Summary
Här beskrivs en mikroskopisk metod för ljusskikt för att visualisera hjärt-CD45 + leukocytinfiltratet i en murin modell av aseptisk fulminant myokardit, vilket induceras av behandling av CD11c.DTR-mus från intratracheal difteritoxin.
Abstract
Fluorescensmikroskopi (LSFM), i kombination med kemiska clearingprotokoll, har blivit guldstandard för analys av fluorescensmärkta strukturer i stora biologiska prover och ligger ner till cellulär upplösning. Under tiden möjliggör den ständiga förädlingen av underliggande protokoll och den förbättrade tillgängligheten av specialiserade kommersiella system oss att undersöka mikrostrukturen hos hela musorganen och till och med tillåta karakterisering av cellulärt beteende i olika metoder för levande cellbildningar. Här beskriver vi ett protokoll för den rumsliga helmonterade visualiseringen och kvantifieringen av CD45 + leukocytpopulationen i inflamma mushjärtan. Metoden använder en transgen musestam (CD11c.DTR) som nyligen visat sig fungera som en robust inducerbar modell för studier av utvecklingen av fulminant dödlig myokardit, kännetecknad av dödlig hjärtarytmi. Detta protokoll innefattar myokardit induktion, intravitAl antikroppsmedierad cellfärgning, organpreparation och LSFM med efterföljande datorassisterad bild efterbehandling. Även om den presenteras som en mycket anpassad metod för vår specifika vetenskapliga fråga, representerar protokollet ett lättjusterbart system som också kan rikta sig till helt olika fluorescerande strukturer i andra organ och även i andra arter.
Introduction
Under utvecklingen av ljusmikroskopi uppträdde många specialiserade former, alla utvecklade för att minimera begränsningar i visualiseringsprocessen för särskilda prover. En sådan metod är fluorescensmikroskopi med lätta blad (LSFM). Först utvecklades 1903 av Siedentopf och Zsigmondy 1 och hittade sina första grundläggande biologiska tillämpningar i början av 1990-talet 2 , har LSFM blivit det mest kraftfulla mikroskopiska verktyget hittills för visualisering av stora exemplar, såsom intakta musorgan, med en fluorescenssignalupplösning Ner till mobilnivån. På grund av dessa fördelar, i kombination med dess potential för live-cell imaging, heter Nature Methods LSFM "Årets metod 2014 3. "
Som namnet antyder utförs provbelysningen i en LSFM av lätta ark, vilka är orienterade vinkelrätt mot axeln för det använda objektet fEller utsläpps-ljusinsamling och efterföljande bildbildning. Ljusskivan genereras vanligtvis antingen genom att fokusera breda, kollimerade laserstrålar med en cylindrisk lins eller genom snabb rörelse av smala, fokuserade laserstrålar i bara ett horisontellt eller vertikalt plan 4 , 5 . På så sätt lyser endast bildbildningsoptikens fokalplan, typiskt med en tjocklek av 1-4 μm. Följaktligen elimineras eller genereras kraftigt 6,7 för ett fluorescerande prov placerat i belysningsplanet, både genereringen av spridd ljus och effekterna av fotobildning från områden ovanför eller under brännplanet. Eftersom alla out-of-focus-planer inte lyser, utelämnas fotobeläggningseffekter i dessa områden. Till skillnad från standard-konfokal- eller multi-fotonmikroskopi skiljer sig vägarna för upplyst och emitterat ljus från varandra, så den slutliga bildkvaliteten Ity beror inte på den perfekta fokuseringen av excitationsljusstrålen genom målen. Beroende på den underliggande frågan är det därför möjligt att använda målsättningar med ett enormt synfält (FOV) så att det största möjliga området av det upplysta planet kan avbildas utan att några delelement flyttar i xy-riktningen.
I moderna LSFM-system fångas en fluorescerande bild av den genererade optiska sektionen på en högkänslig laddningskopplad enhet (CCD) eller komplementära metalloxidhalvledarkameror (CMOS) som kan förvärva hela synfältet (FOV) I mikrosekunder. Genom att flytta provet genom ljusarket och genom att skaffa bilder vid definierade z-steg är det därför möjligt att erhålla full 3D-information av ett prov i en rimlig tidsperiod 8 , 9 , vilket gör denna teknik tillämplig för levande cell Studier 10 ,Röv = "xref"> 11 , 12 .
