Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

doi: 10.3791/55450 Published: May 31, 2017

Summary

כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.

Abstract

מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי (LSFM), בשילוב עם פרוטוקולי ניקוי כימיים, הפך את תקן הזהב לניתוח מבנים שכותרתו fluorescently בדגימות ביולוגיות גדולות, והוא עד רזולוציה הסלולר. בינתיים, חידוד מתמיד של הפרוטוקולים הבסיסיים ואת הזמינות המשופרת של מערכות מסחריות מיוחדות מאפשרים לנו לחקור את המיקרו של איברים העכבר כולו ואף לאפשר את אפיון ההתנהגות הסלולרית גישות שונות לחיות הדמיה תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה מרחבית שלמה הר לכימות של האוכלוסייה +45 leukocyte CDI בלבבות עכברים מודלק. השיטה מעסיקה זן עכבר מהונדס (CD11c.DTR), אשר הוכח לאחרונה לשמש מודל חזק, inducible לחקר התפתחות של דלקת שריר הלב הקטינית, מתאבדת על ידי הפרעות בקצב הלב קטלני. פרוטוקול זה כולל אינדוקציה שריר הלב, intravitאל נוגדנים בתיווך מכתים התא, הכנה איברים, ו LSFM עם המחשב הבא בסיוע תמונה שלאחר עיבוד. למרות שהוצג כשיטה מתואמת מאוד עבור השאלה המדעית שלנו, הפרוטוקול מייצג את תכנית אב של מערכת מתכווננת בקלות שיכולה גם למקד מבנים ניאון שונים לחלוטין באיברים אחרים ואפילו מינים אחרים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במהלך האבולוציה של מיקרוסקופ אור, הופיעו צורות מיוחדות רבות, כולם פיתחו כדי למזער מגבלות בתהליך הדמיה עבור דגימות מסוימות. שיטה אחת כזו היא אור גיליון גיליון מיקרוסקופ פלואורסצנטי (LSFM). הראשון שפותח בשנת 1903 על ידי Siedentopf ו Zigigundy 1 ו מציאת יישומים ביולוגיים בסיסיים הראשון שלה בתחילת 1990 2 , LSFM הפך את כלי מיקרוסקופי חזק ביותר עד כה להדמיה של דגימות גדולות, כגון איברים עכבר שלם, עם רזולוציה האות פלואורסצנטי עד לרמה התאית. בגלל היתרונות הללו, בשילוב עם הפוטנציאל שלה לחיות תא הדמיה, שיטות טבע בשם LSFM "השיטה של ​​השנה 2014 3 ".

כפי שהשם מרמז, תאורה המדגם LSFM מתבצע על ידי גיליונות אור, אשר מכווננים בניצב לציר של המטרה המשמש fאו אוסף אור פליטה ויצירת התמונה הבאים. גיליון האור נוצר בדרך כלל על ידי מיקוד קורות לייזר רחבות וקולימטיות עם עדשה גלילית או על ידי תנועה צדדית מהירה של קורות לייזר ממוקדות צרות במישור אופקי אחד או אנכי 4 , 5 . בדרך זו, רק את המטוס המוקד של אופטיקה הדמיה מואר, בדרך כלל עם עובי של 1-4 מיקרומטר. כתוצאה מכך, עבור מדגם פלואורסצנטי להציב את המטוס תאורה, הן את הדור של אור מפוזרים ואת ההשפעות של photobleaching מאזורים מעל או מתחת למישור המוקד מסולקות או מדוכא מאוד 6 , 7 . כמו כל המטוסים מחוץ להתמקד לא מואר, אפקטים photobleaching מושמטים באזורים אלה. בניגוד למיקרוסקופיה קונפוקלית או רב פוטון רגילה, נתיבי האור המואר והנפלט נפרדים זה מזה, כך שהדימוי הסופי של התמונה Ity אינו תלוי במיקוד המושלם של קרן אור עירור דרך מטרות. בהתאם לשאלה הבסיסית, זה אפשרי ולכן ניתן להשתמש ביעדים עם שדה עצום של נוף (FOV), כך השטח הגדול ביותר האפשרי של המטוס מואר ניתן הדמיה ללא כל רכיב חלקים נעים בכיוון xy.

במערכות LSFM מודרניות, תמונה פלואורסצנטית של החלק האופטי שנוצר נלכדת במצלמת מוליכים למחצה (CMOS) משוכללים (CCD), או במצלמות משלימות של מתכת, המספקות את כל שדה הראייה (FOV) ב microseconds. לכן, על ידי הזזת המדגם דרך הסדין האור על ידי רכישת תמונות ב z-שלבים מוגדרים, ניתן לקבל את המידע המלא 3D של דגימה בסכום סביר של זמן 8 , 9 , מה שהופך את הטכניקה הזו תקף עבור תא חי Pid 12 ,התחת = "xref"> 11 , 12 .

עם זאת, למרות LSFM מציעה שיטה מהירה, רגישה, ידידותית פלואורסצנטי, שידור אור דרך הדגימה היא עדיין בעיה גדולה, במיוחד כאשר דגימות ביולוגיות גדולות הן היעד לניתוח 3D. העברת האור משתנה באופן קריטי על ידי היבטים פיזיים של הקליטה ועל ידי פיזור האור על ממשקים של מבנים עם מדדי השבירה שונים 13 . לכן, כאשר דגימות הדמיה כמה מילימטרים בגודל, LSFM הוא בשילוב בעיקר עם פרוטוקולי ניקוי כדי להפוך את דגימות אופטיות שקוף. טכניקות אלה מבוססות על הרעיון של הסרת מים מהרקמה הביולוגית המתאימה והחלפתם עם חומרי טבילה מבוססי מים או אורגניים המבוססים על ממס, אשר נבחרים להתאים באופן צר את מדדי השבירה של מרכיבי רקמת היעד הספציפיים. כתוצאה מכך, פיזור אור לרוחב ממוזער, וכל אורכי גלשל האור יכול לעבור ביעילות רבה יותר דרך הרקמה 13 . במקרים רבים, דגימות ביולוגיות המטופלות בדרך זו מופיעות בצורה צלולה ומאקרוסקופית, המאפשרת LSFM להתנהל גם על איברים של עכבר שלם, תוך שימוש במרחקים ארוכים, מטרות הגדלה נמוכות.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכנה עבור הדגימה מדגם גדול במיקרוסקופ אור (ראה טבלה של חומרים), אשר הקמנו לחקור את חדירת הלב הסלולר במודל Murine של שריר הלב 15 . עכברים CD11c.DTR לבטא את קולטן רעלן dymhtheria הפרימטים (DTR) תחת שליטה של ​​promotor CD16c 16 . כתוצאה מכך, תאים בעכברים אלה, אשר מבטאים CD11c יחד עם DTR, רגישים אקזוטיים של Corynebacterium diphtheria (רעלן diphtheria, DTX); את הטיפול המערכתי של בעלי חיים אלה עם תוצאות DTX דלדול של כל CD11c + CELls. CD11c הוא אינטגרין, וכקולטן של תא-תאים למגוון גורמים מסיסים שונים, מעורב בתהליכי הפעלה והתבגרות בעיקר בתאי השושלת המונוציטית. כתוצאה מכך, מודל העכבר CD11c.DTR כבר בשימוש אינטנסיבי ללמוד את התפקיד של תאים דנדריטים ותת מקרופאגים בהקשר של שאלות חיסוניות רבות. עם הזמן, דווח כי עכברים CD11c.DTR מטופלים באופן שיטתי עם DTX יכול לפתח תופעות לוואי שליליות והוא יכול להציג שיעורי תמותה גבוהות מאוד 18 , 19 . לאחרונה, הצלחנו לזהות את הסיבה הבסיסית למוות 15 , המתאר את התפתחותה של שריר הלב הדוקרני לאחר יישום DTX תוך-עיני אצל בעלי חיים אלו. האתגר הרעלני גרם להרס תאי, כולל בחלקים מרכזיים של מערכת התמריצים בלב. זה היה מלווה מסיבי CD45+ ליקוציט לחדור, ולבסוף מוביל הפרעות קצב לב קטלניות. במקרה זה, לא רק הופעתו של אוכלוסיית לויקוציטים חשוב, אלא גם את החלוקה המרחבית שלה בתוך הלב. זו השאלה הניסויית היא אתגר עבור הדמיה מיקרוסקופית המודרנית, אשר יש לנו לפתור על ידי גישה מיקרוסקופית אור גיליון נתמך על ידי מכתים נוגדן intravital ו הממס אורגני מבוסס פרוטוקול ניקוי אופטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי ואושרו על ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיות באסן (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, גרמניה). החיות שימשו ושוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).

1. אינדוקציה של שריר הלב על ידי דיפתריה Toxin (DTX)

  1. הכן את הפתרון DTX עבור אינדוקציה של שריר הלב על ידי דילול פתרון המניות DTX עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) לפתרון עבודה 1 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. החל 100 μL של פתרון זה intratracheally (אותו) לתוך 8 עד 10 שבועות CD11c.DTR עכברים ( כ 5 ng / g bodyweight (bw)), כפי שמוצג על ידי Hasenberg et al. עבור היישום של ההשעיה נבג פטרייתי 20 .
    הערה: היישום intraperitoneal של רעלן עלול לגרום אינדוקציה דומה שלדלקת שריר קטלנית. עם זאת, גישה זו צריך להיות הראשון תוקף.
    1. עבור יישום זה, להרדים את החיות על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) של 100 מ"ג / ק"ג bw קטמין ו 10 מ"ג / ק"ג xylazine bw.
    2. לאחר הגעה נרקוזיס עמוק (מבחן קמצוץ הבוהן), אינטובציה החיות באמצעות צנתר ורידי 22 ו indwelt דרך חלל הפה. בדוק את המיקום הנכון של צינור העדשה על ידי איוור החיות עם הנשמה קטן בעל חיים בקצב של 250 נשימות לדקה ואת נפח השאיפה של 250 μL לכל נשימה, גם על ידי Hasenberg et. אל. 20 .
      הערה: כאשר הנכם ממוקמים בצורה נכונה, קצב הנשימה של בעלי החיים ישתנה בהתאם להגדרות האוורור המיושמות.
    3. לנתק את מערכת אוורור לחדור את 100 μL של פתרון DTX או כמות שווה של PBS כבקרה דרך הקטטר לתוך הריאה ולהמשיך לאוורר את החיות עבור 1 דקות נוספות.
  3. בואו החיות להתאושש מהרדמה ולפקח על מצב הבריאות הכללית שינוי משקל הגוף במשך 4 ימים.
    הערה: בהתאם לרקע הגנטי, ללחץ העכבר או למשקל הראשוני, החומרה וההתחלה של שריר הלב הינן שונות, ויש לקבוען תחילה.

2. הכנה לדוגמא עבור מיקרוסקופ אור גיליון

  1. 4 ימים לאחר יישום רעלן, להרדים את העכברים על ידי שטיפה תא אינדוקציה עם תערובת isoflurane 2% vaporized / חמצן. להזריק 15 מיקרוגרם של נוגדנים נגד CD45 שכותרתו ישירות (שיבוט 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) ב 50 μL של PBS תוך ורידי (iv) באמצעות מסלול יישום מסלול רטרו, אשר מבטיח יישום מהיר מאוד מדויק ביותר של כמות נכונה של נוגדן.
    הערה: העומק הרצוי של נרקוזיס הגיע כאשר העכברים הם שכיבה ולא מגיבים בדיקות קמצוץ אצבע.
  2. לאחר 2 שעות של הדגירה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחםD perfuse לבבות באתרו עם 5 מ"ל של PBS / EDTA (5 מ"מ).
    1. לחשוף את הלב להזריק את הפתרון זלוף לתוך החדר הימני באמצעות קטטר 21 G. פרפוזה עם לחץ איטי, קבוע ולוודא כי הדם יכול להיות סחוט לאחר חיתוך האבי העורקים.
      הערה: זה זלוף transcardial עלול לגרום מרכיבים הכנה קטין, אשר יכול להפריע להדמיה 3D הסופי של האורגן. לכן, ניסויים בבעלי חיים מתקדמים יכול לבצע את הזלוף דרך הנבוב הווריד נחות, מוריד את אבי העורקים הבטן.
  3. עבור קיבוע כימי, perfuse את הלב דרך ההפסקה אותו עם 5 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA). שמור את catheter במקום ופשוט לצרף מזרק חדש מלא PFA. פרפוזה בלחץ איטי ומתמיד.
    הערה: Paraformaldehydeis רעיל מאוד; למנוע מגע עם העור, העיניים, רירית אחרים.
    1. בעדינות לתפוס את הלב עם מלקחיים משוננות; Puיהיה מעט כלפי מעלה; וחותכים את כל קשרי הרקמה, כולל העורקים הנכנסים והיוצאים והוורידים. חנות איבר עבור 4 שעות נוספות PFA 4% עבור קיבוע נוסף.
  4. כדי לייבש את האיבר, לדגור את הלב בסדרה אתנול עולה ב 50%, 70%, פעמיים ב 100%, כל 12 שעות, ב 4 ° C בחושך. כאן, להשתמש שחור 5 מ"ל צינורות פוליפרופילן התגובה, ומאפשר להם כל הזמן לסובב ב rotator צינור באמצעות מהירות סיבוב איטי כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
  5. הכנת המדגם השלם על ידי ניקוי כימי. כדי להפוך את הלב שקוף, דגירה אותם dibenzyl אתר 98% (DBE) תוך כל הזמן מסתובבת לילה.
    הערה: DBE מגרה את העיניים, העור ומערכת הנשימה.

3. מיקרוסקופית אור

  1. התנהגות LSFM באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון (ראה טבלה של חומרים). מניחים את המדגם על בעל המדגם הסטנדרטי של המיקרוסקופ לתוך CU מלא DBEVette, אשר מתאים דגימות עד 30 מ"מ x 30 מ"מ x 15 מ"מ.
  2. החזק את המדגם בחוזקה במקום במהלך רכישת התמונה באמצעות בלוקים agarose מיובש וניקוי.
    1. כדי להכין את בלוקים agarose, לשפוך 2% agarose מותכת לתוך עובש (15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ). תן agarose להתקרר עד שהוא מתקשה.
    2. מייבשים אותו בסדרת אתנול עולה (50%, 70%, פעמיים ב 100%). דגירה בלוקים agarose לילה 98% DBE. אחסן את agarose ב DBE עד שהוא משמש.
      הערה: כמו agarose מורכבת בעיקר של מים, פעמים הדגירה עבור כל שלב התייבשות ניתן להרחיב, בהתאם לגודל של הבלוק.
      הערה: DBE מגרה את העיניים, העור ומערכת הנשימה.
    3. בעת הצורך, לחתוך את הבלוק agarose מוכן לצורה הרצויה באמצעות אזמל חדה. בדרך כלל, לחתוך טפסים פריזמה או בצורת טריז למקום בקצה של מתאם מדגם.
      הערה: כמו בלוקים agarose הם אלסטיים,המדגם נשאר במקום כאשר דחף עם כוח קטן.
  3. זיהוי אותות הקרינה של עניין (כאן, autofluorescence אנטי CD45 נוגדן מכתים) עם עירור המתאים פליטה מסנן הגדרות.
    1. עבור זיהוי של אותות החיבור autocluorescence הנגזרת של רקמת חיבור, השתמש 525/50 nm מסנן bandpass באורך גל עירור של 488 ננומטר (OPSL: 50 mW); מכתים CD45 עם נוגדנים AF647 מצמידים מזוהה ב 668 ננומטר (מסנן bandpass: 680/30 ננומטר) ו באורך גל עירור של 647 ננומטר (לייזר דיודה: 50 mW).
    2. בחר 4 מיקרומטר כמרחק בין שני מטוסים בודדים.

4. תמונה שלאחר עיבוד

הערה: נתוני התמונה הדיגיטלית שנרכשו היו מעובדים עוד יותר עם מעבד מדעי 3D / 4D עיבוד ועיבוד תוכנה (ראה טבלה של חומרים).

  1. פתיחה והתאמה מראש של קובצי הנתונים.
  2. לאחר הפעלת תוכנת הניתוח, בחר את כפתור "Surpass" בפינה השמאלית העליונה. כדי לפתוח את ערימות התמונות, בחר "קובץ", "פתח" ובחר תיקייה המכילה את הנתונים מהערוץ הראשון שנרכש. בחר "ערוך" ו"הוסף ערוצים "כדי להוסיף ערוצים שנרכשו.
    הערה: בהתאם לגודל הנתונים ולמערכת המחשב, תהליך זה עשוי להימשך מספר דקות. הפרוטוקול המוצג מדגים את כל השלבים עבור 2 ערוצי הרכישה (autofluorescence ו AF647).
  3. תקן את המאפיינים x, y ו- z voxel על ידי לחיצה על 'ערוך' ובחירת 'מאפייני תמונה'. כאשר החלון החדש נפתח, להתאים את הפרמטרים.
    הערה: שלב זה תלוי במערכת המיקרוסקופ המועסקים ובפורמט הנתונים המסוים. ערכים נכונים של xyz הם קריטיים לגודל הבא ולמידות רחוקות. ברוב המקרים, פרמטרים אלה מאוחסנים כמטא נתונים בקובצי המיקרוגרפיה. עם זאת, אם הקובץRmat לא ניתן לפרש כראוי על ידי תוכנת ניתוח, חשוב להזין ידנית את גודל פיקסל. גודל הפיקסלים במידות x ו- y תלוי בגודל הפיקסלים של המצלמה, binning שיושם באופן פוטנציאלי, ובהגדלת העדשה וההגדלה האובייקטיבית. גודל הפיקסלים ב- z הוא שווה להגדרה עצמית של צעד צעד ( למשל, 4 מיקרומטר).
  • התאמות ערוץ
    1. ראשית לשנות את האות autofluorescence לגווני אפור על ידי פתיחת "התאמת תצוגה" ("ערוך" ו "הצג הצג התאמת"). חלון חדש יציג את כל הערוצים שנפתחו ואת הגדרות התצוגה עבור כולם; כדי לשנות את צבע ברירת המחדל שלה, בחר את ערוץ autofluorescence ולבחור את "לבן" סגנון התצוגה. לחץ על "אישור" כדי להחיל.
    2. עבור התאמת רמת השחור, חזור אל "כוונון תצוגה" והתאם את ערך השחור כדי לא לכלול אותות רקע לא רצויים שאינם מייצגים מבנה מדגםS.
      1. לשם כך, השתמש במשולש השמאלי העליון בשורת הערוץ וגרור אותו משמאל לימין.
        הערה: השינויים יחושפו מיידית. הקפד רק לדכא אותות שאינם נובעים המדגם. ערכים מינימליים ברקע לא צריך להיות "0", כדי למנוע פיקסלים שחור שחור המגרש, כמו אותות רעש עשוי להיות נחוץ עבור חישובים נוספים. ודא שכל השינויים ברמת השחור מבוצעים לאחר רכישת התמונה. אחרת, מידע מדגם יקר עלול ללכת לאיבוד. ההתאמה ברמת השחור משמשת רק למטרות ייצוגיות. כדי להשתמש באותן הגדרות תצוגה על דגימות שונות, ניתן להזין ערכים מדויקים בשדה המספרי "min" מתחת לרשימת הערוצים. זה מאוד מועיל עבור ניתוחים כמותיים.
    3. בצע כוונון אינטנסיביות, אם באמצעות המשולש הימני העליון כדי להתאים את עוצמת הערוץ בהתאמה או על ידי הזנת ערכים מדויקים לשדה המספרי "המקסימלי" מתחת לקצהרשימה.
    4. בצע כוונון ניגודיות על ידי גרירת המשולש התחתון באמצע סרגל הערוץ כדי להגדיל או להקטין את ערך גמא או על ידי הזנת הערכים המדויקים.
    5. התאם את הערוץ AF647 על פי ערוץ autofluorescence. כהבדל, להגדיר את הדמיה של האות AF647 כדי צבע חום המפה מבט שולחן. לעשות זאת על ידי בחירת מצב ערוץ "אש" בגישה דומה לזה בשלב 4.2.1.
      הערה: כמו עוצמת האות הכוללת נמוכים משמעותית לעומת ערוץ autofluorescence, את רמות שחור מתואמים בדרך כלל לערכים נמוכים בהרבה. באשר ערוץ autofluorescence, את הבהירות של הערוץ הזה הוא גדל בדרך כלל.
    6. בחר את "מצב למזג" לדמיין מבנים רקמות בפירוט. לנתח את כל הדגימות מסדרה אחת עם ערכי פרמטר אותו.
  • קליטה וירטואלית
    1. כדי כמעט לחתוך את האיבר לפני expo סצינה 3DRt, להחיל מטוס חיתוך על אובייקט 3D שניתנו.
      1. לחץ על "קליפ מטוס" סמל (מספריים) ברשימת אובייקטים. בתצוגת התמונה, יופיעו מסגרת צהובה ומניפולטור (ציר לבן). סובב את ציר על קצה דק יותר עם העכבר, ובכך לשנות את הכיוון של מטוס חיתוך, ולהזיז את החלק האמצעי העבה של ציר כדי לבחור את העומק הרצוי של גזיר.
      2. הסתר את המסגרת ואת מניפולטור ידי ביטול הסימון תיבות הסימון בהתאמה מתחת לרשימת אובייקטים וליצור את התמונות הרצוי.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    הגישה המוצגת LSFM מנתחת את התפלגות הליקוציטים ואת כמות הלב של Murine עם אינדוקציה של שריר הלב. איור 1 א מסביר את פרוטוקול טרום טיפול עבור עכברים CD11c.DTR מהונדס עבור אינדוקציה שריר הלב. צעד זה מייצג את הגורם הדרוש לגיוס של לויקוציטים לשריר הלב. לאחר יישום מוצלח DTX, בעלי החיים לפתח תסמיני מחלה חמורים, כגון חולשה כללית, אנורקסיה, ירידה במשקל בטווח של 2-4 ימים. לאחר 4 ימים, leukocytes מוכתמים על ידי iv . יישום של נוגדן anti-CD45 מצמידים fluorochrome לפני זלוף transcardial כדי להסיר את הדם מהמחזור. אם מבוצעת בהצלחה, הלב ואיברים אחרים הופכים לבנבן. לאחר מכן, האיבר הוא נכרת, מים רקמה מוחלף עם DBE על ידי שורה אתנול עולה הדגירה הסופי DBE. איור 1B מראה את לוח הזמניםשל שלבי האינקובציה האינדיבידואליים שבהם עובר האיבר הצטמקות משמעותית. איבר ניקוי כימית מועבר לאחר מכן לתא הדמיה מלא DBE על בעל רקמות מיקרוסקופ רגיל. כדי לייצב את האיבר במהלך רכישת תמונה 3D, הוא קבוע על ידי בלוקים agarose שקוף. המיקום המפורט של הדגימה הוא דמיינו באיור 2 . רכישת מחסנית תמונה שלמה, המורכבת משני ערוצים (autofluorescence ואנטי CD45), לוקח בערך 20-30 דקות ומייצר קובץ נתונים של כ 16 GB. לבסוף, הנתונים שהתקבלו מנותחים כמו עיבוד 3D מלאכותי שבו חלוקת לויקוציטים מוצג בתצוגה heatmap. באיור 3 (שורה עליונה), אזורים מודלקים מאוד של לב של חיה מטופלת DTX יכול להיות נתפס על ידי המראה האדמדם / לבנבן שלהם. מחקר מפורט יותר של המודל 3D חושף את ריכוז הלייקוציטים, במיוחד באזורים של מערכת הולכה לב, כגון אטריובנט צרור חוטי ואת סיבי Purkinje. לעומת זאת, לבם של חיות שטופלו ב- PBS אינו מראה דפוס דלקת כלל (בשורה התחתונה).

