Summary
여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.
Abstract
빛샘 형광 현미경 (LSFM)은 화학적 제거 프로토콜과 결합하여 대형 생물 표본에서 형광 표식 구조를 분석하기위한 금본위 제가되었으며 세포 분해능에 이릅니다. 한편 기본 프로토콜의 지속적인 정제와 전문화 된 상용 시스템의 가용성 향상을 통해 우리는 전체 마우스 기관의 미세 구조를 조사 할 수 있었고 다양한 라이브 셀 이미징 접근법에서의 세포 행동의 특성을 고려할 수도있었습니다. 여기, 우리는 염증 마우스 마음에서 CD45 + 백혈구 인구의 공간 전체 마운트 시각화 및 부량에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 치명적인 심장 부정맥을 특징으로하는 치명적인 치명적인 심근염 발달 연구를 위해 강하고 유도 가능한 모델로 작용하는 것으로 최근에 알려진 트랜스 제닉 마우스 균주 (CD11c.DTR)를 사용합니다. 이 프로토콜은 심근염 유도, intravit알 항체 매개 염색, 기관 준비 및 후속 컴퓨터 보조 영상 후 처리를 포함한 LSFM을 포함한다. 우리의 특별한 과학적 질문에 대해 고도로 적응 된 방법으로 제시되었지만,이 프로토콜은 다른 기관의 심지어 다른 종의 형광 구조를 완전히 목표로 할 수있는 쉽게 조정 가능한 시스템의 청사진을 나타냅니다.
Introduction
광학 현미경의 진화 과정에서 특정 표본에 대한 시각화 과정의 한계를 최소화하기 위해 개발 된 많은 특수 형태가 나타났습니다. 그러한 방법 중 하나는 Light Sheet 형광 현미경 검사 (LSFM)입니다. 1903 년 Siedentopf와 Zsigmondy 1 에 의해 처음 개발되었으며 1990 년대 초반에 최초의 생물학적 응용을 발견했습니다 2. LSFM은 형광 신호 분해능을 가진 손상되지 않은 마우스 기관과 같은 큰 표본의 시각화를위한 가장 강력한 현미경 도구가되었습니다 세포 수준까지 이러한 이점 때문에 생존 세포 이미징 가능성과 함께 Nature Methods는 LSFM을 "2014 년의 방법"이라고 명명했습니다.
이름에서 알 수 있듯이 LSFM의 샘플 조명은 가벼운 시트에 의해 수행됩니다.이 시트는 사용 된 대상 축에 수직으로 향하게됩니다. f또는 방출 - 광 수집 및 후속 화상 형성을 포함한다. 광 시트는 대개 원통형 렌즈로 광폭의 시준 된 레이저 빔을 초점을 맞추거나 단 하나의 수평 또는 수직 평면 4 , 5 에서 좁고 집중된 레이저 빔의 신속한 옆쪽 이동에 의해 생성됩니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 1 ~ 4㎛의 두께로 이미징 광학 기기의 초점 평면 만 조명됩니다. 결과적으로, 조명면에 배치 된 형광 표본의 경우, 산란광의 생성과 초점면 위 또는 아래 영역에서의 광 표백 효과가 모두 제거되거나 크게 억제됩니다. 초점이 맞지 않은 비행기는 모두 비추 지 않기 때문에이 지역에서는 표백 효과가 생략됩니다. 표준 공 촛점 또는 다중 광자 현미경과 달리 조명과 방출 된 빛의 경로는 서로 분리되어 있으므로 최종 이미지 품질 목표물을 통한 여기 광선의 완벽한 집속에 의존하지 않습니다. 근원적 인 질문에 따라, 조명 된 평면의 가장 큰 가능한 영역이 xy 방향으로 움직이는 구성 요소없이 이미지화 될 수 있도록 방대한 FOV (Field of View)와 함께 대상을 사용할 수 있습니다.
최신 LSFM 시스템에서 생성 된 광학 섹션의 형광 이미지는 매우 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 또는 CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) 카메라에 캡처되어 FOV (전체 시야) 마이크로 초. 따라서 라이트 시트를 통해 샘플을 이동시키고 정의 된 z 단계에서 이미지를 획득함으로써 합리적인 시간 8 , 9 시간 내에 표본의 전체 3D 정보를 얻을 수 있으므로이 기술을 라이브 셀에 적용 할 수 있습니다 연구 10 ,ass = "xref"> 11 , 12 .
그럼에도 불구하고, LSFM이 신속하고, 민감하며, 형광 친화적 인 방법 임에도 불구하고, 표본을 통한 빛 투과는 여전히 중요한 문제이며, 특히 큰 생물학적 샘플이 3D 분석의 타겟 일 때 특히 중요합니다. 빛의 전달은 흡수의 물리적 측면과 굴절률이 다른 구조물의 경계면에서의 광산란으로 결정적으로 변형됩니다 13 . 따라서 샘플을 수 밀리미터 크기로 이미징 할 때 LSFM은 대부분 샘플을 광학적으로 투명하게 만들기 위해 클리어링 프로토콜과 결합됩니다. 이러한 기술은 각각의 생물학적 조직에서 물을 제거하고이를 특정 표적 조직 구성 요소의 굴절률과 협소하게 매치되도록 선택되는 물 또는 유기 용매 기반 침지 매개체와 교환한다는 아이디어를 기반으로합니다. 결과적으로, 측면 광 산란이 최소화되고, 모든 파장의 광은 조직 (13) 을 훨씬 더 효율적으로 통과 할 수있다. 많은 경우, 이와 같이 처리 된 생물학적 표본은 거시적으로 맑아 보입니다. 따라서 긴 작업 거리, 저배율 목표를 사용하여 전체 마우스 기관에서도 LSFM을 수행 할 수 있습니다.
여기, 우리는 심근염의 쥐 모델에서 세포 침투를 조사하기 위해 설립 한 가벼운 시트 현미경 (재료 표 참조)에서 대형 표본 이미징을위한 준비 프로토콜을 제시합니다 15 . CD11c.DTR 마우스는 CD11c 프로모터 16 의 제어하에 영장류 디프테리아 독소 수용체 (DTR)를 발현합니다. 따라서 DTR과 함께 CD11c를 발현하는이 마우스의 세포는 Corynebacterium diphtheria (디프테리아 독소, DTX)의 외독소에 민감하게 반응 합니다. DTX로 이들 동물을 전신 처리하면 모든 CD11c + ce가 고갈됩니다안돼. CD11c는 integrin이며 다양한 다양한 가용성 요소에 대한 세포 표면 수용체로서 주로 단핵구 계통의 세포에서 활성화 및 성숙 과정에 관여합니다 17 . 결과적으로, CD11c.DTR 마우스 모델은 다양한 면역 학적 질문의 맥락에서 수지상 세포 및 대 식세포 서브 세트의 역할을 연구하는데 집중적으로 사용되었습니다. 시간이 지남에 따라 DTX로 전신적으로 치료 된 CD11c.DTR 마우스는 부작용을 일으킬 수 있고 사망률이 급격히 상승 할 수 있다고보고되었습니다 18 , 19 . 최근 우리는 이러한 동물에서 기관 내 DTX 적용 후 극심한 심근염의 발생을 설명하는 근본적인 사망 원인을 규명 할 수 있었다. 독소에 대한 도전은 심장의 자극 전달 시스템의 중앙 부분을 포함하여 세포 파괴를 일으켰습니다. 이것은 거대한 CD45가 동반되었다.+ 백혈구 침윤, 결국 치명적인 심장 부정맥으로 이어진다. 이 경우 백혈구 개체군의 출현이 중요 할뿐 아니라 심장 내부의 공간 분포도 중요했습니다. 이 실험적인 질문은 intravital 항체 염색법과 유기 용제 기반의 광학 제거 프로토콜에 의해 뒷받침되는 light sheet microscopy 접근법으로 해결 한 현대 현미경 영상에 대한 도전 과제입니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 EU 지침에 따라 수행되었으며 Essen의 관련 지방 당국 (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germany)의 승인을 받았습니다. 동물은 SPF (specific pathogen-free) 조건하에 사용 및 보관되었습니다.
1. 디프테리아 톡신 (DTX)에 의한 심근염 유도
- DTX 솔루션을 인산 완충 식염수 (PBS)로 1 μg / mL 작동 솔루션으로 희석하여 심근염 유발을위한 DTX 솔루션을 준비하십시오.
- Hasenberg 등이 표시 한대로 8-10 주 된 CD11c.DTR 마우스 ( 약 5ng / g 체중 (bw))에이 용액 100 μL를 천천히 (it) 투여 하십시오. 그것은 곰팡이 포자 현탁액의 적용 20 .
주 : 독소의 복강 내 적용은치명적인 심근염. 그러나이 접근법은 먼저 검증되어야합니다.- 그것을 적용하기 위해 100 mg / kg bw ketamine과 10 mg / kg bw xylazine의 복강 내 (ip) 주사에 의해 동물을 마취시킨다.
- 깊은 마취 (발가락 핀치 테스트)에 도달 한 후 구강을 통해 22G 내주 정맥 카테터를 사용하여 동물에게 삽관하십시오. 작은 동물 호흡 보호구로 동물을 환기시켜 렌즈 튜브의 올바른 위치를 확인하십시오. 또한 Hasenberg et.가 보여 주듯이 호흡 당 250μL의 흡입량과 250 회의 호흡량으로 호흡 합니다. al. 20 .
참고 : 올바르게 배치하면 적용된 인공 호흡 설정에 따라 동물의 호흡 률이 변경됩니다. - 환기 시스템을 분리하고 DTX 용액 100 μL 또는 카테터를 통해 대조군과 같은 양의 PBS를 폐에 주입하고 추가로 1 분 동안 동물의 통풍을 계속하십시오.
- 마취에서 회복시키고 4 일 동안 일반적인 건강 상태 및 체중 변화를 모니터링하십시오.
참고 : 유전 적 배경, 마우스 변형 또는 초기 체중에 따라 심근염의 심각성 및 발병 정도가 다를 수 있으므로 먼저 결정해야합니다.
2. Light-sheet 현미경을위한 샘플 준비
- 독소를 적용한 지 4 일 후에 기화 된 2 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물로 유도 챔버를 플러싱하여 쥐를 마취시킨다. 레트로 궤도 응용 경로를 사용하여 PBS 50 μL에 직접적으로 표시된 항 CD45 항체 (클론 30-F11, AlexaFluor647 (AF647))의 15 μg을 정맥 주사 (iv) 주사하여 매우 빠르고 정확한 응용을 보장합니다. 항체의 정확한 양.
참고 : 마우스가 기대어 있고 발가락 핀치 테스트에 반응하지 않으면 원하는 마취 깊이에 도달했습니다. - 배양 2 시간 후, 자궁 경부 전위에 의해 생쥐를 희생시키고d 5 mL의 PBS / EDTA (5 mM)로 원위치 심장 을 관류시킨다.
- 21 G 카테터를 사용하여 심장을 노출시키고 우뇌로 관류 용액을 주입하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 것과 대동맥을 절개 한 후 혈액을 배출 할 수 있는지 확인하십시오.
참고 :이 심 관류는 기관의 최종 3D 시각화를 방해 할 수있는 사소한 준비 인공물을 초래할 수 있습니다. 따라서, 진보 된 동물 실험자는 복부 대동맥을 절개하여 하대 정맥을 통해 관류를 수행 할 수있다.
- 21 G 카테터를 사용하여 심장을 노출시키고 우뇌로 관류 용액을 주입하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 것과 대동맥을 절개 한 후 혈액을 배출 할 수 있는지 확인하십시오.
- 화학적 고정을 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 5 mL를 사용하여 같은 구멍을 통해 심장을 관류하십시오. 카테터를 제 위치에 유지하고 PFA가 채워진 새로운 주사기를 부착하십시오. 느리고 일정한 압력으로 흐르는 관.
주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이있다; 피부, 눈 및 기타 점막과의 접촉을 피하십시오.- 부드럽게 톱니 모양 포 셉를 가진 심혼을 움켜 잡으십시오; 우레탄약간 위로; 들어오고 나가는 동맥과 정맥을 포함한 모든 조직 연결을 차단하십시오. 추가 고정을 위해 장기를 4 % PFA에 4 시간 동안 보관하십시오.
- 기관을 탈수하려면 암실에서 4 ℃, 12 시간 동안 각각 50 %, 70 % 및 100 %로 두 번 상승하는 에탄올 시리즈에서 심장을 배양하십시오. 여기에 검정색 5 mL 폴리 프로필렌 반응 튜브를 사용하여 공기 방울 형성을 방지하기 위해 저속 회전 속도를 사용하여 튜브 회 전자에서 일정하게 회전 할 수있게하십시오.
- 화학적 제거로 샘플 준비를 완료하십시오. 마음을 투명하게 만들기 위해 밤새 계속 회전하면서 98 % dibenzyl ether (DBE)에서 배양하십시오.
참고 : DBE는 눈, 피부 및 호흡기를 자극합니다.
3. 가벼운 판 현미경
- 가벼운 시트 현미경을 사용하여 LSFM을 실시하십시오 (재료 표 참조). 현미경의 표준 샘플 홀더에 샘플을 DBE로 채워진 cuvette은 30mm x 30mm x 15mm까지의 시편에 적합합니다.
- 탈수 및 맑은 아가로 오스 블록을 사용하여 이미지를 수집하는 동안 견본을 제자리에 단단히 고정시킵니다.
- 아가로 오스 블록을 준비하려면 2 % 용융 아가로 오스를 15mm x 15mm x 5mm의 금형에 붓습니다. 응고 될 때까지 아가로 오스가 식도록하십시오.
- 오름차순 에탄올 시리즈 (50 %, 70 %, 100 %에서 두 번)로 탈수하십시오. 98 % DBE에서 아가로 오스 블록을 밤새 품는다. 그것이 사용될 때까지 DBE에 아가로 오스를 저장하십시오.
참고 : 아가로 오스는 주로 물로 구성되어 있기 때문에 각 탈수 단계의 배양 시간은 블록의 크기에 따라 연장 될 수 있습니다.
