utföra en lokal förfining av den valda populationen av partiklar.
  6. Liknande steg 7.2 skapar du en mjukt kantad 3D-mask från en ofiltrerad slutlig halvvolym rekonstruerad av den lokala delmängdsförfiningen.
  7. På samma sätt som steg 7.3 sammanfogas två ofiltrerade slutliga halvvolymer som härrör från den lokala delmängdsförfiningen och skärper den sammanslagna volymen. Filtrera inte den skärpade volymen den här gången.
    OBS! Om heterogenitetsanalysen i steg 8.4 anger flera distinkta tillstånd vid jämförbar upplösning, kan man självständigt förfina alla olika tillstånd.

9. LOCALRES: Beräkna den lokala upplösningen av den slutliga 3D-volymen

  1. Uppskatta den lokala upplösningen av 3D-volymen erhållen från den homogena uppsättningen partiklar.
    1. Klicka på "LOCALRES" -ikonen och sedan på knappen "Lokal upplösning". Ställ in "Första halvvolymen" och "Andra halvan-volymen "genom att välja de ofiltrerade slutliga halvvolymerna för den lokala delmängdsförfiningen (framställd i steg 8.5). Ange" 3D-mask "genom att välja den mjuka kanter 3D-masken som producerades i steg 8.6. Ange filvägen för" Utmatningsvolym " .
    2. Håll standardvärdet på 7 pixlar för "FSC-fönsterstorlek". Kom ihåg att den här inställningen definierar storleken på det fönster där korrelationen i lokal-realtid beräknas. Större fönsterstorlekar producerar mjukare upplösningskartor på bekostnad av lokal upplösning.
    3. Håll standardvärdet 0,5 av "Resolution cut-off" för upplösningskriterium.
      OBS! För varje voxel kommer programmet att rapportera den lokala upplösningen som den frekvens som den lokala FSC-enheten sjunker under den valda upplösningströskeln. En tröskel lägre än 0,5 rekommenderas inte, eftersom lägre korrelationsvärden har stor statistisk osäkerhet. Därför varierar motsvarande lokala upplösning starkt mellan voxels.
    4. För "OveraLl upplösning ", sätt den absoluta upplösningen uppskattad i skärpen efter den lokala delmängdsförfiningen (steg 8.7). Tryck på" Kör kommandot "-knappen för att beräkna den lokala upplösningen av volymen.
  2. Använd det lokala 3D-filtret till volymen skärpad efter den lokala delmängdsförfiningen genom att använda den lokala 3D-upplösningskartan.
    1. Klicka på knappen "3D Local Filter". Ange "Input Volume" genom att välja den skärpa men ofiltrerade 3D-volymen (producerad i steg 8.7). På samma sätt anger du "Lokal upplösningsfil" och "3D-mask" (producerad i steg 9.1 respektive 8.6). Kom ihåg att 3D-masken definierar den region där lokal filtrering ska tillämpas. Ange filvägen för "Utmatningsvolym". Tryck på "Run command" knappen för att applicera det 3D lokala filtret.
  3. Använd chimera för att visuellt inspektera den slutliga 3D-modellen och den lokala 3D-upplösningskartan (producerad i steg 9,2 och 9,1 resp.ektivt). Välj alternativet "Surface color" för att färg 3D-volymen enligt lokal upplösning. Tänk på att fördelningen av lokal upplösning ska vara smidig (se Diskussion ).

Representative Results

Protokollet som beskrivits ovan utfördes från 112 direktdetektorfilmer av A-komponenten i Photorhabdus luminescens Tc-komplexet (TcdAl) 20 , 21 , 22 . Denna dataset spelades in på ett Cs-korrigerat elektronkryo-mikroskop med en hög ljusstyrkafältutsläppspistol (XFEG), som drivs vid en accelerationsspänning på 300 kV. Bilderna förvärvades automatiskt med en total dos av 60 e - / Å -2 vid en pixelstorlek på 1,14 Å på provskalan. Efter anpassning av filmramarna (Protokollsteg 2 ) hade de resulterande rörelsereglerade medelvärdena isotropa Thonringar som sträcker sig till högupplösning ( Figur 2a ). De enskilda partiklarna var lätt synliga och väl separerade ( figur 2b ). Partiklar plockades sedan med hjälp av svärmverktyget för e2boxerLass = "xref"> 18 ( protokoll steg 4.1 ). I detta fall fastställdes ett lämpligt tröskelvärde med hjälp av det mer selektiva alternativet ( Figur 2c ). De 112 digitala mikrograferna gav 9 652 partiklar. Majoriteten av de extraherade bilderna (protokollsteg 4.2 ) innehöll väldefinierade partiklar och deras lådstorlek var ~ 1,5 gånger större än partikelstorleken, såsom rekommenderas ( Figur 2d ). Därefter utfördes en 2D-heterogenitetsanalys med hjälp av ISAC (protokoll steg 5 ). Det gav 98 klassmedelvärden ( figur 3a ). Med hjälp av dessa 2D-klassmedelvärden beräknades en ab initio- modell med användning av VIPER (protokoll steg 6 ) vid mellanupplösning ( figur 3b ). Denna modell visar utmärkt överenskommelse med kristallstrukturen hos TcdA1 som tidigare lösts vid 3,9 Å-upplösning 22 ( Figur 3c ). Denna ab initio- modell användes som ett inledande temp Plattan för 3D-raffinement (MERIDIEN), vilket ger en rekonstruktion på 3,5 Å (0,143 kriterium) (Protokoll steg 7 ) från endast ~ 40 000 asymmetriska enheter ( Figur 4 ). Denna karta med nära atomisk upplösning erhölls inom 24 timmar, med användning av upp till 96 processorer för stegen i arbetsflödet som drar nytta av flera kärnor.

För 3D-variabilitetsanalysen ( protokollsteg 8) användes endast 2000 partikelbilder per grupp i steg 8.3.3 ( dvs processen startar med 5 initiala 3D-grupper) och 200 bilder för den minsta gruppstorleken i steg 8.3.4 på grund av Det lilla antalet partiklar (~ 10 000). Analysen avslöjade lokaliserad flexibilitet huvudsakligen vid det komplexa N-terminala regionen som innehåller His-märket som användes för rening ( Figur 5a ). I själva verket upplöstes tolv N-terminala rester och His-taggen inte i den tidigare publicerade kristallstrukturen av TcdA1"> 22 och denna förmodligen oordnade regionen förblev oupplösad i föreliggande cryo-EM-densitet, troligen på grund av dess flexibilitet. Ytterligare variabilitet detekterades vid receptorbindningsdomänerna och BC-bindningsdomänen ( Figur 5a ). På grund av det totala Tillfredsställande upplösning av strukturen och den relativt små storleken av datasetet, bestämdes denna heterogenitet att vara tolerabel och därför utfördes inte en fokuserad 3D-klassificering 23. Slutligen beräknades den lokala upplösningen av den slutliga densitetskartan (protokoll steg 9.1, figur 5b ) och den skärpa 3D-kartan filtrerades lokalt (protokoll steg 9.2) . En volym av denna kvalitet kan användas för de novo modellbyggnad med användning av Coot 24 eller något annat förädlingsverktyg ( Figur 6 ).

Figur 1
<Stark> Figur 1: Bildbehandling med SPHIRE. ( A ) GUI i SPHIRE-programvarupaketet. Ett specifikt steg i arbetsflödet kan aktiveras genom att välja respektive piktogram på vänster sida av GUI ("arbetsflödessteg"). Kommandon och verktyg som är associerade med detta steg i arbetsflödet visas i det centrala området av GUI. Efter att ha valt en av kommandona visas respektive parametrar i den högra delen av GUI. Avancerade parametrar behöver vanligtvis inte ändra de förinställda standardvärdena. ( B ) Steg i arbetsflödet för enkelpartikelbildbehandling med hjälp av SPHIRE GUI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Motion Correction och ParticLe extraktion. ( A , b ) Typisk högkvalitativ, lågdos, driftskorrigerad digital mikrograph inspelad vid en defokus på 1,7 μm. Notera att de isotropa Thon ringarna sträcker sig till en upplösning på 2,7 Å i effektspektrumet (a) och de välkännbara partiklarna i 2D-bilden ( b ). ( C ) Partikelval med användning av e2boxer. Gröna cirklar indikerar valda partiklar. ( D ) Typiska råpartiklar extraherade från den dosviktade mikrografen. Skalstänger = 20 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: 2D Clustering och Initial Model Generation. ( A ) Galleri med 2D klassmedelvärden, med majoriteten representerande sidovyer o F partikeln. Skala bar = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-karta över TcdA1 erhållen med RVIPER från referensfria klassmedelvärdena. ( C ) Rigidkroppsanpassning av TcdA1-kristallstrukturen (band) (pdb-id 1VW1) i den ursprungliga cryo-EM-densiteten (transparent grå). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Cryo-EM 3D-struktur av TcdA1. ( A , b ) Slutlig 3,5 Å täthetskarta över TcdA1 beräknad med ~ 9 500 partikelbilder: ( a ) sida och ( b ) toppvy. C ) Representativa områden av cryo-EM-densiteten för en a-helix och en p-ark.Arge.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5: Variabilitetsanalys och lokal upplösning. ( A ) Ytan på den skärpa TcdA1 cryo-EM-kartan (grå) och variabilitetskortet (grönt). För bättre klarhet filtrerades variabelkartan med lågpassfiltret till 30 Å. ( B ) Ytbehandling av TcdA1-skärpad cryo-EM-kartan färgad enligt lokal upplösning (Å). Notera det topologiska avtalet mellan områden med hög variabilitet och låg lokal upplösning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6
Figur 6: 3D ModEl Byggande av TcdA1 med användning av Coot. Representativa regioner av kryo-EM-densiteten och atommodellen visas för en a-helix. Atommodellen byggdes de novo med Coot. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Enkeltpartikelkryo-EM har visat en snabb utveckling under de senaste åren och levererat många atomupplösningsstrukturer av makromolekylära komplex med stor biologisk betydelse 25 . För att stödja det stora antalet nybörjare som går in i fältet utvecklade vi enhetspartikelbildanalysplattformen SPHIRE och presenterar här ett genomgångsprotokoll för hela arbetsflödet inklusive filmjustering, partikelplockning, CTF-estimering, första modell Beräkning, 2D och 3D heterogenitetsanalys, 3D-raffinering med hög upplösning och lokal upplösning uppskattning och filtrering.

Protokollet som beskrivs här är avsett som en kort guide till 3D-strukturbestämning med användning av cryo-EM-mikrografer av proteinet av intresse och med hjälp av beräkningsverktyg som tillhandahålls av SPHIREs fristående GUI.

Huvuddelen av arbetsflödet är det mestaAv förfarandena behöver endast köras en gång, eftersom de bygger på begreppet validering genom reproducerbarhet 19 och kräver inte parameterjustering. Denna automatiska valideringsmekanism är en viktig fördel med SPHIRE jämfört med andra mjukvarupaket, eftersom resultaten tenderar att vara objektiva såväl som reproducerbara och, viktigast av allt, erhållas till en acceptabel beräkningskostnad. Rörledningen ger dessutom en mängd diagnostisk information för erfarna användare att genomföra ytterligare oberoende validering och bedömning med egna metoder. Ändå bör en nybörjare som har åtminstone elementär teoretisk bakgrund i strukturell biologi och elektronmikroskopi kunna erhålla strukturer med näratomisk upplösning med egen data och de automatiserade valideringsprocedurerna.

Att erhålla en närbildsupplösningsstruktur är emellertid inte alltid okomplicerad och resultatet kommer mycket att bero på provets kvalitet och ingångsdatanen. För de förfaranden som presenteras här antas det att ett tillräckligt antal högkvalitativa, oanpassade råa EM-filmer är tillgängliga, med deras medelvärden som visar klart urskiljbara homogena och slumpmässigt orienterade enskilda partiklar. Generellt finns det inga restriktioner vad gäller symmetri, storlek eller övergripande form av molekylen, men en låg molekylvikt kan vara en begränsande faktor, speciellt när proteinet har en featurlös globform. Vanligtvis är analys av större, välbeställda partiklar med högpunktsgruppsymmetri mindre krävande. Det är därför starkt rekommenderat för nybörjare att köra nuvarande protokoll först med en välkänd cryo-EM dataset. Antingen SPHIRE handledning data (http: /sphire.mpg.de) eller en av EMPIAR inlämnade dataset (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råa filmer är en bra utgångspunkt .

Vid bearbetning av egna data är det mycket troligt att vissa dataset eller några bilder inte uppfyller vissa kvalifikationerTy kriterier. I det här sammanhanget, förutom de automatiska stabilitets- och reproducerbarhetskontrollerna som utförs av programmet för stora steg i arbetsflödet, rekommenderas det fortfarande att användarna visuellt inspekterar resultaten vid vissa "kontrollpunkter" i protokollet, särskilt om den slutliga återuppbyggnaden Är inte tillfredsställande.

Den första visuella inspektionen kan utföras på mikrografnivå efter filminriktningen (protokollsteg 2 ) och CTF-estimeringen (protokollsteg 3 ). De resulterande rörelsereglerade medelvärdena bör tydligt urskilja och separerade enskilda partiklar och deras effektspektra bör visa klart urskiljbara, isotropa Thon-ringar. Den rumsliga frekvensen som de är synliga definierar i de flesta fall den högsta upplösningen som strukturen i princip i slutändan kan bestämmas. Exempel på ett rörelsekorrigerat medelvärde av tillräcklig kvalitet och dess effektspektrum visas i avsnittet & #34; Representativa resultat. "Utgående bilder som kan ha negativ inverkan på slutresultatet kan avlägsnas med hjälp av SPHIREs GUI-verktyg för drift och CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

När det gäller partikelskärmning är det avgörande steget i SPHIRE-rörledningen 2D-klassificeringen med användning av ISAC (protokollsteg 5.2) . Här bör användaren kontrollera att de reproducerbara 2D-klassernas medelvärden identifieras automatiskt genom att programmet antar en rad orienteringar som är tillräckliga för att kvasi jämnt täcka vinkelutrymmet. Om kvaliteten på klassens medelvärden inte är tillfredsställande (bullriga och / eller suddiga bilder) och / eller antalet reproducerbara klassmedelvärden är mycket lågt, överväga att förbättra automatisk plockningskvalitet, optimera datasetbilder eller provberedning. I de flesta fall är det inte möjligt att beräkna en tillförlitlig rekonstruktion från en dataset som inte ger bra 2D-klassmedelvärden. Exempel på högkvalitativ 2D-klass aveRaser visas i avsnittet "Representativa resultat".

Minst 100 klassmedelvärden krävs för att få en pålitlig initial 3D-modell med RVIPER på ett automatiserat sätt (protokoll steg 6.1 ). För detta steg ska användaren välja medelvärden med högsta kvalitet och inkludera så många olika orienteringar av partikeln som möjligt. Kvaliteten på den ursprungliga modellen är avgörande för framgången för den efterföljande 3D-raffineringen med hög upplösning.

I andra mjukvarupaket görs 3D klassificering ibland för att ta bort "dåliga" partiklar 8 , 9 . I SPHIRE elimineras emellertid de flesta av dessa partiklar automatiskt redan under 2D-klassificering med ISAC. Således rekommenderas det att utföra det beräkningsintensiva steget för 3D-sortering endast om rekonstruktionen och 3D-variabilitetsanalysen indikerar heterogenitet i datasetet.

Viktigast av allt bör användaren noggrant inspektera de resulterande 3D-volymerna noggrant (protokoll steg 9.3 ) och bekräfta att egenskaperna hos respektive densitet överensstämmer väl med den nominella upplösningen. Vid en upplösning av <9 Å blir stavliknande densiteter som motsvarar a-helixer synliga. Vid en upplösning <4,5 Å är densiteter som motsvarar strängar i p-ark normalt väl separerade och skrymmande aminosyror blir synliga. En kartong med hög upplösning (<3 Å) ska visa tydligt urskiljbara sidokedjor, vilket möjliggör byggandet av en exakt atommodell.

Resultat som hittills erhållits visar att det här protokollet i allmänhet är tillämpligt på alla typer av enkelpartikel-kryo-EM-projekt, med hjälp av SPHIREs automatiska reproducerbarhetstest och minimala visuella inspektioner. Representativa resultat av varje behandlingssteg visas för rekonstruktionen av TcdA1-toxinet avPhotorhabdus luminescens 21 , som har lösts till nära atomisk upplösning. Densitetskartor av liknande kvalitet kan användas för att konstruera tillförlitliga atommodeller genom de novo ryggradsspårning samt ömsesidig eller verklig rymdförädling och därigenom ge en solid strukturell ram för förståelse av komplexa molekylära mekanismer.

Tillskottskoder:

Koordinaterna för EM-strukturen och de obearbetade filmerna har deponerats i elektronmikroskopibildbanken och elektronmikroskopipilotbildarkivet enligt anslutningsnummer EMD-3645 respektive EMPIAR-10089.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar D. Roderer för att ge oss TcdA1-mikrografer. Vi tackar Steve Ludtke för hans pågående stöd för EMAN2-infrastrukturen. Detta arbete stöddes av medel från Max Planck Society (till SR) och Europeiska rådet under Europeiska unionens sjunde ramprogram (RP7 / 2007-2013) (bidrag nr 615984) (till SR) och bidrag från National Institutes of Hälsa R01 GM60635 till PAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPHIRE Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas  http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera University of California, San Francisco http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur Janelia Farm Research Campus, Ashburn http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot MRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridge http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2 Baylor College of Medicine, Houston http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 cores Max Planck Institute of Molecular Physiology Linux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope  FEI 300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detector FEI
EPU (automated data acquisition software) FEI https://www.fei.com/software/epu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Tags

Biochemistry strukturell biologi elektronmikroskopi elektronkryo-mikroskopi cryo-EM TEM bildbehandling av en partikel mjukvaruutveckling enkelpartikelanalys Tc-toxin
Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M.,… More

Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M., Merino, F., Voicu, H., Huang, Z., Penczek, P. A., Raunser, S., Gatsogiannis, C. High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE. J. Vis. Exp. (123), e55448, doi:10.3791/55448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter