Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

doi: 10.3791/55450 Published: May 31, 2017

Summary

هنا، ونحن تصف نهج ورقة المجهر الضوئي لتصور القلب CD45 + الكريات البيض التسلل في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم العقيم، والذي يسببه العلاج داخل الخناق السموم علاج الفئران CD11c.DTR.

Abstract

أصبح ضوء ورقة المجهري مضان (لسفم)، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات المقاصة الكيميائية، المعيار الذهبي لتحليل الهياكل فلورزنتلي المسمى في العينات البيولوجية الكبيرة، وينخفض ​​إلى دقة الخلوية. وفي الوقت نفسه، فإن التحسين المستمر للبروتوكولات الأساسية وتعزيز توافر النظم التجارية المتخصصة تمكننا من التحقيق في المجهرية لأجهزة الفأر كله وحتى تسمح لتوصيف السلوك الخلوي في مختلف نهج التصوير الخلية الحية. هنا، نحن تصف بروتوكول للتصور المكاني كله جبل والتقدير الكمي للسكان CD45 + الكريات البيض في قلوب الفأر الملتهبة. طريقة توظف سلالة الماوس المعدلة وراثيا (CD11c.DTR) التي أظهرت مؤخرا لتكون بمثابة نموذج قوي، محرض لدراسة تطور التهاب عضلة القلب المميتة مداهم، تتميز عدم انتظام ضربات القلب القاتلة. ويشمل هذا البروتوكول تحريض عضلة القلب الحث، إنترافيتتلطيخ خلية بوساطة الأجسام المضادة، وإعداد الجهاز، و لسفم مع صورة بمساعدة الحاسوب بعد المعالجة. على الرغم من تقديمها على أنها وسيلة تكييفها للغاية لسؤالنا العلمي معين، بروتوكول يمثل مخططا لنظام قابل للتعديل بسهولة التي يمكن أيضا استهداف هياكل الفلورسنت مختلفة تماما في الأجهزة الأخرى وحتى في الأنواع الأخرى.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلال تطور المجهر الضوئي، ظهرت العديد من الأشكال المتخصصة، وكلها وضعت للحد من القيود في عملية التصور لعينات معينة. واحدة من هذه الطريقة هي ورقة ضوء المجهر مضان (لسفم). وضعت لأول مرة في عام 1903 من قبل سيدنتوف وزيغموندي 1 وإيجاد أول التطبيقات البيولوجية الأساسية في 1990s في وقت مبكر 2 ، أصبح لسفم أداة المجهرية أقوى حتى الآن لتصور العينات الكبيرة، مثل أجهزة الماوس سليمة، مع إشارة إشارة الفلورسنس وصولا الى المستوى الخلوي. وبسبب هذه الفوائد، جنبا إلى جنب مع إمكاناتها لتصوير الخلايا الحية، واسم طرق الطبيعة لسفم "أسلوب السنة 2014 3 ".

وكما يوحي اسمها، يتم إجراء إضاءة العينة في لسفم من قبل ورقة الضوء، والتي يتم توجيهها عموديا على محور الهدف المستخدم fأو جمع الضوء الانبعاثات وتشكيل الصورة اللاحقة. وعادة ما يتم إنشاء ورقة الضوء إما عن طريق التركيز واسعة، شعاع الليزر الموازاة مع عدسة أسطوانية أو عن طريق حركة جانبية سريعة من الحزم الليزر الضيقة، وتركز في واحد فقط الأفقي أو الرأسي الطائرة 4 ، 5 . وبهذه الطريقة، يتم إضاءة فقط المستوى البؤري للبصريات التصوير، وعادة مع سمك 1-4 ميكرون. وبالتالي، لعينة الفلورسنت وضعت في الطائرة الإضاءة، كل من جيل من الضوء المتناثرة وآثار فوتوبلاشينغ من المناطق فوق أو تحت الطائرة البؤرية يتم القضاء عليها أو قمعها إلى حد كبير 6 ، 7 . وبما أن جميع الطائرات خارج البؤرة ليست مضيئة، يتم حذف تأثيرات فوتوبلاشينغ في هذه المناطق. على النقيض من متحد البؤر القياسية أو متعددة الفوتون المجهري، ومسارات ضوء مضيئة والمنبعثة منفصلة عن بعضها البعض، وبالتالي فإن الصورة النهائية كوال إيتي لا تعتمد على التركيز المثالي من شعاع ضوء الإثارة من خلال الأهداف. اعتمادا على السؤال الأساسي، وبالتالي فمن الممكن استخدام الأهداف مع مجال هائل من الرأي (فوف) بحيث أكبر منطقة ممكنة من الطائرة مضيئة يمكن تصويرها دون أي أجزاء مكون تتحرك في اتجاه زي.

في أنظمة لسفم الحديثة، يتم التقاط صورة الفلورسنت من القسم البصري ولدت على جهاز حساسة للغاية تهمة اقتران (كسد) أو مكملة أشباه الموصلات أكسيد المعادن (كموس) الكاميرات، التي هي قادرة على الحصول على كامل مجال الرؤية (فوف) في ميكروثانية. لذلك، عن طريق تحريك العينة من خلال ورقة الضوء والحصول على الصور في خطوات Z محددة، فمن الممكن الحصول على معلومات 3D كاملة من عينة في فترة معقولة من الزمن 8 ، 9 ، مما يجعل هذه التقنية تنطبق على الخلية الحية الدراسات 10 ،أس = "كريف"> 11 ، 12 .

ومع ذلك، على الرغم من لسفم يوفر طريقة سريعة وحساسة، ومضان مضان، انتقال الضوء من خلال العينة لا تزال قضية رئيسية، وخصوصا عندما تكون العينات البيولوجية الكبيرة هي الهدف لتحليل 3D. يتم تعديل انتقال الضوء بشكل حاسم من قبل الجوانب الفيزيائية للامتصاص وبانتثار الضوء في واجهات الهياكل مع مؤشرات الانكسار مختلفة 13 . لذلك، عندما عينات التصوير عدة مليمترات في الحجم، يتم الجمع بين لسفم في الغالب مع بروتوكولات المقاصة لجعل العينات شفافة بصريا. وتستند هذه التقنيات على فكرة إزالة المياه من الأنسجة البيولوجية ذات الصلة وتبادلها مع وسائل الإعلام الغمر المائي أو العضوي القائم على المذيبات، والتي يتم اختيارها لتتناسب بشكل ضيق مع مؤشرات الانكسار من مكونات الأنسجة المستهدفة معينة. ونتيجة لذلك، يتم تقليل تشتت الضوء الجانبي، وجميع الأطوال الموجيةمن الضوء يمكن أن تمر أكثر كفاءة من خلال الأنسجة 13 . في كثير من الحالات، تظهر العينات البيولوجية التي تعامل بهذه الطريقة ظاهريا واضحة وضوح الشمس، والتي تمكن لسفم أن تجري، حتى على أجهزة الماوس بأكملها، وذلك باستخدام لمسافات طويلة العمل، وأهداف التكبير منخفضة.

هنا، نقدم بروتوكول التحضير للتصوير عينة كبيرة في المجهر ورقة الضوء (انظر الجدول من المواد)، التي أنشأناها للتحقيق في التسلل القلبي الخلوي في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب 15 . CD11c.DTR الفئران تعبر عن مستقبلات السموم الخناق الرئيسيات (دتر) تحت سيطرة CD11c المروج 16 . ونتيجة لذلك، يتم عرض الخلايا في هذه الفئران، والتي تعبر عن CD11c جنبا إلى جنب مع دتر، حساسة للذيفان الداخلي للالدفتيريا الخناق (الدفتيريا السم، دتكس). والعلاج المنهجي لهذه الحيوانات مع دتكس النتائج في استنفاد جميع CD11c + سيLLS. CD11c هو إنتغرين و، كمستقبلات سطح الخلية لمجموعة متنوعة من العوامل القابلة للذوبان المختلفة، وتشارك في عمليات التنشيط والنضج أساسا في خلايا النسب مونوسيتيك 17 . ونتيجة لذلك، وقد تم استخدام نموذج الماوس CD11c.DTR بشكل مكثف لدراسة دور الخلايا الجذعية والمجموعات الفرعية بلعم في سياق العديد من الأسئلة المناعية المختلفة. مع مرور الوقت، فقد أفيد أن الفئران CD11c.DTR تعامل بشكل منهجي مع دتكس يمكن أن تتطور الآثار الجانبية السلبية ويمكن عرض معدلات وفيات مرتفعة بقوة 18 ، 19 . في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على تحديد السبب الكامن وراء الوفاة 15 ، واصفا تطور التهاب عضلة القلب مداهم بعد تطبيق دتكس داخل القصبة الهوائية في هذه الحيوانات. تسبب تحدي السموم الدمار الخلوي، بما في ذلك في الأجزاء الوسطى من نظام نقل التحفيز في القلب. ورافق ذلك CD45 ضخمة+ الكريات البيض التسلل، مما يؤدي في النهاية إلى عدم انتظام ضربات القلب القاتلة. في هذه الحالة، لم يكن فقط ظهور السكان الكريات البيض مهمة، ولكن أيضا التوزيع المكاني داخل القلب. هذا السؤال التجريبي هو التحدي للتصوير المجهري الحديث، والتي قمنا حلها من خلال نهج ورقة المجهر الضوئي الذي يدعمه تلطيخ الأجسام المضادة إنترافيتال والبروتوكول القائم على المذيبات العضوية القائمة على المقاصة البصرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة عليها من قبل السلطات المحلية ذات الصلة في إيسن (أز 84-02.04.2014A036 - لاندسامت فور ناتور، أومويلت أوند فيربراوشرشوتز نوردرهين-ويستفالين، إسن، جيرماني). واستخدمت الحيوانات وأقامت تحت ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.

1. تحريض التهاب عضلة القلب عن طريق الدفتيريا السموم (دتكس)

  1. إعداد حل دتكس لتحريض التهاب عضلة القلب عن طريق تمييع حل الأسهم دتكس مع المالحة الفوسفات مخزنة (بس) إلى 1 ميكروغرام / مل حل العمل.
  2. تطبيق 100 ميكرولتر من هذا الحل إنتراتراشيالي (إيت) إلى 8 إلى 10 الفئران CD11c.DTR عمرها (5 نانوغرام / غرام من وزن الجسم (بو))، كما هو مبين من قبل هاسنبرغ وآخرون. لأنه تطبيق تعليق بوغ الفطرية 20 .
    ملاحظة: التطبيق داخل الصفاق من السم قد يؤدي إلى تحريض مماثل منالتهاب عضلة القلب القاتلة. ومع ذلك، فإن هذا النهج سيتعين أولا التحقق من صحته.
    1. لذلك التطبيق، تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق (إب) من 100 ملغ / كغ من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من وزن زيلازين.
    2. بعد الوصول إلى تخدير عميق (أخمص القدمين قرصة الاختبار)، إنتوبات الحيوانات باستخدام 22 G القسطرة الوريدية إندويلت من خلال تجويف الفم. التحقق من المواقع الصحيحة للأنبوب العدسة عن طريق تهوية الحيوانات مع جهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة بمعدل 250 نفسا في الدقيقة وحجم استنشاق 250 ميكرولتر في التنفس، كما أظهرها هاسنبرغ وآخرون. الله. 20 .
      ملاحظة: عند وضعه بشكل صحيح، فإن معدل التنفس من الحيوانات تتغير وفقا لإعدادات التهوية تطبيقها.
    3. قطع نظام التهوية وغرس 100 ميكرولتر من حل دتكس أو مبلغ مساو من برنامج تلفزيوني كسيطرة من خلال القسطرة في الرئة ومواصلة تهوية الحيوانات لمدة 1 دقيقة إضافية.
  3. السماح للحيوانات التعافي من التخدير ومراقبة الحالة الصحية العامة وتغير وزن الجسم لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: اعتمادا على الخلفية الوراثية، سلالة الماوس، أو الوزن الأولي، وشدة وظهور التهاب عضلة القلب قد تختلف وينبغي تحديدها أولا.

2. إعداد عينة للضوء ورقة المجهري

  1. 4 أيام بعد تطبيق السموم، تخدير الفئران عن طريق بيغ غرفة تحريض مع تبخير 2٪ إيسوفلوران / مزيج الأكسجين. حقن 15 ميكروغرام من الأجسام المضادة المضادة CD45 المسمى مباشرة (استنساخ 30-F11، AlexaFluor647 (AF647)) في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الوريد (4) باستخدام الطريق التطبيق المدارية الرجعية، والذي يضمن تطبيق سريع جدا ودقيق للغاية من كمية صحيحة من الأجسام المضادة.
    ملاحظة: تم الوصول إلى عمق المطلوب من التخدير عندما الفئران هي راقد ولا تتفاعل مع أخمص القدمين قرصة الاختبار.
  2. بعد 2 ساعة من الحضانة، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحمد يروي قلوب في الموقع مع 5 مل من برنامج تلفزيوني / إدتا (5 ملم).
    1. فضح القلب وحقن حل نضح في البطين الأيمن باستخدام 21 G القسطرة. إرضاء مع بطيئة، الضغط المستمر والتأكد من أن الدم يمكن أن تنضب بعد قطع فتح الشريان الأورطي.
      ملاحظة: هذا نضح ترانزكارديال قد يؤدي إلى التحف الصغيرة التحف، والتي يمكن أن تزعج التصور 3D النهائي للجهاز. لذلك، يمكن أن تجريب الحيوانات المتقدمة أداء نضح من خلال الوريد الأجوف السفلي، مما يستثني الشريان الأورطي البطني.
  3. لتثبيت الكيميائية، يروي القلب من خلال نفس العطلة مع 5 مل من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا). الحفاظ على القسطرة في مكان وببساطة إرفاق حقنة جديدة مليئة بفا. إرضاء مع الضغط البطيء والثابت.
    ملاحظة: بارافورمالدهيديس سامة للغاية. وتجنب الاتصال مع الجلد والعينين وغيرها من الغشاء المخاطي.
    1. فهم بلطف القلب مع ملقط مسننة. بوليرة لبنانية قليلا صعودا؛ وقطع جميع الاتصالات الأنسجة، بما في ذلك الشرايين الواردة والصادرة والأوردة. تخزين الجهاز لمدة 4 ساعة إضافية في بفا 4٪ لمزيد من التثبيت.
  4. لتجفيف الجهاز، احتضان القلب في سلسلة الايثانول تصاعدي في 50٪، 70٪، ومرتين في 100٪، كل لمدة 12 ساعة، في 4 درجات مئوية في الظلام. هنا، استخدم الأسود 5 مل أنابيب البولي بروبيلين رد فعل، والسماح لهم لتدوير باستمرار في دوار أنبوب باستخدام سرعة دوران بطيئة لمنع تشكيل فقاعة الهواء.
  5. إعداد عينة كاملة عن طريق المقاصة الكيميائية. لجعل قلوب شفافة، احتضان لهم في 98٪ ديبنزيل الأثير (دب) بينما تدور باستمرار بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: دب هو مهيج للعيون، والجلد، والجهاز التنفسي.

3. ضوء ورقة المجهري

  1. إجراء لسفم باستخدام المجهر ورقة الضوء (انظر الجدول من المواد). وضع العينة على حامل عينة القياسية من المجهر في سو مليئة دبفيت، وهو مناسب للعينات حتى 30 مم × 30 مم × 15 مم.
  2. عقد العينة بقوة في مكان خلال الحصول على الصور باستخدام كتل الاغاروز المجففة والمطهرة.
    1. لإعداد كتل الاغاروز، صب 2٪ الاغاروز المنصهر في قالب (15 مم × 15 مم × 5 ملم). السماح للأغاروز يبرد حتى يصلب.
    2. يذوى في سلسلة إيثانول تصاعدي (50٪، 70٪، ومرتين في 100٪). احتضان كتل الاغاروز بين عشية وضحاها في 98٪ دب. تخزين الاغاروز في دب حتى يتم استخدامه.
      ملاحظة: كما يتكون الاغاروز أساسا من الماء، ويمكن تمديد أوقات حضانة لكل خطوة الجفاف، اعتمادا على حجم الكتلة.
      ملاحظة: دب هو مهيج للعيون، والجلد، والجهاز التنفسي.
    3. عند الحاجة، وقطع كتلة أغاروس أعدت إلى الشكل المطلوب باستخدام مشرط حاد. عادة، وقطع أشكال المنشور أو إسفين على شكل لوضع على حواف محول العينة.
      ملاحظة: كما كتل الاغاروز مرنة،تبقى العينة في مكانها عندما دفعت بقوة قليلة.
  3. كشف إشارات مضان من الفائدة (هنا، تألق ذاتي ومكافحة CD45 تلطيخ الأجسام المضادة) مع الإثارة المناسبة والانبعاثات مرشح الانبعاثات.
    1. للكشف عن إشارة التضامن التلقائي الضام المستمدة، استخدم مرشح الموجة الخلفية 525/50 نانومتر في الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر (أوبسل: 50 ميغاواط). تم الكشف عن تلطيخ CD45 مع الأجسام المضادة ل AF647 في 668 نانومتر (مرشح الموجة العريضة: 680/30 نانومتر) وفي الطول الموجي الإثارة من 647 نانومتر (ليزر الصمام الثنائي: 50 ميغاواط).
    2. اختيار 4 ميكرون كما المسافة بين اثنين من الطائرات Z الفردية.

4. صورة بعد المعالجة

ملاحظة: تمت معالجة بيانات الصورة الرقمية المكتسبة بشكل أكبر باستخدام برنامج معالجة الصور وتحليلها ثلاثي الأبعاد / 4D العلمي (انظر جدول المواد).

  1. فتح ملفات البيانات وتعديلها مسبقا.
  2. بعد بدء برنامج التحليل، حدد زر "تجاوز" في الزاوية العلوية اليسرى. لفتح أكوام الصور، اختر "ملف"، "فتح"، وحدد مجلدا يحتوي على البيانات من القناة المكتسبة الأولى. اختر "تعديل" و "إضافة قنوات" لإضافة قنوات أخرى تم الحصول عليها.
    ملاحظة: اعتمادا على حجم البيانات ونظام الكمبيوتر، قد تستغرق هذه العملية عدة دقائق. بروتوكول عرض يوضح جميع الخطوات ل 2 قنوات اكتساب (تألق ذاتي و AF647).
  3. قم بتصحيح أبعاد x و y و z فوكسل بالنقر على "تعديل" وتحديد "خصائص الصورة". عند فتح النافذة الجديدة، اضبط المعلمات.
    ملاحظة: هذه الخطوة تعتمد على نظام المجهر المستخدمة وتنسيق البيانات معين. تصحيح قيم شيز أمر بالغ الأهمية لحجم لاحق والقياسات البعيدة. في معظم الحالات، يتم تخزين هذه المعلمات كبيانات ميتا في ملفات ميكروغراف. ومع ذلك، إذا كان الملف فورمات لا يمكن تفسيرها بشكل صحيح من قبل برنامج التحليل، فمن المهم أن تدخل يدويا حجم بكسل. حجم بكسل في x و y أبعاد تعتمد على حجم بكسل الكاميرا، بينينغ تطبيقها المحتملة، والعدسة والتكبير موضوعي. حجم بكسل في z ما يعادل حجم خطوة Z محددة ذاتيا (على سبيل المثال، 4 ميكرون).
  • تعديلات القناة
    1. أولا تحويل إشارة تألق ذاتي إلى الرمادي عن طريق فتح "تعديل العرض" ("تحرير" و "عرض عرض التكيف"). سوف نافذة جديدة قائمة كافة القنوات المفتوحة وإعدادات العرض لجميع منهم. لتغيير لونه الافتراضي، حدد قناة تألق ذاتي واختيار "الأبيض" نمط العرض. انقر على "موافق" للتطبيق.
    2. لتعديل مستوى أسود، والعودة إلى "تعديل العرض" وضبط قيمة مستوى أسود لاستبعاد إشارات الخلفية غير المرغوب فيها التي لا تمثل بنية عينةالصورة.
      1. للقيام بذلك، استخدم المثلث العلوي الأيسر على شريط القناة واسحبه من اليسار إلى اليمين.
        ملاحظة: سيتم تصور التغييرات على الفور. تأكد من قمع الإشارات غير المستمدة من العينة فقط. يجب ألا تكون القيم الدنيا في الخلفية "0" لتجنب وحدات البكسل السوداء، حيث قد تكون هناك حاجة إلى إشارات ضوئية لإجراء عمليات حسابية إضافية. تأكد من أن جميع التغييرات مستوى أسود يتم تنفيذها بعد الحصول على الصور. وإلا، قد تفقد معلومات العينة القيمة. إن التسوية على مستوى اللون الأسود تخدم أغراض تمثيلية فقط. لاستخدام نفس إعدادات العرض عبر عينات مختلفة، يمكن إدخال القيم الدقيقة في الحقل "مين" العددي أسفل قائمة القنوات. وهذا مفيد جدا للتحليلات الكمية.
    3. إجراء تعديل كثافة، إما عن طريق استخدام المثلث العلوي الأيمن لضبط كثافة قناة منها أو عن طريق إدخال قيم دقيقة في الحقل "ماكس" العددية تحت تشانl.
    4. إجراء تعديل التباين عن طريق سحب المثلث السفلي في منتصف شريط القناة لزيادة أو تقليل قيمة غاما أو عن طريق إدخال القيم الدقيقة.
    5. ضبط قناة AF647 وفقا لقناة تألق ذاتي. كالفارق، تعيين التصور للإشارة AF647 إلى جدول خريطة اللون الحرارة نظرة المتابعة. القيام بذلك عن طريق اختيار وضع القناة "النار" في نهج مماثل لتلك الموجودة في الخطوة 4.2.1.
      ملاحظة: كما شدة إشارة الإجمالية هي أقل بكثير بالمقارنة مع قناة تألق ذاتي، يتم تعديل مستويات سوداء عادة لقيم أقل بكثير. أما بالنسبة للقناة تألق ذاتي، وعادة ما يتم زيادة سطوع هذه القناة.
    6. حدد "وضع مزيج" لتصور هياكل الأنسجة في التفاصيل. تحليل جميع العينات من سلسلة واحدة مع نفس القيم المعلمة.
  • لقطة افتراضية
    1. لقطع تقريبا فتح الجهاز قبل المعرض المشهد 3Dرت، وتطبيق طائرة لقطة على كائن 3D المقدمة.
      1. انقر فوق "لقطة الطائرة" رمز (مقص) في قائمة الكائن. داخل عرض الصورة، سيظهر إطار أصفر ومناور (مغزل أبيض). تدوير المغزل في نهاية أرق مع الماوس، وبالتالي تغيير اتجاه الطائرة لقطة، ونقل الجزء الأوسط سمكا من المغزل لتحديد عمق المطلوب من لقطة.
      2. إخفاء الإطار والمناورة عن طريق إلغاء تحديد خانات الاختيار الخاصة بها أسفل قائمة الكائن وإنشاء اللقطات المطلوبة.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    نهج لسفم عرض يحلل توزيع الكريات البيض وكمية في قلوب الفئران عند تحريض التهاب عضلة القلب الحاد. الشكل 1A يفسر بروتوكول ما قبل المعالجة للفئران المعدلة وراثيا CD11c.DTR لالتهاب عضلة القلب الحث. هذه الخطوة تمثل الزناد اللازم لتجنيد الكريات البيض إلى عضلة القلب. بعد تطبيق دتكس ناجحة، والحيوانات تتطور أعراض المرض الشديد، مثل الضعف العام، وفقدان الشهية، وفقدان الوزن في حدود 2-4 أيام. بعد 4 أيام، هي ملطخة الكريات البيض من قبل الرابع . تطبيق المضادة للضوضاء المضادة CD45 الأجسام المضادة قبل نضح ترانسكارديال لإزالة الدم من الدورة الدموية. إذا أجريت بنجاح، القلب والأعضاء الأخرى تتحول بيضاء. وفي وقت لاحق، يتم استئصال الجهاز، ويتم تبادل المياه الأنسجة مع دب من صف إيثانول تصاعدي والحضانة النهائية في دب. ويبين الشكل 1B الجدول الزمنيمن خطوات الحضانة الفردية التي يخضع فيها الجهاز لانكماش كبير. ثم يتم نقل الجهاز تطهير كيميائيا إلى غرفة التصوير مليئة دب على حامل الأنسجة المجهر القياسية. لتحقيق الاستقرار في الجهاز خلال الحصول على صورة 3D، يتم إصلاحه من قبل كتل الاغاروز شفافة. وتصور المواقع التفصيلية للعينة في الشكل 2 . الاستحواذ على كومة الصورة بأكملها، تتألف من 2 قنوات (تألق ذاتي ومكافحة CD45)، يستغرق حوالي 20-30 دقيقة ويولد ملف بيانات من حوالي 16 غيغابايت. وأخيرا، يتم تحليل البيانات الناتجة عن تقديم 3D الاصطناعية التي يتم عرض توزيع الكريات البيض في عرض خريطة هتماب. في الشكل 3 (الصف العلوي)، والمناطق الملتهبة بقوة من قلب حيوان المعالجة دتكس يمكن أن ينظر إليها من قبل ظهورهم المحمر / الأبيض. دراسة أكثر تفصيلا للنموذج 3D يكشف تركيز الكريات البيض، وخاصة في مناطق نظام التوصيل القلبي، مثل أتريوفنت حزمة ريكولار والألياف بوركينج. في المقابل، قلوب الحيوانات المعالجة بس لا تظهر هذا النمط الالتهاب على الإطلاق (الصف السفلي).

    شكل 1
    الشكل 1: مخطط التعريفي وإعداد عينة من الدفتيريا التي يسببها التهاب عضلة القلب التي يسببها السموم. ( A ) كان يسببها التهاب عضلة القلب من قبل ذلك . تطبيق السم الخناق (100 نانوجرام / حيوان). بعد 4 أيام، كان التهاب عضلة القلب قد تطورت بشكل كامل وتم حقن الأجسام المضادة لمكافحة CD45 بالإضافة إلى AF647 (15 ميكروغرام / حيوان) الرابع . للكشف عن الكريات البيض CD45 + . تم التضحية الحيوانات 2 ساعة في وقت لاحق عن طريق خلع عنق الرحم، و بيرفوسد قلوب مع بس / إدتا (5 ملم) تليها بفا 4٪. ( ب ) بعد إزالة، تم تجفيف الجهاز مع سلسلة إيثانول تصاعدي وأخيرا تطهيرها من قبل الحضانة بين عشية وضحاها في الأثير ثنائي الفينيل..com / فيليز / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: مخطط العينة لتحديد المواقع في المجهر. تم وضع القلب الشفاف المطهر كيميائيا (4) على حامل العينة (2 و 5) واستقر مع مساعدة من كتل الاغاروز مسح (6). ثم تم غمر هذا البناء في كفيت الزجاج مليئة دب (3). وبالنسبة للاستحواذ، تم استخدام عدسة هدفية قدرها 0.5 نا (1) مع مسافة عمل قدرها 5.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 3
    الشكل 3: عرض 3D ممثل الجامع أوغان ضوء ورقة المجهري. تم التعامل مع الفئران CD11c.DTR إنتراتراشيلي مع دتكس (الصف العلوي) أو برنامج تلفزيوني (الصف السفلي). بعد 4 أيام، تطور التهاب عضلة القلب، ممثلة CD45 + تسلل الكريات البيض، وتصور من قبل مضان ورقة ضوء المجهري. لصمة عار الخلايا CD45 + ، تم حقن الأجسام المضادة لمكافحة CD45 إلى AF647 إيف 2 ساعة قبل التضحية الفئران. يتم عرض إشارة تألق ذاتي من النسيج الضام باللون الرمادي، في حين يظهر التسلل CD45 + في ألوان هيتماب (الأزرق: إشارة منخفضة، أبيض: إشارة عالية). ويتكون كل صف من 4 الاداءات 3D قصها رقميا، مما يدل على الوضع داخل الجهاز. ويعلن عمق لقطة بالنسبة إلى الجزء الأمامي من القلب فوق الصور الفردية. تم تعديل هذا الرقم من مان وآخرون. 15 - شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    في علوم الحياة الحديثة، والتصور المجهري للعمليات البيولوجية يلعب دورا متزايد الأهمية. في هذا السياق، تم تحقيق العديد من التطورات خلال القرنين الماضيين التي تساعد على الإجابة على الأسئلة التي لا يمكن معالجتها حتى هذه النقطة،. أولا، كان هناك ميل واضح إلى زيادة جذرية في قدرة القرار المجاهر الخفيفة. مع المجهر إضاءة منظم (سيم) 21 ، 22 ، حفز انبعاث الانبعاث (ستيد) المجهري 23 ، والمجهر توطين الصورة تنشيط (بالم) 24 ، 25 أو ستوكاستيك المجهر إعادة الإعمار البصري (ستورم) 26 ، والحد من فرضه مرة واحدة المقرر لانعراج الضوء 27 تم كسر بشكل كبير. وكان التحدي الثاني الذي يستهدف في كثير من الأحيان هو مراقبة السلوك الخلوي في بيئة تشبهوالحالة الطبيعية في أقرب وقت ممكن. وفي هذا السياق، اضطر تطوير نهج التصوير في الموقع أو في الجسم الحي . للتغلب على محدودية عمق اختراق الضوء في الأنسجة البيولوجية المعقدة، وقد وضعت 2 الفوتون المجهري 28 ، 29 معايير جديدة في هذا المجال البحثي.

    ومع ذلك، ميزة أن جميع هذه التقنيات المجهري تشارك عادة هو استخدام عالية نا أهداف لضمان أفضل قرار ممكن. على الرغم من أنه لا حل المجهرية بمزيد من التفصيل، واستخدام أهداف عالية نا يحد بشكل كبير من مجال الرؤية، فضلا عن مسافة العمل. ونتيجة لذلك، فإن السياق البيولوجي من حيث البيئة المحيطة غالبا ما يخرج من التركيز بالمعنى الحقيقي للكلمة. لإغلاق هذه الفجوة، وقد اكتسبت التنمية لسفم مؤخرا الفائدة، وتوفير تقنية المجهري التي هي قادرة على حل هياكل الفلورسنت في حجم الخلويةولكن أيضا لتقييم مريح معلومات 3D كاملة من عينة مع حجم أكثر من 1 سم.

    بروتوكول الموصوفة هنا يقدم طريقة لكيفية توظيف أولتراميكروسكوب لتصور اختراق الكريات البيض الخلوي في قلوب الفئران بأكملها. بعد نجاح تحريض التهاب عضلة القلب العقيمة في نموذج الماوس CD11c.DTR 30 ، يتلقى الحيوان منها حقن الرابع من الأجسام المضادة لمكافحة CD45 متجانسة، التي تعمم لمدة 2 ساعة في الحيوان الحي. من حيث المبدأ، من خلال إجراء ما بعد الوفاة، يجب أن يكون كامل جبل الأجسام المضادة تلطيخ بين تثبيت الجهاز وجفاف عينة ممكن. لسوء الحظ، تلطيخ كامل جبل يتطلب خطوات حضانة أطول بكثير، وبالتالي يزيد بشكل كبير من الوقت اللازم لتوليد عينة ( أي، 4-21 أيام) 6 ، 31 . وعلاوة على ذلك، هذا النهج تلطيخ إنترافيتال ليس فقط أسرع، ولكن أيضا يسلماختراق الأنسجة أكثر فعالية من الأجسام المضادة مقارنة مع كامل جبل تلطيخ بروتوكول 9 . على الرغم من أن كفاءة تلطيخ المطلقة لم يتم قياس كميا، فمن المتوقع أن يتم وصف نسبة كبيرة من السكان الكريات البيض، بالنظر إلى أن إشارة مضان الناتجة قوية بشكل ملحوظ. كل من البروتينات الفلورسنت وسم الأجسام المضادة نفسها البقاء على قيد الحياة إلى حد كبير عملية المقاصة اللاحقة، وكلاهما يبدو أن مستقرة لفترة طويلة من الزمن. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن وكيل القائم على المذيبات يستخدم لإزالة الأنسجة. هذا يعوق بشكل كبير نهج تلطيخ كامل جبل بعد عملية المقاصة. إن إزالة الأنسجة المستندة إلى المذيبات هي ظاهرة عكسية، لذلك فإن نقل الأنسجة المقاصة إلى وسط مستند إلى الماء (مثل بس)، والذي يستخدم عادة لتلطيخ الأجسام المضادة القياسية، سيؤدي إلى عينة غير شفافة. ولذلك، فإن بروتوكولات تلطيخ غير القياسية في المذيبات العضوية يجب أن تنشأ ط فا كله-- جبل إجراء تلطيخ بعد إزالة العينة.

    نضح القلب اللاحق ضروري تماما للقضاء على أكبر قدر ممكن من الدم المتبقية، حيث يتم مسح الدم سيئة في الخطوات التالية وتفاقم بشكل كبير من نتائج التصوير. بعد استئصال القلب، تتم إزالة ماء الأنسجة في صف إيثانول تصاعدي. هذه الخطوة يمكن اعتبارها الجزء الأول من المقاصة الكيميائية. والفكرة هي استبدال المياه الأنسجة مع وسيلة الغمر التي تتطابق بشكل أفضل مع متوسط ​​معامل الانكسار (ري) من عينة الاختيار. تم اختيار دب كوسيط الغمر بعد بروتوكول إرتوك وآخرون. 32 ، مع بعض التعديلات. (دب) = 1.56) 6 أو 7 أو السكروز (ري (nd20) = 1.44 )f "> 13، فمن الأفضل الحفاظ على تسميات الفلورسنت المستخدمة في هذا البروتوكول.وقد تم الحفاظ على الحفاظ على مضان مماثلة باستخدام إيثيل سينامات (إيسي)، وقد وصفنا استخدامه في دراسة عن الكمي الآلي للكبيبات في الكلى الكلوي 9. العضلات الأنسجة، مرة واحدة يقدر أن يكون معامل الانكسار من 1.382 ± 0.004 33 ، تم مسح جيدا على قدم المساواة مع جميع المواد التي قمنا بتقييم 9. وبالتالي، فإن العامل الحاسم لاختيار دب كان الحفاظ مضان وليس إمكانات المقاصة، تغيير إلى هذا البروتوكول المقاصة السلبي، واستخدام طريقة نشطة مثل كلاريتي 34 ، 35 ، حيث إزالة الدهون مع المعونة من النتائج الحالية الكهربي في الأنسجة تطهيرها بقوة، وينبغي أن يكون ممكنا، ولكن على النقيض من مثل هذا الماء على أساس طريقة المقاصة، نتائج المقاصة دب في تصلب كبيرمن الأنسجة، يرافقه انكماش طفيف. وهذا يسمح لسهولة التعامل مع العينات ولا يتطلب المزيد من التكيف للتصوير، مثل تضمين العينة في كتلة الاغاروز. ولذلك، فإن نقل هذا البروتوكول إلى طريقة مثل كلاريتي يكون تحديا، ولكن الناس أثبتت بنجاح استخدام أولتراميكروسكوب اختيار (انظر الجدول من المواد) مع هذا النهج 3 . من المهم تقييم دقيق للتدمير المحتمل للإشارات مضان الذاتية عن طريق طريقة المقاصة في الاختيار. كما أننا لم نعمل مع كلاريتي أو غيرها من بروتوكولات المقاصة النشطة، لا يمكننا التعليق على رد فعل فلوريكروم في هذه النظم. وأسوأ حالة هي أن تلطيخ الأجسام المضادة اللاحقة للجسم بأكمله يجب أن يتم.

    هذا الأسلوب قابل للتعديل بسهولة لأجهزة أخرى، مثل الرئتين الفئران. الكلى. العقول. وحتى العظام، مثل عظم الفخذ، الساق، أو كالفاريا. في حين إيفالواتي نغ إمكانية التطبيق على مناطق الأنسجة الجديدة و / أو استراتيجيات وضع العلامات الفلورسنت الجديدة، والتحدي الأكبر عادة هو تصميم البروتوكول بطريقة يتم الاحتفاظ مضان على قيد الحياة. وسائل الإعلام الغمر القائم على المذيبات 13 وعوامل التجفيف 36 لها تأثير مباشر على سلامة فلوروكروميس. ويوصى باستخدام مشتقات اليكسافلور، لأنها تبدو مستقرة تماما في مختلف البروتوكولات. ومع ذلك، في كثير من الأحيان، فلوروكروميس أخرى يجب أن تستخدم. في هذه الحالة، فإنه بالتأكيد يستحق تقييم استخدام عوامل المقاصة الأخرى (على سبيل المثال، مقياس 37 ، مكعب 38 ، سوكروس 13 ، وضوح 13 ، 34 ، باكت 39 ، فوكوسكلير 13 ، سيدب 31 ، ساليسيلات الميثيل 40 ، 3Disco 32 ، بابلاس = "كريف"> 6، و إيسي 9 ) وغيرها من بدائل الجفاف (على سبيل المثال، الميثانول وتيترايدروفوران 13 ).

    كما هو الحال في العديد من النهج لسفم أخرى، وعملية تحديد المواقع من القلب الشفاف تحت المجهر يطالبون. توفر النظم التجارية مساحة كافية لتثبيت عينات حجم أجهزة الماوس، بما في ذلك فصوص الرئة والكلى، أو القلوب. ومع ذلك، في هذه اللحظة، لا تتوفر عينات عينة موحدة لهذه العينات. لذلك، كان علينا أن إنشاء جهاز التركيب باستخدام تطهير وإعادة تشكيل كتل الاغاروز. ومع ذلك، كان لا بد من التخلص من عدد معين من مجموعات بيانات الصور بسبب التحف الحركة. وقد زادت هذه المشكلة أيضا بسبب فترة اكتساب طويلة من المجهر المستخدمة هنا. من المحتمل أن توليد مجموعات ضخمة من البيانات سوف يحقق أرباحا كبيرة من أنظمة أسرع، ولكن لم يكن لدينا فرصة لاستخدام مجهر أسرع حتى الآن. المجهر لدينا (انظر الجدول سالمواد F) حول جسم المجهر التكبير وتم تجهيزه مع وحدة ليزر، وكاميرا سموس مع حجم بكسل 6.5 × 6.5 مم 2 ، والبصريات الكشف مع مجموعة التكبير البصري من 1.26X إلى 12.6X. وكان الجزء المركزي من البصريات كشف 0.5 نا الهدف عدسة مع مسافة العمل من 5.5 ملم، مما سمح لمراقبة مجال رؤية كبير تتراوح بين 1.7 و 17.6 ملم قطريا. كان هذا كبيرا بما فيه الكفاية لأداء التقسيم البصري من قلوب الفئران بأكملها. تم تحقيق تصحيح انحراف لوني، بين 400 و 800 نانومتر، من خلال التعديل الميكانيكي للهدف. وعند الحاجة، أجريت تصحيحات لونية أثناء عملية ما بعد المعالجة بمساعدة الحاسوب. انحراف كروية، وأيضا في عينات سمكا، لم يلاحظ في هذا النظام، وبالتالي لم يكن لديك إلى تصحيح.

    الكل في الكل، نقدم هنا بروتوكول قوي للتخليص الكيميائي وتحليل المكاني لتوزيع الكريات البيض داخل قلوب الفئران باستخدام ورقة الضوء المجهري. عند هذه النقطة، من المهم التأكيد على أن هذا الإجراء لسفم بالكاد قادرة على حل هياكل الأنسجة الدقيقة مثل الشعيرات الدموية. في هذا الصدد، هذا لسفم هو مناسبة تماما لتوصيف توزيع الخلايا المناعية العام لوصف تراكمات الخلايا المناعية المحتملة داخل الجهاز. ومع ذلك، يجب على المرء أن نأخذ في الاعتبار أن لسفم بشكل عام ليست الخيار الأمثل لتحليل وتحديد توطين الخلوية في الهياكل الفرعية الجهاز الصغيرة، مثل الأوعية الدموية. للإجابة على مثل هذه الأسئلة، ينبغي أن تستكمل لسفم مع أساليب أخرى، مثل الأنسجة أو 2 الفوتون المجهري. مزيد من القيود على هذا البروتوكول تشمل تقييد إلى حد أقصى من 3-4 الألوان - القناة الزرقاء من الصعب استخدام لإشارات أخرى بصرف النظر عن تألق ذاتي - تقييد لعينات ثابتة، والحد الأقصى لحجم العينة من 30 مم × 30 مم × 15 مم. أيضا، يجب أن تكون رائحة قوية والسمية الحادة من دبn في الاعتبار. إذا كانت النقطة الأخيرة إشكالية، يمكن استخدام سينامات الإيثيل كبديل مقاصة بديلة 9 . الميزة الرئيسية لاختيار هذه التقنية المجهري هو القدرة على تحليل الجهاز بأكمله في وقت واحد. في التحليلات التقليدية من الهيماتوكسيلين و يوزين الملون، الفورمالين ثابتة، وجزءا لا يتجزأ من البارافين (فب) أقسام الأنسجة النسيجية، وهناك احتمال كبير في عداد المفقودين المناطق المكانية الهامة ما لم يتم تحليل كل قسم واحد. وعلاوة على ذلك، ورقة الضوء المجهري لا يتيح فقط قطع الظاهري من العينة في كل طائرة ثلاثية الأبعاد، ولكنه يقدم أيضا هذه الإمكانات دون تدمير العينة أو التسبب قطع القطع الأثرية. إذا لزم الأمر، يمكن بعد ذلك معالجة الجهاز الثابت لإجراء مزيد من التحليلات، مثل ضوء الترابط والمجهر الإلكترون نهج لحل للغاية مناطق معينة من الفائدة. ويمكن العثور على نموذج لمثل هذه الدراسة في عمل كاريمان وآخرون. ، حيث رهان الارتباطوين 2-الفوتون المجهري صورة المكدس وثلاثية الأبعاد البيانات المجهر الإلكتروني أظهرت بنجاح 41 . وهناك نهج آخر واعد يمكن أن يكون الجمع بين هذا البروتوكول مع طريقة أوديسكو نشرت مؤخرا التي تقوم أيضا على المذيبات العضوية والتي من شأنها أن تسمح للتحقيق في أجهزة أكبر بكثير من قبل لسفم القياسية 42 .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgments

    وأيدت البحوث في مختبر غونزر من قبل وزارة التعليم والبحث الاتحادية الألمانية (منحة رقم 0315590 م) ومؤسسة الأبحاث الألمانية (منحة رقم GU769 / 4-1، GU769 / 4-2). كما نشكر إمسيس على الدعم الفني وسيباستيان كوبات للمساعدة في 3D النمذجة الكرتون.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    diphtheria toxin Sigma Aldrich D0564
    phosphate buffered saline Biochrom L182-10
    ketamine [50 mg/mL] Inresa PZN 4089014
    xylazine [2 %] Ceva
    syringe Braun REF 9161502 Braun Omincan F 
    indwelt venous catheter  Becton Dickinson REF 381923 BD Insyte Autoguard
    small animal respirator Harvard Apparatus 73-0044 MiniVent
    anit-CD45 antibody (AF647) BioLegend 103124
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Carl Roth 8043.2
    catheter (21 G) BD Biosciences REF 387455 BD valu-set
    paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
    PE tube (5 mL) Carl Roth EKY9.1 Rotilabo
    ethanol Carl Roth 9065.4
    dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014
    tube rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 MACSmix
    agarose (low gelling) Sigma Aldrich A4018
    mold (15 x 15 x 5 mm) Tissue Tek 4566 Cryomold 
    light sheet microscope system LaVision Biotec Ultramicroscope 
    microscope body Olympus MVX10 
    objective Olympus 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
    sCMOS camera 5.5MP Andor Technology
    488 nm OPSL (50mW) laser Coherent
    647 nm  diode laser (50mW) Coherent
    3D image processing & analysis software Bitplane IMARIS Ver. 8.3
    transgenic mouse strain Steffen Jung et al. CD11c.DTR
    wt mouse strain Envigo Balb/c Ola Hsd J
    Laser Module LaVision Biotec
    MVPLAPO 2XC Objective Lens

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315, (1), 1-39 (1902).
    2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
    3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2, (3), (2015).
    4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, (2), 023705 (2007).
    5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (5), pdb top78 (2010).
    6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1, (1), 36-42 (2008).
    7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
    8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223, (1), 7-20 (2012).
    9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. (2016).
    10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
    11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
    12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8, (12), 1047-1049 (2011).
    13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
    14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5, (10), 3311-3325 (2014).
    15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46, (8), 2028-2042 (2016).
    16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, (2), 211-220 (2002).
    17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25, (5-6), 415-425 (1997).
    18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175, (10), 6428-6435 (2005).
    19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22, (5), 561-570 (2005).
    20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
    21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366, (6450), 44-48 (1993).
    22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, (Pt 2), 82-87 (2000).
    23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, (11), 780-782 (1994).
    24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
    25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, (11), 4258-4272 (2006).
    26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
    27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, (1), 413-418 (1873).
    28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401, (3), 273-294 (1931).
    29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
    30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. in press (2016).
    31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).
    32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, (11), 1983-1995 (2012).
    33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10, (4), 44014 (2005).
    34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
    35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9, (7), 1682-1697 (2014).
    36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10, (5), e0124650 (2015).
    37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, (11), 1481-1488 (2011).
    38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
    39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
    40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11, (3), 89-94 (2000).
    41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129, (2), 444-456 (2016).
    42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
    التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).More

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter