Summary
Her beskriver vi en lysarkmikroskopi tilgang til visualisering af den kardiale CD45 + leukocytinfiltreret i en murin model af aseptisk fulminant myocarditis, som induceres af intratracheal difteritoksinbehandling af CD11c.DTR-mus.
Abstract
Fluorescensmikroskopi (LSFM), i kombination med kemiske clearingprotokoller, er blevet guldstandarden til analyse af fluorescensmærkede strukturer i store biologiske prøver og er ned til cellulær opløsning. I mellemtiden giver den konstante forfining af underliggende protokoller og den øgede tilgængelighed af specialiserede kommercielle systemer os mulighed for at undersøge mikrostrukturen af hele musorganer og endda tillade karakterisering af cellulær adfærd i forskellige levende cellebilledfremgangsmåder. Her beskriver vi en protokol til rumlig helmonteret visualisering og kvantificering af CD45 + leukocytpopulationen i betændte museshjerter. Metoden anvender en transgen musestamme (CD11c.DTR), der for nylig er blevet vist at fungere som en robust inducerbar model til undersøgelse af udviklingen af fulminant dødelig myocarditis, karakteriseret ved dødelig hjertearytmi. Denne protokol omfatter myokarditis induktion, intravitAl-antistof-medieret cellefarvning, orgelpræparation og LSFM med efterfølgende computerassisteret billede efterbehandling. Selvom præsenteret som en meget tilpasset metode til vores specifikke videnskabelige spørgsmål, repræsenterer protokollen tegningen af et let justerbart system, som også kan målrette helt forskellige fluorescerende strukturer i andre organer og endda i andre arter.
Introduction
Under udviklingen af lysmikroskopi fremkom mange specialiserede former, der alle udviklede sig for at minimere begrænsninger i visualiseringsprocessen for bestemte prøver. En sådan metode er fluorescensmikroskopi (LSFM) i lysark. Først udviklet i 1903 af Siedentopf og Zsigmondy 1 og fundet sine første grundlæggende biologiske anvendelser i begyndelsen af 1990'erne 2 , er LSFM blevet det mest kraftfulde mikroskopiske værktøj til dato for visualisering af store prøver, såsom intakte musorgener, med en fluorescenssignalopløsning Ned til det cellulære niveau. På grund af disse fordele, i kombination med dets potentiale for live-celle billeddannelse, kaldte Nature Methods LSFM "Årets metode 2014 3. "
Som navnet antyder, udføres prøvebelysningen i en LSFM af lette ark, som er orienteret vinkelret på aksen for det anvendte mål fEller emission-lysindsamling og efterfølgende billeddannelse. Lysarket genereres normalt enten ved at fokusere brede, kollimerede laserstråler med en cylindrisk linse eller ved den hurtige sideløbende bevægelse af smalle, fokuserede laserstråler i blot et vandret eller lodret plan 4 , 5 . På denne måde lyser kun billedoptikens fokalplan, typisk med en tykkelse på 1-4 μm. Følgelig elimineres eller genereres stærkt undertryk 6 , 7 for en fluorescerende prøve anbragt i belysningsplanet, både genereringen af spredt lys og virkningerne af fotobleaching fra regioner over eller under brændpunktet. Da alle out-of-focus-planer ikke er belyste, bortfalder fotobeløbseffekter i disse områder. I modsætning til standard konfokal- eller multi-fotonmikroskopi er vejene i belyst og udsendt lys adskilt fra hinanden, så den endelige billedkvalitet Ity afhænger ikke af den perfekte fokusering af excitationslysstrålen gennem målene. Afhængigt af det underliggende spørgsmål er det derfor muligt at anvende målsætninger med et enormt synsfelt (FOV), så det største mulige område af det belyste plan kan afbildes uden at nogen komponentdele bevæger sig i xy-retningen.
I moderne LSFM-systemer er et fluorescerende billede af den genererede optiske sektion indfanget på en meget følsom ladningskoblet enhed (CCD) eller komplementære kameraer med metaloxidhalvleder (CMOS), som er i stand til at erhverve hele synsfeltet (FOV) I mikrosekunder. Ved at flytte prøven gennem lyspladen og ved at erhverve billeder ved definerede z-trin er det derfor muligt at opnå den fulde 3D-information af en prøve i en rimelig tidsperiode 8 , 9 , hvilket gør denne teknik gældende for levende celle Undersøgelser 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Ikke desto mindre, selvom LSFM tilbyder en hurtig, følsom og fluorescensvenlig metode, er lysoverførsel gennem prøven stadig et stort problem, især når store biologiske prøver er målet for en 3D-analyse. Lystransmission modificeres kritisk af fysiske aspekter af absorption og ved lysspredning ved grænseflader af strukturer med forskellige brydningsindekser 13 . Derfor, når billeddannelsesprøver er flere millimeter i størrelse, er LSFM for det meste kombineret med clearingprotokoller for at gøre prøverne optisk transparente. Disse teknikker er baseret på ideen om at fjerne vand fra det respektive biologiske væv og udveksle det med vand- eller (organisk) opløsningsmiddelbaseret nedsænkningsmedium, som er valgt til at snævre matche brydningsindekserne for de specifikke målvævskomponenter. Som et resultat minimeres sidestrålespredning og alle bølgelængderAf lys kan langt mere effektivt passere gennem vævet 13 . I mange tilfælde virker biologiske prøver, der behandles på denne måde, makroskopisk krystalklare, hvilket gør det muligt for LSFM at udføres, selv på hele musorganerne, ved hjælp af lange arbejdsstørrelsesmål med lav forstørrelse.
Her præsenterer vi en forberedelsesprotokol til storprøveafbildning i et lysarkmikroskop (se materialebordet), som vi har etableret for at undersøge det cellulære hjerteinfiltrat i en murin model af myocarditis 15 . CD11c.DTR-mus udtrykker primat difteri-toksinreceptoren (DTR) under kontrol af CD11c-promotoren 16 . Følgelig gøres celler i disse mus, som udtrykker CD11c sammen med DTR'en, følsomme overfor exotoxinet af Corynebacterium diphtheria (difteritoksin, DTX); Den systemiske behandling af disse dyr med DTX resulterer i en udtømning af alle CD11c + ceLLS. CD11c er et integrin og er som en celleoverfladereceptor for en række forskellige opløselige faktorer involveret i aktiverings- og modningsfremgangsmåder hovedsageligt i celler af den monocytiske linie 17 . Følgelig er CD11c.DTR-musemodellen blevet anvendt intensivt til at studere rollen som dendritiske celler og makrofagundergrupper i sammenhæng med mange forskellige immunologiske spørgsmål. Over tid er det blevet rapporteret, at CD11c.DTR mus behandlet systemisk med DTX kan udvikle bivirkninger og kan vise stærkt forhøjede dødelighed 18 , 19 . For nylig var vi i stand til at identificere den underliggende dødsårsag 15 , der beskriver udviklingen af fulminant myocarditis efter intratracheal DTX ansøgning i disse dyr. Toxinudfordringen forårsagede cellulær destruktion, herunder i centrale dele af stimulusoverførselssystemet i hjertet. Dette blev ledsaget af massiv CD45+ Leukocyt infiltrere, som endelig fører til dødelige hjertearytmier. I dette tilfælde var udseendet af leukocytpopulationen vigtig, men også dens rumlige fordeling inde i hjertet. Dette eksperimentelle spørgsmål er en udfordring for moderne mikroskopisk billeddannelse, som vi har løst ved en mikroskopisk tilgang til lysark, der understøttes af intravital antistoffarvning og en organisk opløsningsmiddelbaseret optisk clearingsprotokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med EU-retningslinjer og blev godkendt af de relevante lokale myndigheder i Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Tyskland). Dyrene blev anvendt og anbragt under specifikke patogenfrie (SPF) betingelser.
1. Induktion af myocarditis med difteritoksin (DTX)
- Forbered DTX-opløsningen til induktion af myocarditis ved at fortynde DTX stamopløsningen med phosphatpufret saltvand (PBS) til en 1 μg / ml arbejdsløsning.
- Påfør 100 μL af denne opløsning intratrachealt (det) i 8 til 10 ugers gamle CD11c.DTR-mus ( ca. 5 ng / g legemsvægt (bw)), som det fremgår af Hasenberg et al. Til anvendelse af en svampespor suspension 20 .
BEMÆRK: Den intraperitoneale anvendelse af toksinet kan resultere i en lignende induktion afDødelig myokarditis. Denne fremgangsmåde skal dog først valideres.- Til den anvendelse bedøve dyrene en intraperitoneal (ip) injektion på 100 mg / kg legemsketamin og 10 mg / kg legemsvægt xylazin.
- Efter at have nået dyb narkose (tå knivprøvning) intubere dyrene ved at anvende et 22 G indwelt venet kateter gennem mundhulen. Kontroller den korrekte placering af linserøret ved at ventilere dyrene med en respirator med små dyr med en hastighed på 250 åndedrag pr. Minut og et inhalationsvolumen på 250 μL pr. Åndedræt, også vist af Hasenberg et. al. 20 .
BEMÆRK: Ved korrekt positionering ændres dyrets pustefrekvens i henhold til de anvendte ventilationsindstillinger. - Afbryd ventilationssystemet og indsæt 100 μL DTX-opløsningen eller en lige stor mængde PBS som en kontrol gennem kateteret ind i lungen og fortsæt med at ventilere dyrene i yderligere 1 minut.
- Lad dyrene komme sig efter anæstesi og overvåge den generelle sundhedstilstand og kropsvægtændring i 4 dage.
BEMÆRK: Afhængig af den genetiske baggrund, musestamme eller indledende vægt kan sværhedsgraden og indtræden af myocarditis variere og bør først bestemmes.
2. Prøveforberedelse til lysarkmikroskopi
- 4 dage efter toksinapplikation bedøve musene ved skylning af et induktionskammer med en fordampet 2% isofluran / oxygenblanding. Injicer 15 μg af et direkte mærket anti-CD45-antistof (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) i 50 μl PBS intravenøst (iv) under anvendelse af den retro-orbitale applikationsrute, hvilket sikrer en meget hurtig og yderst nøjagtig anvendelse af Korrekt mængde antistof.
BEMÆRK: Den ønskede dybde af narkose er nået, når musene er liggende og ikke reagerer på tåbningstestning. - Efter 2 timers inkubation ofre musene ved cervikal dislokation anD perfumere hjerterne in situ med 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
- Udsæt hjertet og indsprøjt perfusionsopløsningen i højre ventrikel ved hjælp af et 21 G kateter. Perfuse med langsomt, konstant tryk og sørg for, at blodet kan drænes efter at have klippet åbent aorta.
BEMÆRK: Denne transcardiale perfusion kan resultere i mindre præparationsartefakter, hvilket kunne forstyrre den endelige 3D-visualisering af orgelet. Derfor kunne avancerede dyreeksperimenter udføre perfusionen gennem den ringere vena cava, og udskærer abdominal aorta.
- Udsæt hjertet og indsprøjt perfusionsopløsningen i højre ventrikel ved hjælp af et 21 G kateter. Perfuse med langsomt, konstant tryk og sørg for, at blodet kan drænes efter at have klippet åbent aorta.
- For kemisk fixering, perfusér hjertet gennem den samme forsænkning med 5 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Hold kateteret på plads, og læg simpelthen en ny sprøjte fyldt med PFA. Perfuse med langsomt og konstant tryk.
BEMÆRK: Paraformaldehyd er meget giftigt; Undgå kontakt med hud, øjne og anden slimhinder.- Tag forsigtigt hjertet med serrated tang puLl det lidt opad; Og skære alle vævsforbindelser, herunder indkommende og udgående arterier og vener. Opbevar organet i yderligere 4 timer i 4% PFA for yderligere fiksering.
- For at dehydrere orgelet inkuberer hjertet i en stigende ethanolserie ved 50%, 70% og to gange ved 100%, hver i 12 timer ved 4 ° C i mørke. Her skal du bruge sorte 5 ml polypropylen-reaktionsrør, der tillader dem konstant at rotere i en rørrotator ved hjælp af en langsom rotationshastighed for at forhindre luftboblingsdannelse.
- Komplet prøveforberedelse ved kemisk clearing. For at gøre hjerterne gennemsigtige inkuberer de dem i 98% dibenzylether (DBE), mens de konstant roterer natten over.
BEMÆRK: DBE er irriterende for øjne, hud og åndedrætsorganerne.
3. Lysarkmikroskopi
- Udfør LSFM ved hjælp af lysarkmikroskopet (se materialebordet). Placer prøven på mikroskopets standardprøveholder i DBE-fyldte cuVette, som er egnet til prøver op til 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Hold prøven fast på plads under billedopsamlingen ved hjælp af dehydrerede og rydde agaroseblokke.
- Til fremstilling af agaroseblokke hældes 2% smeltet agarose i en form (15 mm x 15 mm x 5 mm). Lad agarosen afkøle, indtil den størkner.
- Dehydrere det i en stigende ethanol serie (50%, 70% og to gange ved 100%). Inkubér agaroseblokkene natten over i 98% DBE. Opbevar agarosen i DBE, indtil den anvendes.
BEMÆRK: Da agarosen hovedsagelig består af vand, kan inkubationstiderne for hvert dehydreringstrin forlænges afhængigt af blokens størrelse.
BEMÆRK: DBE er irriterende for øjnene, huden og åndedrætsorganerne. - Når det er nødvendigt, skær den forberedte agaroseblok til den ønskede form ved hjælp af en skarp skalpel. Typisk skæres prisme- eller kileformede former til at placeres ved prøveadapterens kanter.
BEMÆRK: Da agaroseblokke er elastiske,Prøven forbliver på plads, når den trykkes med lille kraft.
- Påvisning af fluorescenssignaler af interesse (her autofluorescens og anti-CD45 antistoffarvning) med passende excitations- og emissionsfilterindstillinger.
- Til påvisning af det bindevævsafledte autofluorescenssignal skal der anvendes et 525/50 nm bandpassfilter ved en excitationsbølgelængde på 488 nm (OPSL: 50 mW); CD45-farvning med et AF647-koblet antistof påvises ved 668 nm (bandpassfilter: 680/30 nm) og ved en excitationsbølgelængde på 647 nm (diode laser: 50 mW).
- Vælg 4 μm som afstanden mellem de to individuelle z-fly.
4. Billede Efterbehandling
BEMÆRK: De overførte digitale billeddata blev yderligere behandlet med en videnskabelig 3D / 4D billedbehandling og analyse software (se materialebordet).
- Åbning og forudjustering af datafiler.
- Når du har startet analysesoftwaren, skal du vælge knappen "Overgå" i øverste venstre hjørne. For at åbne billedstablerne skal du vælge "File", "Open" og vælge en mappe, der indeholder dataene fra den første erhvervede kanal. Vælg "Rediger" og "Tilføj kanaler" for at tilføje yderligere erhvervede kanaler.
BEMÆRK: Afhængigt af datastørrelsen og computersystemet kan denne proces tage flere minutter. Den præsenterede protokol viser alle trin for 2 opkøbskanaler (autofluorescens og AF647). - Korrigér x, y og z voxel dimensioner ved at klikke på "Rediger" og vælge "Billedegenskaber." Når det nye vindue åbnes, skal du justere parametrene.
BEMÆRK: Dette trin afhænger af det anvendte mikroskopsystem og det bestemte datformat. Korrekte xyz værdier er kritiske for efterfølgende størrelse og fjerne målinger. I de fleste tilfælde gemmes disse parametre som metadata i mikrograffilerne. Men hvis filen foRmat kan ikke fortolkes korrekt af analyseprogrammet, er det vigtigt at manuelt indtaste pixelstørrelsen. Pixelstørrelsen i x- og y-målene afhænger af kameraets pixelstørrelse, den potentielt anvendte binning og objektivet og objektiv forstørrelsen. Pixelstørrelsen i z svarer til den selvdefinerede z-trin størrelse ( fx 4 μm).
- Først omdannes autofluorescenssignalet til gråtoner ved at åbne "Displayjustering" ("Rediger" og "Vis skærmjustering"). Et nyt vindue viser alle åbne kanaler og displayindstillingerne for dem alle; For at ændre standardfarven, vælg autofluorescenskanalen og vælg den "hvide" displaystil. Klik på "ok" for at søge.
- Til justering af sortniveau skal du gå tilbage til "Displayjustering" og justere værdien for sorte niveau for at udelukke uønskede baggrundssignaler, der ikke repræsenterer prøvestrukturs.
- For at gøre det skal du bruge den øverste venstre trekant på kanallinjen og trække den fra venstre mod højre.
BEMÆRK: Ændringer vil blive visualiseret straks. Sørg for kun at undertrykke signaler, der ikke stammer fra prøven. Mindste værdier i baggrunden bør aldrig være "0" for at undgå tonehøjde pixel, da der kan være behov for støjsignaler til yderligere beregninger. Sørg for, at alle ændringer i sortniveau udføres efter billedkøb. Ellers kan værdifulde prøveoplysninger gå tabt. Sortjusteringen justerer kun repræsentative formål. For at bruge de samme displayindstillinger over forskellige prøver, kan præcise værdier indtastes i "min" numeriske felt under kanallisten. Dette er meget nyttigt til kvantitative analyser.
- For at gøre det skal du bruge den øverste venstre trekant på kanallinjen og trække den fra venstre mod højre.