Trots att LSFM erbjuder en snabb, känslig och fluorescensvänlig metod är ljusöverföring genom provet fortfarande en viktig fråga, särskilt när stora biologiska prover är målet för en 3D-analys. Ljusöverföring modifieras kritiskt av fysiska aspekter av absorption och genom ljusspridning vid gränssnitt av strukturer med olika brytningsindex 13 . Därför kombineras LSFM när bildbehandlingsprov flera millimeter i storlek kombineras med clearingprotokoll för att göra proven optiskt transparent. Dessa tekniker är baserade på tanken att avlägsna vatten från respektive biologiska vävnad och utbyta den med vatten- eller (organiskt) lösningsmedelsbaserat nedsänkningsmedium, vilka väljs för att snävt matcha brytningsindexen för de specifika målvävnadskomponenterna. Som ett resultat minimeras lateral ljusspridning och alla våglängderAv ljus kan mycket mer effektivt passera genom vävnaden 13 . I många fall uppträder biologiska prover som behandlas på detta sätt makroskopiskt kristallklart, vilket gör att LSFM kan utföras, även på hela musorganen, med hjälp av långa arbetsavstånd, lågförstoringsmål.
Här presenterar vi ett preparatprotokoll för storprovsbildning i ett lakmikroskop (se materialtabellen), som vi har fastställt för att undersöka det cellulära hjärtinfiltratet i en murin modell av myokardit 15 . CD11c.DTR-möss uttrycker primat difteritoxinreceptorn (DTR) under kontroll av CD11c-promotorn 16 . Följaktligen görs celler i dessa möss, vilka uttrycker CD11c tillsammans med DTR, känsliga för exotoxinet av Corynebacterium difteri (difteritoxin, DTX); Den systemiska behandlingen av dessa djur med DTX resulterar i en uttömning av alla CD11c + cells. CD11c är ett integrin och är som en cell-ytreceptor för en mängd olika lösliga faktorer inblandad i aktiverings- och mognadsprocesser, huvudsakligen i celler av den monocytiska linjen 17 . Följaktligen har CD11c.DTR-musmodellen använts intensivt för att studera rollen av dendritiska celler och makrofagundergrupper i sammanhanget med många olika immunologiska frågor. Över tiden har det rapporterats att CD11c.DTR-möss som behandlas systemiskt med DTX kan utveckla negativa biverkningar och kan visa starkt förhöjda dödligheten 18 , 19 . Nyligen kunde vi identifiera den underliggande dödsorsaken 15 , som beskriver utvecklingen av fulminant myokardit efter intratracheal DTX-applikation hos dessa djur. Toxinutmaningen orsakade cellulär förstöring, inklusive i centrala delar av stimulansöverföringssystemet i hjärtat. Detta följdes av massiva CD45+ Infiltration av leukocyter, vilket slutligen leder till dödliga hjärtarytmier. I detta fall var inte bara leukocytpopulationens utseende viktigt, utan också dess rumsfördelning i hjärtat. Den här experimentella frågan är en utmaning för modern mikroskopisk bildbehandling, som vi har löst genom ett lätta arkmikroskopi-tillvägagångssätt som stöds av intravital antikroppsfärgning och ett organiskt lösningsmedelsbaserat optiskt clearingsprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med EU-riktlinjer och godkändes av de relevanta lokala myndigheterna i Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Tyskland). Djuren användes och hölls under specifika patogenfria (SPF) betingelser.
1. Induktion av myokardit med difteritoxin (DTX)
- Förbered DTX-lösningen för induktion av myokardit genom utspädning av DTX-stamlösningen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en 1 μg / ml arbetslösning.
- Applicera 100 μL av denna lösning intratrakealt (den) i 8 till 10 veckors gamla CD11c.DTR-möss ( ca 5 ng / g kroppsvikt (bw)), såsom visas av Hasenberg et al. För appliceringen av en svampsporususpension 20 .
OBS: Den intraperitoneala applikationen av toxinet kan leda till en liknande induktion avDödlig myokardit. Detta tillvägagångssätt måste dock först valideras.- För den appliceringen bedöva djuren genom en intraperitoneal (ip) injektion av 100 mg / kg kroppsvikt ketamin och 10 mg / kg kroppsvikt xylazin.
- Efter att ha nått djup narkos (tå nypa test) intubera djuren genom att använda en 22 G inwelt venös kateter genom munhålan. Kontrollera att linsröret är korrekt placerat genom att ventilera djuren med en andningsskydd med små djur med en hastighet av 250 andetag per minut och en inhalationsvolym på 250 μl per andetag, vilket också visas av Hasenberg et. al. 20 .
OBS: Vid korrekt positionering ändras djupets andningshastighet enligt de applicerade ventilationsinställningarna. - Koppla bort ventilationssystemet och sätt in 100 μL DTX-lösningen eller lika mycket PBS som en kontroll genom katetern in i lungan och fortsätt att ventilera djuren i ytterligare 1 min.
- Låt djuren återhämta sig från anestesi och övervaka den allmänna hälsotillståndet och kroppsviktförändringen i 4 dagar.
OBS: Beroende på den genetiska bakgrunden, musstammen eller inledningsvikten kan svårighetsgraden och inledningen av myokardit variera och bör bestämmas först.
2. Provberedning för ljusarkmikroskopi
- 4 dagar efter toxinapplikation bedövar mössen genom att spola en induktionskammare med en förångad 2% isofluran / syreblandning. Injicera 15 μg av en direkt märkt anti-CD45-antikropp (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) i 50 | il PBS intravenöst (iv) med användning av den retro-orbitala appliceringsvägen, vilken säkerställer en mycket snabb och hög noggrann tillämpning av Korrekt mängd antikropp.
ANMÄRKNING: Det önskade djupet av narkos har uppnåtts när mössna är liggande och reagerar inte på tånklämningstestning. - Efter 2 timmars inkubation, offra mössen genom cervikal dislokation anD perfekta hjärtan in situ med 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
- Exponera hjärtat och injicera perfusionslösningen i höger kammare med hjälp av en 21 G kateter. Perfuse med långsamt, konstant tryck och se till att blodet kan tömmas efter att ha klippt upp aortan.
OBS! Denna transcardiella perfusion kan resultera i mindre preparat artefakter, vilket kan störa den sista 3D-visualiseringen av organet. Därför kan avancerade djurexperimenter utföra perfusion genom den sämre vena cavaen, som exciserar buken aorta.
- Exponera hjärtat och injicera perfusionslösningen i höger kammare med hjälp av en 21 G kateter. Perfuse med långsamt, konstant tryck och se till att blodet kan tömmas efter att ha klippt upp aortan.
- För kemisk fixering, perfekta hjärtat genom samma urtagning med 5 ml 4% paraformaldehyd (PFA). Håll katetern på plats och sätt helt enkelt en ny spruta fylld med PFA. Perfuse med långsamt och konstant tryck.
OBS: Paraformaldehyd är mycket giftigt; Undvik kontakt med hud, ögon och andra slemhinnor.- Ta försiktigt hjärtat med serrated tanglar; puLl det lite uppåt; Och skära alla vävnadsförbindelser, inklusive inkommande och utgående artärer och vener. Förvara organet i ytterligare 4 timmar i 4% PFA för ytterligare fixering.
- För att dehydrera ordet, inkubera hjärtat i en stigande etanolserie med 50%, 70% och två gånger vid 100%, vardera i 12 timmar, vid 4 ° C i mörkret. Använd här svarta 5 ml polypropenreaktionsrör, så att de ständigt roterar i en rörrotator med en långsam rotationshastighet för att förhindra luftbubblbildning.
- Komplett provberedning genom kemisk rening. För att göra hjärtan transparenta, inkubera dem i 98% dibensyleter (DBE) under konstant rotation över natten.
OBS: DBE är irriterande för ögon, hud och andningsorgan.
3. Ljusmikroskopi
- Utför LSFM med hjälp av lakmikroskopet (se materialtabellen). Placera provet på mikroskopets standardprovhållare i DBE-fyllda cuVette, som är lämplig för prov upp till 30 mm x 30 mm x 15 mm.
- Håll provet ordentligt på plats under bildförvärv med hjälp av dehydrerade och rensade agarosblocken.
- För att framställa agarosblocken häll 2% smält agaros i en form (15 mm x 15 mm x 5 mm). Låt agarosen svalna tills den stelnar.
- Dehydrera den i en stigande etanolserie (50%, 70% och två gånger vid 100%). Inkubera agarosblocket över natten i 98% DBE. Förvara agarosen i DBE tills den används.
OBS: Eftersom agarosen huvudsakligen består av vatten, kan inkubationstiderna för varje dehydratiseringssteg förlängas, beroende på blockets storlek.
OBS: DBE är irriterande för ögonen, huden och andningsorganen. - Vid behov skär det preparerade agarosblocket till önskad form med en vass skalpell. Typiskt skär prism- eller kilformade former som placeras vid provadapterns kanter.
OBS: Eftersom agarosblocken är elastiska,Provet stannar på plats när det pressas med liten kraft.
- Detektera fluorescenssignalerna av intresse (här, autofluorescens och anti-CD45 antikroppsfärgning) med lämpliga excitations- och emissionsfilterinställningar.
- För detektering av den bindvävs-härledda autofluorescenssignalen, använd ett 525/50 nm bandpassfilter vid en exciteringsvåglängd av 488 nm (OPSL: 50 mW); CD45-färgning med en AF647-kopplad antikropp detekteras vid 668 nm (bandpassfilter: 680/30 nm) och vid en excitationsvåglängd av 647 nm (diodlaser: 50 mW).
- Välj 4 μm som avståndet mellan de två individuella z-planen.
4. Bild efterbehandling
OBS! Den förvärvade digitala bilddata bearbetades vidare med en vetenskaplig 3D / 4D bildbehandling och analysprogramvara (se materialtabellen).
- Öppning och förinställning av datafilerna.
- Efter att du har startat analysprogrammet, välj "Surpass" knappen i övre vänstra hörnet. För att öppna bildstaplarna, välj "Arkiv", "Öppna" och välj en mapp som innehåller data från den första förvärvade kanalen. Välj "Redigera" och "Lägg till kanaler" för att lägga till ytterligare förvärvade kanaler.
OBS: Beroende på datastorlek och datorsystem kan denna process ta flera minuter. Det presenterade protokollet visar alla steg för 2 uppköpskanaler (autofluorescens och AF647). - Korrigera x-, y- och z-voxeldimensionerna genom att klicka på "Redigera" och välja "Bildegenskaper". När det nya fönstret öppnas, justera parametrarna.
OBS! Detta steg beror på det anställda mikroskopsystemet och det specifika dataformatet. Korrekta xyz-värden är kritiska för efterföljande storlek och avlägsna mätningar. I de flesta fall lagras dessa parametrar som metadata i mikrograffilerna. Om filen emRmat kan inte tolkas korrekt av analysprogrammet, är det viktigt att man manuellt anger pixelstorleken. Pixelstorleken i x- och y-måtten beror på kamerans pixelstorlek, den potentiellt applicerade binningen och linsen och objektivförstoringen. Pixelstorleken i z motsvarar den självdefinierade zstegstorleken ( t.ex. 4 μm).
- Förvandla först autofluorescenssignalen till gråskala genom att öppna "Displayjustering" ("Redigera" och "Visa bildskärmsjustering"). Ett nytt fönster kommer att lista alla öppna kanaler och bildskärmsinställningarna för dem alla; För att ändra dess standardfärg, välj autofluorescenskanalen och välj den "vita" visningsstilen. Klicka på "ok" för att ansöka.
- För svart nivåjustering, gå tillbaka till "Displayjustering" och justera värdet för svart nivå för att utesluta oönskade bakgrundssignaler som inte representerar provstrukturens.
- För att göra det, använd den övre vänstra triangeln på kanalfältet och dra den från vänster till höger.
OBS: Ändringar kommer att visualiseras omedelbart. Se till att endast undertrycka signaler som inte härrör från provet. Minimivärden i bakgrunden ska aldrig vara "0" för att undvika pitch-black pixlar, eftersom ljudsignalerna kan behövas för ytterligare beräkningar. Se till att alla svarta nivåändringar utförs efter bildförvärv. Annars kan värdefull provinformation gå förlorad. Svartjusteringen justerar bara representativa ändamål. För att använda samma visningsinställningar över olika prover kan exakta värden matas in i "min" sifferfältet under kanallistan. Detta är till stor hjälp för kvantitativa analyser.
- För att göra det, använd den övre vänstra triangeln på kanalfältet och dra den från vänster till höger.
- Utför intensitetsjustering antingen genom att använda den övre högra triangeln för att justera respektive kanalintensitet eller genom att ange exakta värden i "max" numeriskt fält under channeJag listar.
- Utför kontrastjustering genom att dra den nedre triangeln mitt i kanalfältet för att öka eller minska gammvärdet eller genom att ange exakta värden.
- Justera AF647-kanalen enligt autofluorescenskanalen. Som en skillnad, sätt visualiseringen av AF647-signalen till en värmekarta färguppslagstabell. Gör detta genom att välja kanalläget "brand" i ett tillvägagångssätt som liknar det i steg 4.2.1.
OBS! Eftersom de totala signalintensiteterna är signifikant lägre jämfört med autofluorescenskanalen, justeras de svarta nivåerna vanligtvis till mycket lägre värden. När det gäller autofluorescenskanalen ökas ljusstyrkan för denna kanal vanligen. - Välj "blandningsläge" för att visualisera vävnadsstrukturerna i detalj. Analysera alla prov från en serie med samma parametervärden.
- För att praktiskt taget klippa upp orgeln före 3D-scenens expoRt, applicera ett klippplan på det gjorda 3D-objektet.
- Klicka på ikonen "Klippplan" (sax) i objektlistan. Inuti bildvyn visas en gul ram och en manipulator (vit spindel). Rotera spindeln vid det tunnare änden med musen, varigenom klippningsplanets orientering ändras och flytta den tjockare mittdelen av spindeln för att välja önskat skärpedjup.
- Dölj rammen och manipulatorn genom att avmarkera respektive kryssrutor under objektlistan och skapa önskade ögonblicksbilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterade LSFM-metoden analyserar leukocytfördelningen och mängden i murina hjärtan vid induktion av allvarlig myokardit. Figur 1A förklarar förbehandlingsprotokollet för de transgena CD11c.DTR-mössen för myokarditinduktion. Detta steg representerar den nödvändiga utlösaren för rekrytering av leukocyter till myokardiet. Efter framgångsrik DTX-applikation utvecklar djuren svåra sjukdomssymptom, såsom allmän svaghet, anorexi och viktminskning inom intervallet 2-4 dagar. Efter 4 dagar färgas leukocyter av iv . Applicering av fluorokrom-kopplad anti-CD45-antikropp före transkardiell perfusion för att avlägsna blodet från cirkulationen. Om framgångsrikt utförs, blir hjärtat och andra organ vitaktiga. Därefter exciteras orgelet och vävnadsvatten utbytes med DBE med en stigande etanolrad och en slutlig inkubation i DBE. Figur 1B visar tidtabellenAv de individuella inkubationstegen i vilka organet genomgår signifikant krympning. Det kemiskt rensade organet överförs sedan till en DBE-fylld bildkammare på standardmikroskopens vävnadshållare. För att stabilisera orgeln under 3D-bildförvärv fixeras det genom transparenta agarosblock. Den detaljerade positioneringen av provet visualiseras i figur 2 . Förvärvet av en hel bildstapel, som består av 2 kanaler (autofluorescens och anti-CD45), tar ungefär 20-30 minuter och genererar en datafil på cirka 16 GB. Slutligen analyseras de resulterande data som artificiell 3D-rendering, i vilken leukocytfördelningen visas i en värmekartvy. I Figur 3 (övre raden) kan de starkt inflammerade områdena i ett hjärta av ett DTX-behandlat djur uppfattas av deras röda / vita utseende. En mer detaljerad studie av 3D-modellen avslöjar leukocytkoncentrationen, speciellt i områden i hjärtledningssystemet, såsom atriovent Ricularbunt och Purkinje-fibrerna. Däremot visar hjärtan hos PBS-behandlade djur inte det här inflammationsmönstret alls (nedre raden).