    איור 1
    איור 1: Scheme של אינדוקציה והכנה לדוגמא של דיפתריה Toxin-Induced Myocarditis. ( א ) פיתוח שריר הלב נגרם על ידי זה . יישום של רעלן דיפטריה (100 ng / בעלי חיים). לאחר 4 ימים, myocarditis היה מפותח לחלוטין ו AF647 מצמידים נוגדן CD45 (15 מיקרוגרם / בעל חיים) הוזרק IV . כדי לגלות CD45 + leukocytes. בעלי חיים היו קורבן 2 שעות מאוחר יותר על ידי נקע צוואר הרחם, ואת הלבבות היו perfused עם PBS / EDTA (5 מ"מ) ואחריו PFA 4%. ( ב ) לאחר הסרת, האיבר היה מיובש עם סדרת אתנול עולה ולבסוף ניקה על ידי הדגירה לילה באתר dibenzyl."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    איור 2
    איור 2: תרשים של מיקום הדגימה במיקרוסקופ. כימיקל, לב שקוף כימית (4) היה ממוקם על בעל המדגם (2 ו - 5) וייצבה בעזרת בלוקים agarose פינה (6). מבנה זה היה שקוע אז בקובט זכוכית מלא DBE (3). לרכישה, עדשה אובייקטיבית 0.5 NA (1) עם מרחק עבודה של 5.5 מ"מ הועסק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3: נציג 3D Renderings של שלם אומיקרוסקופי אור. עכברים CD11c.DTR טופלו intratracheally עם DTX (בשורה העליונה) או PBS (בשורה התחתונה). 4 ימים מאוחר יותר, התפתחות של שריר הלב, המיוצגת על ידי חדירת CD45 + ליקוציט, דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליון. כדי להכתים את התאים CD45 + , נוגדן אנטי CD45 מצמידים ל AF647 הוזרק iv 2 שעות לפני להקריב את העכברים. האות autofluorescence של רקמת חיבור מוצג אפור, ואילו לחדור CD45 + מוצג בצבעים heatmap (כחול: אות נמוך, לבן: אות גבוה). כל שורה מורכבת מ 4 דיגיטליות מקוטע 3D renderings, המדגים את המצב בתוך האורגן. עומק החיתוך ביחס לחלק הקדמי של הלב מוכרז מעל הדימויים האישיים. הדמות שונתה ממאן ואחרים. 15 . סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. בבקשה לחץ כאןכדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    במדעי החיים המודרניים, הדמיון המיקרוסקופי של תהליכים ביולוגיים ממלא תפקיד חשוב יותר ויותר. בהקשר זה, התפתחויות רבות הושגו במהלך שתי המאות האחרונות המסייעות לענות על שאלות שאינן ניתנות להתייחסות עד לנקודה זו. ראשית, יש נטייה ברורה להגדיל באופן משמעותי את יכולת ההחלטה של ​​מיקרוסקופים אור. עם מיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM) 21 , 22 , מגרה דלדול פליטת (STED) מיקרוסקופיה 23 , ו-הפעלה מיקרוסקופית לוקליזציה התמונה (PALM) 24 , 25 או סטוכסטיים שחזור מיקרוסקופ אופטי (STORM) 26 , כדי עקיפה אור 27 שבור באופן משמעותי. האתגר השני המכוון לעתים קרובות היה להתבונן בהתנהגות הסלולר בסביבה הדומהאת המצב הטבעי ככל האפשר. בהקשר זה, פיתוח של גישות הדמיה in situ או in vivo נאלצו. כדי להתגבר על עומק החדירה לאור מוגבל ברקמות ביולוגיות מורכבות, 2-פוטון מיקרוסקופיה 28 , 29 יש לקבוע סטנדרטים חדשים בתחום המחקר הזה.