참고 : DBE는 눈, 피부 및 호흡기를 자극합니다. - 필요한 경우 날카로운 메스를 사용하여 준비된 아가로 오스 블록을 원하는 모양으로 자릅니다. 일반적으로 샘플 어댑터의 모서리에 프리즘 또는 쐐기 모양의 양식을 자릅니다.
참고 : 아가로 오스 블록은 탄성이므로,작은 힘으로 밀었을 때 샘플이 제 위치에 유지됩니다.
- 적절한 여기 및 방출 필터 설정으로 관심 형광 신호 (여기서는자가 형광 및 항 CD45 항체 염색)를 감지합니다.
- 결합 조직 유래자가 형광 신호를 검출하기 위해 488 nm의 여기 파장 (OPSL : 50 mW)에서 525/50 nm 밴드 패스 필터를 사용하십시오. AF647 결합 항체로 CD45 염색은 668 nm (밴드 패스 필터 : 680/30 nm) 및 647 nm의 여기 파장 (다이오드 레이저 : 50 mW)에서 검출됩니다.
- 두 개의 개별 z 평면 사이의 거리로 4 μm를 선택하십시오.
4. 이미지 후 처리
참고 : 획득 한 디지털 이미지 데이터는 과학적 3D / 4D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어로 처리됩니다 (재료 표 참조).
- 데이터 파일 열기 및 사전 조정.
- 분석 소프트웨어를 시작한 후 왼쪽 상단 모서리에서 "능가"버튼을 선택하십시오. 이미지 스택을 열려면 "File (파일)", "Open (열기)"을 선택하고 첫 번째 획득 한 채널의 데이터가 들어있는 폴더를 선택하십시오. 획득 한 채널을 추가하려면 "편집"및 "채널 추가"를 선택하십시오.
주 : 데이터 크기 및 컴퓨터 시스템에 따라이 프로세스에는 몇 분이 소요될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 2 수집 채널 (autofluorescence 및 AF647)에 대한 모든 단계를 보여줍니다. - "편집"을 클릭하고 "이미지 속성"을 선택하여 x, y 및 z 복셀 치수를 수정하십시오. 새 창이 열리면 매개 변수를 조정하십시오.
참고 :이 단계는 사용 된 현미경 시스템과 특정 데이터 형식에 따라 다릅니다. 올바른 xyz 값은 후속 크기 및 원거리 측정에 중요합니다. 대부분의 경우 이러한 매개 변수는 현미경 파일에 메타 데이터로 저장됩니다. 그러나, 파일 format는 분석 소프트웨어에서 올바르게 해석 할 수 없으므로 수동으로 픽셀 크기를 입력하는 것이 중요합니다. x 및 y 차원의 픽셀 크기는 카메라 픽셀 크기, 적용될 수있는 비닝 및 렌즈 및 대물 배율에 따라 다릅니다. z의 픽셀 크기는 자체 정의 된 z 단계 크기 ( 예 : 4 μm)와 같습니다.
- 먼저 "Display adjustment"( "Edit"및 "Show Display Adjustment")를 열어 autofluorescence 신호를 회색조로 변환하십시오. 새 창이 열리면 모든 채널이 표시되고 모든 채널이 표시됩니다. 기본 색상을 변경하려면자가 형광 채널을 선택하고 "흰색"표시 스타일을 선택하십시오. 적용하려면 "확인"을 클릭하십시오.
- 검정 레벨 조정의 경우, "디스플레이 조정"으로 돌아가서 샘플 구조를 나타내지 않는 원치 않는 배경 신호를 제외하도록 검정 레벨 값을 조정하십시오에스.
- 이렇게하려면 채널 막대의 왼쪽 상단 삼각형을 사용하고 왼쪽에서 오른쪽으로 드래그하십시오.
참고 : 변경 사항은 즉시 시각화됩니다. 샘플에서 파생되지 않는 신호 만 억제하십시오. 추가 계산을 위해 잡음 신호가 필요할 수 있기 때문에 배경의 최소값은 "0"이되어서는 안됩니다. 이미지 획득 후 모든 검은 레벨 변경이 수행되는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 중요한 샘플 정보가 손실 될 수 있습니다. 블랙 레벨 조정은 대표적인 목적으로 만 사용됩니다. 다른 샘플에 대해 동일한 디스플레이 설정을 사용하려면 채널 목록 아래의 "최소"숫자 필드에 정확한 값을 입력 할 수 있습니다. 이는 정량 분석에 매우 유용합니다.
- 이렇게하려면 채널 막대의 왼쪽 상단 삼각형을 사용하고 왼쪽에서 오른쪽으로 드래그하십시오.
- 오른쪽 위 삼각형을 사용하여 각각의 채널 밝기를 조정하거나 채널 아래의 "최대"숫자 필드에 정확한 값을 입력하여 밝기 조정을 수행하십시오난 목록.
- 채널 막대의 가운데에있는 아래쪽 삼각형을 드래그하여 감마 값을 높이거나 낮추거나 정확한 값을 입력하여 대비를 조정하십시오.
- autofluorescence 채널에 따라 AF647 채널을 조정하십시오. 차이점으로, AF647 신호의 시각화를 히트 맵 컬러 룩업 테이블로 설정하십시오. 4.2.1 단계와 유사한 접근 방식으로 채널 모드 "화재"를 선택하여이를 수행하십시오.
참고 : 전체 신호 강도가자가 형광 채널에 비해 상당히 낮기 때문에 검정 레벨은 대개 훨씬 낮은 값으로 조정됩니다. 자기 형광 채널에 관해서는,이 채널의 밝기는 일반적으로 증가합니다. - "블렌드 모드"를 선택하여 조직 구조를 자세히 시각화하십시오. 동일한 매개 변수 값을 가진 한 시리즈의 모든 샘플을 분석하십시오.
- 3D 장면 엑스포 전에 오르간을 실제로 자르려면렌더링 된 3D 객체에 클리핑 평면을 적용합니다.
- 오브젝트 목록에서 "Clipping Plane"아이콘 (가위)을 클릭하십시오. 이미지보기 내부에는 노란색 프레임과 조작자 (흰색 스핀들)가 나타납니다. 스핀들을 마우스로 끝까지 돌려서 클리핑면의 방향을 변경하고 스핀들의 두꺼운 중간 부분을 이동하여 원하는 클리핑 깊이를 선택합니다.
- 객체 목록 아래의 해당 확인란의 선택을 취소하여 프레임과 조작자를 숨기고 원하는 스냅 샷을 만듭니다.
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Representative Results
제시된 LSFM 접근법은 심각한 심근염 유발시 쥐의 심장에서 백혈구 분포와 양을 분석합니다. 그림 1A 는 심근염 유도에 대한 유전자 변형 CD11c.DTR 마우스의 전처리 프로토콜을 설명합니다. 이 단계는 백혈구를 심근에 모집하는 데 필요한 방아쇠를 나타냅니다. 성공적인 DTX 적용 후, 동물들은 일반적인 약점, 식욕 부진 및 2 ~ 4 일 범위의 체중 감소와 같은 심각한 질병 증상을 나타냅니다. 4 일 후, 백혈구는 iv에 의해 염색된다 . 순환에서 혈액을 제거하기 위해 심근 관류 전에 형광 결합 항 CD45 항체를 적용 성공적으로 수행되면 심장과 다른 기관이 희끄무레하게 변합니다. 이어서, 장기를 절제하고 조직 수를 상승하는 에탄올 행 및 DBE에서의 최종 배양에 의해 DBE와 교환한다. 그림 1B 는 시간표를 보여준다.기관이 상당한 수축을 겪는 개별 배양 단계를 나타낸다. 화학적으로 제거 된 장기는 다음 표준 현미경 조직 홀더에 DBE 채워진 이미징 챔버로 전송됩니다. 3D 이미지 획득 중에 장기를 안정화하기 위해 투명 아가 로즈 블록으로 고정됩니다. 표본의 자세한 배치는 그림 2 에서 볼 수 있습니다. 2 개의 채널로 구성된 전체 이미지 스택 (autofluorescence 및 anti-CD45)의 획득은 약 20-30 분이 소요되며 약 16GB의 데이터 파일을 생성합니다. 마지막으로, 결과 데이터는 백혈구 분포가 히트 맵보기로 표시되는 인공 3D 렌더링으로 분석됩니다. 도 3 (상단)에서, DTX- 처리 된 동물의 심장의 강하게 염증이있는 부분은 그들의 붉은 / 희끄무레 한 외관에 의해 감지 될 수있다. 3 차원 모델에 대한보다 상세한 연구는 백혈구 농도, 특히 심장 전도 시스템의 영역 (예 : 심장 마비)에서 나타납니다 ricular 번들과 Purkinje 섬유. 반대로 PBS로 처리 한 동물의 심장은이 염증 패턴을 전혀 보이지 않습니다 (아래 줄).
그림 1 : 디프테리아 독소에 의한 심근염의 유도 및 샘플 준비. ( A ) 심근염 발병이 그로 인해 유발되었다 . 디프테리아 독소 (100 ng / 동물) 적용. 4 일 후, 심근염이 완전히 발병하였고 AF647 결합 항 CD45 항체 (15 ㎍ / 동물)가 정맥 내 주사되었다 . CD45 + 백혈구를 검출한다. 2 시간 후에 자궁 경부 전위에 의해 동물을 희생시키고, PBS / EDTA (5 mM)로 4 % PFA로 관류시켰다. ( B ) 제거 후, 기관을 상승하는 에탄올 시리즈로 탈수시키고, 최종적으로 디 벤질 에테르 중에서 밤새 배양하여 제거 하였다..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 현미경의 샘플 포지셔닝 구성표 화학적으로 깨끗한 투명 하트 (4)를 샘플 홀더 (2 및 5)에 놓고 맑은 아가로 오스 블록 (6)의 도움으로 안정화 시켰습니다. 이 구조는 DBE가 채워진 유리 큐벳 (3)에 잠기 게되었다. 획득을 위해 5.5mm의 작동 거리를 갖는 0.5NA 대물 렌즈 (1)가 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Whole-or의 대표적인 3D 렌더링gan Light-sheet 현미경. CD11c.DTR 마우스를 DTX (위의 줄) 또는 PBS (아래 줄)로 기관 내로 처리 하였다. 4 일 후, CD45 + 백혈구 침윤으로 대표되는 심근염의 발달이 형광 광 시트 현미경에 의해 시각화되었다. CD45 + 세포를 염색하기 위해, AF647에 결합 된 항 -CD45 항체를 생쥐를 희생시키기 2 시간 전에 iv로 주사 하였다. 결합 조직의자가 형광 신호는 회색으로 표시되고 CD45 + 침투는 히트 맵 색상 (파란색 : 낮은 신호, 흰색 : 높은 신호)으로 표시됩니다. 각 행은 디지털로 클리핑 된 4 개의 3D 렌더링으로 구성되어있어 장기 내부의 상황을 보여줍니다. 심장의 앞쪽 부분에 상대적인 클리핑 깊이는 개별 이미지 위에 선언됩니다. 이 수치는 Mann et al. 15 . 눈금 막대 = 1mm. 여기를 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
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Discussion
현대 생명 과학에서 생물학적 과정의 현미경 시각화는 점차 중요한 역할을합니다. 이러한 맥락에서 지난 2 세기 동안 많은 발전이 이루어져이 시점까지는 해결할 수없는 질문에 답할 수있었습니다. 첫째, 광학 현미경의 해상도 능력을 근본적으로 높이는 명백한 경향이있었습니다. 한때 가정 된 해상도 제한으로 인해 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 21 , 22 , 유도 방출 - 공핍 (STED) 현미경 23 및 광 활성화 된 국소 현미경 (PALM) 24 , 25 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM) 회절 광 ( 27) 은 상당히 파손되었다. 두 번째로 자주 목표로하는 과제는 닮은 환경에서 세포 행동을 관찰하는 것이 었습니다가능한 한 자연 상태. 이러한 맥락에서, 현장 또는 생체 내 이미징 접근법의 개발이 강제되었다. 복잡한 생물학적 조직에서 제한된 빛 침투 깊이를 극복하기 위해 2 광자 현미경 28 , 29 가이 연구 분야에서 새로운 표준을 세웠습니다.
그러나 이러한 모든 현미경 기술이 일반적으로 공유하는 기능은 최고의 해상도를 보장하기 위해 높은 NA 목표를 사용하는 것입니다. 미세 구조를보다 상세하게 해결할지라도, 높은 NA 목표를 사용하면 작업 거리뿐만 아니라 시야가 크게 제한됩니다. 결과적으로 주변 환경과 관련한 생물학적 배경은 종종 진실한 의미에서 초점을 벗어난다. 이러한 차이를 줄이기 위해 LSFM 개발은 최근 세포 크기에서 형광 구조를 분해 할 수있는 현미경 기술을 제공하여 관심을 모으고 있습니다또한 1cm 이상의 크기를 가진 시편의 전체 3D 정보를 편리하게 평가할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 전체 쥐 마음에서 세포 백혈구 침투를 시각화하기 위해 ultr 현미경을 사용하는 방법의 방법을 제시합니다. CD11c.DTR 마우스 모델 30 에서 무균 심근염을 성공적으로 유도 한 후, 각각의 동물은 살아있는 동물에서 2 시간 동안 순환하는 형광 색 - 결합 된 항 -CD45 항체의 정맥 주사를 받는다. 원칙적으로 사후 검사를 수행하면 장기 고정과 표본 탈수증 사이의 전체 항체 염색이 가능해야합니다. 불행하게도, whole-mount staining은 훨씬 더 긴 배양 단계를 필요로하기 때문에 시료 생성에 필요한 시간 ( 즉, 4-21 일)을 크게 증가시킵니다 6 , 31 . 또한,이 intravital 얼룩 접근은뿐만 아니라 빠르고,하지만 또한 제공whole-mount staining protocol에 비해 항체의 조직 침투가 더 효율적 임 9 . 절대 염색 효율이 정량화되지는 않았지만, 생성 된 형광 신호가 현저하게 강하다는 것을 고려하면, 백혈구 집단의 많은 부분이 표지 될 것으로 예상된다. 형광 단백질과 항체 라벨링 자체는 후속 정제 과정에서 대부분 생존하며, 둘 다 오랜 기간 동안 안정한 것으로 보인다. 조직 제거에는 용제 기반 약제가 사용된다는 점도 유의해야합니다. 이것은 클리어링 프로세스 이후의 전체 마운트 얼룩 접근을 막아줍니다. 용제 기반 조직 세척은 가역적 인 현상이므로 표준 항체 염색에 일반적으로 사용되는 물과 같은 매체 (예 : PBS)로 투명 조직을 옮기면 불투명 한 시료가됩니다. 그러므로, 유기 용매에서의 비표준 염색 프로토콜은 샘플을 채취 한 후에 fa 전체 마운트 염색 절차가 필요합니다.
가능한 한 많은 잔여 혈액을 제거하기 위해 후속 심장 관류가 절대적으로 필요합니다. 혈액이 다음 단계에서 잘 처리되지 않아 영상 결과가 극적으로 악화되기 때문입니다. 심장을 절제 한 후, 상승하는 에탄올 행에서 조직 수를 제거합니다. 이 단계는 화학 물질 제거의 첫 부분으로 간주 될 수 있습니다. 아이디어는 조직 표본을 선택 표본의 평균 굴절률 (RI)에 더 잘 맞는 침지 매질로 대체하는 것입니다. Ertuk et al. 의 프로토콜에 따라 DBE가 침지 매질로 선택 되었다. 32 , 일부 수정. DBE의 굴절률은 1.55 (nD20)이며 벤질 알콜 : 벤질 벤조 에이트 (BABB, RI (nD20) = 1.56) 6,7 또는 자당 (RI (nD20) = 1.44)과 같은 다른 청정제와 비교했을 때 )13, 그것은이 프로토콜에 사용 된 형광 라벨을 가장 잘 보존했다. 비슷한 형광 보존은 에틸 신나 메이트 (ECI)를 사용하여 산출되었다. 우리는 신장 신장에서의 사구체의 자동화 된 정량화에 관한 연구에서 그것의 사용을 기술했다. 조직은 굴절률 1.382 ± 0.004 33 으로 추정되었는데, 우리가 평가 한 모든 물질들로 균등하게 깨끗 해졌다 .9 그러므로 DBE의 선택에있어 결정적인 요소는 형광 보존이었고 제거 가능성이 아니었다. 이 패시브 클리어링 프로토콜로 변경하면, 전기 영동 전류의 도움으로 지질을 제거하면 강력하게 제거 된 조직이 생기는 CLARITY 34 , 35 와 같은 능동적 방법의 사용이 가능해야한다. 그러나, 이러한 물과는 대조적으로 기반 지우기 방법을 사용하면 DBE 지우기가 중요한 경화를 초래합니다경미한 수축을 수반하는 조직의 이를 통해 샘플을 쉽게 처리 할 수 있으며 시료를 아가로 오스 블록에 삽입하는 것과 같은 이미징을위한 추가 적응이 필요하지 않습니다. 따라서이 프로토콜을 CLARITY와 같은 방법으로 전송하는 것은 어려운 일일 수 있지만, 사람들은 선택한 접근법을 사용하여 선택한 초 극세사 (재료 표 참조)의 사용을 성공적으로 입증했습니다 3 . 선택 방법에 의한 내인성 형광 신호의 파괴 가능성을주의 깊게 평가하는 것이 중요합니다. 우리가 CLARITY 또는 다른 활성 제거 프로토콜을 사용한 적이 없기 때문에 이러한 시스템에서 형광 염색 반응에 관해서는 언급 할 수 없습니다. 최악의 경우는 이후 전체 마운트 항체 염색이 수행되어야 할 것입니다.
이 방법은 쥐 폐와 같은 다른 기관에서 쉽게 조절할 수 있습니다. 신장; 두뇌; 대퇴골, 경골, 또는 두개골과 같은 뼈조차도 포함하지 않습니다. 평가하는 동안 새로운 조직 영역 및 / 또는 새로운 형광 라벨링 전략에 대한 응용 가능성을 고려할 때 가장 큰 문제는 일반적으로 형광이 살아있는 방식으로 프로토콜을 설계하는 것입니다. 용매 기반 침지 매체 (13) 및 탈수제 (36) 는 형광색의 무결성에 직접적인 영향을 미친다. AlexaFluor 유도체의 사용은 여러 가지 프로토콜에서 상당히 안정적으로 보이므로 권장됩니다. 그러나, 매우 자주, 다른 fluorochromes가 고용되어야합니다. 이 경우에는 다른 제거제 ( 예 : Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , 메틸 살리 실 레이트 40 , 3Disco 32 , BABBlass = "xref"> 6, ECI 9 ) 및 기타 탈수 대안 ( 예 : 메탄올 및 테트라 하이드로 푸란 13 ).
다른 많은 LSFM 접근법과 마찬가지로 현미경 하에서 투명한 심장을 위치시키는 과정이 요구됩니다. 상업용 시스템은 폐엽, 신장 또는 심장을 포함한 마우스 기관 크기의 샘플을 설치할 수있는 충분한 공간을 제공합니다. 그러나 현재이 표본을위한 표준화 된 표본 보유자는 없습니다. 그러므로, 우리는 cleared and re-shaped agarose blocks을 사용하여 장치를 설치해야했습니다. 여전히, 이동 아티팩트로 인해 특정 수의 이미지 데이터 세트를 버려야했습니다. 이 문제는 여기에 사용 된 현미경의 획득 시간이 길어서 증가했습니다. 잠재적으로 거대한 데이터 세트의 생성은 더 빠른 시스템으로 인해 상당한 이익을 얻지 만 더 빠른 현미경을 사용할 기회는 아직 없습니다. 우리의 현미경 (표 참조 of 재료)는 줌 현미경 몸체 주위에 제작되었으며 레이저 모듈, 픽셀 크기 6.5 x 6.5 mm 2 의 sCMOS 카메라 및 광학 확대 범위가 1.26X ~ 12.6X 인 검출 광학 기가 장착되었습니다. 검출 광학계의 중심부는 작동 거리가 5.5 mm 인 0.5 NA의 대물 렌즈였으며 대각선으로 1.7 - 17.6 mm의 넓은 시야를 관찰 할 수있었습니다. 이것은 전체 쥐 마음의 광학 단면을 수행하기에 충분히 컸습니다. 400 ~ 800 nm 사이의 색수차 보정은 대물 렌즈의 기계적 조정으로 이루어졌습니다. 필요한 경우 컴퓨터 보조 사후 처리 중에 색채 보정을 추가로 수행했습니다. 두꺼운 시편에서도 구면 수차가 관찰되지 않았으므로 보정 할 필요가 없습니다.
전체적으로, 우리는 여기서 공간적인 l의 화학적 제거와 분석을위한 확실한 프로토콜을 제시한다.가벼운 시트 현미경을 사용하여 쥐 마음 속의 유핵 세포 분포. 이 시점에서,이 LSFM 절차는 모세 혈관과 같은 미세 조직 구조를 거의 해결할 수 없다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 이와 관련하여이 LSFM은 일반적인 면역 세포 분포를 특성화하고 장기 내 면역 세포 축적 가능성을 설명하는 데 적합합니다. 그러나 LSFM은 일반적으로 vasculature와 같은 작은 기관의 하위 구조에서 세포의 위치를 분석하고 정량화하는 데 완벽한 선택이 아니라는 점을 명심해야합니다. 이러한 질문에 답하기 위해 LSFM은 조직학 또는 2 광자 현미경과 같은 다른 방법으로 보완되어야합니다. 이 프로토콜의 또 다른 제한 사항은 최대 3 ~ 4 색의 제한을 포함합니다. 청색 채널은자가 형광을 제외한 다른 신호에 사용하기가 어렵습니다 (고정 샘플에 대한 제한 및 최대 샘플 크기 30mm x 30mm x 15 mm. 또한 DBE의 강한 냄새와 급성 독성은n을 고려해야합니다. 후자의 점이 문제가된다면, 신 남산 에틸을 대체 청정제 9 로 사용할 수있다. 이 현미경 검사 기술을 선택하는 주요 이점은 전체 장기를 한 번에 분석 할 수있는 능력입니다. 헤 마톡 실린 및 에오신 - 염색, 포르말린 - 고정 및 파라핀 - 임베딩 (FFPE) 조직 조직 절편의 통상적 인 분석에서, 모든 단일 절을 분석하지 않는 한 중요한 공간을 놓칠 확률이 높다. 또한, 가벼운 시트 현미경은 모든 3 차원 평면에서 샘플의 가상 절단을 가능하게 할뿐만 아니라 표본을 파괴하거나 절단 아티팩트를 일으키지 않고 이러한 잠재력을 제공합니다. 필요한 경우 고정 장기는 후속 분석을 통해 상관 관계가있는 특정 영역을 고도로 해결하기위한 상관적인 광 및 전자 현미경 검사법과 같이 처리 될 수 있습니다. 그러한 연구를위한 템플릿은 Karreman et al. , 상관 관계가 베팅 된 곳2 광자 현미경 이미지 스택과 3 차원 전자 현미경 데이터를 성공적으로 보여 주었다. 또 다른 유망한 접근법은 유기 용매를 기반으로하고 최근에 발표 된 uDISCO 방법과이 프로토콜을 조합하여 표준 LSFM 42 에 의해 훨씬 더 큰 기관을 조사 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Gunzer 연구소의 연구는 독일 연방 교육 연구부 (부여 0315590 AD)와 독일 연구 재단 (보조금 GU769 / 4-1, GU769 / 4-2)에 의해 지원되었습니다. 우리는 기술 지원에 대한 IMCES와 3D 만화 모델링에 대한 Sebastian Kubat에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
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