- Udfør intensitetsjustering enten ved at bruge den øverste højre trekant for at justere den respektive kanalintensitet eller ved at indtaste præcise værdier i "max" numerisk felt under channeJeg lister.
- Udfør kontrastjustering ved at trække den nederste trekant midt i kanallinjen for at øge eller reducere gamma-værdien eller ved at indtaste de præcise værdier.
- Juster AF647-kanalen i henhold til autofluorescenskanalen. Som forskel skal du indstille visualiseringen af AF647-signalet til en varmekortfarveopslagstabel. Gør dette ved at vælge kanaltilstanden "ild" i en fremgangsmåde svarende til den i trin 4.2.1.
BEMÆRK: Da de samlede signalintensiteter er signifikant lavere sammenlignet med autofluorescenskanalen, justeres de sorte niveauer normalt til meget lavere værdier. Hvad angår autofluorescenskanalen, øges lysstyrken af denne kanal normalt. - Vælg "blend mode" for at visualisere vævsstrukturer i detaljer. Analysér alle prøver fra en serie med de samme parameterværdier.
- For at næsten skære organet inden 3D-scene expoRt, anvende et klipningsplan på det gengivne 3D-objekt.
- Klik på ikonet "Clipping Plane" (saks) i objektlisten. Inde i billedvisningen vises en gul ramme og en manipulator (hvid spindel). Drej spindlen ved den tyndere ende med musen og derved ændre retningen af klippeplanet, og bevæg den tykkere midterdel af spindlen for at vælge den ønskede dybde af clipping.
- Skjul rammen og manipulatoren ved at fjerne markeringen i de respektive afkrydsningsfelter under objektlisten og oprette de ønskede snapshots.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fremlagte LSFM tilgang analyserer leukocytfordelingen og mængden i murine hjerter ved induktion af alvorlig myokarditis. Figur 1A forklarer forbehandlingsprotokollen for de transgene CD11c.DTR-mus for myokarditisinduktion. Dette trin repræsenterer den nødvendige trigger til rekruttering af leukocytter til myokardiet. Efter en vellykket DTX-applikation udvikler dyrene alvorlige sygdomssymptomer, såsom generel svaghed, anoreksi og vægttab inden for intervallet 2-4 dage. Efter 4 dage farves leukocytter af iv . Påføring af fluorochrom-koblet anti-CD45-antistof forud for transcardiel perfusion for at fjerne blodet fra omsætning. Hvis det udføres med succes, bliver hjertet og andre organer hvidlige. Efterfølgende udskilles organet, og vævsvand udveksles med DBE ved en stigende etanol række og en endelig inkubation i DBE. Figur 1B viser tidsplanenAf de individuelle inkubationstrin, hvor organet undergår betydelig krympning. Det kemisk rydde organ overføres derefter til et DBE-fyldt billedkammer på standardmikroskopvævsholderen. For at stabilisere organet under 3D-billeddannelse fastgøres den gennem transparente agaroseblokke. Den detaljerede positionering af prøven er visualiseret i figur 2 . Købet af en hel billedstabel, der består af 2 kanaler (autofluorescens og anti-CD45), tager ca. 20-30 minutter og genererer en datafil på ca. 16 GB. Endelig analyseres de resulterende data som kunstig 3D-gengivelse, hvori leukocytfordelingen vises i en varmekortvisning. I figur 3 (øverste række) kan de stærkt betændte områder af et hjerte af et DTX-behandlet dyr opfattes af deres rødlige / hvide udseende. En mere detaljeret undersøgelse af 3D-modellen afslører leukocytkoncentrationen, især i områder i hjerteledningssystemet, såsom atriovent Ricularbundt og Purkinje-fibre. I modsætning hertil viser hjerter af PBS-behandlede dyr slet ikke dette betændelsesmønster (nederste række).
Figur 1: Induktionsskema og prøvepræparation af difteritoksin-induceret myocarditis. ( A ) Myokarditis udvikling blev induceret af den . Anvendelse af difteritoksin (100 ng / dyr). Efter 4 dage var myokarditis fuldt udviklet, og et AF647-koblet anti-CD45-antistof (15 μg / dyr) blev injiceret iv . At detektere CD45 + leukocytter. Dyr blev ofret 2 timer senere ved cervikal dislokation, og hjerterne blev perfusioneret med PBS / EDTA (5 mM) efterfulgt af 4% PFA. ( B ) Efter fjernelse blev organet dehydreret med en stigende ethanolserie og endelig fjernet ved inkubation natten over i dibenzylether..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skema for prøveplacering i mikroskop. Det kemisk rydde, gennemsigtige hjerte (4) blev anbragt på prøveholderen (2 og 5) og stabiliseret ved hjælp af rydde agaroseblokke (6). Denne konstruktion blev derefter nedsænket i den DBE-fyldte glaskuvette (3). Til erhvervelse blev en 0,5 NA objektivlins (1) med en arbejdsafstand på 5,5 mm anvendt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative 3D-afgivelser af hele ellerGan Light-sheet Microscopy. CD11c.DTR-mus blev behandlet intratrakealt med DTX (øverste række) eller PBS (nederste række). 4 dage senere blev udviklingen af myocarditis, repræsenteret ved CD45 + leukocytinfiltration, visualiseret ved fluorescens-lysarkmikroskopi. For at plette CD45 + -cellerne blev et anti-CD45-antistof koblet til AF647 injiceret iv 2 timer før ofring af musene. Autofluorescenssignalet for bindevæv vises i gråt, mens CD45 + infiltreret vises i varmekortfarver (blå: lavt signal, hvidt: højt signal). Hver række består af 4 digitalt klipede 3D renderinger, der viser situationen inde i orgelet. Klipningsdybden i forhold til den forreste del af hjertet er angivet over de enkelte billeder. Figuren er blevet modificeret fra Mann et al. 15 . Skalbjælke = 1 mm. Venligst klik herFor at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den moderne livsvidenskab spiller den mikroskopiske visualisering af biologiske processer en stadig vigtigere rolle. I den forbindelse er der sket mange udviklinger i løbet af de sidste to århundreder, der hjælper med at besvare spørgsmål, der ikke kan adresseres til dette punkt. For det første har der været en klar tendens til grundlæggende at øge opløsningsmulighederne for lysmikroskoper. Med struktureret belysningsmikroskopi (SIM) 21 , 22 , stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi 23 og fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM) 24 , 25 eller stokastisk optisk rekonstruktionmikroskopi (STORM) 26 , den engangs-postulerede opløsningsbegrænsning Til lysdiffraktion 27 var signifikant brudt. Den anden ofte målrettede udfordring var at observere cellulær adfærd i et miljø, der lignedeDen naturlige tilstand så tæt som muligt. I denne sammenhæng blev udviklingen af in situ eller in vivo billeddannelsesmetoder tvunget. For at overvinde den begrænsede lysindtrængningsdybde i komplekse biologiske væv har 2-fotonmikroskopi 28 , 29 sat nye standarder i dette forskningsfelt.
Men en funktion, som alle disse mikroskopi teknikker normalt deler, er brugen af højt NA mål for at sikre den bedst mulige opløsning. Selv om det løser mikrostrukturer mere detaljeret, begrænser brugen af højt NA-mål markant synsvinkel, såvel som arbejdsafstanden. Som følge heraf bliver den biologiske kontekst med hensyn til det omgivende miljø ofte ude af fokus i ordets reneste forstand. For at lukke dette hul har LSFM udvikling for nylig fået interesse, og giver en mikroskopi teknik, der er i stand til at løse fluorescerende strukturer ved cellestørrelseMen også til bekvemt at vurdere hele 3D-informationen af en prøve med en størrelse på mere end 1 cm.
Den her beskrevne protokol viser en metode til anvendelse af et ultramikroskop til visualisering af en cellulær leukocytinfiltration i hele murine hjerter. Efter den vellykkede induktion af steril myocarditis i en CD11c.DTR-musemodel 30 modtager det respektive dyr en iv-injektion af et fluorochrom-koblet anti-CD45-antistof, der cirkulerer i 2 timer i levende dyr. I princippet bør det fuldstændige antistoffarvning mellem organfiksering og prøvedehydrering i princippet muliggøres ved at udføre en post mortem. Desværre kræver fuldmonteret farvning langt længere inkubationstrin og øger derfor massivt den tid, der er nødvendig for prøvegenerering ( dvs. 4-21 dage) 6 , 31 . Desuden er denne intravital farvning tilgang ikke kun hurtigere, men også levererMere effektiv vævspennetrækning af antistoffet sammenlignet med en helmonteret farvningsprotokol 9 . Skønt den absolutte farvnings-effektivitet ikke er blevet kvantificeret, forventes det, at en stor del af leukocytpopulationen er mærket, idet det resulterende fluorescenssignal er bemærkelsesværdigt stærkt. Både fluorescerende proteiner og antistofmærkning selv overlever i vid udstrækning den efterfølgende clearingproces, og begge synes at være stabile i lang tid. Det skal også bemærkes, at et opløsningsmiddelbaseret middel anvendes til vævsoprensning. Dette forhindrer massivt en hel-mount farvning tilgang efter clearing processen. Den opløsningsmiddelbaserede vævsoprensning er et reversibelt fænomen, så en overførsel af det rydde væv til et vandbaseret medium (såsom PBS), som sædvanligvis anvendes til standard antistoffarvning, ville resultere i en ikke-gennemsigtig prøve. Derfor skal ikke-standardfarvningsprotokoller i organiske opløsningsmidler etableres i Der kræves en fuldmonteret farvningsprocedure efter prøveudtagning.
Den efterfølgende hjertep perfusion er absolut nødvendig for at fjerne så meget resterende blod som muligt, da blodet er dårligt ryddet i de følgende trin og forværrer billeddannelsesresultaterne dramatisk. Efter udskæring af hjertet fjernes vævsvandet i en stigende ethanolrække. Dette trin kan betragtes som den første del af kemisk clearing. Tanken er at erstatte vævsvandet med et nedsænkningsmiddel, der bedre matcher det gennemsnitlige brydningsindeks (RI) for det valgte præparat. DBE blev valgt som nedsænkningsmediet ifølge protokollen fra Ertuk et al. 32 , med nogle ændringer. DBE har et brydningsindeks på 1,55 (nD20), og når det blev sammenlignet med andre rensemidler, såsom benzylalkohol: benzylbenzoat (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 eller saccharose (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13 bevarede det bedst de fluorescerende mærker, der blev anvendt i denne protokol. En lignende fluorescensbevarelse blev givet ved anvendelse af ethylcinnamat (ECI). Vi har beskrevet dets anvendelse i en undersøgelse af den automatiserede kvantificering af glomeruli i nefretiske nyrer 9 . Væv, som en gang var anslået til at have et brydningsindeks på 1,382 ± 0,004 33 , blev lige så godt ryddet med alle stoffer, som vi vurderede 9. Derfor var den afgørende faktor for valget af DBE fluorescensbeholdningen og ikke clearingspotentialet. Skifte til denne passive clearingprotokol, anvendelse af en aktiv metode som CLARITY 34 , 35 , hvor fjernelse af lipider ved hjælp af en elektroforetisk strøm resulterer i stærkt rydde væv, bør det være muligt. I modsætning til et sådant vand -baseret clearingmetode resulterer DBE-clearingen i en betydelig hærdningAf vævet, ledsaget af mindre krympning. Dette giver mulighed for nem håndtering af prøverne og kræver ikke yderligere tilpasninger til billeddannelse, såsom indlejring af prøven i en agaroseblok. Derfor vil overførslen af denne protokol til en metode som CLARITY være udfordrende, men folk har med succes vist anvendelse af det valgte ultramikroskop (se materialebordet) med denne fremgangsmåde 3 . Det er vigtigt at omhyggeligt evaluere den potentielle ødelæggelse af endogene fluorescenssignaler med den valgte clearingsmetode. Da vi aldrig har arbejdet med CLARITY eller andre aktive clearingprotokoller, kan vi ikke kommentere fluorchrom-reaktionen i disse systemer. Det værste tilfælde ville være, at der skulle udføres en efterfølgende helmontering antistoffarvning.
Denne metode er let at justere til andre organer, såsom murine lunger; nyrer; hjerner; Og endda knogler, såsom lårbenet, tibia eller calvaria. Mens evaluati Ng applikationspotentialet på nye vævsområder og / eller nye fluorescerende mærkningsstrategier, er den største udfordring normalt at designe protokollen på en sådan måde, at fluorescensen holdes i live. Det opløsningsmiddelbaserede nedsænkningsmedium 13 og dehydratiseringsmidlerne 36 har en direkte indvirkning på fluorokromernes integritet. Brugen af AlexaFluor-derivater anbefales, da de synes at være ret stabile i forskellige protokoller. Imidlertid må andre fluorokrom meget ofte anvendes. I dette tilfælde er det absolut værd at evaluere brugen af andre clearingmidler ( fx Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , methylsalicylat 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 og ECI 9 ) og andre dehydreringsalternativer ( fx methanol og tetrahydrofuran 13 ).
Som i mange andre LSFM-tilgange kræver processen med positionering af det gennemsigtige hjerte under mikroskopet. Kommercielle systemer giver tilstrækkelig plads til montering af prøver af musemorgas størrelse, herunder lungelaber, nyrer eller hjerter. Imidlertid er der i øjeblikket ingen standardiserede prøveholdere til disse prøver. Derfor var vi nødt til at etablere et monteringsapparat ved hjælp af rydde og reformede agaroseblokke. Alligevel måtte et vist antal billeddatasæt kasseres på grund af bevægelsesgenstande. Dette problem blev også øget på grund af den lange overtagelsestid for det anvendte mikroskop. Potentielt vil genereringen af store datasæt betyde betydeligt fra hurtigere systemer, men vi har ikke mulighed for at bruge et hurtigere mikroskop endnu. Vores mikroskop (se tabel oF materialer) blev bygget omkring et zoommikroskopkrop og udstyret med et lasermodul, et sCMOS-kamera med en pixelstørrelse på 6,5 x 6,5 mm 2 og detektionsoptik med et optisk forstørrelsesområde fra 1.26X til 12.6X. Den centrale del af detektionsoptikken var en 0,5 NA objektivlins med en arbejdsstørrelse på 5,5 mm, hvilket muliggjorde observation af et stort synsfelt på mellem 1,7 og 17,6 mm diagonalt. Dette var stort nok til at udføre den optiske sektion af hele murine hjerter. Korrektionen af kromatisk aberration mellem 400 og 800 nm blev opnået ved den mekaniske tilpasning af målet. Efter behov blev chromatiske korrektioner udført under den computerassisterede efterbehandling. Sfærisk aberration, også i tykkere prøver, blev ikke observeret i dette system og behøvede derfor ikke at blive rettet.
Alt i alt præsenterer vi her en robust protokol til kemisk clearing og analyse af rumlig lEukocytfordeling inde i murine hjerter ved anvendelse af lysarkmikroskopi. På dette tidspunkt er det vigtigt at understrege, at denne LSFM-procedure næppe er i stand til at løse fine vævsstrukturer som kapillærer. I denne henseende er denne LSFM velegnet til at karakterisere den generelle immuncellefordeling og beskrive mulige immuncelleakkumuleringer inde i orgelet. Men man skal huske på, at LSFM generelt ikke er det perfekte valg til at analysere og kvantificere mobil lokalisering i suborganer af små organer, såsom vaskulaturen. For at besvare sådanne spørgsmål skal LSFM suppleres med andre metoder, såsom histologi eller 2-foton mikroskopi. Yderligere begrænsninger af denne protokol inkluderer begrænsningen til maksimalt 3-4 farver. Den blå kanal er svær at bruge til andre signaler bortset fra autofluorescens-begrænsningen til faste prøver og den maksimale prøvestørrelse på 30 mm x 30 mm x 15 mm. Også den stærke lugt og akut toksicitet af DBE bør tageN i betragtning. Hvis sidstnævnte punkt er problematisk, kan ethyl cinnamate anvendes som et alternativt clearingsmiddel 9 . Den store fordel ved at vælge denne mikroskopi teknik er evnen til at analysere hele orgelet på en gang. I konventionelle analyser af hæmatoxylin og eosinfarvede, formalinfaste og paraffinindlejrede (FFPE) histologiske vævssektioner er der stor sandsynlighed for at mangle vigtige rumlige områder, medmindre hvert enkelt afsnit analyseres. Desuden muliggør lakse-mikroskopi ikke kun virtuel skæring af prøven i hvert tredimensionalt plan, men det giver også dette potentiale uden at ødelægge prøven eller forårsage skæreartefakter. Hvis det er nødvendigt, kan det faste organ efterfølgende behandles til yderligere analyser, såsom et korrelativt lys og elektronmikroskopi tilgange til stærkt løse bestemte områder af interesse. En skabelon til en sådan undersøgelse findes i Karreman et al. , Hvor korrelationsspilningenWeen en 2-foton mikroskopi billedstabel og tredimensionelle elektronmikroskopi data blev vist med succes 41 . En anden lovende tilgang kunne være kombinationen af denne protokol med den nyligt offentliggjorte uDISCO-metode, der også er baseret på et organisk opløsningsmiddel, og det ville muliggøre undersøgelsen af meget større organer med en standard LSFM 42 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskningen i Gunzer-laboratoriet blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (tilskud nr. 0315590 AD) og af det tyske forskningsstiftelse (tilskud nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Vi takker også IMCES for teknisk support og Sebastian Kubat for hjælp til 3D tegneserie modellering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
