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Medicine

लाइट शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा फुलमिंटेंट माईकार्डाइटिस के मरीन मॉडल में ल्यूकोसाइट फैलाने का मात्रात्मक विज़ुअलाइज़ेशन

Published: May 31, 2017 doi: 10.3791/55450
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1Department of Translational Skin Cancer Research, University of Duisburg/Essen, 2Institute for Experimental Immunology and Imaging, University of Duisburg/Essen, 3Imaging Center Essen, Electron Microscopy Unit, University Hospital of Essen

Summary

यहां, हम सीड 745 डीयूटीआर चूहों के इंट्रेट्रेचियल डिप्थीरिया विष उपचार द्वारा प्रेरित सीड 45 + ल्यूकोसाइट फैलाने वाले एसिप्टिक फुलमिनेंट मायोकार्डिटिस के मूरीन मॉडल में एक हल्के शीट माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।

Abstract

लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम), रासायनिक समाशोधन प्रोटोकॉल के संयोजन में, बड़े जैविक नमूनों में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए स्वर्ण मानक बन गया है, और सेलुलर संकल्प के नीचे है। इस बीच, अंतर्निहित प्रोटोकॉल का निरंतर शोधन और विशेष व्यावसायिक प्रणालियों की बढ़ी हुई उपलब्धता हमें पूरे माउस अंगों के माइक्रोस्ट्रक्चर की जांच करने और विभिन्न लाइव-सेल इमेजिंग दृष्टिकोणों में सेलुलर व्यवहार के लक्षण वर्णन की अनुमति देने में सक्षम बनाता है। यहाँ, हम सूक्ष्म माउस दिलों में CD45 + leukocyte आबादी के स्थानिक पूरे माउंट दृश्य और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस पद्धति में एक ट्रांसजेनिक माउस तनाव (सीडी 11। डीटीआर) है जो कि हाल ही में घातक घातक मायोकार्डिटिस के विकास के अध्ययन के लिए एक मजबूत, अप्रभावी मॉडल के रूप में काम करने के लिए दिखाया गया है, जो घातक हृदय अतालता द्वारा विशेषता है। इस प्रोटोकॉल में मायोकार्टिटिस प्रेरण शामिल है, अंतर्निहितअल एंटीबॉडी-मध्यस्थता सेल धुंधला हो जाना, अंग तैयारी, और एलएसएफएम के साथ बाद में कंप्यूटर सहायता वाली छवि पोस्ट प्रोसेसिंग। यद्यपि हमारे विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्न के लिए एक उच्च-अनुकूल विधि के रूप में प्रस्तुत किया गया है, प्रोटोकॉल एक आसानी से समायोज्य प्रणाली के खाका का प्रतिनिधित्व करता है जो अन्य अंगों में और यहां तक ​​कि अन्य प्रजातियों में भी पूरी तरह से भिन्न फ्लोरोसेंट संरचनाओं को लक्षित कर सकता है।

Introduction

प्रकाश माइक्रोस्कोपी के विकास के दौरान, कई विशेष रूपों प्रकट हुए, उनमें से सभी विशेष नमूनों के लिए विज़ुअलाइज़ेशन प्रक्रिया में सीमाओं को कम करने के लिए विकसित हुए। ऐसा ही एक तरीका प्रकाश-पत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) है। पहले 1 9 03 में एसडेंटेफ़फ और जेसिगंडी द्वारा विकसित किया गया था और 1 99 0 के प्रारंभ में अपनी पहली मौलिक जैविक अनुप्रयोगों का पता लगाया गया, एलएसएफएम बड़े नमूनों के दृश्य के लिए सबसे शक्तिशाली सूक्ष्म उपकरण बन गया है, जैसे कि अखंड माउस अंग, प्रतिदीप्ति संकेत संकल्प के साथ सेलुलर स्तर तक नीचे इन लाभों के कारण, लाइव-सेल इमेजिंग के लिए अपनी क्षमता के साथ, LSFM नामक प्रकृति विधि "वर्ष 2014 की विधि" 3 ।

जैसा कि नाम से पता चलता है, एक एलएसएफएम में नमूना रोशनी हल्की चादरों द्वारा आयोजित की जाती है, जिसका उपयोग उद्देश्य के अक्ष के लिए लंबवत रूप से केंद्रित होता है।या उत्सर्जन-प्रकाश संग्रह और बाद की छवि संरचना। प्रकाश शीट आम तौर पर एक बेलनाकार लेंस के साथ या संकीर्ण, फ़ोकस वाले लेजर बीम के तेज तरफ आंदोलन द्वारा, एक क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर विमान 4 , 5 में व्यापक, संगोषित लेजर बीम पर ध्यान केंद्रित करके उत्पन्न होता है। इस तरह, इमेजिंग प्रकाशिकी का केवल फोकल प्लेन प्रकाशित होता है, आमतौर पर 1-4 माइक्रोन की मोटाई के साथ। नतीजतन, रोशनी वाले विमान में रखा फ्लोरोसेंट नमूना के लिए, बिखरे हुए प्रकाश की पीढ़ी और फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे के क्षेत्रों से फोटोबलीचिंग के प्रभाव को समाप्त कर दिया गया या 6 , 7 को बहुत दबा दिया गया। चूंकि सभी फ़ोकस वाले विमानों को प्रकाशित नहीं किया जाता है, इन क्षेत्रों में फोटोबलीचिंग प्रभाव छोड़े जाते हैं। मानक confocal या बहु-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के विपरीत, प्रबुद्ध और उत्सर्जित प्रकाश के पथ एक दूसरे से अलग होते हैं, इसलिए अंतिम छवि यह उद्देश्य के माध्यम से उत्तेजना प्रकाश किरण के सही ध्यान केंद्रित पर निर्भर नहीं करता है। अंतर्निहित प्रश्न के आधार पर, इसलिए एक विशाल क्षेत्र के दृश्य (एफओवी) के साथ उद्देश्यों का उपयोग करना संभव है ताकि प्रबुद्ध विमान का सबसे बड़ा संभावित क्षेत्र किसी भी घटक भागों के बिना चित्रित किया जा सकता है जो एक्सआई-दिशा में चलते हैं।

आधुनिक एलएसएफएम प्रणालियों में, उत्पन्न ऑप्टिकल अनुभाग की एक फ्लोरोसेंट छवि को एक अति संवेदनशील चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) या पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक (सीएमओएस) कैमरों पर कब्जा कर लिया जाता है, जो संपूर्ण क्षेत्र दृश्य (एफओवी) हासिल करने में सक्षम होते हैं। माइक्रोसॉन्ड्स में इसलिए, नमूना को प्रकाश शीट के माध्यम से ले जाकर और परिभाषित z- चरणों में छवियों को प्राप्त करके, उचित समय 8 , 9 में एक नमूने की पूरी 3 डी जानकारी प्राप्त करना संभव है, इस तकनीक को लाइव-सेल पढ़ाई 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12

फिर भी, हालांकि, एलएसएफएम तेजी से, संवेदनशील और प्रतिदीप्ति-अनुकूल तरीके प्रदान करता है, नमूना के माध्यम से प्रकाश संचरण अभी भी एक प्रमुख मुद्दा है, खासकर जब बड़े जैविक नमूने एक 3D विश्लेषण के लिए लक्ष्य हैं हल्के संचरण को अवशोषण के भौतिक पहलुओं और अलग-अलग अपवर्तक सूचकांकों के साथ संरचनाओं के इंटरफेस पर प्रकाश बिखरने से गंभीर रूप से संशोधित किया गया है। इसलिए, जब इमेजिंग नमूने आकार में कई मिलीमीटर, एलएसएफएम को ऑप्टिकली पारदर्शी नमूनों को प्रस्तुत करने के लिए ज्यादातर क्लियरिंग प्रोटोकॉल के साथ मिलाया जाता है। इन तकनीकों को संबंधित जैविक ऊतकों से पानी निकालने और इसे जल या (कार्बनिक) विलायक आधारित विसर्जन मीडिया के साथ आदान प्रदान करने के विचार पर आधारित हैं, जो विशेष लक्ष्य टिशू घटकों के अपवर्तक सूचकांकों से बाल निकालने के लिए चुना जाता है। नतीजतन, पार्श्व प्रकाश बिखरने को कम किया जाता है, और सभी तरंग दैर्ध्यप्रकाश की अधिकतापूर्वक ऊतक 13 से गुजर सकती है कई मामलों में, इस तरह से किए गए जैविक नमूने मैक्रोस्कोपिक रूप से क्रिस्टल-स्पष्ट दिखाई देते हैं, जो एलएसएफएम को लंबे समय तक काम-दूरी, कम बढ़ाई उद्देश्यों का उपयोग करते हुए पूरे माउस अंगों पर भी संचालित करने में सक्षम बनाता है।

यहां, हम एक हल्के शीट माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) में बड़ी-नमूना इमेजिंग के लिए एक तैयारी प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जिसे हमने म्यूकार्डिटिस 15 के मूवीन मॉडल में सेलुलर कार्डियाक की घुसपैठ की जांच करने के लिए स्थापित किया है। CD11c.DTR चूहों सीडी 11 सी प्रमोटर 16 के नियंत्रण में प्राइमेट डिप्थीरिया टोक्सिन रिसेप्टर (डीटीआर) को व्यक्त करते हैं। नतीजतन, इन चूहों में कोशिकाओं, जो सीडी 11 सी को डीटीआर के साथ व्यक्त करते हैं, कोरीनेबैक्टीरियम डिप्थेरिया (डिप्थीरिया विष, डीटीएक्स) के एक्सोटॉक्सिन के प्रति संवेदनशील होते हैं ; डीटीएक्स के साथ इन जानवरों का सिस्टमिक उपचार सभी सीडी 11 सी + सीई की कमी के कारण होता हैlls। सीडी 11 सी एक इंटीग्रिन है और विभिन्न घुलनशील कारकों के लिए एक सेल-स्पेस रिसेप्टर के रूप में सक्रियता और परिपक्वता प्रक्रियाओं में मुख्यतः मोनोसाइटिक वंश 17 की कोशिकाओं में शामिल है। नतीजतन, सीडी 11। डीटीआर माउस मॉडल को कई अलग-अलग इम्युनोलॉजिकल सवालों के संदर्भ में वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज सबसेट्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए तीव्रता से उपयोग किया गया है। समय के साथ, यह सूचित किया गया है कि डीडीएक्स के साथ प्रणालीगत इलाज के लिए CD11c.DTR चूहों प्रतिकूल दुष्प्रभाव पैदा कर सकता है और जोरदार ऊंचा मृत्यु दर 18 , 1 9 प्रदर्शित कर सकता है। हाल ही में, हम इन जानवरों में इंट्रेट्रेचियल डीटीएक्स आवेदन के बाद फायरमिनेंट मायोकार्टिटिस के विकास का वर्णन करते हुए मौत 15 के मूल कारण की पहचान करने में सक्षम थे। विष चुनौती दिल में उत्तेजना संचरण प्रणाली के केंद्रीय भागों सहित, सेलुलर विनाश का कारण था। यह बड़े CD45 के साथ था+ लुकासैट घुसपैठ, अंत में घातक हृदय अतालता के लिए अग्रणी इस मामले में, न केवल ल्यूकोसैट जनसंख्या की उपस्थिति महत्वपूर्ण थी, बल्कि दिल के भीतर इसके स्थानिक वितरण भी था। यह प्रयोगात्मक प्रश्न आधुनिक माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के लिए एक चुनौती है, जिसे हमने एक हल्के शीट माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण से हल किया है जो इंट्राविलेट एंटीबॉडी धुंधला और एक कार्बनिक विलायक-आधारित ऑप्टिकल क्लियरिंग प्रोटोकॉल द्वारा समर्थित है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को यूरोपीय संघ के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और एसेन (एजे 84-02.04.2014.A036 - लैंडेसमैट फर नैटुर, उम्बर्ग और वर्ब्राउचर्सचुट्ज़ नॉर्डरायिन-वेस्टफैलन, एसेन, जर्मनी) में संबंधित स्थानीय प्राधिकरणों द्वारा अनुमोदित किया गया था। जानवरों को विशिष्ट रोग-मुक्त (एसपीएफ़) शर्तों के तहत इस्तेमाल किया जाता था।

1. डिप्थीरिया टोक्सिन (डीटीएक्स) द्वारा मायोकार्डिटिस की प्रेरण

  1. डीओटीएक्स स्टॉक समाधान को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ 1 माइग्रेट / एमएल काम करने वाले समाधान के साथ डीओटीएक्स शेयर समाधान को कम करके डीओटीएक्स समाधान तैयार करें।
  2. इस समाधान के 100 μL को इंट्र्राटेलिली (यह) 8 से 10 सप्ताहीय सीडी 11। डीटीआर चूहों ( सीए 5 एनजी / जी बॉडीवेट (बीडब्ल्यू)) में लागू करें, जैसा कि हसनबर्ग एट अल द्वारा दिखाया गया है । इसके लिए एक कवक बोर निलंबित 20 के आवेदन
    नोट: विष के इंट्राटेरिटोनियल आवेदन के परिणामस्वरूप एक समान प्रेरण हो सकता हैघातक मायोकार्डिटिस हालांकि, इस दृष्टिकोण को पहले मान्य होना पड़ेगा।
    1. इसके लिए आवेदन, जानवरों को 100 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू ज़ीलैलेन के इंट्राटेरिटीनियल (आईपी) इंजेक्शन से अनैतिक बनाना।
    2. गहरी नार्कोसिस (पैर की मुहर चुटकी परीक्षण) तक पहुंचने के बाद, मौखिक गुहा के माध्यम से 22 जी का शिरापरक कैथेटर लगाकर जानवरों का इंट्यूबेट करें। लेस ट्यूब की सही स्थिति को छोटे जानवरों के श्वसन यंत्र के साथ प्रति मिनट 250 साँस की दर से और 250 μL प्रति सांस के एक साँस लेना के साथ जानवरों को हवा देकर, हसनबर्ग एट द्वारा दिखाया गया है । अल। 20
      नोट: जब सही ढंग से स्थित हो, पशु की सांस की दर लागू वेंटिलेशन सेटिंग्स के अनुसार बदल जाएगी।
    3. वेंटिलेशन सिस्टम को डिस्कनेक्ट करें और फेफड़ों में कैथेटर के माध्यम से नियंत्रण के रूप में 100 μL डीटीएक्स समाधान या पीबीएस की एक समान राशि को स्थापित करें और एक अतिरिक्त मिनट के लिए जानवरों को हवाला देते रहें।
  3. जानवरों को संज्ञाहरण से पुनर्प्राप्त करें और सामान्य स्वास्थ्य स्थिति और शरीर के वजन में परिवर्तन 4 दिनों के लिए मॉनिटर करें।
    नोट: आनुवंशिक पृष्ठभूमि, माउस तनाव, या शुरुआती वजन के आधार पर, मस्तिष्कशोथ की गंभीरता और शुरुआत भिन्न हो सकती है और पहले निर्धारित किया जाना चाहिए।

2. लाइट शीट माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार करना

  1. विष दिन के बाद 4 दिन, वाष्पीकृत 2% isoflurane / ऑक्सीजन मिश्रण के साथ एक प्रेरण कक्ष फ्लश द्वारा चूहों anesthetize। रेट्रो-ऑर्बिटल एप्लिकेशन रूट का उपयोग करके 50 μL पीबीएस में इंसुलिनर (iv) में सीधी लेबल एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी (क्लोन 30-एफ 11, एलेक्साफ़्लोरोर 647 (एएफ 647)) के 15 माइक्रोग्राम को इंजेक्ट करें, जो कि बहुत तेजी से और अत्यधिक सटीक एप्लीकेशन को सुनिश्चित करता है सही मात्रा में एंटीबॉडी
    नोट: चूहों लेटा हुआ हैं और पैर की अंगुली चटनी परीक्षण पर प्रतिक्रिया नहीं करते जब narcosis की वांछित गहराई तक पहुंच गया है।
  2. ऊष्मायन के 2 घंटे के बाद, ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों की बलिदान एकडीबीएस के 5 एमएल पीबीएस / ईडीटीए (5 एमएम) के साथ मस्तिष्क को दिलाना चाहिए।
    1. दिल का खुलासा करें और 21 जी कैथेटर का उपयोग करके सही वेंट्रिकल में छिड़काव समाधान को इंजेक्ट करें। धीमे, निरंतर दबाव के साथ पर्फ्यूस करें और सुनिश्चित करें कि महाधमनी को काटने के बाद रक्त को निकाला जा सकता है।
      नोट: इस transcardial छिड़काव के परिणामस्वरूप मामूली तैयारी कलाकृतियों, जो अंग के अंतिम 3 डी दृश्य को परेशान कर सकता है। इसलिए, उन्नत पशु प्रयोगकर्ता पेट की महाधमनी का उदय करते हुए, अवर विना कावा के माध्यम से छिड़काव का प्रदर्शन कर सकते हैं।
  3. रासायनिक निर्धारण के लिए, 5 एमएल के 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) के साथ एक ही अवकाश के माध्यम से हृदय को छिड़कना। कैथेटर को जगह में रखें और बस पीएफए ​​से भरा एक नया सिरिंज संलग्न करें। धीमी और निरंतर दबाव के साथ छिड़कना
    नोट: पॉराफार्मैडाइहाइड्रिस अत्यधिक विषैले; त्वचा, आंखों और अन्य श्लेष्म के साथ संपर्क से बचें
    1. धीरे दाँतेदार संदंश के साथ दिल समझ; पुयह थोड़ा ऊपर की ओर; और आने वाले और आउटगोइंग धमनियों और नसों सहित सभी ऊतक कनेक्शनों को काटते हैं। आगे निर्धारण के लिए 4% पीएफए ​​में एक अतिरिक्त 4 एच के लिए अंग को स्टोर करें।
  4. अंग को निर्जलीकरण करने के लिए, दिल में एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला में 50%, 70%, और दो बार 100%, प्रत्येक 12 घंटे के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं। यहां, ब्लैक 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन प्रतिक्रिया ट्यूबों का उपयोग करें, जिससे उन्हें हवा के बबल गठन को रोकने के लिए धीमी गति से रोटेशन गति से एक ट्यूब रोटेटर में लगातार घुमाएं।
  5. रासायनिक समाशोधन द्वारा पूरा नमूना तैयार करना दिल को पारदर्शी बनाने के लिए, उन्हें रातोंरात लगातार घूमते हुए 98% डीबेंज़िल ईथर (डीबीई) में सेते हैं।
    नोट: डीबीई आंखों, त्वचा और श्वसन तंत्र को परेशान कर रहा है।

3. हल्की शीट माइक्रोस्कोपी

  1. हल्के शीट माइक्रोस्कोप (सामग्री की मेज देखें) का उपयोग करके एलएसएफएम का आचरण करें। माइक्रोस्कोप के मानक नमूना धारक पर नमूना डाइब्रे-भरी सीयू में रखेंVette, जो 30 मिमी x 30 मिमी x 15 मिमी तक नमूने के लिए उपयुक्त है।
  2. निर्जलित और मंजूरीग्रस्त agarose ब्लॉकों का उपयोग करते हुए छवि अधिग्रहण के दौरान नमूना को दृढ़ता से रखें।
    1. Agarose ब्लॉक तैयार करने के लिए, 2% पिघला हुआ agarose एक मोल्ड (15 मिमी x 15 मिमी x 5 मिमी) में डालना Agarose ठंडा जब तक यह solidifies चलो
    2. एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला (50%, 70%, और दो बार 100%) में इसे निर्जलीकरण करें। 98% डीबीई में agarose ब्लॉकों को रातोंरात सेते हैं। जब तक इसका उपयोग नहीं किया जाता तब तक डीबीई में agarose को स्टोर करें।
      नोट: जैसा कि agarose में मुख्य रूप से पानी शामिल है, प्रत्येक निर्जलीकरण चरण के लिए ऊष्मायन समय बढ़ाया जा सकता है, ब्लॉक के आकार के आधार पर।
      नोट: डीबीई आंखों, त्वचा और श्वसन प्रणाली से परेशान है।
    3. जब जरूरत पड़ती है, तैयार तीक्ष्ण ब्लॉक को वांछित आकार में एक तेज स्केलपेल का उपयोग करके कट कर। आमतौर पर, नमूना एडाप्टर के किनारों पर रखने के लिए प्रिज्म या पच्चर के आकार के आकारों को काटते हैं।
      नोट: के रूप में agarose ब्लॉक लोचदार हैं,नमूना जगह में रहता है जब थोड़े बल के साथ धक्का दिया
  3. उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर सेटिंग के साथ ब्याज के प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाएं (यहां, आटोफ्लोरेसेंस और एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी धुंधला हो जाना)।
    1. संयोजी ऊतक से प्राप्त ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत के लिए, 488 एनएम (ओपीएसएल: 50 मेगावाट) की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर 525/50 एनएम बैंडपास फिल्टर का उपयोग करें; 664 एनएम (बैंडपास फिल्टर: 680/30 एनएम) और 647 एनएम (डायोड लेजर: 50 मेगावाट) की एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर एएफ 647-युग्मित एंटीबॉडी के साथ सीडी 45 धुंधला हो गया है।
    2. दो व्यक्तिगत z- विमानों के बीच की दूरी के रूप में 4 सुक्ष्ममापी चुनें

4. छवि पोस्ट प्रसंस्करण

नोट: अधिग्रहित डिजिटल छवि डेटा को एक वैज्ञानिक 3D / 4D छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्रियों की तालिका देखें) के साथ संसाधित किया गया था।

  1. डेटा फ़ाइलों का उद्घाटन और पूर्व-समायोजन
  2. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को शुरू करने के बाद, ऊपरी बाएं कोने में "टॉप" बटन का चयन करें छवि स्टैक खोलने के लिए, "फ़ाइल" चुनें, "खोलें," और पहले अधिग्रहीत चैनल के डेटा वाले फ़ोल्डर का चयन करें। आगे प्राप्त किए गए चैनल जोड़ने के लिए "संपादित करें" और "चैनल जोड़ें" चुनें
    नोट: डेटा आकार और कंप्यूटर सिस्टम के आधार पर, यह प्रक्रिया कई मिनट ले सकती है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल 2 अधिग्रहण चैनलों (autofluorescence और AF647) के सभी चरणों को दर्शाता है
  3. "संपादित करें" पर क्लिक करके और "छवि गुणों" का चयन करके एक्स, वाई और ज़्ज़ेल आयाम को सही करें। जब नई विंडो खुलती है, पैरामीटर समायोजित करें।
    नोट: यह कदम नियोजित माइक्रोस्कोप प्रणाली और विशेष डेटा प्रारूप पर निर्भर करता है। सही xyz मान बाद के आकार और दूर के माप के लिए महत्वपूर्ण हैं। ज्यादातर मामलों में, इन मापदंडों को माइक्रोग्राफ फ़ाइलों में मेटा डेटा के रूप में संग्रहित किया जाता है। हालांकि, यदि फ़ाइल के लिएविश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा rmat को सही ढंग से व्याख्या नहीं किया जा सकता है, मैन्युअल रूप से पिक्सल आकार दर्ज करना महत्वपूर्ण है एक्स और वाई आयामों में पिक्सेल आकार कैमरे के पिक्सेल आकार, संभावित रूप से लगायी गई बिनिंग, और लेंस और उद्देश्य बढ़ाई पर निर्भर करता है। Z में पिक्सेल आकार स्वयं-परिभाषित z- चरण आकार ( जैसे, 4 माइक्रोन) के बराबर है।
  • चैनल समायोजन
    1. पहले "प्रदर्शन समायोजन" ("संपादन" और "प्रदर्शन समायोजन दिखाएं") खोलकर ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत को स्केल करने के लिए परिवर्तित करें एक नई विंडो उन सभी के लिए सभी खोले चैनलों और प्रदर्शन सेटिंग्स सूचीबद्ध करेगी; अपने डिफ़ॉल्ट रंग को बदलने के लिए, autofluorescence चैनल चुनें और "सफेद" डिस्प्ले शैली चुनें आवेदन करने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें
    2. काले स्तर समायोजन के लिए, "प्रदर्शन समायोजन" पर वापस जाएं और अवांछित पृष्ठभूमि संकेतों को छोड़ने के लिए काला स्तर मान समायोजित करें जो नमूना संरचना का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैंरों।
      1. ऐसा करने के लिए, चैनल पट्टी पर ऊपरी-बायां त्रिकोण का उपयोग करें और बाएं से दाएं को खींचें
        नोट: परिवर्तन तुरंत दृश्यमान होंगे न केवल नमूने से निकलने वाले संकेतों को दबाना सुनिश्चित करें। पृष्ठभूमि में न्यूनतम मान पिच-ब्लैक पिक्सल से बचने के लिए "0" नहीं होना चाहिए, क्योंकि अतिरिक्त गणना के लिए शोर संकेतों की आवश्यकता हो सकती है सुनिश्चित करें कि छवि अधिग्रहण के बाद सभी काला स्तर परिवर्तन किए जाते हैं। अन्यथा, मूल्यवान नमूना जानकारी खो सकती है काले-स्तर समायोजन केवल प्रतिनिधि उद्देश्यों में कार्य करता है। विभिन्न नमूनों में एक ही डिस्प्ले सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए, सटीक मानों को चैनल सूची के नीचे "न्यूनतम" संख्यात्मक फ़ील्ड में डाला जा सकता है। यह मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी है
    3. तीव्रता समायोजन करने के लिए, संबंधित चैनल की तीव्रता को समायोजित करने के लिए ऊपरी दाहिने त्रिकोण का उपयोग करके या चैन के नीचे "अधिकतम" संख्यात्मक क्षेत्र में सटीक मान डालकरएल सूची
    4. गामा मान को बढ़ाने या घटाना या सटीक मूल्यों को दर्ज करके चैनल पट्टी के मध्य में निचले त्रिकोण को खींचकर इसके विपरीत समायोजन करें।
    5. Autofluorescence चैनल के अनुसार AF647 चैनल को समायोजित करें एक फर्क के रूप में, एएएफ 647 सिग्नल का दृश्य गर्मी-नक्शा रंग लुक-अप तालिका में सेट करें। चरण 4.1.1 में उस तरह के दृष्टिकोण में चैनल मोड "आग" चुनकर यह करें।
      नोट: जैसा कि संपूर्ण संकेत तीव्रता autofluorescence चैनल की तुलना में काफी कम है, काले स्तर आमतौर पर बहुत कम मूल्यों में समायोजित होते हैं। Autofluorescence चैनल के लिए, इस चैनल की चमक आम तौर पर बढ़ जाती है।
    6. ऊतक संरचनाओं को विस्तार से देखने के लिए "मिश्रण मोड" का चयन करें समान पैरामीटर मानों के साथ एक श्रृंखला से सभी नमूनों का विश्लेषण करें।
  • आभासी क्लिपिंग
    1. 3 डी दृश्य एक्सपो से पहले अंग को खोलने के लिए लगभग अक्षर काटने के लिएआरटी, गाया 3D ऑब्जेक्ट पर एक क्लिपिंग प्लेन लागू करें
      1. ऑब्जेक्ट सूची में "क्लिटिंग प्लेन" आइकन (कैंची) पर क्लिक करें। छवि दृश्य के अंदर, एक पीला फ्रेम और एक मेनिप्युलेटर (सफेद स्पिंडल) दिखाई देगा। स्पिन्ंडल को माउस के साथ पतली छोर पर घुमाएं, जिससे कतरन विमान के उन्मुखीकरण को बदलकर, कतरन की वांछित गहराई का चयन करने के लिए स्पिंडल के मोटे मध्य भाग को स्थानांतरित करें।
      2. ऑब्जेक्ट सूची के नीचे संबंधित चेकबॉक्स को अनचेक करके और वांछित स्नैपशॉट बनाकर फ़्रेम और मैनिप्युलेटर छुपाएं।

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    Representative Results

    प्रस्तुत एलएसएफएम दृष्टिकोण गंभीर मायोकार्टाइटिस के शामिल होने पर ल्यूकोसाइट वितरण और मूरीन के दिल में मात्रा का विश्लेषण करता है। चित्रा 1 ए माइोकार्डिटिस प्रेरण के लिए ट्रांसजेनिक सीडी 11। डीटीआर चूहों के लिए प्री-उपचार प्रोटोकॉल बताता है। यह कदम मायोकार्डियम को ल्यूकोसाइट्स की भर्ती के लिए आवश्यक ट्रिगर का प्रतिनिधित्व करता है। सफल डीटीएक्स आवेदन के बाद, जानवरों को गंभीर बीमारी के लक्षण, जैसे सामान्य कमजोरी, आहार और वजन घटाने, 2-4 दिनों की सीमा के भीतर विकसित होते हैं 4 दिनों के बाद, ल्यूकोसाइट्स iv द्वारा दाग रहे हैं ट्रांसक्रैडीयल छिड़काव से पहले फ्लोरोक्रोम-युग्मित एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी के आवेदन से रक्त को रक्त परिसंचरण से निकाला जा सकता है। यदि सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया जाता है, तो हृदय और अन्य अंग सफेद रंग के होते हैं। इसके बाद, अंग excised किया गया है, और ऊतक पानी एक आरोही इथेनॉल पंक्ति और डीबीई में एक अंतिम ऊष्मायन द्वारा डीबीई के साथ विमर्श किया है। चित्रा 1 बी समय सारिणी दिखाता हैव्यक्तिगत ऊष्मायन के चरणों में जो अंग महत्वपूर्ण संकोचन से गुजरता है रासायनिक संरेखित अंग को मानक माइक्रोस्कोप ऊतक धारक पर डीबीई से भरे इमेजिंग कक्ष में स्थानांतरित किया जाता है। 3D छवि अधिग्रहण के दौरान अंग स्थिर करने के लिए, इसे पारदर्शी agarose ब्लॉकों द्वारा तय किया गया है। नमूना की विस्तृत स्थिति को चित्रा 2 में देखा गया है । एक संपूर्ण छवि स्टैक का अधिग्रहण, 2 चैनलों (आटोफ्लोरेसेंस और एंटी-सीडी 45) से बना, लगभग 20-30 मिनट लेता है और लगभग 16 जीबी की डेटा फ़ाइल बनाता है। अंत में, परिणामी डेटा का विश्लेषण कृत्रिम 3 डी रेंडरिंग के रूप में किया जाता है जिसमें ल्यूकोसाइट वितरण एक हीटमैप दृश्य में प्रदर्शित होता है। चित्रा 3 (ऊपरी पंक्ति) में, डीटीएक्स के इलाज वाले जानवरों के दिल के जोरदार सूजन वाले क्षेत्रों को उनके लाल / सफेद रूप से देखा जा सकता है। 3 डी मॉडल का एक और विस्तृत अध्ययन, विशेष रूप से हृदय प्रवाहकत्त्व प्रणाली के क्षेत्रों में लुओकोसाइट की एकाग्रता का पता चलता है, जैसे कि एरिकओवर समृद्ध बंडल और पुर्किंजिया फाइबर इसके विपरीत, पीबीएस-इलाज वाले जानवरों के दिमाग में ये सूजन पैटर्न बिल्कुल नहीं दिखता है (निचला पंक्ति)।

    आकृति 1
    चित्रा 1: आदान प्रदान की योजना और डिप्थीरिया विष-प्रेरित माईकार्डिटिस का नमूना तैयार करना ( ए ) मायोकार्डिटिस के विकास को इसके द्वारा प्रेरित किया गया था । डिप्थीरिया विष के आवेदन (100 एनजी / पशु) 4 दिनों के बाद, मायोकार्डिटिस पूरी तरह से विकसित हो गया था और एएफ 647-युग्मित एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी (15 माइक्रोग्राम / पशु) को इंजेक्शन किया गया था iv । सीडी 45 + ल्यूकोसाइट्स का पता लगाने के लिए जानवरों को 2 घंटे बाद ग्रीवा अव्यवस्था के बाद बलिदान किया गया, और दिल पीबीएस / ईडीटीए (5 एमएम) के साथ परिचित थे, इसके बाद 4% पीएफए ( बी ) हटाने के बाद, अंग एक आरोही इथेनॉल श्रृंखला के साथ निर्जलित था और अंत में रातोंरात ऊष्मायन द्वारा डीबेंज़िल ईथर में साफ हो गया।.com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    चित्रा 2: माइक्रोस्कोप में नमूना स्थिति की योजना। रासायनिक संरेखित, पारदर्शी दिल (4) नमूना धारक (2 और 5) पर तैनात था और साफ एग्रोसोज ब्लॉक (6) की मदद से स्थिर था। यह निर्माण तब डीबीई से भरे गिलास क्युवेट (3) में जलमग्न था। अधिग्रहण के लिए, 0.5 एनए का उद्देश्य लेंस (1) 5.5 मिलीमीटर की दूरी के साथ कार्यरत था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    चित्र तीन
    चित्रा 3: पूर्ण-या के प्रतिनिधि 3 डी प्रस्तुत करनागैन लाइट शीट माइक्रोस्कोपी सीडी 11। डीटीआर चूहों को डीटीएक्स (ऊपरी पंक्ति) या पीबीएस (निचली पंक्ति) के साथ इंट्र्रेट्राचेली से इलाज किया गया था। 4 दिन बाद, सीआईडी ​​45 + ल्यूकोसैट घुसपैठ के द्वारा पेश किया गया माइोकार्डिटिस का विकास, प्रतिदीप्ति प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया था। सीडी 45 + कोशिकाओं को दागने के लिए, एएफ 647 के साथ मिलकर एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी को चूहों का त्याग करने से पहले iv 2 घंटे इंजेक्ट किया गया था। संयोजी ऊतक के autofluorescence संकेत भूरे रंग में प्रदर्शित होता है, जबकि सीडी 45 + घुसपैठ हीटमैप रंगों में दिखाया गया है (नीला: कम संकेत, सफेद: उच्च संकेत)। प्रत्येक पंक्ति अंग के अंदर की स्थिति का प्रदर्शन करते हुए 4 डिजिटली रूप से 3 डी रेडिंगिंग का बना हुआ है। हृदय के सामने वाले हिस्से के मुकाबले क्लिपिंग की गहराई अलग-अलग छवियों के ऊपर घोषित की जाती है। यह आंकड़ा मान एट अल से संशोधित किया गया है 15 स्केल बार = 1 मिमी आप यहाँ क्लिक करेंइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए

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    Discussion

    आधुनिक जीवन विज्ञान में, जैविक प्रक्रियाओं की सूक्ष्म दृश्यता एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इस संदर्भ में, पिछले दो शताब्दियों के दौरान कई घटनाएं प्राप्त हुई हैं, जो इस बिंदु तक संबोधित नहीं किए गए सवालों के जवाब देने में सहायता करती हैं। सबसे पहले, प्रकाश सूक्ष्मदर्शी की संकल्प क्षमता में मौलिक रूप से वृद्धि करने की स्पष्ट प्रवृत्ति रही है। संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) 21 , 22 के साथ , उत्तेजित उत्सर्जन-क्षीणन (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी 23 , और फोटो सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) 24 , 25 या स्टेचैस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टोर्म) 26 , एक बार समयबद्ध संकल्प सीमा के कारण प्रकाश विवर्तन 27 महत्वपूर्ण रूप से टूट गया था दूसरा अक्सर-लक्षित चुनौती एक जैसी वातावरण में सेलुलर व्यवहार का पालन करना थाप्राकृतिक स्थिति यथासंभव संभव है। इस संदर्भ में, स्वस्थानी या विवो इमेजिंग के तरीकों का विकास मजबूर हो गया था। जटिल जैविक ऊतकों में सीमित प्रकाश पैठ की गहराई को दूर करने के लिए, 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी 28 , 2 9 ने इस शोध के क्षेत्र में नए मानकों को स्थापित किया है।

    हालांकि, एक विशेषता यह है कि इन सभी सूक्ष्मदर्शी तकनीकों को आम तौर पर साझा किया जाता है, उच्चतम संभावित संकल्प की गारंटी के लिए उच्च-एनए उद्देश्यों का उपयोग होता है। यद्यपि यह अधिक विस्तार से माइक्रोस्ट्रक्चर को हल करता है, उच्च-एनए उद्देश्यों के उपयोग में दृश्य के क्षेत्र, साथ ही साथ काम दूरी पर प्रतिबंध लगाता है। परिणामस्वरूप, आसपास के परिवेश के संदर्भ में जैविक संदर्भ अक्सर शब्द के सच्चे अर्थों में ध्यान से बाहर हो जाते हैं। इस अंतर को बंद करने के लिए, एलएसएफएम विकास ने हाल ही में दिलचस्पी ली है, एक माइक्रोस्कोपी तकनीक प्रदान करने जो सेलुलर आकार में फ्लोरोसेंट संरचनाओं को हल करने में सक्षम हैबल्कि एक नमूने की संपूर्ण 3D जानकारी का आसानी से आकलन करने के लिए 1 सेमी से अधिक के आकार के साथ

    यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पूरे मूरीन दिलों में एक सेलुलर ल्यूकोसैट घुसपैठ की कल्पना करने के लिए एक अल्ट्रामिस्कोरोस्कोप को कैसे उपयोग करें, की एक विधि प्रस्तुत करता है। CD11c.DTR माउस मॉडल 30 में बाँझ मायोकार्डिटिस के सफल प्रेरण के बाद, संबंधित पशु एक फ्लोरोक्रोम-युग्मित एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी का एक इंजेक्शन प्राप्त करता है, जो जीवित जानवरों में 2 घंटे के लिए फैलता है। सिद्धांत रूप में, एक पोस्टमार्टम प्रदर्शन करके, अंग निर्धारण और नमूना निर्जलीकरण के बीच पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला हो जाना संभव हो सकता है। दुर्भाग्य से, पूरे माउंट धुंधला लंबे समय तक ऊष्मायन कदमों की मांग करता है और इसलिए नमूना उत्पादन के लिए आवश्यक समय बढ़ता है ( यानी, 4-21 दिन तक) 6 , 31 । इसके अलावा, यह इंट्राविटिव स्टीनिंग दृष्टिकोण केवल तेज ही नहीं है, लेकिन यह भी बचाता हैपूरे माउंट स्टैनिंग प्रोटोकॉल 9 की तुलना में एंटीबॉडी के अधिक प्रभावी ऊतक पैठ यद्यपि पूर्ण धुंधला दक्षता मात्रा निर्धारित नहीं की गई है, यह आशा की जाती है कि ल्यूकोसाइट जनसंख्या का एक बड़ा हिस्सा लेबल किया जाता है, यह देखते हुए कि परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति संकेत असाधारण मजबूत है दोनों फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एंटीबॉडी लेबलिंग, बड़े पैमाने पर बाद में समाशोधन प्रक्रिया से बचते हैं, और दोनों लंबे समय के लिए स्थिर प्रतीत होते हैं। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक विलायक आधारित एजेंट ऊतक समाशोधन के लिए उपयोग किया जाता है। यह समाशोधन प्रक्रिया के बाद व्यापक रूप से पूरे माउंट स्टैनिंग दृष्टिकोण को बाधित करता है। विलायक-आधारित ऊतक समाशोधन एक प्रतिवर्ती घटना है, इसलिए जल-आधारित माध्यम (जैसे पीबीएस) में मंजूरी वाले ऊतकों का स्थानांतरण, जो आम तौर पर मानक एंटीबॉडी धुंधला के लिए उपयोग किया जाता है, नॉन-पारदर्शी नमूना बनता है इसलिए, कार्बनिक सॉल्वैंट्स में गैर-मानक धुंधला प्रोटोकॉल को स्थापित करना होगा नमूना समाशोधन के बाद एफए पूरे माउंट स्टैनिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।

    इसके बाद के दिल के छिड़काव के रूप में संभव के रूप में ज्यादा अवशिष्ट खून को खत्म करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि रक्त निम्न चरणों में खराब साफ है और नाटकीय रूप से इमेजिंग परिणाम बिगड़ता है। हृदय के उछाल के बाद ऊतक का पानी एक आरोही इथेनॉल पंक्ति में हटा दिया जाता है। यह कदम रासायनिक समाशोधन के पहले भाग के रूप में माना जा सकता है। यह विचार विसर्जन माध्यम के साथ ऊतक के पानी का स्थान लेने के लिए है, जो पसंद के नमूने के मतलब अपवर्तनांक (आरआई) से मेल खाता है। एर्टुक एट अल के प्रोटोकॉल के बाद डीबीई को विसर्जन माध्यम के रूप में चुना गया था । 32 , कुछ संशोधनों के साथ डीबीई 1.55 (एनडी 20) का एक अपवर्तक सूचक है, और जब अन्य क्लीयरिंग एजेंटों जैसे बेंज़िल अल्कोहल: बेंज़िल बेंजोएट (बीएबीबी; आरआई (एनडी 20) = 1.56) 6 , 7 या सुक्रोज़ (आरआई (एनडी 20) = 1.44 )एफ "> 13, यह सबसे अच्छा इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त फ्लोरोसेंट लेबल्स को संरक्षित करता है। एथिल सिनिमेट (ईसीआई) का उपयोग करके एक समान प्रतिदीप्ति संरक्षण उत्पन्न किया गया था। हमने नेफेटिक किडनी में ग्लोमेरुली के स्वचालित मात्रा का ठहराव पर एक अध्ययन में इसके उपयोग का वर्णन किया है 9. मांसपेशी ऊतक, एक बार 1.382 ± 0.004 33 के एक अपवर्तक सूचक होने का अनुमान है, सभी पदार्थों के साथ समान रूप से अच्छी तरह से साफ किया गया था जो हमने 9 का मूल्यांकन किया था। इसलिए, डीबीई की पसंद के लिए महत्वपूर्ण कारक प्रतिदीप्ति संरक्षण था और क्लियरिंग क्षमता नहीं। इस निष्क्रिय क्लीयरिंग प्रोटोकॉल में परिवर्तन, एक सक्रिय विधि जैसे क्लेरियटी 34 , 35 का उपयोग , जहां इलेक्ट्रोफोरेक्टिक वर्तमान परिणामों की सहायता से लिपिड को हटाने के लिए ऊतकों को मजबूती से साफ किया जाना चाहिए, हालांकि, इस तरह के पानी के विपरीत -समाप्त समाशोधन विधि, एक महत्वपूर्ण सख्त में डीबीई समाशोधन के परिणामऊतक का, मामूली संकोचन के साथ। यह नमूनों की आसान संचालन के लिए अनुमति देता है और इमेजिंग के लिए और अनुकूलन की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि एगरोस ब्लॉक में नमूना को एम्बेड करना। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को क्लारिटी जैसी एक विधि के हस्तांतरण में चुनौतीपूर्ण होगा, लेकिन लोगों ने इस दृष्टिकोण के साथ चुना अल्टरमरिक्रोस्कोप (सामग्रियों की तालिका देखें) का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है पसंद के समाशोधन विधि द्वारा अंतर्जात प्रतिदीप्ति संकेतों के संभावित विनाश का ध्यानपूर्वक मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। जैसा कि हमने स्पष्टता या अन्य सक्रिय-समाशोधन प्रोटोकॉल के साथ काम कभी नहीं किया है, हम इन प्रणालियों में फ्लोरोकोम की प्रतिक्रिया पर टिप्पणी नहीं कर सकते। सबसे खराब स्थिति यह होगी कि बाद में पूरे माउंट एंटीबॉडी धुंधला हो जाना होगा।

    यह विधि अन्य अंगों के लिए आसानी से समायोज्य है, जैसे कि मूरीन फेफड़े; गुर्दे; दिमाग; और यहां तक ​​कि हड्डियों, जैसे कि स्मोरी, टिबिया, या कैल्वरिया मूल्यांकन जबकि नए ऊतक क्षेत्रों और / या नए फ्लोरोसेंट लेबलिंग रणनीतियों पर आवेदन की क्षमता एनजी, सबसे बड़ी चुनौती आम तौर पर प्रोटोकॉल को ऐसे तरीके से डिज़ाइन करना है जो प्रतिदीप्ति जीवित रखा जाता है विलायक आधारित विसर्जन मीडिया 13 और निर्जलीकरण एजेंट 36 का फ्लोरोरेम्रोम की अखंडता पर सीधा प्रभाव पड़ता है। AlexaFluor डेरिवेटिव के उपयोग की सिफारिश की जाती है, क्योंकि वे विभिन्न प्रोटोकॉल में काफी स्थिर प्रतीत होते हैं। हालांकि, बहुत अक्सर, अन्य फ्लोरोरेमों को नियोजित किया जाना चाहिए। इस मामले में, यह निश्चित रूप से अन्य क्लीयरिंग एजेंटों ( जैसे, स्केल 37 , क्यूबिक 38 , सोक्रोस 13 , क्लैरिटी 13 , 34 , पीएसीटी 3 9 , फोकसक्लियर 13 , सीओडीबी 31 , मिथाइल सैलिसिलेट 40 , 3 डीसिस्को 32 , बीएबीबीLass = "xref"> 6, और ECI 9 ) और अन्य निर्जलीकरण विकल्प ( जैसे, मेथनॉल और टेट्राहाइड्रोफुरैन 13 )।

    कई अन्य एलएसएफएम दृष्टिकोण के रूप में, माइक्रोस्कोप के तहत पारदर्शी दिल की स्थिति की प्रक्रिया मांग की जा रही है। वाणिज्यिक प्रणालियां, नमूनों को माउस अंगों के आकार को स्थापित करने के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करती हैं, जिनमें फेफड़े के लॉब, गुर्दे या दिल शामिल हैं। हालांकि, फिलहाल, इन नमूनों के लिए कोई मानकीकृत नमूना धारक उपलब्ध नहीं हैं। इसलिए, हमें साफ और फिर से आकार वाले agarose ब्लॉकों का उपयोग करके एक बढ़ते हुए तंत्र को स्थापित करना था। फिर भी, आंदोलन कलाकृतियों के कारण एक निश्चित संख्या में छवि डेटा सेट को छोड़ दिया जाना था। माइक्रोस्कोप के लंबे अधिग्रहण के समय के कारण यहां इस समस्या का भी बढ़ा हुआ था। संभावित रूप से, बड़ी डेटा सेटों की पीढ़ी तेजी से सिस्टम से लाभकारी होगी, लेकिन हमारे पास अभी तक एक तीव्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का मौका नहीं है। हमारा सूक्ष्मदर्शी (तालिका ओ देखेंएफ सामग्री) एक ज़ूम माइक्रोस्कोप बॉडी के चारों ओर बनाया गया था और एक लेजर मॉड्यूल, 6.5 x 6.5 मिमी 2 के पिक्सेल आकार के साथ एक एससीएमओएस कैमरा और 1.26X से 12.6X तक ऑप्टिकल आवर्धन सीमा के साथ का पता लगाने के ऑप्टिक्स के साथ सुसज्जित था। पता लगाने के प्रकाशिकी का मध्य भाग 5.5 एमएएम की दूरी के साथ एक 0.5 एनए लेंस लेंस था, जिससे 1.7 और 17.6 एमएम के बीच तिरंगे के बड़े क्षेत्र के निरीक्षण के लिए अनुमति दी गई थी। यह पूरे मूरीन दिलों के ऑप्टिकल सेक्शनिंग करने के लिए काफी बड़ा था। रंगीन विपथन का सुधार, 400 और 800 एनएम के बीच, उद्देश्य के यांत्रिक समायोजन द्वारा प्राप्त किया गया था। जहां ज़रूरत होती है, कंप्यूटर-आधारित पोस्ट-प्रोसेसिंग के दौरान रंगीन सुधार भी किए जाते थे। गोलाकार विपथन, मोटे नमूनों में भी, इस प्रणाली में नहीं देखा गया और इसलिए उन्हें सही नहीं किया गया।

    सब कुछ, हम यहां मौजूद स्थानीय एल के रासायनिक समाशोधन और विश्लेषण के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैंप्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मूत्रान दिल के अंदर यूकोसाइट वितरण। इस बिंदु पर, यह ज़रूरी है कि यह एलएसएफएम प्रक्रिया ठीक ऊतक संरचनाओं जैसे कि केशिकाएं हल करने में सक्षम न हो। इस संबंध में, यह एलएसएफएम सामान्य प्रतिरक्षा सेल वितरण को चिह्नित करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और अंग के अंदर संभावित प्रतिरक्षा सेल संचय का वर्णन करता है। हालांकि, एक को ध्यान में रखना चाहिए कि एलएसएफएम सामान्य रूप से लघु-अंग उप-संरचनाओं में सेलुलर स्थानीयकरण का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए सही विकल्प नहीं है, जैसे कि vasculature ऐसे सवालों के जवाब देने के लिए, एलएसएफएम को अन्य विधियों, जैसे ऊतक विज्ञान या 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ पूरक होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल की और सीमाएं अधिकतम 3-4 रंगों के प्रतिबंध को शामिल करती हैं- नीले चैनल को ऑटोफ्लोरेसेंस के अलावा अन्य संकेतों के लिए उपयोग करना कठिन होता है-निश्चित नमूनों के लिए प्रतिबंध, और 30 मिमी x 30 मिमी x 15 का अधिकतम नमूना आकार मिमी। इसके अलावा, डीबीई की मजबूत गंध और तीव्र विषाक्तता लेना चाहिएखाते में एन यदि उत्तरार्द्ध बिंदु समस्याग्रस्त है, तो एथिल सिनामाइट को वैकल्पिक क्लियरिंग एजेंट 9 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस माइक्रोस्कोपी तकनीक को चुनने का मुख्य लाभ एक ही बार में पूरे अंग का विश्लेषण करने की क्षमता है। हेमटैक्साइलिन और ईओसिन-स्टेन्ड, फैमिलीफिनिन-फिक्स्ड, और पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक विज्ञान ऊतक वर्गों के पारंपरिक विश्लेषण में, महत्वपूर्ण स्थानिक क्षेत्रों के गायब होने की संभावना अधिक है, जब तक कि हर एक खंड का विश्लेषण नहीं किया जाता है। इसके अलावा, हल्के शीट माइक्रोस्कोपी न केवल हर त्रि-आयामी विमान में नमूने के आभासी कटौती को सक्षम करता है, लेकिन यह नमूना को नष्ट करने या कलाकृतियों को काटने के बिना भी इस संभावना को प्रदान करता है। यदि आवश्यक हो, तो आगे के विश्लेषण के लिए निश्चित अंग को संसाधित किया जा सकता है, जैसे कि ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों को अत्यधिक हल करने के लिए एक परस्पर संबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण। ऐसे अध्ययन के लिए एक टेम्प्लेट Karreman एट अल के काम में पाया जा सकता है , जहां सहसंबंध शर्तएक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेज स्टैक और तीन आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा को सफलतापूर्वक 41 दिखाया गया था। एक और आशाजनक दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल का संयोजन हाल ही में प्रकाशित यूडीआईएससीओ विधि के साथ हो सकता है जो कि कार्बनिक विलायक पर भी आधारित है और इससे मानक एलएसएफएम 42 द्वारा बहुत अधिक अंगों की जांच करने की अनुमति होगी।

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    Disclosures

    लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    गन्ज़र प्रयोगशाला में रिसर्च जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ़ एजुकेशन एंड रिसर्च (अनुदान नंबर 0315590 एडी) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (अनुदान नंबर GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) द्वारा समर्थित था। हम 3 डी कार्टून मॉडलिंग के साथ तकनीकी सहायता और सेबेस्टियन क्यूबैट के लिए आईएमसीईएस का आभार व्यक्त करते हैं।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    diphtheria toxin Sigma Aldrich D0564
    phosphate buffered saline Biochrom L182-10
    ketamine [50 mg/mL] Inresa PZN 4089014
    xylazine [2 %] Ceva
    syringe Braun REF 9161502 Braun Omincan F 
    indwelt venous catheter  Becton Dickinson REF 381923 BD Insyte Autoguard
    small animal respirator Harvard Apparatus 73-0044 MiniVent
    anit-CD45 antibody (AF647) BioLegend 103124
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Carl Roth 8043.2
    catheter (21 G) BD Biosciences REF 387455 BD valu-set
    paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
    PE tube (5 mL) Carl Roth EKY9.1 Rotilabo
    ethanol Carl Roth 9065.4
    dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014
    tube rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 MACSmix
    agarose (low gelling) Sigma Aldrich A4018
    mold (15 x 15 x 5 mm) Tissue Tek 4566 Cryomold 
    light sheet microscope system LaVision Biotec Ultramicroscope 
    microscope body Olympus MVX10 
    objective Olympus 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
    sCMOS camera 5.5MP Andor Technology
    488 nm OPSL (50mW) laser Coherent
    647 nm  diode laser (50mW) Coherent
    3D image processing & analysis software Bitplane IMARIS Ver. 8.3
    transgenic mouse strain Steffen Jung et al. CD11c.DTR
    wt mouse strain Envigo Balb/c Ola Hsd J
    Laser Module LaVision Biotec
    MVPLAPO 2XC Objective Lens

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Männ, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55450, doi:10.3791/55450 (2017).

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