Figur 1: Induktionsschema och provberedning av difteritoxininducerad myokardit. ( A ) Myokarditutveckling inducerades av den . Applicering av difteritoxin (100 ng / djur). Efter 4 dagar hade myokardit utvecklats fullt och en AF647-kopplad anti-CD45-antikropp (15 | ig / djur) injicerades iv . Att detektera CD45 + leukocyter. Djur offrades 2 timmar senare genom cervikal dislokation och hjärtan perfusionerades med PBS / EDTA (5 mM) följt av 4% PFA. ( B ) Efter avlägsnande avorganiserades organet med en stigande etanolserie och slutligen rensades genom inkubation över natten i dibensyleter..com / filer / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schema för provplacering i mikroskopet. Det kemiskt rensade, transparenta hjärtat (4) placerades på provhållaren (2 och 5) och stabiliserades med hjälp av rensade agarosblock (6). Denna konstruktion nedsänktes sedan i den DBE-fyllda glaskuvetten (3). För förvärv användes en 0,5 NA objektivlins (1) med ett arbetsavstånd på 5,5 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa 3D-återgivningar av hela ellerGan Light-sheet Microscopy. CD11c.DTR-möss behandlades intratrakealt med DTX (övre raden) eller PBS (nedre raden). 4 dagar senare visualiserades utvecklingen av myokardit, som representerades av CD45 + leukocytinfiltrering, genom fluorescensljusmikroskopi. För att fläcka CD45 + -cellerna injicerades en anti-CD45-antikropp kopplad till AF647 iv 2 h före avlivning av mössen. Autofluorescenssignalen för bindväv visas i grått, medan infiltrera CD45 + visas i värmekortfärger (blå: låg signal, vit: hög signal). Varje rad består av 4 digitalt klippade 3D-renderingar som visar situationen i orgeln. Klippdjupet i förhållande till hjärtans främre del anges ovanför de enskilda bilderna. Figuren har modifierats från Mann et al. 15 . Skala bar = 1 mm. Vänligen klicka härFör att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modern livsvetenskap spelar den mikroskopiska visualiseringen av biologiska processer en allt viktigare roll. I detta sammanhang har många utvecklingar uppnåtts under de senaste två århundradena som hjälper till att svara på frågor som inte kan adresseras till denna punkt. För det första har det varit en tydlig tendens att fundamentalt öka upplösningsförmågan hos ljusmikroskop. Med strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) 21 , 22 , stimulerad utsläppsdepletion (STED) -mikroskopi 23 och fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) 24 , 25 eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) 26 , den en-postulerade upplösningsbegränsningen Till ljusdiffraktion 27 var signifikant bruten. Den andra ofta riktade utmaningen var att observera cellulärt beteende i en miljö som liknarDet naturliga tillståndet så nära som möjligt. I detta sammanhang tvingades utvecklingen av in situ eller in vivo imaging approaches. För att övervinna det begränsade ljuspenningsdjupet i komplexa biologiska vävnader har 2-fotonmikroskopi 28 , 29 satt nya standarder inom detta forskningsfält.
En funktion som alla dessa mikroskopitekniker brukar dela med är dock att NA-mål används för att garantera bästa möjliga upplösning. Även om det löser mikrostrukturer i större detalj begränsar användningen av hög NA-mål betydligt synfältet samt arbetsavståndet. Följaktligen blir det biologiska sammanhanget när det gäller den omgivande miljön ofta ur fokus i ordets renaste mening. För att avsluta detta gap har LSFM utveckling nyligen fått intresse, vilket ger en mikroskopi teknik som kan lösa fluorescerande strukturer i cellstorlekMen också att bekvämt bedöma hela 3D-informationen för ett prov med en storlek på mer än 1 cm.
