Summary
ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。
Abstract
Light-sheet fluorescence microscopy（LSFM）は、化学的クリアリングプロトコールと組み合わせて、大きな生物学的試料中の蛍光標識された構造を分析するためのゴールドスタンダードとなっており、細胞分解能に達しています。その一方で、基礎となるプロトコルの絶え間ない改良と特殊な商用システムの利用性の向上により、マウスの器官全体の微細構造を調べることができ、様々な生存細胞イメージングアプローチにおける細胞の挙動の特徴づけまで可能にしました。ここでは、炎症を起こしたマウスの心臓におけるCD45 +白血球集団の空間的全マウント視覚化および定量化のためのプロトコルを説明する。この方法は、致命的な心臓不整脈を特徴とする致命的な致死性心筋炎の発達の研究のための頑強な誘導性モデルとして機能することが最近示されているトランスジェニックマウス株（CD11c.DTR）を使用する。このプロトコルには、心筋炎の誘導、腹腔内アル抗体媒介性細胞染色、器官調製、およびその後のコンピュータ支援画像後処理を伴うLSFMを含む。我々の特定の科学的な問題に高度に適合した方法として提示されているが、プロトコールは、他の臓器および他の種においても全く異なる蛍光構造を標的とすることができる容易に調節可能なシステムの青写真を表す。
Introduction
光学顕微鏡の進化の間、多くの特殊な形態が現れ、それらの全てが特定の標本の視覚化プロセスの限界を最小限に抑えるために開発された。このような方法の1つは、薄シート蛍光顕微鏡法（LSFM）である。最初にSiedentopfとZsigmondy 1によって1903年に開発され、1990年代初頭の最初の基本的な生物学的応用を発見した2。LSFMは、蛍光シグナルの分解能を持つ無傷のマウス器官などの大きな標本の視覚化のための最も強力な顕微鏡ツール細胞レベルまで低下する。これらの利点のために、生存細胞イメージングの可能性と組み合わせて、Nature MethodsはLSFMを「2014年の方法」 3と名付けました。
名前が示唆するように、LSFMでのサンプル照明は、使用される対物レンズの軸に垂直に向けられた光シートによって行われますまたは発光光収集およびその後の画像形成を含む。光シートは、通常、シリンドリカルレンズを用いて広いコリメートされたレーザビームを集束することによって、またはただ1つの水平または垂直平面4,5 において狭く集束されたレーザビームの迅速な横方向移動によって生成される。このようにして、結像光学系の焦点面のみが、典型的には1~4μmの厚さで照明される。その結果、照明面に置かれた蛍光試料については、散乱光の生成と、焦点面の上方または下方の領域からの光退色の影響がともに排除または大幅に抑制される6,7 。すべての焦点外れ面が照らされないので、これらの領域では光退色効果は省略される。標準的な共焦点または多光子顕微鏡法とは対照的に、照射された光および放出された光の経路は互いに分離されているので、最終的な画像品質対物レンズを通る励起光ビームの完全な集束には依存しない。基礎となる質問に依存して、膨大な視界（FOV）を有する対物レンズを使用することが可能であり、照明された平面の可能な限り大きな領域を、xy方向に移動する構成部品なしで撮像することができる。
現代のLSFMシステムでは、生成された光学セクションの蛍光画像が、高感度の電荷結合素子（CCD）または相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラ上に捕捉され、視野全体（FOV）マイクロ秒単位。したがって、光シートを通って試料を移動させ、規定されたzステップで画像を取得することによって、合理的な時間8,9 において試料の完全な3D情報を得ることができ、この技術を生細胞に適用することができる研究10 、ass = "xref"> 11,12。
それにもかかわらず、LSFMは迅速で、感度が高く、蛍光に優しい方法を提供するが、特に大きな生体試料が3D解析の標的である場合、標本を通る光の伝達は依然として大きな問題である。光の透過率は、吸収の物理的な側面と屈折率の異なる構造の界面での光の散乱によって決定的に変化します13 。したがって、数ミリメートルの大きさの試料を撮像する場合、LSFMは、大部分が透明化プロトコルと組み合わされて、試料を光学的に透明にする。これらの技術は、それぞれの生物学的組織から水分を除去し、特定の標的組織成分の屈折率に狭く一致するように選択された水または（有機）溶媒ベースの液浸媒体と交換するという考えに基づいている。その結果、横方向散乱が最小限に抑えられ、すべての波長より効率的に組織13を通過することができる。多くの場合、このように処理された生物学的標本はマクロ的に結晶透明であり、長い作動距離、低倍率の目的を用いてLSFMをマウスの器官全体でさえも導くことができる。
ここでは、心筋炎マウスモデルの細胞心臓浸潤を調べるために確立した薄いシート顕微鏡（材料の表を参照）での大量サンプルイメージングの準備プロトコールを示します。 CD11c.DTRマウスは、CD11cプロモーター16の制御下で霊長類ジフテリア毒素受容体（DTR）を発現する。その結果、DTRとともにCD11cを発現するこれらのマウスの細胞は、 Corynebacterium diphtheria （ジフテリア毒素、DTX）の外毒素に対して感受性になる 。これらの動物をDTXで全身治療すると、すべてのCD11c + ceが枯渇するlls。 CD11cはインテグリンであり、様々な異なる可溶性因子の細胞表面受容体として、主に単球系譜17の細胞において活性化および成熟プロセスに関与する。その結果、CD11c.DTRマウスモデルは、多くの異なる免疫学的質問の文脈における樹状細胞およびマクロファージサブセットの役割を研究するために集中的に使用されている。時間の経過とともに、DTXで全身治療されたCD11c.DTRマウスは有害な副作用を引き起こし、死亡率が著しく上昇することが報告されている18,19。最近、本発明者らは、これらの動物における気管内DTX適用後の劇症性心筋炎の発症を説明する、根本的な死因15を特定することができた。毒素攻撃は、心臓における刺激伝達系の中心部を含む細胞破壊を引き起こした。これには大量のCD45+白血球浸潤、最終的に致命的な心臓不整脈に至る。この場合、白血球集団の出現が重要であるだけでなく、心臓内部の空間分布も重要であった。この実験的問題は、現代の顕微鏡イメージングの課題であり、私たちは、生体内抗体染色および有機溶媒ベースの光学的クリアリングプロトコルによって支持される薄いシート顕微鏡法によって解決した。
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Protocol
すべての動物実験はEUのガイドラインに従って実施され、エッセン（AZ 84-02.04.2014.A036 - LandesamtfürNatur、Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen、Essen、Germany）の関連する地方当局によって承認された。動物を使用し、特定の病原体不含（SPF）条件下で飼育した。
ジフテリア毒素（DTX）による心筋炎の誘導
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でDTXストック溶液を希釈して1μg/ mLの作業溶液にすることにより、心筋炎の誘導のためのDTX溶液を調製する。
- Hasenberg らが示すように、この溶液100μLを8-10週齢のCD11c.DTRマウス（ 約 5 ng / g体重（bw））に気管内投与する。真菌の胞子懸濁液の適用20 。
注：毒素の腹腔内適用は、致命的な心筋炎。しかし、このアプローチはまず検証されなければならない。- それを適用するために、ケタミン100mg / kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内（腹腔内）注射によって動物を麻酔する。
- 深刻な麻酔（トウピンチ試験）に達した後、22Gの留置静脈カテーテルを口腔に通して動物に挿管する。 Hasenbergらによって示されているように、動物を小型動物呼吸器で毎分250回、息当たり250μLの吸入量で換気することにより、レンズチューブの正しい位置を確認する。 al。 20 。
注記：正しく配置すると、適用された換気設定に従って動物の呼吸数が変化します。 - 換気システムを外し、100μLのDTX溶液または対照と同じ量のPBSをカテーテルを通して肺に注入し、動物をさらに1分間換気し続ける。
- 動物を麻酔から回復させ、一般的な健康状態および体重変化を4日間監視する。
注：遺伝的背景、マウスのひずみ、または最初の体重に応じて、心筋炎の重篤度および発症率が異なり、最初に決定する必要があります。
2.薄いシート顕微鏡の試料調製
- 毒素適用の4日後に、気化した2％イソフルラン/酸素混合物で誘導チャンバーをフラッシュすることによってマウスを麻酔する。レトロ軌道の適用経路を使用して50μLのPBS中に15μgの直接標識抗CD45抗体（クローン30-F11、AlexaFluor647（AF647））を静脈内（iv）注入し、非常に迅速かつ高精度の抗体の正しい量。
注：マウスがリカンベントであり、つまんでピンチテストに反応しない場合、所望の麻酔深度に達している。 - 2時間のインキュベーションの後、マウスを頸部脱臼により屠殺し、5mLのPBS / EDTA（5mM） をその場で灌流する。
- 心臓を露出させ、21Gカテーテルを用いて右心室に灌流溶液を注入する。ゆっくりと一定の圧力で灌流し、大動脈を切開した後に血液を抜くことができることを確認する。
注：この心筋灌流は、器官の最終的な3D視覚化を妨げる可能性がある、わずかな準備アーチファクトをもたらすことがある。したがって、高度な動物実験者は、下大静脈を通して腹部大動脈を切除し、腹部大動脈を切除することができた。
- 心臓を露出させ、21Gカテーテルを用いて右心室に灌流溶液を注入する。ゆっくりと一定の圧力で灌流し、大動脈を切開した後に血液を抜くことができることを確認する。
- 化学的固定のために、5mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて同じくぼみを通して心臓を灌流する。カテーテルを所定の位置に保持し、PFAで満たされた新しいシリンジを単に取り付ける。ゆっくりと一定の圧力で熟す。
注：パラホルムアルデヒドは非常に毒性が強い。皮膚、眼、および他の粘膜との接触を避ける。- 穏やかに鋸歯状鉗子で心臓をつかむ。 puそれはやや上向きです。出入りする動脈および静脈を含むすべての組織接続を切断する。さらなる固定のために、器官を4％PFAでさらに4時間保管する。
- 臓器を脱水するには、暗所で4℃、50％、70％、100％でそれぞれ12時間、上昇するエタノールシリーズで心臓をインキュベートする。ここでは、黒い5 mLのポリプロピレン製反応管を使用し、気泡の発生を防ぐためにゆっくりとした回転速度を使用して管回転装置で絶えず回転させます。
- 化学薬品による完全なサンプル調製。心臓を透明にするために、常に一晩中回転させながら、それらを98％ジベンジルエーテル（DBE）中でインキュベートする。
注：DBEは眼、皮膚、および呼吸器系を刺激する。
光シート顕微鏡
- ライトシート顕微鏡を使用してLSFMを実施します（材料表を参照）。顕微鏡の標準試料ホルダー上の試料をDBE充填Cu30mm×30mm×15mmまでの標本に適したベットである。
- 脱水され、クリアされたアガロースブロックを使用して、画像取得の間、試料を適所にしっかりと保持する。
- アガロースブロックを調製するために、2％溶融アガロースを金型（15mm×15mm×5mm）に注ぐ。凝固するまでアガロースを冷ます。
- 上向きエタノールシリーズ（50％、70％、100％で2回）で脱水する。アガロースブロックを98％DBEで一晩インキュベートする。アガロースを使用するまでDBEに保存する。
注：アガロースは主に水で構成されているため、各脱水段階のインキュベーション時間は、ブロックのサイズに応じて延長される場合があります。
注：DBEは眼、皮膚、および呼吸器系に刺激を与えます。 - 必要に応じて、準備されたアガロースブロックを鋭利なメスを使用して所望の形状に切断する。典型的には、プリズムまたはくさび形の形状を切断して、サンプルアダプターの端に配置します。
注：アガロースブロックは弾性であるため、わずかな力で押されたときにサンプルは定位置にとどまります。
- 適切な励起および発光フィルター設定で目的の蛍光シグナル（ここでは、自己蛍光および抗CD45抗体染色）を検出する。
- 結合組織由来の自己蛍光シグナルを検出するには、励起波長488 nm（OPSL：50 mW）で525/50 nmのバンドパスフィルターを使用します。 AF647結合抗体によるCD45染色は、668nm（バンドパスフィルター：680 / 30nm）および647nmの励起波長（ダイオードレーザー：50mW）で検出される。
- 2つの個別のz平面間の距離として4μmを選択します。
4.画像後処理
注：得られたデジタル画像データは、科学的3D / 4D画像処理および分析ソフトウェア（材料の表を参照）でさらに処理した。
- データファイルのオープンと事前調整。
- 分析ソフトウェアを起動した後、左上隅の "Surpass"ボタンを選択します。画像スタックを開くには、「ファイル」、「開く」を選択し、最初に取得したチャンネルのデータを含むフォルダを選択します。追加のチャンネルを追加するには、[編集]と[チャンネルを追加]を選択します。
注記：データサイズやコンピュータシステムによっては、この処理に数分かかることがあります。提示されたプロトコールは、2つの獲得チャネル（自己蛍光およびAF647）の全てのステップを示す。 - 「編集」をクリックして「画像のプロパティ」を選択して、x、y、zボクセルの寸法を修正します。新しいウィンドウが開いたら、パラメータを調整します。
注：このステップは、使用される顕微鏡システムおよび特定のデータフォーマットに依存します。正しいxyz値は、後続のサイズおよび遠隔測定には重要です。ほとんどの場合、これらのパラメータは、顕微鏡写真ファイルにメタデータとして保存されます。ただし、ファイルformatは分析ソフトウェアによって正しく解釈されないため、手動でピクセルサイズを入力することが重要です。 xおよびy次元のピクセルサイズは、カメラのピクセルサイズ、適用される可能性のあるビニング、およびレンズと対物レンズの倍率によって異なります。 zのピクセルサイズは、自己定義されたzステップサイズ（ 例えば、 4μm）に等しい。
- まず、 "Display adjustment"（ "Edit"と "Show Display Adjustment"）を開いて、自家蛍光信号をグレースケールに変換します。新しいウィンドウには、開いているすべてのチャンネルとそのすべての表示設定が表示されます。デフォルトの色を変更するには、自己蛍光チャンネルを選択し、 "白"表示スタイルを選択します。 「OK」をクリックして適用します。
- 黒レベル調整の場合は、「表示調整」に戻って黒レベルの値を調整して、サンプル構造を表さない不要なバックグラウンド信号を除外しますs。
- これを行うには、チャンネルバーの左上三角形を左から右にドラッグします。
注：変更はすぐに視覚化されます。サンプルから派生していない信号のみを抑制するようにしてください。ノイズ信号が追加の計算に必要となる可能性があるため、ピッチ黒画素を避けるために、バックグラウンドの最小値を決して "0"にしないでください。画像取得後にすべての黒レベルの変更が実行されていることを確認してください。そうしないと、貴重なサンプル情報が失われる可能性があります。黒レベルの調整は代表的な目的にすぎません。異なるサンプルで同じディスプレイ設定を使用するには、チャンネルリストの下の「最小」の数値フィールドに正確な値を入力します。これは定量分析に非常に役立ちます。
- これを行うには、チャンネルバーの左上三角形を左から右にドラッグします。
- 右上の三角形を使用してそれぞれのチャンネルの強さを調整するか、またはチャンネルの下の「最大」数値フィールドに正確な値を入力することによって、強度調整を実行しますリスト。
- チャンネルバーの中央にある下三角をドラッグしてガンマ値を増減するか、または正確な値を入力して、コントラスト調整を実行します。
- 自己蛍光チャンネルに従ってAF647チャンネルを調整します。違いとして、AF647信号の可視化をヒートマップカラールックアップテーブルに設定します。手順4.2.1と同様の方法でチャンネルモード「火」を選択してください。
注：全体のシグナル強度は自己蛍光チャネルに比べて大幅に低いので、黒レベルは通常より低い値に調整されます。自己蛍光チャネルに関しては、このチャネルの輝度は通常増加する。 - 「ブレンドモード」を選択して、組織構造を詳細に視覚化します。 1つのシリーズのすべてのサンプルを同じパラメータ値で分析します。
- 3Dシーンのエキスポの前にオルガンを事実上切り開くにはレンダリングされた3Dオブジェクトにクリッピングプレーンを適用します。
- オブジェクトリストの "Clipping Plane"アイコン（はさみ）をクリックします。画像ビュー内で、黄色の枠とマニピュレータ（白いスピンドル）が表示されます。スピンドルを薄い方の端でマウスで回転させると、クリッピング面の向きが変わり、スピンドルの中央部が厚くなり、必要なクリッピングの深さが選択されます。
- オブジェクトリストの下のそれぞれのチェックボックスをオフにして、フレームとマニピュレータを非表示にし、目的のスナップショットを作成します。
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Representative Results
提示されたLSFMアプローチは、重篤な心筋炎の誘導時のマウス心臓の白血球分布および量を分析する。 図1Aは、心筋炎誘導のためのトランスジェニックCD11c.DTRマウスの前処理プロトコールを説明する。このステップは、白血球の心筋への動員に必要な引き金を表す。成功したDTX適用の後、動物は、一般的な衰弱、食欲不振、および2〜4日の範囲内の体重減少などの重篤な疾患症状を発症する。 4日後、白血球はivによって染色される。循環から血液を除去するために、経心筋灌流の前に蛍光色素結合抗CD45抗体を適用すること。正常に行われた場合、心臓および他の器官は白くなる。続いて、臓器を摘出し、上昇するエタノール行およびDBEでの最終インキュベーションによって、組織水をDBEと交換する。 図1Bは、タイムテーブル器官が著しく収縮する個々のインキュベーション段階のうちの少なくとも1つを含む。次いで、化学的に浄化された臓器を、標準的な顕微鏡組織ホルダー上のDBE充填画像化チャンバーに移す。 3D画像取得中に臓器を安定させるために、透明アガロースブロックで固定する。標本の詳細な配置を図2に示します。 2つのチャネル（自己蛍光および抗CD45）からなる全体の画像スタックの取得は、約20〜30分かかり、約16GBのデータファイルを生成する。最後に、得られたデータを、ヒートマップビューで白血球分布が表示される人工3Dレンダリングとして分析する。 図3 （上段）では、DTX処置動物の心臓の強く炎症を起こした領域は、その赤みを帯びた/白っぽい外観によって知覚することができる。 3Dモデルのより詳細な研究は、白血球濃度、特に心臓伝導系の領域、例えば心房細動ルービックバンドルおよびプルキンエ繊維を含む。対照的に、PBS処置動物の心臓は、この炎症パターンを全く示さない（下段）。
図1：ジフテリア毒素誘発性心筋炎の誘導および試料調製のスキーム。 （ A ）心筋炎の発症がそれによって引き起こされた。ジフテリア毒素（100ng /動物）の適用。 4日後、心筋炎が完全に発症し、AF647結合抗CD45抗体（15μg/動物）を静脈注射した。 CD45 +白血球を検出する。動物を2時間後に頸部脱臼により犠牲にし、心臓をPBS / EDTA（5mM）、続いて4％PFAで灌流した。 （ B ）除去後、器官を上昇するエタノールシリーズで脱水し、最後にジベンジルエーテル中で一晩インキュベートすることにより除去した。.com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2：顕微鏡でのサンプルの配置のスキーム化学的に透明な透明な心臓（4）を試料ホルダー（2および5）上に置き、透明アガロースブロック（6）の助けを借りて安定化させた。次いで、この構築物をDBE充填ガラスキュベット（3）に沈めた。取得のために、5.5mmの作動距離を有する0.5NA対物レンズ（1）を使用した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：Whole-orの代表的な3Dレンダリングガン薄片顕微鏡。 CD11c.DTRマウスを、DTX（上段）またはPBS（下段）で気管内処置した。 4日後、CD45 +白血球浸潤に代表される心筋炎の発症を、蛍光光シート顕微鏡検査によって視覚化した。 CD45 +細胞を染色するために、AF647に結合した抗CD45抗体を、マウスを犠牲にする2時間前に静脈内に注射した。結合組織の自己蛍光シグナルは灰色で表示され、CD45 +浸潤はヒートマップカラー（青：低シグナル、白：高シグナル）で示されています。各列は4つのデジタルクリップされた3Dレンダリングで構成され、オルガン内の状況を示します。心臓の前部に対するクリッピング深度は、個々の画像の上に宣言される。この図は、Mann et al。 15 。スケールバー= 1mm。 ここをクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを表示します。
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Discussion
現代の生命科学では、生物学的プロセスの顕微鏡視覚化がますます重要な役割を果たしている。この文脈では、この時点までに対処できない質問に答えるために役立つ過去2世紀の間に多くの開発が達成されました。第1に、光学顕微鏡の解像度能力を根本的に増加させる明らかな傾向があった。一度仮定された分解能制限による構造化照明顕微鏡（SIM） 21,22 、誘導発光 - 空乏（STED）顕微鏡23 、および光活性化局在化顕微鏡（PALM） 24,25または確率論的光学再構成顕微鏡（STORM）光回折27は著しく壊れていた。第二にしばしば標的とされた課題は、似ている環境での細胞の行動を観察することでしたできるだけ自然な状態。これに関連して、 インサイチュまたはインビボイメージングアプローチの開発が強制された。複雑な生物学的組織における限られた光の侵入深さを克服するために、2光子顕微鏡法28,29がこの研究分野において新しい基準を設定している。
しかしながら、これらの顕微鏡技術が通常共有する特徴は、最高の可能な解像度を保証するために高NAの目的を使用することである。それは微細構造をより詳細に解決するが、高NAの目的を使用することにより、視野および作業距離が大幅に制限される。結果として、周囲の環境の観点からの生物学的コンテクストは、しばしば真実の意味で焦点をはずす。このギャップを埋めるために、細胞サイズで蛍光構造を分解することができる顕微鏡技術を提供するLSFM開発が最近注目されている1cm以上の大きさの標本の3D情報全体を簡便に評価することができます。
ここに記載されているプロトコルは、ウルトラミクロスコープを用いてマウスの心臓全体で細胞性白血球浸潤を視覚化する方法の方法を提示する。 CD11c.DTRマウスモデル30における滅菌心筋炎の成功した誘導の後、それぞれの動物は、生存動物において2時間循環する蛍光色素結合抗CD45抗体の静脈内注射を受ける。原則として、死後の検査を行うことにより、臓器固定と試料脱水との間の全面的な抗体染色が可能であるべきである。残念なことに、全面染色はより長いインキュベーション工程を必要とし、したがって試料生成に必要な時間（ すなわち、 4〜21日）を大幅に増加させる6,31。さらに、この生体内染色法は、迅速であるだけでなく、全マウント染色プロトコールと比較して、抗体のより効果的な組織浸透9 。絶対染色効率は定量化されていないが、得られる蛍光シグナルが顕著に強いことを考慮すると、白血球集団の大部分が標識されることが予想される。蛍光タンパク質および抗体標識自体は、その後の清澄化プロセスで大部分生存し、両方が長期間安定であるように見える。また、組織清掃のために溶媒ベースの薬剤が使用されることにも留意すべきである。これは、クリアリングプロセスに続く全マウント染色法を大いに妨げる。溶媒に基づく組織の清澄化は可逆的な現象であるため、標準的な抗体染色のために通常使用される水系媒体（PBSなど）への透明組織の移動は、不透明な試料を生じる。したがって、有機溶媒中の非標準的な染色プロトコールは、検体の除去後に全面染色操作が必要である。
次のステップでは血液の清浄化が不十分で、結像結果が劇的に悪化するので、できるだけ多くの残留血液を除去するためには、その後の心臓灌流が絶対に必要である。心臓を切除した後、組織水を上昇するエタノール行で除去する。このステップは、ケミカル・クリアリングの最初の部分と見なすことができます。この考えは、組織水を、選択された標本の平均屈折率（RI）とよりよく一致する浸漬媒体で置換することである。 Ertuk らのプロトコールに従って、DBEを浸漬培地として選択した。いくつかの改変を加えて、 図32に示す。 DBEの屈折率は1.55（nD20）であり、ベンジルアルコール：ベンジルベンゾエート（BABB; RI（nD20）= 1.56） 6,7またはスクロース（RI（nD20）= 1.44）のような他の清澄剤と比較した場合、 ）我々は腎臓腎臓の糸球体の自動定量化に関する研究にその使用を記載している9.筋肉（腎臓）は、一度屈折率1.382±0.004 33と評価された組織は、我々が評価したすべての物質で同様に良好にクリアされた9。したがって、DBEの選択にとって重要な要因は、蛍光保存であり、クリアーポテンシャルではない。この受動的クリアリングプロトコールに変更すると、電気泳動電流の助けを借りて脂質を除去することにより強力にクリアされた組織が得られる、CLARITY 34,35のような能動的方法の使用が可能であるべきである。ベースのクリアリング方法では、DBEのクリアにより著しい硬化が生じる小さな収縮を伴いながら、これにより、試料の取扱いが容易になり、試料をアガロースブロックに包埋するなど、画像化にさらなる適応を必要としない。したがって、このプロトコルをCLARITYのような方法に移行するのは難しいかもしれませんが、人々はこのアプローチで選択した超顕微鏡（材料の表を参照）の使用を成功裏に実証しました3 。選択したクリアリング法による内在性蛍光シグナルの潜在的破壊を注意深く評価することが重要です。 CLARITYや他のアクティブクリアなプロトコルでは一度も作業していないため、これらのシステムでは蛍光色素反応についてコメントすることはできません。最悪のケースは、その後の全面的な抗体染色が行われなければならないことであろう。
この方法は、ネズミの肺のような他の器官に対して容易に調節可能である。腎臓;脳;大腿骨、脛骨、または頭蓋骨のような骨も含む。評価中新しい組織領域および/または新しい蛍光ラベリング戦略に対するアプリケーションの可能性のために、最大の課題は通常、蛍光が生き続けるようにプロトコルを設計することです。溶媒に基づく液浸媒体13および脱水剤36は、蛍光色素の完全性に直接的な影響を有する。 AlexaFluor誘導体は、様々なプロトコールで非常に安定しているように見えるので、AlexaFluor誘導体の使用が推奨されています。しかしながら、非常にしばしば、他の蛍光色素を使用しなければならない。この場合、他のクリアリング剤（ 例えば、スケール37 、キュービック38 、スクロース13 、クラリティ13,34、PACT 39 、フォーカスクリア13 、シードDB31、サリチル酸メチル40、3Disco 32 、BABBlass = "xref"> 6、およびECI 9 ）および他の脱水選択肢（ 例えば、メタノールおよびテトラヒドロフラン13 ）が挙げられる。
他の多くのLSFMの手法と同様に、透明な心臓を顕微鏡下に配置するプロセスが要求されている。市販のシステムは、肺葉、腎臓、または心臓を含むマウス器官のサイズのサンプルを設置するのに十分なスペースを提供する。しかし、現時点では、これらの標本用の標準化されたサンプルホルダは入手できません。したがって、透明化し、再成形したアガロースブロックを用いて実装装置を確立しなければならなかった。それでも、動きのアーチファクトのために、ある数の画像データセットを破棄しなければならなかった。この問題は、ここで使用された顕微鏡の長い取得時間のためにも増加しました。潜在的に、巨大なデータセットの生成はより高速のシステムから大幅に利益を得ることができますが、まだ高速な顕微鏡を使用する機会はありませんでした。我々の顕微鏡（表oを参照f材料）は、ズーム顕微鏡本体の周りに構築され、レーザーモジュール、6.5x6.5mm 2の画素サイズを有するsCMOSカメラ、および1.26Xから12.6Xの光学倍率範囲を有する検出光学系を備えていた。検出光学系の中心部分は、0.5mmの対物レンズであり、作動距離は5.5mmであり、対角線上に1.7~17.6mmの広い視野を観察することができた。これは、マウスの心臓全体の光学的切片化を行うのに十分な大きさであった。 400〜800nmの色収差の補正は、対物レンズの機械的調整によって達成された。必要に応じて、コンピュータ支援の後処理中に色補正をさらに実行した。厚い試料でも球面収差はこの系では観察されなかったので、補正する必要はなかった。
全体として、本明細書では、空間的lの化学的清澄化および分析のための堅牢なプロトコールを提示する軽いシート顕微鏡法を用いたネズミの心臓内の白血球分布。この時点で、このLSFM法は毛細血管のような細かい組織構造をほとんど決めることができないことを強調することが重要である。この点で、このLSFMは、一般的な免疫細胞分布を特徴づけ、器官内の潜在的な免疫細胞蓄積を記述するのに適している。しかしながら、LSFMは、一般的に、脈管構造のような小器官のサブ構造における細胞局在を分析および定量するための完璧な選択ではないことに留意しなければならない。このような疑問に答えるために、LSFMは、組織学や2光子顕微鏡などの他の方法で補完されるべきである。このプロトコルのさらなる限界には、最大3〜4色の制限があります。青色チャンネルは、自家蛍光から離れた他の信号には使用できません。固定サンプルへの制限、最大サンプルサイズは30 mm x 30 mm x 15 mm。また、DBEの強いにおいや急性毒性は、nを考慮する。後者の点に問題がある場合には、桂皮酸エチルを代わりの清澄剤9として使用することができる。この顕微鏡技術を選択する大きな利点は、器官全体を一度に分析できることです。ヘマトキシリンおよびエオシン染色、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）組織学的組織切片の従来の分析では、個々の切片を分析しない限り、重要な空間領域を欠く可能性が高い。さらに、薄板顕微鏡法は、3次元平面ごとにサンプルを仮想切断することができるだけでなく、標本を破壊したり、切断アーチファクトを引き起こすことなくこの可能性を提供します。必要であれば、固定された臓器をその後、特定の関心領域を高度に解決するための相関光および電子顕微鏡法などのさらなる分析のために処理することができる。そのような研究のためのテンプレートは、Karreman et al。ここで、相関ベット2光子顕微鏡画像スタックと3次元電子顕微鏡データが成功裏に示された41 。もう一つの有望なアプローチは、このプロトコールと最近発表された有機溶媒に基づくuDISCO法との組み合わせであり、標準的なLSFM 42によってはるかに大きな臓器の調査が可能になるだろう。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
Gunzer研究所の研究は、ドイツ連邦教育研究省（付与番号0315590 AD）およびドイツ研究財団（付与番号GU769 / 4-1、GU769 / 4-2）の支援を受けていた。テクニカルサポートについてはIMCES、3D漫画モデリングについてはSebastian Kubatに感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
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