Summary
Her beskriver vi en mikroskopi for lette ark for å visualisere den kardiale CD45 + leukocyttinfiltraten i en murin modell av aseptisk fulminant myokarditt, som er indusert av intratracheal difteritoksinbehandling av CD11c.DTR-mus.
Abstract
Lysveisfluorescensmikroskopi (LSFM), i kombinasjon med kjemiske clearingprotokoller, er blitt gullstandarden for analyse av fluorescensmerkede strukturer i store biologiske prøver, og er ned til cellulær oppløsning. I mellomtiden gjør den konstante forfiningen av underliggende protokoller og økt tilgjengelighet av spesialiserte kommersielle systemer oss til å undersøke mikrostrukturen til hele musorganene og tillate selv karakterisering av cellulær oppførsel i ulike levende cellebilder. Her beskriver vi en protokoll for romlig helmontert visualisering og kvantifisering av CD45 + leukocyttpopulasjonen i inflammerte mushjerter. Metoden anvender en transgen musestamme (CD11c.DTR) som nylig har vist seg å fungere som en robust, induktiv modell for studiet av utviklingen av fulminant dødelig hjerteinfarkt, karakterisert ved dødelig hjertearytmi. Denne protokollen inkluderer myokardittinduksjon, intravitAl antistoff-mediert cellefarging, organpreparasjon og LSFM med etterfølgende datastøttet bilde etterbehandling. Selv om den presenteres som en svært tilpasset metode for vårt spesifikke vitenskapelige spørsmål, representerer protokollen utskrift av et lettjusterbart system som også kan målrette helt forskjellige fluorescerende strukturer i andre organer og til og med i andre arter.
Introduction
Under utviklingen av lysmikroskopi oppstod mange spesialiserte former, alle utviklet for å minimere begrensninger i visualiseringsprosessen for bestemte prøver. En slik metode er fluorescensmikroskopi (LSFM) med lysark. Først utviklet i 1903 av Siedentopf og Zsigmondy 1 og funnet sine første grunnleggende biologiske anvendelser tidlig på 1990-tallet 2 , har LSFM blitt det mest kraftfulle mikroskopiske verktøyet til dags for visualisering av store prøver, som intakte musorgrupper, med en fluorescenssignaloppløsning Ned til mobilnettet. På grunn av disse fordelene, i kombinasjon med potensialet for live-celledannelse, heter Nature Methods LSFM "Årets metode 2014 3. "
Som navnet antyder, blir prøvebelysningen i en LSFM utført av lette ark, som er orientert vinkelrett på aksen til objektet som brukes fEller utslipp-lys samling og etterfølgende bildedannelse. Lysarket genereres vanligvis enten ved å fokusere brede, kollimerte laserstråler med en sylindrisk linse eller ved rask sidelengs bevegelse av smale, fokuserte laserstråler i bare ett horisontalt eller vertikalt plan 4 , 5 . På denne måten lyser kun fotografisk optikkens fokalplan, typisk med en tykkelse på 1-4 μm. Følgelig, for en fluorescerende prøve plassert i belysningsplanet, elimineres både genereringen av spredt lys og virkningene av fotoblekking fra regioner over eller under fokusplanet eller undertrykkes kraftig 6 , 7 . Ettersom alle out-of-focus-planene ikke er opplyst, utelates fotoblekkseffekter i disse områdene. I motsetning til standard konfokal- eller multi-fotonmikroskopi er stiene til opplyst og utstrålt lys skilt fra hverandre, slik at den endelige bildekvaliteten Ity er ikke avhengig av perfekt fokusering av eksitasjonslysstrålen gjennom målene. Avhengig av det underliggende spørsmålet, er det derfor mulig å bruke mål med et enormt synsfelt (FOV) slik at det største mulige arealet i det opplyste planet kan avbildes uten at noen komponentdeler beveger seg i xy-retningen.
I moderne LSFM-systemer blir et fluorescerende bilde av den genererte optiske delen tatt på en svært følsom ladetilkoblet enhet (CCD) eller komplementære metalloksidhalvlederkameraer, som er i stand til å erverve hele synsfeltet (FOV) I mikrosekunder. Ved å flytte prøven gjennom lysplaten og ved å anskaffe bilder ved definerte z-trinn, er det derfor mulig å oppnå full 3D-informasjon av en prøve i en rimelig tidsperiode 8 , 9 , noe som gjør denne teknikken anvendelig for levende celle Studier 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Likevel, selv om LSFM tilbyr en rask, sensitiv og fluorescens-vennlig metode, er lysoverføring gjennom prøven fortsatt et stort problem, spesielt når store biologiske prøver er målet for en 3D-analyse. Lystransmisjon er kritisk modifisert av fysiske aspekter ved absorpsjon og ved lysspredning ved grensesnitt av strukturer med forskjellige brytningsindekser 13 . Derfor, når bildebehandlingen prøver flere millimeter i størrelse, er LSFM for det meste kombinert med clearingprotokoller for å gjøre prøvene optisk gjennomsiktige. Disse teknikkene er basert på ideen om å fjerne vann fra det respektive biologiske vev og utveksle det med vann- eller (organisk) løsningsmiddelbasert nedsenkningsmedium, som er valgt for å begrense brytningsindeksene til de spesifikke målvevskomponentene. Som et resultat minimeres sidestrålespredning, og alle bølgelengderAv lys kan mye mer effektivt passere gjennom vevet 13 . I mange tilfeller ser biologiske prøver som er behandlet på denne måten ut makroskopisk krystallklar, noe som gjør at LSFM kan utføres, selv på hele musorgruppene, ved hjelp av lange arbeidsavstand, lave forstørrelsesmål.
Her presenterer vi en forberedelsesprotokoll for storprøvebilder i et lysarkmikroskop (se tabell over materialer), som vi har etablert for å undersøke det cellulære hjerteinfiltratet i en murin modell av myokarditt 15 . CD11c.DTR-mus uttrykker primat difteri-toksinreseptoren (DTR) under kontroll av CD11c-promotoren 16 . Følgelig blir celler i disse musene, som uttrykker CD11c sammen med DTR, gjort følsomme overfor exotoxinet av Corynebacterium difteri (difteritoksin, DTX); Den systemiske behandlingen av disse dyrene med DTX resulterer i en utarming av alle CD11c + cells. CD11c er et integrin og, som en celleoverflaterreseptor for en rekke forskjellige oppløselige faktorer, er involvert i aktiverings- og modningsprosesser hovedsakelig i celler av den monocytiske linjen 17 . Følgelig har CD11c.DTR-musemodellen vært intensivt brukt til å studere rollen av dendritiske celler og makrofagundergrupper i sammenheng med mange forskjellige immunologiske spørsmål. Over tid har det blitt rapportert at CD11c.DTR-mus behandlet systemisk med DTX kan utvikle uønskede bivirkninger og kan vise sterkt forhøyede dødelighetsgrader 18 , 19 . Nylig var vi i stand til å identifisere den underliggende dødsårsaken 15 , som beskriver utviklingen av fulminant myokarditt etter intratracheal DTX-applikasjon i disse dyrene. Toksinutfordringen forårsaket cellulær ødeleggelse, inkludert i sentrale deler av stimulusoverføringssystemet i hjertet. Dette ble ledsaget av massiv CD45+ Leukocytt infiltrere, som til slutt fører til dødelig hjertearytmi. I dette tilfellet var ikke bare forekomsten av leukocyttpopulasjonen viktig, men også dens romlige fordeling inne i hjertet. Dette eksperimentelle spørsmålet er en utfordring for moderne mikroskopisk avbildning, som vi har løst ved hjelp av en mikroskopisk tilnærming til lysark som støttes av intravital antistofffarging og en organisk løsningsmiddelbasert optisk rydningsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med EUs retningslinjer og ble godkjent av de relevante lokale myndighetene i Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Tyskland). Dyrene ble brukt og innkapslet under spesifikke patogenfrie (SPF) betingelser.
1. Induksjon av myokarditt med difteritoksin (DTX)
- Klargjør DTX-løsningen for induksjon av myokarditt ved å fortynne DTX-stamløsningen med fosfatbuffert saltvann (PBS) til en 1 μg / ml arbeidsoppløsning.
- Påfør 100 μL av denne løsningen intratrakealt (det) i 8 til 10 uker gamle CD11c.DTR-mus ( ca. 5 ng / g kroppsvekt (bw)), som vist av Hasenberg et al. For anvendelse av en soppsporesuspensjon 20 .
MERK: Intraperitoneal påføring av toksinet kan resultere i en lignende induksjon avDødelig myokarditt. Denne tilnærmingen må imidlertid først bekreftes.- For den applikasjonen bedøv dyrene ved en intraperitoneal (ip) injeksjon på 100 mg / kg kroppsvekt ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt xylazin.
- Etter å ha nådd dyp narkose (tånekleprøve), intuberer dyrene ved å bruke et 22 G innvelt venøst kateter gjennom munnhulen. Kontroller korrekt plassering av objektivrøret ved å ventilere dyrene med en liten åndedrettsvern med en hastighet på 250 puste per minutt og et inhalasjonsvolum på 250 μL per pust, også vist av Hasenberg et. al. 20 .
MERK: Ved korrekt posisjonering vil pusten på dyrene endres i henhold til de anvendte ventilasjonsinnstillingene. - Koble ventilasjonssystemet og sett inn 100 μL DTX-oppløsningen eller en tilsvarende mengde PBS som en kontroll gjennom kateteret inn i lungen og fortsett å ventilere dyrene i 1 ekstra minutt.
- La dyrene komme seg fra anestesi og overvåke generell helsestatus og kroppsvektsendring i 4 dager.
MERK: Avhengig av den genetiske bakgrunnen, musestammen eller innledningsvekten, kan alvorlighetsgraden og begynnelsen av myokarditt variere og bør bestemmes først.
2. Prøveforberedelse for lysarkmikroskopi
- 4 dager etter toksinapplikasjon bedøve musene ved å skylle et induksjonskammer med en fordampet 2% isofluran / oksygenblanding. Injiser 15 μg av et direkte merket anti-CD45-antistoff (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) i 50 μl PBS intravenøst (iv) ved hjelp av den retro-orbitale påføringsruten som sikrer en meget rask og svært nøyaktig anvendelse av Riktig mengde antistoff.
MERK: Ønsket dybde av narkose er oppnådd når musene er liggende og ikke reagerer på tåpestesting. - Etter 2 timers inkubasjon, offer musene ved cervikal dislokasjon anD perfeksjonere hjertene in situ med 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
- Utsett hjertet og injiser perfusjonsløsningen i høyre ventrikel ved hjelp av et 21 G kateter. Perfuse med langsomt, konstant trykk og sørg for at blodet kan tømmes etter å ha klippet åpningen av aorta.
MERK: Denne transkardiale perfusjonen kan resultere i mindre forberedelsesartefakter, noe som kan forstyrre den endelige 3D-visualiseringen av orgelet. Derfor kan avanserte dyreeksperimenter utføre perfusjonen gjennom den nedre vena cava, som uttar abdominal aorta.
- Utsett hjertet og injiser perfusjonsløsningen i høyre ventrikel ved hjelp av et 21 G kateter. Perfuse med langsomt, konstant trykk og sørg for at blodet kan tømmes etter å ha klippet åpningen av aorta.
- For kjemisk fiksering, perfiserer hjertet gjennom samme fordypning med 5 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Hold kateteret på plass og legg ganske enkelt på en ny sprøyte fylt med PFA. Perfuse med langsomt og konstant trykk.
MERK: Paraformaldehyd er svært giftig; Unngå kontakt med hud, øyne og annen slimhinne.- Ta forsiktig hjertet med serrated tang; puLl det litt oppover; Og kutte alle vevsforbindelser, inkludert innkommende og utgående arterier og årer. Oppbevar organet i ytterligere 4 timer i 4% PFA for ytterligere fiksering.
- For å dehydrere orgelet, inkuber hjertet i en stigende etanolserie ved 50%, 70% og to ganger ved 100%, hver i 12 timer, ved 4 ° C i mørket. Her bruker du svarte 5 ml polypropylen reaksjonsrør, slik at de stadig roterer i en rotor rotator ved å bruke en sakte rotasjonshastighet for å hindre luftboblingsdannelse.
- Fullstendig prøvepreparasjon ved kjemisk rydding. For å gjøre hjertene gjennomsiktige, inkuberer de dem i 98% dibenzyleter (DBE) mens de roterer konstant over natten.
MERK: DBE er irriterende for øyne, hud og luftveiene.
3. Lysarkmikroskopi
- Gjør LSFM ved hjelp av lysarkmikroskopet (se tabell over materialer). Plasser prøven på standardprøveholderen til mikroskopet i DBE-fyllet cuVette, som er egnet for prøver opp til 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Hold prøven fast på plass under bildeoppsamlingen ved å bruke dehydrerte og rydde agaroseblokkene.
- For å fremstille agaroseblokkene, hell 2% smeltet agarose i en form (15 mm x 15 mm x 5 mm). La agarosen avkjøles til den størkner.
- Dehydrere det i en stigende etanol serie (50%, 70% og to ganger på 100%). Inkubér agaroseblokkene over natten i 98% DBE. Oppbevar agarosen i DBE til den brukes.