    עם זאת, תכונה כי כל אלה טכניקות מיקרוסקופיה בדרך כלל לשתף את השימוש היעדים גבוהים NA כדי להבטיח את הפתרון הטוב ביותר האפשרי. למרות שהיא עושה לפתור microstructures בפירוט רב יותר, השימוש היעדים גבוהה NA מעמיד באופן משמעותי את שדה הראייה, כמו גם את המרחק עבודה. כתוצאה מכך, ההקשר הביולוגי במונחים של הסביבה הסובבת אותו מתבלט לעתים קרובות במובן האמיתי ביותר של המילה. כדי לסגור את הפער, פיתוח LSFM זכה לאחרונה עניין, מתן טכניקה מיקרוסקופית כי הוא מסוגל לפתור מבנים ניאון בגודל סלולריאלא גם כדי להעריך בנוחות את כל המידע 3D של דגימה עם גודל של יותר מ 1 ס"מ.

    הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטה של ​​איך להעסיק ultramicroscope לדמיין לחדור ליקוציט הסלולר בלב שלם Murine. לאחר ההשראה המוצלחת של מיוקרדיטיס סטרילית במודל עכבר CD11c.DTR 30 , החיה בהתאמה מקבל הזרקת iv של נוגדן anti-CD45 fluorochrome מצמידים, אשר מסתובב במשך 2 שעות של חיה חיה. באופן עקרוני, על ידי ביצוע שלאחר המוות, את כל נוגדן הר נוגדן בין קיבוע איברים התייבשות המדגם צריך להיות אפשרי. למרבה הצער, שלם הר מכתים דרישות הרבה יותר דגירה צעדים ולכן מסיבית מגדילה את הזמן הדרוש עבור הדור המדגם ( כלומר, על ידי 4-21 ימים) 6 , 31 . יתר על כן, גישה זו intravital מכתים הוא לא רק מהר יותר, אלא גם מספקחדירה יעילה יותר של רקמות הנוגדן לעומת פרוטוקול מכתים הר שלם 9 . למרות היעילות המוחלטת מכתים לא לכמת, צפוי כי חלק גדול של האוכלוסייה לויקוציטים מתויג, בהתחשב בכך האות הקרינה וכתוצאה מכך חזק להפליא. שני חלבונים ניאון ותווית נוגדן עצמו בעיקר לשרוד את תהליך ניקוי הבא, ושניהם נראים יציבים במשך תקופה ארוכה של זמן. כמו כן יש לציין כי סוכן מבוסס ממס מבוסס על ניקוי רקמות. זה מאסיבית מעכב שלם הר מכתים גישה בעקבות תהליך ניקוי. מסנן הרקמה מבוסס ממס הוא תופעה הפיך, ולכן העברת הרקמה מנקה לתוך מדיום מבוסס מים (כגון PBS), אשר משמש בדרך כלל מכתים נוגדנים סטנדרטיים, יביא מדגם לא שקוף. לכן, פרוטוקולים מכתים שאינם סטנדרטיים ב ממיסים אורגניים יצטרכו להיות i Fa שלם הר הליך מכתים יש צורך לאחר ניקוי המדגם.

    הזרימה הלב הבא הוא הכרחי לחלוטין כדי לחסל דם שיורית ככל האפשר, שכן הדם הוא מסומנת כהלכה בשלבים הבאים באופן דרמטי מחמיר את תוצאות ההדמיה. לאחר הוצאת הלב, מים רקמות מוסר בשורה אתנול עולה. צעד זה יכול להיחשב החלק הראשון של ניקוי כימי. הרעיון הוא להחליף את רקמת המים עם בינוני טבילה המתאימה יותר למדד השבירה מתכוון (RI) של הדגימה של בחירה. DBE נבחר כמדיום טבילה בעקבות הפרוטוקול של Ertuk et al. 32 , עם כמה שינויים. DBE יש מדד השבירה של 1.55 (nD20), וכאשר הושווה לסוכני ניקוי אחרים, כגון אלכוהול בנזיל: בנזיל בנזואט (BABB, RI (nD20) = 1.56) 6 , 7 או סוכרוז (RI (nD20) = 1.44 )F 13>, הוא השתמר בצורה הטובה ביותר תוויות ניאון בשימוש בפרוטוקול זה.שימור פלואורסצנטי דומה נוצרה באמצעות אתיל קינמט (ECI). תיארנו את השימוש שלה במחקר על כימות אוטומטי של glomeruli ב nephretic כליות 9. השריר רקמות, פעם שנאמד יש מקדם השבירה של 1.382 ± 0.004 33 , היה גם ניקה היטב עם כל החומרים שאנחנו העריכו 9. לכן, הגורם המכריע לבחירה של DBE היה שימור הקרינה ולא פוטנציאל ניקוי. שינוי בפרוטוקול סליקה פסיבי זה, שימוש בשיטה אקטיבית כמו CLARITY 34 , 35 , כאשר הסרת שומנים בסיוע זרם חשמלי מייצרת רקמות משוכלות, צריכה להיות אפשרית, אך בניגוד למים אלו - שיטת ניקוי הסליקה, ניקוי ה - DBE גורם לקשיים משמעותייםשל הרקמה, מלווה עם הצטמקות קלה. זה מאפשר טיפול קל של דגימות ואינו דורש התאמות נוספות עבור הדמיה, כגון הטבעת המדגם בלוק agarose. לכן, העברת פרוטוקול זה לשיטה כמו CLARITY יהיה מאתגר, אבל אנשים הוכיחו בהצלחה את השימוש ultramicroscope נבחר (ראה טבלה של חומרים) עם גישה זו 3 . חשוב להעריך בזהירות את פוטנציאל הרס של אותות הקרינה האנדוגני על ידי שיטת ניקוי של בחירה. מאחר שמעולם לא עבדנו עם CLARITY או עם פרוטוקולים אחרים לניקוי פעיל, לא נוכל להגיב על תגובת הפלואורוכרום במערכות אלו. המקרה הגרוע ביותר יהיה כי מכתים נוגדן כולו לאחר הר חייב להיות מבוצע.

    שיטה זו ניתן להתאמה בקלות לאיברים אחרים, כגון ריאות Murine; כליות; מוֹחַ; ואפילו עצמות, כגון עצם הירך, השוקה, או calvaria. בעוד הערכה Ng פוטנציאל היישום על אזורי רקמות חדשות ו / או אסטרטגיות תיוג חדש ניאון, האתגר הגדול ביותר בדרך כלל היא לעצב את הפרוטוקול באופן הקרינה נשמרת בחיים. חומרי הטבילה מבוססי הממס 13 וסוכני התייבשות 36 יש להם השפעה ישירה על שלמות הפלואורוכרומים. השימוש של נגזרות AlexaFluor מומלץ, כפי שהם נראים יציב למדי בפרוטוקולים שונים. עם זאת, לעתים קרובות מאוד, fluorochromes אחרים חייבים להיות מועסקים. במקרה זה, זה בהחלט שווה להעריך את השימוש של חומרי ניקוי אחרים ( למשל, קנה מידה 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , בהירות 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , מתיל סליצילט 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6, ו- ECI 9 ) וחלופות התייבשות אחרות ( למשל, מתנול וטטרהידרופורן 13 ).

    כמו גישות LSFM רבים אחרים, תהליך של מיקום הלב שקוף תחת המיקרוסקופ הוא תובעני. מערכות מסחריות מספקות מקום מספיק להתקנת דגימות בגודל של איברים עכברים, כולל אונות הריאות, הכליות או הלבבות. עם זאת, כרגע, לא מחזיקי מדגם סטנדרטיים עבור דגימות אלה זמינים. לכן, היינו צריכים להקים מתקן הרכבה באמצעות בלוקים agarose מנוקה מחדש. עם זאת, מספר מסוים של ערכות נתוני תמונה היה צריך להיות מושלך בשל חפצים תנועה. בעיה זו גדלה גם בשל זמן הרכישה הארוך של המיקרוסקופ המשמש כאן. פוטנציאל, הדור של ערכות נתונים ענק יהיה רווח משמעותי ממערכות מהירות יותר, אבל לא היתה לנו הזדמנות להשתמש במיקרוסקופ מהיר יותר עדיין. המיקרוסקופ שלנו (ראה טבלהF חומרים) נבנה סביב מיקרוסקופ זום הגוף היה מצויד מודול לייזר, מצלמת sCMOS עם גודל פיקסל של 6.5 x 6.5 מ"מ 2 , ואופטיקה זיהוי עם טווח הגדלה אופטי בין 1.26X ל 12.6X. החלק המרכזי של אופטיקת זיהוי היה עדשה אובייקטיבית 0.5 NA עם מרחק עבודה של 5.5 מ"מ, אשר אפשרה תצפית של שדה גדול של נוף בין 1.7 ו 17.6 מ"מ באלכסון. זה היה גדול מספיק כדי לבצע את חתך אופטי של לב שלם Murine. תיקון של סטייה כרומטית, בין 400 ל 800 ננומטר, הושגה על ידי התאמה מכנית של המטרה. במידת הצורך, תיקונים כרומטיים בוצעו עוד יותר במהלך עיבוד לאחר בסיוע מחשב. אפריקציה כדורית, גם דגימות עבות, לא נצפו במערכת זו ולכן לא היה צורך לתקן.

    בסך הכל, אנו מציגים כאן פרוטוקול איתן עבור כימי ניקוי וניתוח של L מרחביהפצה eukocyte בתוך לבבות Murine באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון. בשלב זה, חשוב להדגיש כי הליך LSFM זה בקושי מסוגל לפתור מבנים רקמות דק כגון נימי דם. במובן זה, LSFM זה מתאים היטב לאפיין את התפלגות התא החיסונית הכללית ולתאר צבירת תאים חיסוניים פוטנציאליים בתוך האורגן. עם זאת, יש לזכור כי LSFM באופן כללי היא לא הבחירה המושלמת לניתוח וכימות לוקליזציה הסלולר בתת קטן איברים מבנים, כגון כלי הדם. כדי לענות על שאלות כאלה, LSFM צריך להיות משלים עם שיטות אחרות, כגון היסטולוגיה או 2-פוטון מיקרוסקופ. מגבלות נוספות של פרוטוקול זה כוללים את ההגבלה למקסימום של 3-4 צבעים - הערוץ הכחול קשה לשימוש עבור אותות אחרים מלבד autofluorescence - ההגבלה לדגימות קבוע, ואת גודל המדגם המרבי של 30 מ"מ x 30 מ"מ x 15 מ"מ. כמו כן, ריח חזק ורעילות חריפה של DBE צריך לקחתN בחשבון. אם הנקודה האחרונה היא בעייתית, אתיל קינמט יכול לשמש כסילוק חלופי 9 . היתרון העיקרי של בחירת טכניקת מיקרוסקופיה זו היא היכולת לנתח את האורגן כולו בבת אחת. בניתוחים קונבנציונאליים של מקטעי רקמות היסטולוגיות hematoxylin ו- eosin, פורמלין-קבוע, ו- paraffin-embedded (FFPE), קיימת סבירות גבוהה לחסר אזורים מרחביים חשובים, אלא אם כן כל חלק בודד מנותח. יתר על כן, מיקרוסקופ אור גיליון לא רק מאפשר חיתוך וירטואלי של המדגם בכל מטוס תלת מימדי, אבל זה גם מציע פוטנציאל זה מבלי להרוס את הדגימה או גרימת חפצים חיתוך. אם יש צורך, איבר קבוע יכול להיות מעובד עבור ניתוחים נוספים, כגון אור קורלטיבי וגישות אלקטרונים מיקרוסקופ כדי לפתור מאוד אזורים מסוימים של עניין. תבנית של מחקר כזה ניתן למצוא בעבודתם של Karreman et al. , שבו ההימור מתאםWeen 2-photon תמונה מיקרוסקופית מחסנית ונתונים מיקרוסקופיים תלת מימדי אלקטרונים הוצג בהצלחה 41 . גישה מבטיחה נוספת יכולה להיות שילוב של פרוטוקול זה עם שיטה שפורסמה לאחרונה uDISCO כי הוא גם מבוסס על ממס אורגני וזה יאפשר חקירה של איברים גדולים יותר על ידי תקן LSFM 42 .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    למחברים אין מה לחשוף.

    Acknowledgments

    המחקר במעבדה Gunzer נתמך על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (מס '0315590 AD) ועל ידי קרן המחקר הגרמנית (מענק מס' GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). אנו מודים עוד IMCES עבור תמיכה טכנית Sebastian Kubat לעזרה עם מודלים 3D Cartoon.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    diphtheria toxin Sigma Aldrich D0564
    phosphate buffered saline Biochrom L182-10
    ketamine [50 mg/mL] Inresa PZN 4089014
    xylazine [2 %] Ceva
    syringe Braun REF 9161502 Braun Omincan F 
    indwelt venous catheter  Becton Dickinson REF 381923 BD Insyte Autoguard
    small animal respirator Harvard Apparatus 73-0044 MiniVent
    anit-CD45 antibody (AF647) BioLegend 103124
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Carl Roth 8043.2
    catheter (21 G) BD Biosciences REF 387455 BD valu-set
    paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
    PE tube (5 mL) Carl Roth EKY9.1 Rotilabo
    ethanol Carl Roth 9065.4
    dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014
    tube rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 MACSmix
    agarose (low gelling) Sigma Aldrich A4018
    mold (15 x 15 x 5 mm) Tissue Tek 4566 Cryomold 
    light sheet microscope system LaVision Biotec Ultramicroscope 
    microscope body Olympus MVX10 
    objective Olympus 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
    sCMOS camera 5.5MP Andor Technology
    488 nm OPSL (50mW) laser Coherent
    647 nm  diode laser (50mW) Coherent
    3D image processing & analysis software Bitplane IMARIS Ver. 8.3
    transgenic mouse strain Steffen Jung et al. CD11c.DTR
    wt mouse strain Envigo Balb/c Ola Hsd J
    Laser Module LaVision Biotec
    MVPLAPO 2XC Objective Lens

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315, (1), 1-39 (1902).
    2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170, (Pt 3), 229-236 (1993).
    3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2, (3), (2015).
    4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, (2), 023705 (2007).
    5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (5), pdb top78 (2010).
    6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1, (1), 36-42 (2008).
    7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, (4), 331-336 (2007).
    8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223, (1), 7-20 (2012).
    9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. (2016).
    10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
    11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
    12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8, (12), 1047-1049 (2011).
    13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
    14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5, (10), 3311-3325 (2014).
    15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46, (8), 2028-2042 (2016).
    16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, (2), 211-220 (2002).
    17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25, (5-6), 415-425 (1997).
    18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175, (10), 6428-6435 (2005).
    19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22, (5), 561-570 (2005).
    20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
    21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366, (6450), 44-48 (1993).
    22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, (Pt 2), 82-87 (2000).
    23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, (11), 780-782 (1994).
    24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, (5793), 1642-1645 (2006).
    25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, (11), 4258-4272 (2006).
    26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, (10), 793-795 (2006).
    27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, (1), 413-418 (1873).
    28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401, (3), 273-294 (1931).
    29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
    30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. in press (2016).
    31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).
    32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, (11), 1983-1995 (2012).
    33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10, (4), 44014 (2005).
    34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, (7449), 332-337 (2013).
    35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9, (7), 1682-1697 (2014).
    36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10, (5), e0124650 (2015).
    37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, (11), 1481-1488 (2011).
    38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, (3), 726-739 (2014).
    39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
    40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11, (3), 89-94 (2000).
    41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129, (2), 444-456 (2016).
    42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13, (10), 859-867 (2016).
    ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).More

    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter