Summary
Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.
Abstract
A microscopia de fluorescência de folha clara (LSFM), em combinação com protocolos de limpeza química, tornou-se o padrão-ouro para analisar estruturas marcadas de forma fluorescente em grandes espécimes biológicos e está em baixa resolução celular. Enquanto isso, o refinamento constante dos protocolos subjacentes e a maior disponibilidade de sistemas comerciais especializados permitem investigar a microestrutura de órgãos de ratos inteiros e até mesmo permitir a caracterização do comportamento celular em várias abordagens de imagens de células vivas. Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização espacial de montagem total e a quantificação da população de leucócitos CD45 + em corações inflamados de ratos. O método emprega uma cepa de rato transgênica (CD11c.DTR) que recentemente mostrou ser um modelo robusto e induzível para o estudo do desenvolvimento de miocardite fulminante fatal, caracterizada por arritmias cardíacas letais. Este protocolo inclui a indução de miocardite, intravíteColoração de células mediada por anticorpos, preparação de órgãos e LSFM com posterior processamento de imagem assistida por computador. Embora apresentado como um método altamente adaptado para nossa questão científica particular, o protocolo representa o modelo de um sistema facilmente ajustável que também pode alvejar estruturas fluorescentes completamente diferentes em outros órgãos e mesmo em outras espécies.
Introduction
Durante a evolução do microscópio de luz, surgiram muitas formas especializadas, todas desenvolvidas para minimizar as limitações no processo de visualização de determinados espécimes. Um desses métodos é a microscopia de fluorescência de folha clara (LSFM). Desenvolvido em 1903 pela Siedentopf e Zsigmondy 1 e encontrando suas primeiras aplicações biológicas fundamentais no início da década de 1990 2 , o LSFM tornou-se a ferramenta microscópica mais poderosa até à data para a visualização de grandes espécimes, como órgãos de ratos intactos, com uma resolução de sinal de fluorescência Até o nível celular. Devido a esses benefícios, em combinação com o seu potencial para imagens de células vivas, Nature Methods denominou LSFM o "Método do Ano 2014 3 ".
Como o nome sugere, a iluminação da amostra em um LSFM é conduzida por folhas leves, orientadas perpendicularmente ao eixo do objetivo usado fOu coleta de luz de emissão e subseqüente formação de imagem. A folha de luz geralmente é gerada através da focagem de raios laser colimados e largos com uma lente cilíndrica ou pelo rápido movimento lateral de feixes laser estreitos e focados em apenas um plano horizontal ou vertical 4 , 5 . Desta forma, apenas o plano focal da imagem óptica é iluminado, tipicamente com uma espessura de 1-4 μm. Conseqüentemente, para uma amostra fluorescente colocada no plano de iluminação, tanto a geração de luz dispersa quanto os efeitos do fotobloco de regiões acima ou abaixo do plano focal são eliminados ou muito suprimidos 6 , 7 . Como todos os aviões fora de foco não são iluminados, os efeitos de fotoblocos são omitidos nessas áreas. Em contraste com a microscopia confocal ou multi-fotônica padrão, os caminhos da luz iluminada e emitida são separados um do outro, de modo que a imagem final qual Ity não depende da focagem perfeita do feixe de luz de excitação através dos objetivos. Dependendo da questão subjacente, é possível usar objetivos com um enorme campo de visão (FOV) para que a maior área possível do plano iluminado possa ser visualizada sem nenhuma parte componente movendo-se na direção xy.
Nos sistemas LSFM modernos, uma imagem fluorescente da seção óptica gerada é capturada em um dispositivo de acoplamento de carga altamente sensível (CCD) ou câmeras semicondutoras de óxido de metal complementares (CMOS), capazes de adquirir todo o campo de visão (FOV) Em microssegundos. Portanto, ao mover a amostra através da folha de luz e ao adquirir imagens em passos z definidos, é possível obter a informação 3D completa de uma amostra em um período razoável de tempo 8 , 9 , tornando esta técnica aplicável para células vivas Estudos 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
No entanto, embora o LSFM ofereça um método rápido, sensível e compatível com fluorescência, a transmissão de luz através da amostra ainda é um problema importante, especialmente quando grandes amostras biológicas são alvo de uma análise em 3D. A transmissão de luz é criticamente modificada por aspectos físicos de absorção e por dispersão de luz em interfaces de estruturas com diferentes índices de refração 13 . Portanto, quando a imagem exibe amostras de vários milímetros de tamanho, o LSFM é principalmente combinado com protocolos de limpeza para tornar as amostras opticamente transparentes. Estas técnicas baseiam-se na ideia de remover a água dos respectivos tecidos biológicos e trocá-la com meios de imersão baseados em solventes de água ou (orgânicos), que são escolhidos para combinar estreitamente os índices de refracção dos componentes de tecido alvo específicos. Como resultado, a dispersão de luz lateral é minimizada e todos os comprimentos de ondaDe luz pode passar muito mais eficientemente através do tecido 13 . Em muitos casos, os espécimes biológicos tratados dessa maneira aparecem cristalos e macroscópicamente, o que permite que o LSFM seja conduzido, mesmo em órgãos de mouse inteiros, usando longos objetivos de distância de trabalho, baixa ampliação.
Aqui, apresentamos um protocolo de preparação para imagens de grande amostra em um microscópio de folha clara (veja a tabela de materiais), que estabelecemos para investigar o infiltrado cardíaco celular em um modelo murino de miocardite 15 . Os ratinhos CD11c.DTR expressam o receptor de toxina da difteria primata (DTR) sob o controle do promotor CD11c 16 . Conseqüentemente, as células desses camundongos, que expressam CD11c juntamente com o DTR, tornam-se sensíveis à exotoxina de Corynebacterium diphtheria (toxina diftérica, DTX); O tratamento sistêmico desses animais com DTX resulta em um esgotamento de todos os CD11c + ceLls. CD11c é uma integrina e, como um receptor de superfície celular para uma variedade de diferentes fatores solúveis, está envolvido em processos de ativação e maturação principalmente em células da linhagem monocítica 17 . Conseqüentemente, o modelo de mouse CD11c.DTR tem sido intensamente utilizado para estudar o papel das células dendríticas e subconjuntos de macrófagos no contexto de muitas questões imunológicas diferentes. Ao longo do tempo, foi relatado que os ratos CD11c.DTR tratados sistematicamente com DTX podem desenvolver efeitos colaterais adversos e podem exibir taxas de mortalidade fortemente elevadas 18 , 19 . Recentemente, conseguimos identificar a causa subjacente da morte 15 , descrevendo o desenvolvimento da miocardite fulminante após a aplicação DTX intratraqueal nesses animais. O desafio da toxina causou destruição celular, inclusive nas partes centrais do sistema de transmissão do estímulo no coração. Isso foi acompanhado por CD45 maciço+ Infiltrado de leucócitos, levando finalmente a arritmias cardíacas letais. Nesse caso, não só a aparência da população de leucócitos era importante, mas também sua distribuição espacial dentro do coração. Esta questão experimental é um desafio para imagens microscópicas modernas, que solucionamos por uma abordagem de microscópio de folha clara que é suportada por coloração de anticorpos intravíticos e um protocolo de limpeza óptica com solvente orgânico.
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Protocol
Todas as experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações da UE e foram aprovadas pelas autoridades locais relevantes em Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Alemanha). Os animais foram utilizados e alojados sob condições específicas de patógeno livre (SPF).
1. Indução de miocardite por toxina de difteria (DTX)
- Prepare a solução de DTX para a indução de miocardite, diluindo a solução de reserva de DTX com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para uma solução de trabalho de 1 μg / mL.
- Aplicar 100 μL desta solução intratraquealmente (ele) em ratos CD11c.DTR de 8 a 10 semanas de idade ( cerca de 5 ng / g de peso corporal (bw)), como mostrado por Hasenberg et al. Para a aplicação de uma suspensão de esporos de fungos 20 .
NOTA: A aplicação intraperitoneal da toxina pode resultar em uma indução semelhante deMiocardite fatal. No entanto, essa abordagem deveria primeiro ser validada.- Para aplicação, anestesiar os animais por meio de uma injeção intraperitoneal (ip) de 100 mg / kg de cevina bw e 10 mg / kg de xilazina.
- Depois de atingir a narcose profunda (teste de pinça do dedo do pé), entubar os animais usando um cateter venoso induzido 22 G através da cavidade oral. Verifique o posicionamento correto do tubo da lente ventilando os animais com um respirador de pequeno animal com uma taxa de 250 respirações por minuto e um volume de inalação de 250 μL por respiração, também mostrado por Hasenberg et. Al. 20 .
NOTA: Quando posicionado corretamente, a taxa de respiração dos animais mudará de acordo com as configurações de ventilação aplicadas. - Desconecte o sistema de ventilação e instale a solução de 100 μL de DTX ou uma quantidade igual de PBS como controle através do cateter para o pulmão e continue a ventilar os animais por 1 minuto adicional.
- Deixe os animais se recuperar da anestesia e monitorar o estado geral de saúde e a mudança de peso durante 4 dias.
NOTA: Dependendo do fundo genético, da cepa do mouse ou do peso inicial, a gravidade eo início da miocardite podem variar e devem ser determinados em primeiro lugar.
2. Preparação de amostras para microscopia de folha clara
- 4 dias após a aplicação da toxina, anestesiar os camundongos lavando uma câmara de indução com uma mistura evaporada de isoflurano / oxigênio a 2%. Injectar 15 μg de um anticorpo anti-CD45 marcado diretamente (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) em 50 μL de PBS por via intravenosa (iv) usando a rota de aplicação retro-orbital, o que garante uma aplicação muito rápida e altamente precisa da Quantidade correta de anticorpo.
NOTA: A profundidade desejada de narcose foi alcançada quando os camundongos estão recostados e não reagem ao teste de pinça. - Após 2 h de incubação, sacrificar os ratos por deslocamento cervical eD perfuse os corações in situ com 5 mL de PBS / EDTA (5 mM).
- Exponha o coração e injete a solução de perfusão no ventrículo direito usando um cateter de 21 G. Perfume com pressão lenta e constante e certifique-se de que o sangue pode ser drenado após o corte da aorta.
NOTA: Esta perfusão transcardial pode resultar em artefatos de preparação menores, o que poderia perturbar a visualização 3D final do órgão. Portanto, experimentadores avançados de animais podem realizar a perfusão através da veia cava inferior, excitando a aorta abdominal.
- Exponha o coração e injete a solução de perfusão no ventrículo direito usando um cateter de 21 G. Perfume com pressão lenta e constante e certifique-se de que o sangue pode ser drenado após o corte da aorta.
- Para a fixação química, perfure o coração através do mesmo recesso com 5 mL de paraformaldeído a 4% (PFA). Mantenha o cateter no lugar e simplesmente prenda uma nova seringa preenchida com PFA. Perfusa com pressão lenta e constante.
NOTA: Paraformaldehydeis altamente tóxico; Evite o contato com a pele, olhos e outras mucosas.- Aperte suavemente o coração com fórceps serrilhados; PuLigeiramente para cima; E cortar todas as conexões de tecido, incluindo as artérias e veias entrantes e extrovertidas. Armazene o órgão por mais 4 h em 4% de PFA para posterior fixação.
- Para desidratar o órgão, incubar o coração em uma série ascendente de etanol em 50%, 70% e duas vezes em 100%, cada uma por 12 h, a 4 ° C no escuro. Aqui, use tubos de reação de polipropileno preto de 5 mL, permitindo que eles rodam constantemente em um rotador de tubo usando uma velocidade de rotação lenta para evitar a formação de bolhas de ar.
- Preparação completa da amostra por limpeza química. Para tornar os corações transparentes, incubri-los em 98% de éter de dibenzilo (DBE) enquanto gira constantemente durante a noite.
NOTA: O DBE é irritante para os olhos, pele e sistema respiratório.
3. Microscopia de folha clara
- Conduza LSFM usando o microscópio de luz (veja a tabela de materiais). Coloque a amostra no suporte de amostra padrão do microscópio na placa cheia de DBEVette, que é adequado para amostras de até 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Segure a amostra firmemente no lugar durante a aquisição da imagem utilizando blocos de agarose desidratados e limpos.
- Para preparar os blocos de agarose, despeje 2% de agarose fundida em um molde (15 mm x 15 mm x 5 mm). Deixe a agarose esfriar até se solidificar.
- Desidratá-lo em uma série ascendente de etanol (50%, 70% e duas vezes em 100%). Incube os blocos de agarose durante a noite em 98% de DBE. Armazene a agarose em DBE até que seja usada.
NOTA: Como a agarose é composta principalmente de água, os tempos de incubação para cada passo de desidratação podem ser prolongados, dependendo do tamanho do bloco.
NOTA: DBE é irritante para os olhos, pele e sistema respiratório. - Quando necessário, corte o bloco de agarose preparado na forma desejada usando um bisturi afiado. Tipicamente, corte formas em forma de prisma ou em forma de cunha para colocar nas bordas do adaptador de amostra.
NOTA: Como os blocos de agarose são elásticos,A amostra permanece no lugar quando pressionada com pouca força.
- Detectar os sinais de fluorescência de interesse (aqui, autofluorescência e coloração de anticorpos anti-CD45) com as configurações apropriadas de filtro de excitação e emissão.
- Para a detecção do sinal de autofluorescência derivado do tecido conjuntivo, use um filtro de passagem de banda de 525/50 nm com um comprimento de onda de excitação de 488 nm (OPSL: 50 mW); A coloração com CD45 com um anticorpo acoplado a AF647 é detectada a 668 nm (filtro passa-banda: 680/30 nm) e a um comprimento de onda de excitação de 647 nm (laser de diodo: 50 mW).
- Escolha 4 μm como a distância entre os dois planos z individuais.
4. Pós-processamento de imagem
NOTA: Os dados de imagem digital adquiridos foram processados posteriormente com um software científico de análise e processamento de imagem 3D / 4D (veja a tabela de materiais).
- Abertura e pré-ajuste dos arquivos de dados.
- Depois de iniciar o software de análise, selecione o botão "Superar" no canto superior esquerdo. Para abrir as pilhas de imagens, escolha "Arquivo", "Abrir" e selecione uma pasta contendo os dados do primeiro canal adquirido. Escolha "Editar" e "Adicionar canais" para adicionar outros canais adquiridos.
NOTA: Dependendo do tamanho do dado e do sistema do computador, esse processo pode levar vários minutos. O protocolo apresentado demonstra todas as etapas para 2 canais de aquisição (autofluorescência e AF647). - Corrija as dimensões x, y e z voxel clicando em "Editar" e selecionando "Propriedades da imagem". Quando a nova janela for aberta, ajuste os parâmetros.
NOTA: Esta etapa depende do sistema de microscópio empregado e do formato de dados específico. Os valores correctos de xyz são críticos para tamanhos subseqüentes e medidas distantes. Na maioria dos casos, esses parâmetros são armazenados como metadados nos arquivos de micrografia. No entanto, se o arquivo paraO rmat não pode ser interpretado corretamente pelo software de análise, é importante inserir manualmente o tamanho do pixel. O tamanho do pixel nas dimensões x e y depende do tamanho do pixel da câmera, do binamento potencialmente aplicado e da ampliação da lente e do objetivo. O tamanho de pixel em z é equivalente ao tamanho de passo z autodefinido ( por exemplo, 4 μm).
- Primeiro, transforme o sinal de autofluorescência em grayscale, abrindo o "Ajuste da tela" ("Editar" e "Mostrar ajuste da tela"). Uma nova janela irá listar todos os canais abertos e as configurações de exibição para todos eles; Para alterar a cor padrão, selecione o canal de autofluorescência e escolha o estilo de exibição "branco". Clique em "ok" para aplicar.
- Para ajustar o nível de preto, volte para "Ajuste da tela" e ajuste o valor do nível de preto para excluir os sinais de fundo indesejados que não representam a estrutura da amostraS.
- Para fazer isso, use o triângulo superior esquerdo na barra de canais e arraste-o da esquerda para a direita.
NOTA: as alterações serão visualizadas imediatamente. Certifique-se de apenas suprimir sinais que não derivam da amostra. Os valores mínimos em segundo plano nunca devem ser "0" para evitar pixels de pitch-black, pois os sinais de ruído podem ser necessários para cálculos adicionais. Certifique-se de que todas as alterações de nível de preto sejam realizadas após a aquisição da imagem. Caso contrário, informações de amostra valiosas podem ser perdidas. O ajuste no nível de preto serve apenas para fins representativos. Para usar as mesmas configurações de exibição em diferentes amostras, valores precisos podem ser inseridos no campo numérico "min" abaixo da lista de canais. Isso é muito útil para análises quantitativas.
- Para fazer isso, use o triângulo superior esquerdo na barra de canais e arraste-o da esquerda para a direita.
- Execute o ajuste de intensidade, quer usando o triângulo superior direito para ajustar a intensidade do canal respectivo ou inserindo valores precisos no campo numérico "max" abaixo da canetaL lista.
- Execute o ajuste de contraste arrastando o triângulo inferior no meio da barra de canais para aumentar ou diminuir o valor da gama ou inserindo os valores precisos.
- Ajuste o canal AF647 de acordo com o canal de autofluorescência. Como uma diferença, defina a visualização do sinal AF647 para uma tabela de pesquisa de cores do mapa de calor. Faça isso escolhendo o modo de canal "fogo" em uma abordagem semelhante à da etapa 4.2.1.
NOTA: Como as intensidades globais do sinal são significativamente menores em comparação com o canal de autofluorescência, os níveis de preto geralmente são ajustados para valores muito mais baixos. Quanto ao canal de autofluorescência, o brilho deste canal geralmente é aumentado. - Selecione o "modo de mistura" para visualizar estruturas de tecido em detalhes. Analise todas as amostras de uma série com os mesmos valores de parâmetro.
- Para abrir praticamente o órgão antes da expo de cena 3DRt, aplique um plano de recorte no objeto 3D renderizado.
- Clique no ícone "Plano de corte" (tesoura) na lista de objetos. Dentro da vista da imagem, um quadro amarelo e um manipulador (fuso branco) aparecerão. Gire o fuso na extremidade mais fina com o mouse, alterando a orientação do plano de corte e mova a parte média mais espessa do fuso para selecionar a profundidade de corte desejada.
- Esconda o quadro e o manipulador desmarcando as respectivas caixas de seleção abaixo da lista de objetos e crie as instantâneas desejadas.
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Representative Results
A abordagem LSFM apresentada analisa a distribuição de leucócitos e a quantidade de corações murinos após a indução de miocardite grave. A Figura 1A explica o protocolo de pré-tratamento para os ratos CD11c.DTR transgênicos para indução de miocardite. Este passo representa o gatilho necessário para o recrutamento de leucócitos para o miocardio. Após uma aplicação DTX bem sucedida, os animais desenvolvem sintomas de doença grave, como fraqueza geral, anorexia e perda de peso no intervalo de 2-4 dias. Após 4 dias, os leucócitos são corados pelo iv . Aplicação de anticorpos anti-CD45 acoplados com fluorochrome antes da perfusão transcardial para remover o sangue da circulação. Se for realizado com sucesso, o coração e outros órgãos se tornam esbranquiçados. Posteriormente, o órgão é excisado, e a água dos tecidos é trocada com DBE por uma linha ascendente de etanol e uma incubação final em DBE. A Figura 1B mostra o cronogramaDos passos de incubação individuais em que o órgão sofre um encolhimento significativo. O órgão quimicamente limpo é então transferido para uma câmara de imagem cheia de DBE no suporte de tecido padrão do microscópio. Para estabilizar o órgão durante a aquisição da imagem 3D, é fixado por blocos de agarose transparentes. O posicionamento detalhado do espécime é visualizado na Figura 2 . A aquisição de toda uma pilha de imagens, composta por 2 canais (autofluorescência e anti-CD45), leva cerca de 20-30 min e gera um arquivo de dados de cerca de 16 GB. Finalmente, os dados resultantes são analisados como renderização 3D artificial em que a distribuição de leucócitos é exibida em uma vista de mapa de calor. Na Figura 3 (linha superior), as áreas fortemente inflamadas de um coração de um animal tratado com DTX podem ser percebidas pela aparência avermelhada / esbranquiçada. Um estudo mais detalhado do modelo 3D revela a concentração de leucócitos, especialmente em regiões do sistema de condução cardíaca, como o atriovente Obrador e as fibras de Purkinje. Em contraste, corações de animais tratados com PBS não mostram esse padrão de inflamação (faixa inferior).
Figura 1: Esquema de indução e preparação de amostras de miocardite induzida por toxina difteria. ( A ) O desenvolvimento da miocardite foi induzido por ele . Aplicação de toxina diftérica (100 ng / animal). Após 4 dias, a miocardite foi totalmente desenvolvida e um anticorpo anti-CD45 acoplado a AF647 (15 μg / animal) foi injetado iv . Para detectar leucócitos CD45 + . Os animais foram sacrificados duas horas depois por deslocação cervical, e os corações foram perfundidos com PBS / EDTA (5 mM) seguido por 4% de PFA. ( B ) Após a remoção, o órgão foi desidratado com uma série de etanol ascendente e finalmente foi removido por incubação durante a noite em éter dibenzilico..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema do Posicionamento da Amostra no Microscópio. O coração transparente quimicamente desobstruído (4) foi posicionado no suporte da amostra (2 e 5) e estabilizado com a ajuda de blocos de agarose limpos (6). Esta construção foi então submersa na cuvete de vidro cheia de DBE (3). Para aquisição, utilizou-se uma lente objetiva de 0,5 NA (1) com uma distância de trabalho de 5,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gráficos representativos 3D de todo ouMicroscopia de folha clara. Os ratos CD11c.DTR foram tratados intratraquealmente com DTX (linha superior) ou PBS (linha inferior). 4 dias depois, o desenvolvimento da miocardite, representado pela infiltração de leucócitos CD45 + , foi visualizado por microscopia de luz fluorescente. Para manchar as células CD45 + , um anticorpo anti-CD45 acoplado a AF647 foi injetado iv 2 h antes de sacrificar os camundongos. O sinal de autofluorescência do tecido conjuntivo é exibido em cinza, enquanto que o infiltrado CD45 + é mostrado nas cores do heatmap (azul: sinal baixo, branco: sinal alto). Cada linha é composta de 4 renderizações tridimensionais digitalizadas, demonstrando a situação dentro do órgão. A profundidade de corte em relação à parte frontal do coração é declarada acima das imagens individuais. A figura foi modificada de Mann et al. 15 . Barra de escala = 1 mm. Por favor, clique aquiPara ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
Na ciência da vida moderna, a visualização microscópica dos processos biológicos desempenha um papel cada vez mais importante. Neste contexto, muitos desenvolvimentos foram alcançados nos últimos dois séculos que ajudam a responder questões não abordáveis até este ponto,. Primeiro, tem havido uma tendência clara de aumentar fundamentalmente a capacidade de resolução de microscópios de luz. Com microscopia de iluminação estruturada (SIM) 21 , 22 , microscopia estimulada de depleção de emissão (STED) 23 e microscopia de localização foto-ativada (PALM) 24 , 25 ou microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) 26 , a limitação de resolução postulada pela primeira vez A difracção de luz 27 foi significativamente quebrada. O segundo desafio frequentemente orientado era observar o comportamento celular em um ambiente que se assemelhavaA condição natural o mais próximo possível. Neste contexto, o desenvolvimento de abordagens de imagem in situ ou in vivo foi forçado. Para superar a intensidade da penetração de luz limitada em tecidos biológicos complexos, a microscopia de 2 fótons 28 , 29 estabeleceu novos padrões neste campo de pesquisa.
No entanto, uma característica que todas essas técnicas de microscopia geralmente compartilham é o uso de objetivos de alta NA para garantir a melhor resolução possível. Embora ele resolva as microestruturas em maior detalhe, o uso de objetivos de alta NA restringe significativamente o campo de visão, bem como a distância de trabalho. Como conseqüência, o contexto biológico em termos do ambiente circundante geralmente fica fora de foco no sentido mais verdadeiro da palavra. Para reduzir essa lacuna, o desenvolvimento do LSFM recentemente ganhou interesse, fornecendo uma técnica de microscopia capaz de resolver estruturas fluorescentes em tamanho celularMas também para avaliar convenientemente toda a informação 3D de um espécime com um tamanho superior a 1 cm.
O protocolo descrito aqui apresenta um método de como empregar um ultramicroscópio para visualizar um infiltrado de leucócitos celulares em corações murinos inteiros. Após a indução bem sucedida de miocardite estéril em um modelo de rato CD11c.DTR 30 , o animal respectivo recebe uma injeção intravenosa de um anticorpo anti-CD45 acoplado com fluorochrome, que circula durante 2 h no animal vivo. Em princípio, ao realizar um post-mortem, a coloração do anticorpo total entre a fixação de órgãos e a desidratação da amostra deve ser possível. Infelizmente, a mancha de montagem total exige passos de incubação muito mais longos e, portanto, aumenta massivamente o tempo necessário para a geração da amostra ( ou seja, de 4 a 21 dias) 6 , 31 . Além disso, essa abordagem de coloração intravital não é apenas mais rápida, mas também oferecePenetração de tecido mais efetiva do anticorpo em comparação com um protocolo de coloração total 9 . Embora a eficiência de coloração absoluta não tenha sido quantificada, espera-se que uma grande proporção da população de leucócitos seja rotulada, dado que o sinal de fluorescência resultante é notavelmente forte. Tanto as proteínas fluorescentes como a própria rotulação de anticorpos sobrevivem em grande parte ao subsequente processo de limpeza, e ambas parecem ser estáveis durante um longo período de tempo. Deve também notar-se que um agente à base de solvente é usado para limpeza de tecidos. Isso impele massivamente uma abordagem de coloração total ao longo do processo de limpeza. O limpador de tecido à base de solvente é um fenômeno reversível, de modo que uma transferência do tecido limpo para um meio à base de água (como o PBS), que geralmente é empregada para coloração padrão de anticorpos, resultaria em uma amostra não transparente. Portanto, protocolos de coloração não padrão em solventes orgânicos teriam que ser estabelecidos i É necessário um procedimento de coloração de todo o suporte após o apagamento da amostra.
A perfusão cardíaca subsequente é absolutamente necessária para eliminar o máximo de sangue residual possível, uma vez que o sangue está devidamente eliminado nas etapas a seguir e piora dramaticamente os resultados da imagem. Depois de extrair o coração, a água do tecido é removida em uma linha ascendente de etanol. Este passo pode ser considerado como a primeira parte da limpeza química. A idéia é substituir a água do tecido por um meio de imersão que melhor corresponda ao índice de refração médio (RI) da amostra escolhida. DBE foi escolhido como o meio de imersão após o protocolo de Ertuk et al. 32 , com algumas modificações. DBE tem um índice de refracção de 1,55 (nD20), e quando comparado com outros agentes de limpeza, tais como álcool benzílico: benzoato de benzilo (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 ou sacarose (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13, melhor preservou os rótulos fluorescentes utilizados neste protocolo. Uma preservação de fluorescência similar foi produzida usando cinnamato de etil (ECI). Descrevemos seu uso em um estudo sobre a quantificação automatizada de glomérulos em rins nefríticos 9. O músculo O tecido, uma vez que se estima ter um índice de refração de 1,382 ± 0,004 33 , foi igualmente bem limpo com todas as substâncias que avaliamos 9. Portanto, o fator crucial para a escolha do DBE foi a preservação da fluorescência e não o potencial de limpeza. Mudança para este protocolo de limpeza passiva, o uso de um método ativo, como CLARITY 34 , 35 , onde a remoção de lipídios com o auxílio de uma corrente eletroforética resulta em tecidos fortemente limpos deve ser possível. No entanto, em contraste com essa água Com base no método de limpeza, o apagamento do DBE resulta em um endurecimento significativoDo tecido, acompanhado de menor encolhimento. Isso permite o fácil manuseio das amostras e não requer mais adaptações para a imagem, como a incorporação da amostra em um bloco de agarose. Portanto, a transferência deste protocolo para um método como CLARITY seria desafiadora, mas as pessoas demonstraram com sucesso o uso do ultramicroscópio escolhido (veja a tabela de materiais) com esta abordagem 3 . É importante avaliar cuidadosamente a potencial destruição de sinais de fluorescência endógena pelo método de limpeza de escolha. Como nunca trabalhamos com o CLARITY ou outros protocolos de limpeza ativa, não podemos comentar a reação do fluorochrome nesses sistemas. O pior caso seria que uma mancha de anticorpos de montagem total subseqüente deveria ser realizada.
Este método é facilmente ajustável a outros órgãos, como os pulmões murinos; rins; Cérebro; E até os ossos, como fêmur, tíbia ou calvária. Enquanto avalia O potencial de aplicação em novas regiões de tecido e / ou novas estratégias de rotulagem fluorescente, o maior desafio geralmente é projetar o protocolo de forma a que a fluorescência seja mantida viva. O meio de imersão à base de solvente 13 e os agentes de desidratação 36 têm um impacto directo sobre a integridade dos fluorocromos. Recomenda-se o uso de derivados de AlexaFluor, pois parecem ser bastante estáveis em vários protocolos. No entanto, muitas vezes, outros fluorocromos devem ser empregados. Neste caso, vale a pena avaliar o uso de outros agentes de limpeza ( por exemplo, Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , salicilato de metilo 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 e ECI 9 ) e outras alternativas de desidratação ( por exemplo, metanol e tetrahidrofurano 13 ).
Como em muitas outras abordagens LSFM, o processo de posicionamento do coração transparente sob o microscópio é exigente. Os sistemas comerciais fornecem espaço suficiente para instalar amostras do tamanho dos órgãos do mouse, incluindo lobos pulmonares, rins ou corações. No entanto, no momento, não há amostras padronizadas para esses espécimes disponíveis. Portanto, tivemos que estabelecer um aparelho de montagem usando blocos de agarose limpos e re-formados. Ainda assim, um certo número de conjuntos de dados de imagem teve que ser descartado devido a artefatos de movimento. Este problema também foi aumentado devido ao longo tempo de aquisição do microscópio usado aqui. Potencialmente, a geração de grandes conjuntos de dados se beneficiará significativamente de sistemas mais rápidos, mas ainda não tivemos a chance de usar um microscópio mais rápido. Nosso microscópio (ver tabela oF materiais) foi construído em torno de um corpo de microscópio de zoom e foi equipado com um módulo laser, uma câmera sCMOS com um tamanho de pixel de 6,5 x 6,5 mm 2 e óptica de detecção com uma ampliação óptica variando de 1,26X a 12,6X. A parte central da óptica de detecção foi uma lente objetiva de 0,5 NA com uma distância de trabalho de 5,5 mm, o que permitiu a observação de um grande campo de visão variando entre 1,7 e 17,6 mm na diagonal. Isso foi grande o suficiente para realizar o corte óptico de corações murinos inteiros. A correção da aberração cromática, entre 400 e 800 nm, foi alcançada pelo ajuste mecânico do objetivo. Quando necessário, as correções cromáticas foram realizadas durante o pós-processamento assistido por computador. A aberração esférica, também em espécimes mais espessos, não foi observada neste sistema e, portanto, não precisava ser corrigida.
Em suma, apresentamos aqui um protocolo robusto para a limpeza e análise química de lDistribuição de eucócitos dentro de corações murinos usando microscopia de folha clara. Neste ponto, é importante enfatizar que este procedimento LSFM dificilmente pode resolver estruturas de tecido fino, como capilares. A este respeito, este LSFM é bem adequado para caracterizar a distribuição de células imunes gerais e para descrever potencial acumulação de células imunitárias dentro do órgão. No entanto, é preciso ter em mente que o LSFM em geral não é a escolha perfeita para analisar e quantificar a localização celular em subestruturas de pequenos órgãos, como a vasculatura. Para responder a tais perguntas, o LSFM deve ser complementado com outros métodos, como a histologia ou a microscopia de 2 fótons. Outras limitações deste protocolo incluem a restrição a um máximo de 3-4 cores - o canal azul é difícil de usar para outros sinais além da autofluorescência - a restrição às amostras fixas e o tamanho máximo da amostra de 30 mm x 30 mm x 15 milímetros. Além disso, o cheiro forte e a toxicidade aguda do DBE devem ser tomadasN em conta. Se o último ponto é problemático, o cinnamato de etil pode ser usado como agente de compensação alternativo 9 . A principal vantagem de escolher esta técnica de microscopia é a capacidade de analisar o órgão inteiro ao mesmo tempo. Nas análises convencionais das seções de tecido histológico de hematoxilina e manchas de eosina, formadas por formalina e parafina (FFPE), há uma grande probabilidade de perder áreas espaciais importantes, a menos que toda seção seja analisada. Além disso, o microscópio de luz não só permite o corte virtual da amostra em todos os planos tridimensionais, mas também oferece esse potencial sem destruir o espécime ou causar artefatos de corte. Se necessário, o órgão fixo poderia posteriormente ser processado para novas análises, como uma luz correlativa e microscopia eletrônica abordagens para resolver resolutamente regiões específicas de interesse. Um modelo para esse estudo pode ser encontrado no trabalho de Karreman et al. , Onde a aposta de correlaçãoUma pilha de imagens de microscopia de 2 fótons e dados de microscopia eletrônica tridimensional foram mostrados com sucesso 41 . Outra abordagem promissora poderia ser a combinação deste protocolo com o método uDISCO recentemente publicado que também é baseado em um solvente orgânico e que permitiria a investigação de órgãos muito maiores por um padrão LSFM 42 .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa no laboratório Gunzer foi apoiada pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (concessão nº 0315590 AD) e pela Fundação Alemã de Pesquisa (número de concessão GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Agradecemos ainda mais o IMCES pelo suporte técnico e Sebastian Kubat para ajudar com a modelagem de desenhos animados em 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
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