MERK: Da agarosen hovedsakelig består av vann, kan inkubasjonstiden for hvert dehydreringstrinn forlenges, avhengig av blokkens størrelse.
MERK: DBE er irriterende for øynene, huden og luftveiene. - Ved behov kuttes den forberedte agaroseblokken til ønsket form ved hjelp av en skarp skalpell. Vanligvis skjærer prisma- eller kileformede skjemaer på kantene på prøveadapteren.
MERK: Da agaroseblokkene er elastiske,Prøven forblir på plass når den trykkes med liten kraft.
- Oppdag fluorescenssignalene av interesse (her, autofluorescens og anti-CD45 antistofffarging) med de passende innstillinger for eksitering og utslippsfilter.
- For påvisning av bindevevsavledet autofluorescenssignal, bruk et 525/50 nm bandpassfilter ved en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm (OPSL: 50 mW); CD45-farging med et AF647-koblet antistoff detekteres ved 668 nm (bandpassfilter: 680/30 nm) og ved en eksitasjonsbølgelengde på 647 nm (diode laser: 50 mW).
- Velg 4 μm som avstanden mellom de to individuelle z-flyene.
4. Bilde Etterbehandling
MERK: De overførte digitale bildedataene ble viderebehandlet med en vitenskapelig 3D / 4D bildebehandling og analyse programvare (se materialebordet).
- Åpning og forhåndsjustering av datafilene.
- Etter å ha startet analyseprogrammet, velg "Overpass" -knappen øverst i venstre hjørne. For å åpne bildestablene velger du "File," "Open", og velg en mappe som inneholder dataene fra den første overførte kanalen. Velg "Rediger" og "Legg til kanaler" for å legge til flere overførte kanaler.
MERK: Denne prosessen kan ta flere minutter, avhengig av datastørrelse og datasystem. Den presenterte protokollen demonstrerer alle trinnene for 2 oppkjøpskanaler (autofluorescens og AF647). - Korriger dimensjonene x, y og z voxel ved å klikke på "Rediger" og velg "Bildeegenskaper". Når det nye vinduet åpnes, juster parametrene.
MERK: Dette trinnet avhenger av det anvendte mikroskopsystemet og det bestemte dataformatet. Korrekte xyzverdier er kritiske for etterfølgende størrelser og fjerne målinger. I de fleste tilfeller lagres disse parametrene som metadata i mikrograffiler. Men hvis filen foRmat kan ikke tolkes riktig av analyseprogramvaren, er det viktig å manuelt skrive inn pixelstørrelsen. Pikselstørrelsen i x- og y-dimensjonene er avhengig av kameraets pikselstørrelse, den potensielt anvendte binningen og objektivet og objektiv forstørrelsen. Pikselstørrelsen i z er ekvivalent med den selvdefinerte z-trinnstørrelsen ( f.eks. 4 μm).
- Først transformer autofluorescenssignalet til gråtoner ved å åpne "Displayjustering" ("Rediger" og "Vis skjermjustering"). Et nytt vindu vil vise alle åpne kanaler og skjerminnstillingene for dem alle; For å endre standardfarge, velg autofluorescence-kanalen og velg den hvite visningsstilen. Klikk på "ok" for å søke.
- For svart nivåjustering, gå tilbake til "Displayjustering" og juster verdien for svart nivå for å utelukke uønskede bakgrunnssignaler som ikke representerer prøvestrukturs.
- For å gjøre det, bruk den øverste venstre trekant på kanallinjen og dra den fra venstre til høyre.
MERK: Endringer vil bli visualisert umiddelbart. Pass på at du bare undertrykker signaler som ikke kommer fra prøven. Minimumverdier i bakgrunnen skal aldri være "0" for å unngå tonehøyde piksler, da det kan være behov for lydsignaler for ytterligere beregninger. Pass på at alle svarte nivåendringer utføres etter bildeoppkjøpet. Ellers kan verdifull prøveinformasjon gå tapt. Sortjusteringen justerer bare representativ bruk. For å bruke de samme skjerminnstillingene over forskjellige prøver, kan du angi nøyaktige verdier i "min" tallfeltet under kanallisten. Dette er svært nyttig for kvantitative analyser.
- For å gjøre det, bruk den øverste venstre trekant på kanallinjen og dra den fra venstre til høyre.
- Utfør intensitetsjustering enten ved å bruke øverste høyre trekant for å justere den respektive kanalintensiteten eller ved å angi nøyaktige verdier i "maks" tallfelt under channeL listen.
- Utfør kontrastjustering ved å dra den nedre trekanten midt på kanallinjen for å øke eller redusere gammaverdien eller ved å angi de nøyaktige verdiene.
- Juster AF647-kanalen i henhold til autofluorescenskanalen. Som en forskjell, sett visualiseringen av AF647-signalet til en varmekartfargeoppslagstabell. Gjør dette ved å velge kanalmodus "brann" i en tilnærming lik den i trinn 4.2.1.
MERK: Siden de totale signalintensitetene er signifikant lavere sammenlignet med autofluorescenskanalen, justeres de svarte nivåene vanligvis til mye lavere verdier. Når det gjelder autofluorescenskanalen, økes lysstyrken til denne kanalen vanligvis. - Velg "blandingsmodus" for å visualisere vevsstrukturer i detalj. Analyser alle prøver fra en serie med de samme parameterverdiene.
- For å nesten kutte organet før 3D-scenen expoRt, bruk et klippeplan på det gjengitte 3D-objektet.
- Klikk på "Clipping Plane" -ikonet (saks) i objektlisten. I bildevisningen vises en gul ramme og en manipulator (hvit spindel). Rotér spindelen ved den tynnere enden med musen, og derved forandre retningen av klippeplanet, og flytt den tykkere midterdelen av spindelen for å velge ønsket dybde av klipping.
- Skjul rammen og manipulatoren ved å fjerne markeringen i de respektive boksene under objektlisten og opprette ønskede stillbilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterte LSFM-tilnærmingen analyserer leukocyttfordelingen og mengden i murine hjerter ved induksjon av alvorlig myokarditt. Figur 1A forklarer forbehandlingsprotokollen for de transgene CD11c.DTR-musene for myokardittinduksjon. Dette trinnet representerer den nødvendige utløseren for rekruttering av leukocytter til myokardiet. Etter vellykket DTX-applikasjon utvikler dyrene alvorlige sykdomssymptomer, slik som generell svakhet, anoreksi og vekttap i løpet av 2-4 dager. Etter 4 dager flekker leukocytter av iv . Påføring av fluorokrom-koblet anti-CD45 antistoff før transkardial perfusjon for å fjerne blodet fra sirkulasjon. Hvis vellykket utføres hjerte og andre organer hvitt. Deretter blir organet skåret ut, og vevsvann utveksles med DBE med en stigende etanolrad og en endelig inkubasjon i DBE. Figur 1B viser tidsplanenAv de individuelle inkubasjonstrinnene hvor orgelet gjennomgår betydelig krymping. Det kjemisk rydde organet blir så overført til et DBE-fylt bildekammer på standardmikroskopvevholderen. For å stabilisere orgelet under 3D-bildeoppkjøp, er det festet med gjennomsiktige agaroseblokker. Den detaljerte posisjoneringen av prøven er visualisert i figur 2 . Oppkjøpet av en hel bildestabel, bestående av 2 kanaler (autofluorescens og anti-CD45), tar ca. 20-30 minutter og genererer en datafil på ca 16 GB. Til slutt analyseres de resulterende dataene som kunstig 3D-gjengivelse der leukocyttfordelingen vises i en varmekartvisning. På figur 3 (øvre rad) kan de sterkt betente områdene i et hjerte av et DTX-behandlet dyr oppfattes av deres rødlige / hvite utseende. En mer detaljert studie av 3D-modellen avslører leukocytkonsentrasjonen, spesielt i områder av hjerteledningssystemet, som atrioventet Ricularbunt og Purkinje-fibre. I motsetning til at hjerter av PBS-behandlede dyr ikke viser dette betennelsesmønsteret i det hele tatt (nederste rad).
Figur 1: Induksjonsskjema og prøveeksempel av difteritoksin-inducert myokarditt. ( A ) Myokardittutvikling ble indusert av den . Påføring av difteritoksin (100 ng / dyr). Etter 4 dager hadde myokarditt fullstendig utviklet og et AF647-koblet anti-CD45 antistoff (15 μg / dyr) ble injisert iv . Å oppdage CD45 + leukocytter. Dyr ble ofret 2 timer senere ved cervikal dislokasjon, og hjertene ble perfusert med PBS / EDTA (5 mM) fulgt av 4% PFA. ( B ) Etter fjerning ble orgelet dehydrert med en stigende etanol-serie og til slutt fjernet ved inkubasjon over natten i dibenzyleter..com / filer / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ordning for prøveposisjonering i mikroskop. Det kjemisk rydde gjennomsiktige hjertet (4) ble plassert på prøveholderen (2 og 5) og stabilisert ved hjelp av rydde agaroseblokker (6). Denne konstruksjon ble deretter nedsenket i DBE-fylt glasskuvette (3). For oppkjøp ble en 0,5 NA objektivlins (1) med en arbeidsavstand på 5,5 mm benyttet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative 3D-gjengivelser av hele ellerGan Light-sheet Microscopy. CD11c.DTR-mus ble behandlet intratrakealt med DTX (øvre rad) eller PBS (nederste rad). 4 dager senere ble utviklingen av myokarditt, representert ved CD45 + leukocyttinfiltrasjon, visualisert ved fluorescens-lysarkmikroskopi. For å fargelegge CD45 + -cellene ble et anti-CD45 antistoff koblet til AF647 injisert iv 2 timer før avlivning av musene. Autofluorescenssignalet for bindevev vises i grått, mens CD45 + infiltrer vises i varmekartfargene (blå: lavt signal, hvitt: høyt signal). Hver rad består av 4 digitalt klippede 3D-gjengivelser, som viser situasjonen i orgelet. Klippedybden i forhold til den fremre delen av hjertet er deklarert over de enkelte bildene. Figuren er blitt modifisert fra Mann et al. 15 . Skalbjelke = 1 mm. Vennligst klikk herFor å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I moderne livsvitenskap spiller den mikroskopiske visualiseringen av biologiske prosesser en stadig viktigere rolle. I denne sammenheng har mange utviklinger blitt oppnådd de siste to århundrene som bidrar til å svare på spørsmål som ikke kan adresseres til dette punktet. For det første har det vært en klar tendens til å fundamentalt øke oppløsningsevnen til lysmikroskop. Med strukturert belysningsmikroskopi (SIM) 21 , 22 , stimulert utslippsdepletjon (STED) mikroskopi 23 og fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) 24 , 25 eller stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM) 26 , den en-postulerte oppløsningsbegrensning Til lysdiffraksjon 27 var signifikant ødelagt. Den andre ofte målrettede utfordringen var å observere cellulær oppførsel i et miljø som ligner påDen naturlige tilstanden så tett som mulig. I denne sammenheng ble utviklingen av in situ eller in vivo imaging tilnærminger tvunget. For å overvinne den begrensede lyspenningsdybden i komplekse biologiske vev har 2-fotonmikroskopi 28 , 29 satt nye standarder i dette forskningsfeltet.
Imidlertid er en funksjon som alle disse mikroskopi teknikkene vanligvis deler, bruken av høy NA-mål for å garantere best mulig oppløsning. Selv om det løser mikrostrukturer i større detalj, begrenser bruken av høy NA-mål markant synspunkt, samt arbeidsavstanden. Som konsekvens blir den biologiske konteksten i forhold til omgivelsene ofte ute av fokus i ordets sanne betydning. For å lukke dette gapet har LSFM utvikling nylig fått interesse, og gir en mikroskopi teknikk som er i stand til å løse fluorescerende strukturer ved cellestørrelseMen også for å kunne vurdere hele 3D-informasjonen til en prøve med en størrelse på mer enn 1 cm.
Protokollen beskrevet her presenterer en metode for hvordan man bruker et ultramikroskop for å visualisere en cellulær leukocyttinfiltrasjon i hele murine hjerter. Etter vellykket induksjon av steril myokarditt i en CD11c.DTR-musemodell 30 mottar det respektive dyr en iv-injeksjon av et fluorokrom-koblet anti-CD45-antistoff som sirkulerer i 2 timer i levende dyr. I prinsippet, ved å utføre en post mortem, bør det helfestede antistofffarging mellom organfiksering og prøvedehydrering være mulig. Dessverre krever fullmontert farging langt lengre inkubasjonstrinn, og øker dermed massivt tiden som trengs for prøvegenerering ( dvs. 4-21 dager) 6 , 31 . Videre er denne intravital flekkeringsmetoden ikke bare raskere, men leverer ogsåMer effektiv vevpenetrasjon av antistoffet sammenlignet med en helmontert fargeprotokoll 9 . Selv om den absolutte fargingseffektiviteten ikke er kvantifisert, forventes det at en stor del av leukocyttpopulasjonen er merket, gitt at det resulterende fluorescenssignalet er bemerkelsesverdig sterk. Både fluorescerende proteiner og antistoffmerking selv overlever i stor grad den etterfølgende clearingprosessen, og begge ser ut til å være stabile i lang tid. Det bør også bemerkes at et løsningsmiddelbasert middel brukes til vevsrensing. Dette hindrer massivt en helmontert farging tilnærming etter clearingprosessen. Løsningsmiddelbasert vevsdeklarering er et reversibelt fenomen, slik at overføring av det rydde vev til et vannbasert medium (som PBS), som vanligvis brukes for standard antistofffarging, ville resultere i en ikke-gjennomsiktig prøve. Derfor må ikke-standard fargeprotokoller i organiske løsningsmidler bli etablert i Det er behov for en fullmontert fargingsprosedyre etter prøveklarering.
Den etterfølgende hjertep perfusjonen er absolutt nødvendig for å eliminere så mye gjenværende blod som mulig, siden blodet er dårlig ryddet i de følgende trinnene og forverrer dramatisk bildene. Etter å ha tatt hjertet ut, blir vevsvannet fjernet i en stigende etanolrad. Dette trinnet kan betraktes som den første delen av kjemisk clearing. Tanken er å erstatte vevsvannet med et nedsenkingsmedium som bedre samsvarer med den gjennomsnittlige brytningsindeksen (RI) for prøven som er valgt. DBE ble valgt som nedsenkingsmediet etter protokollen fra Ertuk et al. 32 , med noen modifikasjoner. DBE har en brytningsindeks på 1,55 (nD20), og når den ble sammenlignet med andre rensemidler, slik som benzylalkohol: benzylbenzoat (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 eller sukrose (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13, best bevarte de fluorescerende etikettene som ble brukt i denne protokollen. En lignende fluorescensbevarelse ble gitt ved bruk av etylkinnamat (ECI). Vi har beskrevet bruken i en studie om den automatiserte kvantifisering av glomeruli i nephretiske nyrer 9 . Vev, som en gang var beregnet å ha en brytningsindeks på 1,382 ± 0,004 33 , ble like godt fjernet med alle stoffer som vi evaluerte 9. Derfor var den avgjørende faktoren for valget av DBE fluorescensbehandlingen og ikke clearingspotensialet. Endre til denne passive clearing protokollen, bruk av en aktiv metode som CLARITY 34 , 35 , hvor fjerning av lipider ved hjelp av en elektroforetisk strøm resulterer i sterkt rydde vev, bør være mulig. I motsetning til et slikt vann -basert clearingmetode, resulterer DBE-rydningen i en betydelig herdingAv vevet, ledsaget av mindre krymping. Dette muliggjør enkel håndtering av prøvene og krever ikke ytterligere tilpasninger for avbildning, for eksempel å legge inn prøven i en agaroseblokk. Derfor vil overføringen av denne protokollen til en metode som CLARITY være utfordrende, men folk har med fordel demonstrert bruken av det valgte ultramikroskopet (se materialetabellen) med denne tilnærmingen 3 . Det er viktig å nøye vurdere den potensielle ødeleggelsen av endogene fluorescenssignaler ved valg av valgfri metode. Som vi aldri har jobbet med CLARITY eller andre aktive clearingprotokoller, kan vi ikke kommentere fluorokromreaksjonen i disse systemene. Det verste fallet ville være at en etterfølgende helmontering av antistofffarging måtte utføres.
Denne metoden er lett å justere til andre organer, for eksempel murine lunger; nyrer; hjerner; Og til og med bein, som lårbenet, tibia eller calvaria. Mens evaluati Ng applikasjonspotensialet på nye vevsregioner og / eller nye fluorescerende merkingsstrategier, er den største utfordringen vanligvis å designe protokollen på en måte at fluorescensen holdes i live. Det løsningsmiddelbaserte nedsenkningsmedium 13 og dehydratiseringsmiddelene 36 har en direkte innvirkning på integriteten til fluorokromene. Bruk av AlexaFluor-derivater anbefales, da de ser ut til å være ganske stabile i forskjellige protokoller. Imidlertid må andre fluorokrom ofte brukes. I dette tilfellet er det definitivt verdt å evaluere bruken av andre clearingmidler ( f.eks. Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , metylsalicylat 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 og ECI 9 ) og andre dehydreringsalternativer ( f.eks. Metanol og tetrahydrofuran 13 ).
Som i mange andre LSFM-tilnærminger kreves prosessen med posisjonering av det gjennomsiktige hjertet under mikroskopet. Kommersielle systemer gir nok plass til å installere prøver på størrelsen på musorganer, inkludert lungelobber, nyrer eller hjerter. Imidlertid er det for øyeblikket ingen standardiserte prøveholdere for disse prøvene. Derfor måtte vi etablere et monteringsapparat ved å bruke rydde og reformede agaroseblokker. Likevel måtte et visst antall bilde datasett kasseres på grunn av bevegelsesartefakter. Dette problemet ble også økt på grunn av den lange oppkjøpstidspunktet for mikroskopet som brukes her. Potensielt vil genereringen av store datasett tjene betydelig fra hurtigere systemer, men vi har ikke muligheten til å bruke et raskere mikroskop ennå. Vårt mikroskop (se tabell oF-materialer) ble bygd rundt et zoommikroskophus og utstyrt med en lasermodul, et sCMOS-kamera med en pikselstørrelse på 6,5 x 6,5 mm 2 og deteksjonsoptikk med et optisk forstørrelsesområde fra 1,26X til 12,6X. Den sentrale delen av deteksjonsoptikken var en 0,5 NA objektivlins med en arbeidsavstand på 5,5 mm, noe som muliggjorde observasjon av et stort synsfelt som varierte mellom 1,7 og 17,6 mm diagonalt. Dette var stort nok til å utføre den optiske seksjonen av hele murine hjerter. Korrigeringen av kromatisk aberrasjon, mellom 400 og 800 nm, ble oppnådd ved mekanisk justering av målet. Om nødvendig ble kromatiske korrigeringer utført under den datamaskinassisterte etterbehandlingen. Sfærisk avvik, også i tykkere prøver, ble ikke observert i dette systemet og måtte derfor ikke korrigeres.
Alt i alt presenterer vi her en robust protokoll for kjemisk rydding og analyse av romlig lEukocytfordeling i murine hjerter ved bruk av lysarkmikroskopi. På dette punktet er det viktig å understreke at denne LSFM-prosedyren ikke er i stand til å løse fine vevstrukturer som kapillærer. I denne forbindelse er denne LSFM velegnet til å karakterisere den generelle immuncellfordelingen og å beskrive potensielle immuncelleakkumuleringer inne i organet. Imidlertid må man huske på at LSFM generelt ikke er det perfekte valget for å analysere og kvantifisere mobil lokalisering i småorganets understrukturer, slik som vaskulaturen. For å svare på slike spørsmål, bør LSFM suppleres med andre metoder, for eksempel histologi eller 2-foton mikroskopi. Ytterligere begrensninger av denne protokollen inkluderer begrensningen til maksimalt 3-4 farger. Den blå kanalen er vanskelig å bruke for andre signaler bortsett fra autofluorescens-begrensningen til faste prøver og den maksimale samplingsstørrelsen på 30 mm x 30 mm x 15 mm. Også den sterke lukten og akutt toksisitet av DBE bør taN i betraktning. Hvis sistnevnte punkt er problematisk, kan etylkinnamat brukes som et alternativt rydemiddel 9 . Den største fordelen ved å velge denne mikroskopi teknikken er evnen til å analysere hele orgelet på en gang. I konvensjonelle analyser av hematoksylin og eosin-farget, formalin-fiksert og parafin-innebygd (FFPE) histologisk vevseksjoner, er det høy sannsynlighet for manglende viktige romområder, med mindre hver enkelt seksjon er analysert. Dessuten muliggjør lette arkmikroskopi ikke bare virtuell skjæring av prøven i hvert tredimensjonalt plan, men det gir også dette potensialet uten å ødelegge prøven eller forårsake kutteartefakter. Om nødvendig kunne det faste organet bli behandlet for videre analyser, slik som et korrelativt lys og elektronmikroskopi tilnærminger til svært løse bestemte områder av interesse. En mal for en slik studie kan bli funnet i Karreman et al. , Hvor korrelasjonsspilletWeen en 2-photon mikroskopi bilde stabel og tredimensjonale elektronmikroskopi data ble vist med suksess 41 . En annen lovende tilnærming kan være kombinasjonen av denne protokollen med den nylig publiserte uDISCO-metoden, som også er basert på et organisk løsningsmiddel, og det vil muliggjøre undersøkelse av mye større organer med en standard LSFM 42 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning i Gunzer-laboratoriet ble støttet av det tyske forbundsdepartementet for utdanning og forskning (stipend nr. 0315590 AD) og av tysk forskningsfond (stipend nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Vi takker også IMCES for teknisk støtte og Sebastian Kubat for hjelp med 3D tegneserie modellering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
