Summary
Ici, nous décrivons une approche de microscopie de feuille lumineuse pour visualiser l'infiltration de leucocytes CD45 + cardiaque dans un modèle murin de myocardite fulminante aseptique, qui est induite par le traitement intratrachéal de la toxine diphtérique des souris CD11c.DTR.
Abstract
La microscopie de fluorescence à lumière légère (LSFM), combinée à des protocoles de compensation chimique, est devenue l'étalon-or pour l'analyse de structures marquées par fluorescence dans de grands échantillons biologiques et se résume à la résolution cellulaire. Pendant ce temps, le raffinement constant des protocoles sous-jacents et la disponibilité accrue de systèmes commerciaux spécialisés nous permettent d'étudier la microstructure des organes de souris entiers et permettent même de caractériser le comportement cellulaire dans diverses approches d'imagerie des cellules vivantes. Ici, nous décrivons un protocole pour la visualisation spatiale et la quantification intégrale de la population de leucocytes CD45 + chez des cœurs de souris enflammés. La méthode utilise une souche de souris transgénique (CD11c.DTR) qui a récemment été démontrée comme un modèle robuste et inducible pour l'étude du développement d'une myocardite fatale fulminante caractérisée par des arythmies cardiaques létales. Ce protocole comprend l'induction de la myocardite, intravitLa coloration cellulaire à médiation par anticorps, la préparation d'organe et la LSFM avec un post-traitement ultérieur assisté par ordinateur. Bien que présentée comme une méthode hautement adaptée pour notre question scientifique particulière, le protocole représente le plan d'un système facilement ajustable qui peut également cibler des structures fluorescentes complètement différentes dans d'autres organes et même dans d'autres espèces.
Introduction
Au cours de l'évolution du microscope optique, de nombreuses formes spécialisées sont apparues, toutes développées pour minimiser les limitations dans le processus de visualisation des spécimens particuliers. Une telle méthode est la microscopie à fluorescence légère (LSFM). Développé en 1903 par Siedentopf et Zsigmondy 1 et pour trouver ses premières applications biologiques fondamentales au début des années 1990 2 , LSFM est devenu l'outil microscopique le plus puissant à ce jour pour la visualisation de grands spécimens, tels que des organes de souris intacts, avec une résolution de signal de fluorescence Jusqu'au niveau cellulaire. En raison de ces avantages, en combinaison avec son potentiel pour l'imagerie des cellules vivantes, Nature Methods a appelé LSFM la "Méthode de l'année 2014 3 ".
Comme son nom l'indique, l'illumination de l'échantillon dans un LSFM est menée par des feuilles légères orientées perpendiculairement à l'axe de l'objectif utilisé fOu la collecte de lumière d'émission et la formation d'image ultérieure. La feuille de lumière est généralement générée soit en focalisant des faisceaux laser collimés et larges avec une lentille cylindrique, soit par le mouvement rapide des flancs laser étroits et focalisés dans un seul plan horizontal ou vertical 4 , 5 . De cette façon, seul le plan focal de l'optique d'imagerie est éclairé, généralement avec une épaisseur de 1 à 4 μm. Par conséquent, pour un échantillon fluorescent placé dans le plan d'illumination, la génération de lumière dispersée et les effets du photoblanchage des régions situées au-dessus ou en dessous du plan focal sont éliminés ou fortement supprimés 6 , 7 . Comme tous les avions hors-focus ne sont pas éclairés, les effets de photoblanchage sont omises dans ces domaines. Contrairement à la microscopie confocale ou à photométrie standard, les chemins de lumière éclairée et émis sont séparés l'un de l'autre, de sorte que l'image finale qualit Cela ne dépend pas de la focalisation parfaite du faisceau lumineux d'excitation à travers les objectifs. En fonction de la question sous-jacente, il est donc possible d'utiliser des objectifs avec un énorme champ de vision (FOV) afin que la plus grande surface possible du plan lumineux puisse être imagée sans que des composants ne se déplacent dans la direction xy.
Dans les systèmes LSFM modernes, une image fluorescente de la section optique générée est capturée sur un appareil à couplage de charge très sensible (CCD) ou des caméras semi-conductrices d'oxyde métallique complémentaires (CMOS) capables d'acquérir tout le champ de vision (FOV) En microsecondes. Par conséquent, en déplaçant l'échantillon à travers la feuille de lumière et en acquérant des images à des étapes z définies, il est possible d'obtenir l'information 3D complète d'un spécimen dans un délai raisonnable 8 , 9 , ce qui rend cette technique applicable aux cellules vivantes Études 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Néanmoins, bien que LSFM offre une méthode rapide, sensible et compatible avec la fluorescence, la transmission de la lumière à travers l'échantillon est encore un problème majeur, surtout lorsque de grands échantillons biologiques sont la cible d'une analyse en 3D. La transmission de la lumière est modifiée de manière critique par des aspects physiques de l'absorption et par la diffusion de la lumière aux interfaces de structures avec différents indices de réfraction 13 . Par conséquent, lorsque l'imagerie échantillonne plusieurs millimètres de taille, le LSFM est principalement combiné avec des protocoles de nettoyage pour rendre les échantillons optiquement transparents. Ces techniques sont basées sur l'idée d'éliminer l'eau du tissu biologique respectif et de l'échanger avec des milieux d'immersion à base de solvant à base d'eau ou organiques, qui sont choisis pour associer étroitement les indices de réfraction des composants tissulaires cibles particuliers. En conséquence, la diffusion latérale de la lumière est minimisée et toutes les longueurs d'ondesDe la lumière peut passer beaucoup plus efficacement à travers le tissu 13 . Dans de nombreux cas, les spécimens biologiques traités de cette manière apparaissent macroscopiquement limpides, ce qui permet de conduire le LSFM, même sur des organes entiers de souris, en utilisant des objectifs de longue distance de travail et de faible grossissement.
Ici, nous présentons un protocole de préparation pour l'imagerie à grand échantillon dans un microscope à feuilles lumineuses (voir le tableau des matériaux), que nous avons établi pour étudier l'infiltration cardiaque cellulaire dans un modèle murin de myocardite 15 . Les souris CD11c.DTR expriment le récepteur de la toxine diphtérique des primates (DTR) sous le contrôle du promoteur CD11c 16 . En conséquence, les cellules de ces souris, qui expriment CD11c avec la DTR, sont rendues sensibles à l' exotoxine de Corynebacterium diphtheria (diphtheria toxin, DTX); Le traitement systémique de ces animaux avec DTX entraîne une épuisement de tous les CD11c + ceLls. CD11c est une intégrine et, en tant que récepteur de surface cellulaire pour une variété de différents facteurs solubles, est impliqué dans les processus d'activation et de maturation principalement dans les cellules de la lignée monocytaire 17 . Par conséquent, le modèle de souris CD11c.DTR a été intensément utilisé pour étudier le rôle des cellules dendritiques et des sous-groupes de macrophages dans le contexte de nombreuses questions immunologiques différentes. Au fil du temps, il a été rapporté que les souris CD11c.DTR traitées systémiquement avec DTX peuvent développer des effets secondaires indésirables et peuvent afficher des taux de mortalité fortement élevés 18 , 19 . Récemment, nous avons pu identifier la cause sous-jacente de la mort 15 , décrivant le développement de la myocardite fulminante après l'application intratrachéale DTX chez ces animaux. Le défi de la toxine a causé la destruction cellulaire, y compris dans les parties centrales du système de transmission du stimulus dans le cœur. Cela a été accompagné d'un CD45 massif+ Infiltration de leucocytes, entraînant finalement des arythmies cardiaques létales. Dans ce cas, non seulement l'apparition de la population de leucocytes était importante, mais aussi sa répartition spatiale à l'intérieur du cœur. Cette question expérimentale est un défi pour l'imagerie microscopique moderne, que nous avons résolue par une approche de microscopie à la lumière qui est soutenue par la coloration d'anticorps intravital et un protocole de nettoyage optique à base de solvants organiques.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives de l'UE et ont été approuvées par les autorités locales concernées à Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Allemagne). Les animaux ont été utilisés et logés sous des conditions spécifiques de pathogène (SPF).
1. Induction de la myocardite par la toxine diphtérique (DTX)
- Préparer la solution DTX pour l'induction de la myocardite en diluant la solution mère DTX avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à une solution de travail de 1 μg / mL.
- Appliquer 100 μL de cette solution par voie intratrachéale (elle) dans des souris CD11c.DTR de 8 à 10 semaines ( environ 5 ng / g de poids corporel (bw)), comme l'ont montré Hasenberg et al. Pour l'application d'une suspension de spores fongiques 20 .
NOTE: L'application intrapéritonéale de la toxine peut entraîner une induction similaire deMyocardite fatale. Cependant, cette approche devrait d'abord être validée.- Pour cette application, anesthésier les animaux par une injection intrapéritonéale (ip) de 100 mg / kg de kwtamétine et 10 mg / kg pc de xylazine.
- Après avoir atteint une narcose profonde (test de pincement), entourez les animaux en utilisant un cathéter veineux indenté 22 G à travers la cavité buccale. Vérifiez le positionnement correct du tube de l'objectif en ventilant les animaux avec un respirateur à petit animal à une vitesse de 250 respirations par minute et un volume d'inhalation de 250 μL par souffle, également montré par Hasenberg et al. Al. 20 .
REMARQUE: Lorsqu'il est positionné correctement, le taux d'inhalation des animaux changera en fonction des paramètres de ventilation appliqués. - Débranchez le système de ventilation et insérez les 100 μL de solution de DTX ou une quantité égale de PBS comme un contrôle à travers le cathéter dans le poumon et continuez à ventiler les animaux pendant 1 minute supplémentaire.
- Laissez les animaux se remettre de l'anesthésie et surveillez l'état de santé général et le changement de poids corporel pendant 4 jours.
NOTE: Selon le fond génétique, la souche de souris ou le poids initial, la gravité et le début de la myocardite peuvent varier et devraient être déterminés en premier.
2. Préparation de l'échantillon pour la microscopie à la lumière
- 4 jours après l'application de la toxine, anesthésier les souris en rinçant une chambre d'induction avec un mélange vaporisé à 2% d'isoflurane / oxygène. Injecter 15 μg d'un anticorps anti-CD45 marqué directement (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) dans 50 μL de PBS par voie intraveineuse (iv) en utilisant la voie d'application rétro-orbitale, ce qui assure une application très rapide et très précise de la Quantité correcte d'anticorps.
REMARQUE: La profondeur souhaitée de narcose a été atteinte lorsque les souris sont en position couchée et ne réagissent pas aux tests de pincement. - Après 2 h d'incubation, sacrifiez les souris par dislocation cervicale etD perfuse les cœurs in situ avec 5 ml de PBS / EDTA (5 mM).
- Exposer le cœur et injecter la solution de perfusion dans le ventricule droit à l'aide d'un cathéter 21 G. Perfuser avec une pression lente et constante et s'assurer que le sang peut être vidangé après avoir ouvert l'aorte.
REMARQUE: Cette perfusion transcardiale pourrait entraîner des artefacts de préparation mineurs, ce qui pourrait perturber la visualisation 3D finale de l'organe. Par conséquent, les expérimentateurs animaux avancés pourraient effectuer la perfusion à travers la veine cave inférieure, en excitant l'aorte abdominale.
- Exposer le cœur et injecter la solution de perfusion dans le ventricule droit à l'aide d'un cathéter 21 G. Perfuser avec une pression lente et constante et s'assurer que le sang peut être vidangé après avoir ouvert l'aorte.
- Pour la fixation chimique, perfuser le cœur par le même creux avec 5 mL de paraformaldéhyde à 4% (PFA). Gardez le cathéter en place et attachez simplement une nouvelle seringue remplie de PFA. Perfuser avec une pression lente et constante.
REMARQUE: les paraformaldéhyde sont hautement toxiques; Éviter tout contact avec la peau, les yeux et autres muqueuses.- Saisissez doucement le cœur avec des pinces dentées; PuLl légèrement vers le haut; Et couper toutes les connexions tissulaires, y compris les artères et veines entrantes et sortantes. Rangez l'organe pendant 4 h supplémentaires en PFA 4% pour une fixation supplémentaire.
- Pour déshydrater l'organe, incuber le cœur dans une série ascendante d'éthanol à 50%, 70% et deux fois à 100%, chacun pendant 12 h, à 4 ° C dans l'obscurité. Ici, utilisez des tubes de réaction de polypropylène noir de 5 ml, ce qui leur permet de tourner de manière constante dans un rotor à tube avec une vitesse de rotation lente pour empêcher la formation de bulle d'air.
- Préparation complète des échantillons par détartrage chimique. Pour rendre les coeurs transparents, les incuber dans 98% d'éther de dibenzyle (DBE) tout en faisant tourner en permanence pendant la nuit.
REMARQUE: DBE est irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires.
3. Microscopie à feuilles lumineuses
- Conduire LSFM à l'aide du microscope à lumière (voir la table des matériaux). Placez l'échantillon sur le porte-échantillons standard du microscope dans la tête remplie de DBEVette, qui convient aux spécimens jusqu'à 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Tenir l'échantillon solidement en place pendant l'acquisition de l'image en utilisant des blocs d'agarose déshydratés et effacés.
- Pour préparer les blocs d'agarose, versez 2% d'agarose fondu dans un moule (15 mm x 15 mm x 5 mm). Laissez refroidir l'agarose jusqu'à ce qu'elle se solidifie.
- Déshydratez-le dans une série d'éthanol ascendant (50%, 70% et deux fois à 100%). Incuber les blocs d'agarose pendant une nuit dans 98% de DBE. Conservez l'agarose dans DBE jusqu'à ce qu'il soit utilisé.
REMARQUE: Comme l'agarose est principalement composé d'eau, les temps d'incubation pour chaque étape de déshydratation peuvent être prolongés, selon la taille du bloc.
REMARQUE: DBE est irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires. - Au besoin, couper le bloc d'agarose préparé à la forme souhaitée en utilisant un scalpel pointu. Typiquement, découpez des formes prisme ou en forme de coin pour placer sur les bords de l'adaptateur d'échantillon.
NOTE: Comme les blocs d'agarose sont élastiques,L'échantillon reste en place lorsqu'il est poussé avec peu de force.
- Détecter les signaux de fluorescence d'intérêt (ici, autofluorescence et coloration anticorps anti-CD45) avec les paramètres appropriés d'un filtre d'émission et d'excitation.
- Pour la détection du signal d'autofluorescence dérivé du tissu conjonctif, utiliser un filtre passe-bande de 525/50 nm à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm (OPSL: 50 mW); La coloration CD45 avec un anticorps couplé AF647 est détectée à 668 nm (filtre passe-bande: 680/30 nm) et à une longueur d'onde d'excitation de 647 nm (laser à diode: 50 mW).
- Choisissez 4 μm comme distance entre les deux plans z individuels.
4. Post-traitement d'image
REMARQUE: les données d'image numérique acquises ont été traitées avec un logiciel scientifique de traitement et d'analyse d'image 3D / 4D (voir la table des matières).
- Ouverture et pré-ajustement des fichiers de données.
- Après avoir démarré le logiciel d'analyse, sélectionnez le bouton "Surpass" dans le coin supérieur gauche. Pour ouvrir les piles d'images, choisissez "Fichier", "Ouvrir", et sélectionnez un dossier contenant les données de la première voie acquise. Choisissez "Modifier" et "Ajouter des canaux" pour ajouter d'autres canaux acquis.
REMARQUE: en fonction de la taille des données et du système informatique, ce processus peut prendre plusieurs minutes. Le protocole présenté démontre toutes les étapes pour 2 canaux d'acquisition (autofluorescence et AF647). - Corrigez les dimensions du voxel x, y et z en cliquant sur "Modifier" et en sélectionnant "Propriétés de l'image". Lorsque la nouvelle fenêtre s'ouvre, ajustez les paramètres.
REMARQUE: Cette étape dépend du système de microscope utilisé et du format de données particulier. Les valeurs correctes de xyz sont essentielles pour la taille et les mesures à distance ultérieures. Dans la plupart des cas, ces paramètres sont stockés sous forme de métadonnées dans les fichiers micrographiques. Toutefois, si le fichier foRmat ne peut pas être interprété correctement par le logiciel d'analyse, il est important d'entrer manuellement la taille du pixel. La taille des pixels dans les dimensions x et y dépend de la taille du pixel de la caméra, de la tranche appliquée potentiellement et de l'objectif et du grossissement de l'objectif. La taille de pixel en z est équivalente à la taille auto-définie en z-étape ( par exemple, 4 μm).
- Transformez d'abord le signal d'autofluorescence en niveaux de gris en ouvrant le "Réglage de l'affichage" ("Modifier" et "Afficher le réglage de l'affichage"). Une nouvelle fenêtre répertorie tous les canaux ouverts et les paramètres d'affichage pour chacun d'eux; Pour changer sa couleur par défaut, sélectionnez le canal d'autofluorescence et choisissez le style d'affichage "blanc". Cliquez sur "ok" pour postuler.
- Pour le réglage du niveau du noir, revenez à "Réglage de l'affichage" et réglez la valeur du niveau du noir pour exclure les signaux de fond indésirables qui ne représentent pas la structure de l'échantillonS.
- Pour ce faire, utilisez le triangle supérieur gauche sur la barre de canal et faites-le glisser de gauche à droite.
REMARQUE: les modifications seront visualisées immédiatement. Veillez à supprimer uniquement les signaux qui ne dérivent pas de l'échantillon. Les valeurs minimales en arrière-plan ne doivent jamais être "0" pour éviter les pixels noir, car les signaux de bruit peuvent être nécessaires pour des calculs supplémentaires. Assurez-vous que tous les changements de niveau de noir sont effectués après l'acquisition de l'image. Sinon, des informations précieuses sur l'échantillon peuvent être perdues. Le réglage du niveau noir sert à des fins représentatives. Pour utiliser les mêmes paramètres d'affichage sur différents échantillons, des valeurs précises peuvent être entrées dans le champ numérique "min" sous la liste des chaînes. Ceci est très utile pour les analyses quantitatives.
- Pour ce faire, utilisez le triangle supérieur gauche sur la barre de canal et faites-le glisser de gauche à droite.
- Effectuez le réglage de l'intensité, soit en utilisant le triangle supérieur droit pour ajuster l'intensité du canal respectif, soit en entrant des valeurs précises dans le champ numérique "max" sous la canalisationL liste.
- Effectuez un réglage du contraste en faisant glisser le triangle inférieur au milieu de la barre de canal pour augmenter ou diminuer la valeur gamma ou en saisissant les valeurs précises.
- Réglez le canal AF647 selon le canal d'autofluorescence. En tant que différence, définissez la visualisation du signal AF647 dans une table de recherche de couleurs de la carte de chaleur. Pour ce faire, choisissez le mode "feu" dans une approche similaire à celle de l'étape 4.2.1.
REMARQUE: Comme les intensités globales du signal sont nettement inférieures par rapport au canal d'autofluorescence, les niveaux de noir sont habituellement ajustés à des valeurs beaucoup plus faibles. En ce qui concerne le canal d'autofluorescence, la luminosité de ce canal augmente habituellement. - Sélectionnez le "mode mélange" pour visualiser les structures tissulaires en détail. Analyser tous les échantillons d'une série avec les mêmes valeurs de paramètres.
- Pour ouvrir pratiquement l'organe avant l'expo de scène 3DRt, appliquez un plan d'écrêtage sur l'objet 3D rendu.
- Cliquez sur l'icône "Clipping Plane" (ciseaux) dans la liste des objets. À l'intérieur de la vue d'image, un cadre jaune et un manipulateur (broche blanche) apparaîtront. Tournez la broche à l'extrémité plus mince avec la souris, changeant ainsi l'orientation du plan d'écrêtage et déplacez la partie médiane plus épaisse de la broche pour sélectionner la profondeur de coupe souhaitée.
- Cachez le cadre et le manipulateur en décochant les cases correspondantes sous la liste des objets et créez les instantanés souhaités.
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Representative Results
L'approche LSFM présentée analyse la répartition des leucocytes et la quantité de cœur murin lors de l'induction d'une myocardite sévère. La figure 1A explique le protocole de prétraitement pour les souris CD11c.DTR transgéniques pour l'induction de la myocardite. Cette étape représente le déclencheur nécessaire pour le recrutement de leucocytes dans le myocarde. Après une application DTX réussie, les animaux développent des symptômes graves de la maladie, tels que la faiblesse générale, l'anorexie et la perte de poids dans la fourchette de 2-4 jours. Après 4 jours, les leucocytes sont colorés par le iv . L'application d'anticorps anti-CD45 couplé au fluorochrome avant la perfusion transcardiale pour éliminer le sang de la circulation. Si elle est réalisée avec succès, le cœur et les autres organes deviennent blanchis. Par la suite, l'organe est excisé, et l'eau tissulaire est échangée avec DBE par une rangée ascendante d'éthanol et une incubation finale en DBE. La figure 1B montre le calendrierDes étapes d'incubation individuelles dans lesquelles l'organe subit un retrait important. L'organe éliminé chimiquement est ensuite transféré dans une chambre d'imagerie remplie de DBE sur le support de tissu de microscope standard. Pour stabiliser l'organe lors de l'acquisition de l'image 3D, il est fixé par des blocs d'agarose transparents. Le positionnement détaillé de l'échantillon est visualisé à la figure 2 . L'acquisition d'une pile d'images entière, composée de 2 canaux (autofluorescence et anti-CD45), prend environ 20-30 min et génère un fichier de données d'environ 16 Go. Enfin, les données résultantes sont analysées comme un rendu 3D artificiel dans lequel la distribution des leucocytes est affichée dans une vue de la carte de chaleur. Dans la figure 3 (rangée supérieure), les zones fortement enflammées d'un coeur d'un animal traité par DTX peuvent être perçues par leur apparence rougeâtre / blanchâtre. Une étude plus détaillée du modèle 3D révèle la concentration de leucocytes, en particulier dans les régions du système de conduction cardiaque, comme l'atriovent Ricular bundle et les fibres de Purkinje. En revanche, les coeurs des animaux traités avec du PBS ne montrent pas tout ce type d'inflammation (rang inférieur).
Figure 1: Schéma d'induction et préparation d'échantillons de la myocardite induite par la toxine diphtérique. ( A ) Le développement de la myocardite a été induit par celui-ci . Application de la toxine diphtérique (100 ng / animal). Après 4 jours, la myocardite a été complètement développée et un anticorps anti-CD45 couplé à AF647 (15 μg / animal) a été injecté iv . Pour détecter les leucocytes CD45 + . Les animaux ont été sacrifiés 2 h plus tard par dislocation cervicale, et les coeurs ont été perfusés avec du PBS / EDTA (5 mM) suivi de 4% de PFA. ( B ) Après élimination, l'organe a été déshydraté avec une série d'éthanol ascendant et a été finalement éliminé par incubation durant la nuit dans de l'éther de dibenzyle..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Schéma de positionnement de l'échantillon dans le microscope. Le coeur transparent (4) chimiquement défriché a été positionné sur le support d'échantillon (2 et 5) et stabilisé à l'aide de blocs d'agarose défrichés (6). Cette construction a ensuite été immergée dans la cuvette en verre remplie de DBE (3). Pour l'acquisition, une lentille d'objectif de 0,5 NA (1) avec une distance de travail de 5,5 mm a été utilisée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Représentations 3D représentatives de l'ensemble ouMicroscopie à levier. Les souris CD11c.DTR ont été traitées intratrachéalement avec DTX (rangée supérieure) ou PBS (rangée inférieure). 4 jours plus tard, le développement de la myocardite, représenté par l'infiltration de leucocytes CD45 + , a été visualisé par microscopie fluorescente à la lumière. Pour tacher les cellules CD45 + , un anticorps anti-CD45 couplé à AF647 a été injecté iv 2 h avant de sacrifier les souris. Le signal d'autofluorescence du tissu conjonctif est affiché en gris, alors que l'infiltration CD45 + est présentée dans les couleurs du Heatmap (bleu: signal faible, blanc: signal élevé). Chaque rangée est composée de 4 rendements 3D clipsés en 3D, démontrant la situation à l'intérieur de l'organe. La profondeur d'écrêtage par rapport à la partie avant du cœur est déclarée au-dessus des images individuelles. La figure a été modifiée de Mann et al. 15 . Barre d'échelle = 1 mm. Cliquez ici s'il vous plaitPour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans la science de la vie moderne, la visualisation microscopique des processus biologiques joue un rôle de plus en plus important. Dans ce contexte, de nombreux développements ont été réalisés au cours des deux derniers siècles qui aident à répondre à des questions non adressables jusqu'à ce point. Tout d'abord, il y a eu une nette tendance à augmenter fondamentalement la capacité de résolution des microscopes à lumière. Avec la microscopie d'illumination structurée (SIM) 21 , 22 , la microscopie de dépression-épuisement (STED) estimée 23 , et la microscopie de localisation photo-activée (PALM) 24 , 25 ou la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) 26 , la limitation de résolution postulée une fois À la diffraction de la lumière 27 était significativement cassé. Le deuxième défi souvent ciblé était d'observer le comportement cellulaire dans un environnement ressemblant àLa condition naturelle aussi près que possible. Dans ce contexte, le développement d'approches d'imagerie in situ ou in vivo a été forcé. Pour surmonter la profondeur limitée de la pénétration de la lumière dans les tissus biologiques complexes, la microscopie à 2 photons 28 , 29 a établi de nouvelles normes dans ce domaine de recherche.
Cependant, une caractéristique que toutes ces techniques de microscopie partagent habituellement est l'utilisation d'objectifs élevés de NA pour garantir la meilleure résolution possible. Bien qu'il résolue plus en détail les microstructures, l'utilisation d'objectifs élevés de NA limite significativement le champ de vision, ainsi que la distance de travail. En conséquence, le contexte biologique en termes de milieu environnant se démarque souvent dans le vrai sens du mot. Pour combler cette lacune, le développement du LSFM s'est récemment intéressé, fournissant une technique de microscopie capable de résoudre des structures fluorescentes à la taille cellulaireMais aussi pour évaluer de manière pratique l'ensemble de l'information 3D d'un spécimen d'une taille supérieure à 1 cm.
Le protocole décrit ici présente une méthode pour utiliser un ultramicroscope pour visualiser un infiltrat de leucocytes cellulaire dans des coeurs murins entiers. Après l'induction réussie d'une myocardite stérile dans un modèle de souris CD11c.DTR 30 , l'animal respectif reçoit une injection iv d'un anticorps anti-CD45 couplé au fluorochrome, qui circule pendant 2 h chez l'animal vivant. En principe, en effectuant un post-mortem, la coloration de l'anticorps tout entier entre la fixation d'organe et la déshydratation de l'échantillon devrait être possible. Malheureusement, la coloration intégrale exige des étapes d'incubation beaucoup plus longues et augmente massivement le temps nécessaire à la génération d'échantillon ( c.-à-d. De 4 à 21 jours) 6 , 31 . En outre, cette approche de coloration intravital n'est pas seulement plus rapide, mais aussiPénétration tissulaire plus efficace de l'anticorps par rapport à un protocole de coloration total 9 . Bien que l'efficacité de coloration absolue n'a pas été quantifiée, on s'attend à ce qu'une grande proportion de la population de leucocytes soit marquée, étant donné que le signal de fluorescence résultant est remarquablement fort. Les protéines fluorescentes et l'étiquetage des anticorps survivent en grande partie au processus de décollement ultérieur, et les deux semblent être stables pendant une longue période de temps. Il convient également de noter qu'un agent à base de solvant est utilisé pour le nettoyage des tissus. Cela entrave massivement une approche de coloration intégrale après le processus de défrichage. La décoloration des tissus à base de solvant est un phénomène réversible, de sorte qu'un transfert du tissu dégagé dans un milieu à base d'eau (tel que le PBS), qui est habituellement utilisé pour la coloration standard des anticorps, aboutirait à un échantillon non transparent. Par conséquent, les protocoles de coloration non standard dans les solvants organiques devraient être établis i Une procédure de coloration intégrale est nécessaire après le dégagement de l'échantillon.
La perfusion cardiaque subséquente est absolument nécessaire pour éliminer autant de sang résiduel que possible, car le sang est mal éclairé dans les étapes suivantes et aggrave considérablement les résultats d'imagerie. Après avoir excisé le cœur, l'eau du tissu est enlevée dans une rangée ascendante d'éthanol. Cette étape peut être considérée comme la première partie du dégagement chimique. L'idée est de substituer l'eau tissulaire par un milieu d'immersion qui correspond mieux à l'indice de réfraction moyen (RI) de l'échantillon de choix. DBE a été choisi comme milieu d'immersion suivant le protocole d'Ertuk et al. 32 , avec quelques modifications. DBE a un indice de réfraction de 1,55 (nD20), et lorsqu'il a été comparé à d'autres agents de compensation, tels que l'alcool benzylique: benzoate de benzyle (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 ou saccharose (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13, il a mieux conservé les marqueurs fluorescents utilisés dans ce protocole. Une préservation de fluorescence similaire a été obtenue à l'aide de cinnamate d'éthyle (ECI). Nous avons décrit son utilisation dans une étude sur la quantification automatisée des glomérules dans les reins néphrétiques 9. Le muscle Les tissus, une fois estimés avoir un indice de réfraction de 1,382 ± 0,004 33 , ont également été éliminés avec toutes les substances que nous avons évaluées 9. Par conséquent, le facteur crucial pour le choix du DBE était la préservation de la fluorescence et non le potentiel de compensation. Changement à ce protocole de compensation passive, l'utilisation d'une méthode active telle que CLARITY 34 , 35 , où l'élimination des lipides à l'aide d'un courant électrophorétique entraîne des tissus fortement dégagés, devrait être possible. Cependant, contrairement à une telle eau Méthode de décontamination basée, la compensation de DBE entraîne un durcissement significatifDu tissu, accompagné d'un rétrécissement mineur. Cela permet une manipulation facile des échantillons et ne nécessite pas d'autres adaptations pour l'imagerie, comme l'encastrement de l'échantillon dans un bloc d'agarose. Par conséquent, le transfert de ce protocole à une méthode comme CLARITY serait difficile, mais les gens ont démontré avec succès l'utilisation de l'ultramicroscope choisi (voir la table des matières) avec cette approche 3 . Il est important d'évaluer soigneusement la destruction potentielle des signaux de fluorescence endogène par la méthode de décollement de choix. Comme nous n'avons jamais travaillé avec CLARITY ou d'autres protocoles de clearing actif, nous ne pouvons pas commenter la réaction de fluorochrome dans ces systèmes. Le pire des cas serait qu'il faudrait effectuer une coloration d'anticorps tout au long de l'ensemble.
Cette méthode est facilement ajustable à d'autres organes, tels que les poumons murins; reins; cerveaux; Et même les os, comme le fémur, le tibia ou la calvaire. Bien que évaluati Le potentiel de l'application sur de nouvelles régions de tissus et / ou de nouvelles stratégies d'étiquetage fluorescent, le plus grand défi consiste généralement à concevoir le protocole de manière à ce que la fluorescence soit maintenue en vie. Le milieu d'immersion à base de solvant 13 et les agents de déshydratation 36 ont un impact direct sur l'intégrité des fluorochromes. L'utilisation de dérivés d'AlexaFluor est recommandée, car ils semblent être assez stables dans divers protocoles. Cependant, très souvent, d'autres fluorochromes doivent être employés. Dans ce cas, il vaut vraiment la peine d'évaluer l'utilisation d'autres agents de compensation ( p. Ex., Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , salicylate de méthyle 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6, et ECI 9 ) et d'autres alternatives de déshydratation ( par exemple, le méthanol et le tétrahydrofurane 13 ).
Comme dans beaucoup d'autres approches LSFM, le processus de positionnement du coeur transparent au microscope est exigeant. Les systèmes commerciaux fournissent assez d'espace pour installer des échantillons de la taille des organes de la souris, y compris les lobes pulmonaires, les reins ou les cœurs. Cependant, pour le moment, aucun support d'échantillon standardisé pour ces spécimens n'est disponible. Par conséquent, nous avons dû établir un appareil de montage en utilisant des blocs d'agarose décolorés et ré-formés. Pourtant, un certain nombre de jeux de données d'image ont dû être éliminés en raison des artefacts de mouvement. Ce problème a également été augmenté en raison du long temps d'acquisition du microscope utilisé ici. Potentiellement, la génération d'ensembles de données énormes profitera de manière significative à partir de systèmes plus rapides, mais nous n'avons pas encore eu la possibilité d'utiliser un microscope plus rapide. Notre microscope (voir tableau oF matériaux) a été construit autour d'un corps de microscope zoom et a été équipé d'un module laser, d'une caméra sCMOS avec une taille de pixel de 6,5 x 6,5 mm 2 et d'une optique de détection avec une gamme de grossissement optique de 1,26X à 12,6X. La partie centrale de l'optique de détection était une lentille d'objectif de 0,5 NA avec une distance de travail de 5,5 mm, ce qui permettait d'observer un large champ de vision compris entre 1,7 et 17,6 mm en diagonale. C'était assez grand pour effectuer la coupe optique de coeurs murins entiers. La correction de l'aberration chromatique, entre 400 et 800 nm, a été réalisée par l'ajustement mécanique de l'objectif. Au besoin, des corrections chromatiques ont été effectuées au cours du post-traitement assisté par ordinateur. L'aberration sphérique, également dans des spécimens plus épais, n'a pas été observée dans ce système et n'a donc pas dû être corrigée.
Dans l'ensemble, nous présentons ici un protocole robuste pour la compensation chimique et l'analyse de l'espace lRépartition des eukocytes à l'intérieur des coeurs murins à l'aide d'une microscopie à la lumière. À ce stade, il est important de souligner que cette procédure LSFM n'est guère capable de résoudre des structures tissulaires fines telles que les capillaires. À cet égard, ce LSFM est bien adapté pour caractériser la distribution générale des cellules immunitaires et pour décrire les accumulations potentielles de cellules immunitaires à l'intérieur de l'organe. Cependant, il faut garder à l'esprit que LSFM en général n'est pas le choix parfait pour analyser et quantifier la localisation cellulaire dans les sous-structures des petits organes, comme le système vasculaire. Pour répondre à ces questions, LSFM devrait être complété par d'autres méthodes, telles que l'histologie ou la microscopie à 2 photons. D'autres limitations de ce protocole incluent la restriction d'un maximum de 3-4 couleurs: le canal bleu est difficile à utiliser pour d'autres signaux indépendamment de l'autofluorescence: la restriction aux échantillons fixes et la taille maximale de l'échantillon de 30 mm x 30 mm x 15 Mm. En outre, l'odeur forte et la toxicité aiguë de DBE devraient être prisesN en compte. Si le dernier point est problématique, le cinnamate d'éthyle peut être utilisé comme agent de compensation alternatif 9 . Le principal avantage de choisir cette technique de microscopie est la capacité d'analyser l'organe entier à la fois. Dans les analyses classiques des sections de tissus histologiques à l'hématoxyline et à la coloration éosinée, à la formaline et à la paraffine (FFPE), il existe une forte probabilité de manquer des zones spatiales importantes, sauf si chaque section est analysée. En outre, la microscopie optique permet non seulement de découper virtuellement l'échantillon dans tous les plans tridimensionnels, mais elle offre également ce potentiel sans détruire l'échantillon ni provoquer des artefacts de coupe. Si nécessaire, l'organe fixe pourrait ensuite être traité pour d'autres analyses, comme une lumière corrélative et des approches microscopiques électroniques pour résoudre des régions particulières d'intérêt. Un modèle pour une telle étude peut être trouvé dans le travail de Karreman et al. , Où la corrélation parieUne pile d'images à microscopie à 2 photons et des données tridimensionnelles à microscopie électronique ont été montrées avec succès 41 . Une autre approche prometteuse pourrait être la combinaison de ce protocole avec la méthode uDISCO récemment publiée qui est également basée sur un solvant organique et qui permettrait d'étudier des organes beaucoup plus importants par un LSFM standard 42 .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
La recherche dans le laboratoire de Gunzer a été soutenue par le ministère allemand de l'Éducation et de la Recherche (délivrance n ° 0315590 AD) et par la Fondation allemande pour la recherche (numéro de concours GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Nous remercions encore l'IMCES pour le soutien technique et Sebastian Kubat pour l'aide à la modélisation de dessin animé en 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
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