Protokollet som beskrivs här presenterar en metod för hur man använder ett ultramikroskop för att visualisera ett cellulärt leukocytinfiltrat i hela murina hjärtan. Efter den framgångsrika induktionen av steril myokardit i en CD11c.DTR-musmodell 30 mottager respektive djur en iv-injektion av en fluorokrom-kopplad anti-CD45-antikropp, som cirkulerar i 2 h i levande djur. I princip, genom att utföra en post mortem, bör den fullständiga antistofffärgningen mellan organfixering och provdehydrering vara möjlig. Tyvärr kräver helmonterad färgning mycket längre inkubationssteg och ökar därför kraftigt den tid som krävs för provgenerering ( dvs 4-21 dagar) 6 , 31 . Dessutom är detta intravitala färgningsförfarandet inte bara snabbare, men levererar ocksåEffektivare vävnadspenetration av antikroppen jämfört med ett helmonterat färgningsprotokoll 9 . Fastän den absoluta färgningseffektiviteten inte har kvantifierats förväntas en stor andel av leukocytpopulationen märkas, eftersom den resulterande fluorescenssignalen är anmärkningsvärt stark. Både fluorescerande proteiner och antikroppsmärkning i sig överlever i huvudsak den efterföljande clearingsprocessen, och båda verkar vara stabila under en lång tidsperiod. Det bör också noteras att ett lösningsmedelsbaserat medel används för vävnadsrening. Detta hindrar massivt en helmonterad färgning tillvägagångssätt efter clearingprocessen. Den lösningsmedelsbaserade vävnadsclearingen är ett reversibelt fenomen, så en överföring av den rensade vävnaden till ett vattenbaserat medium (såsom PBS), som vanligtvis används för standard antikroppsfärgning, skulle resultera i ett osynligt prov. Därför måste icke-standardfärgningsprotokoll i organiska lösningsmedel etableras i Fa full-mount färgning procedur behövs efter provröjning.
Den efterföljande hjärtperfusionen är absolut nödvändig för att eliminera så mycket resterande blod som möjligt, eftersom blodet är dåligt rensat i följande steg och försämrar dramatiskt bildbildningsresultaten. Efter att ha tagit ut hjärtat avlägsnas vävnadsvattnet i en stigande etanolrad. Detta steg kan ses som den första delen av kemisk rening. Tanken är att ersätta vävnadsvattnet med ett nedsänkningsmedium som bättre matchar det genomsnittliga brytningsindexet (RI) för det valda provet. DBE valdes som nedsänkningsmediet enligt protokollet från Ertuk et al. 32 , med några modifieringar. DBE har ett brytningsindex av 1,55 (nD20) och när det jämfördes med andra rensningsmedel, såsom bensylalkohol: bensylbensoat (BABB; RI (nD20) = 1,56) 6 , 7 eller sackaros (RI (nD20) = 1,44 )F "> 13, bibehölls bäst de fluorescerande etiketterna som användes i detta protokoll. En liknande fluorescensbehållning gavs med användning av etylkinnamat (ECI). Vi har beskrivit dess användning i en studie om den automatiserade kvantifieringen av glomeruli hos nefretiska njurar 9 . Vävnad, som en gång uppskattats ha ett brytningsindex på 1,382 ± 0,004 33 , var lika välklarat med alla ämnen som vi utvärderade 9. Därför var den avgörande faktorn för valet av DBE fluorescensbehållandet och inte clearingspotentialen. Ändra till detta passiva clearingprotokoll, användningen av en aktiv metod såsom CLARITY 34 , 35 , där avlägsnandet av lipider med hjälp av en elektroforetisk ström resulterar i starkt rensade vävnader, bör vara möjligt. I motsats till ett sådant vatten -baserad clearingmetod resulterar DBE-clearingen i ett betydande härdandeAv vävnaden, åtföljd av mindre krympning. Detta möjliggör enkel hantering av proverna och kräver ingen ytterligare anpassningar för avbildning, såsom inbäddning av provet i ett agarosblock. Därför skulle överföringen av detta protokoll till en metod som CLARITY vara utmanande, men människor har framgångsrikt visat användning av det valda ultramikroskopet (se materialtabellen) med detta tillvägagångssätt 3 . Det är viktigt att noggrant utvärdera den potentiella förstöringen av endogena fluorescenssignaler med valfri röjningsmetod. Eftersom vi aldrig har arbetat med CLARITY eller andra aktiva clearingprotokoll kan vi inte kommentera fluorokromreaktionen i dessa system. Det värsta fallet skulle vara att en efterföljande helmonterad antikroppsfärgning skulle behöva utföras.
Denna metod är lätt att justera till andra organ, såsom murina lungor; njurar; hjärnor; Och även ben, såsom lårbenet, tibia eller calvaria. Medan utvärdering Ng applikationspotentialen på nya vävnadsområden och / eller nya fluorescerande märkningsstrategier, är den största utmaningen oftast att utforma protokollet på ett sätt som fluorescensen hålls vid liv. Det lösningsmedelsbaserade nedsänkningsmediet 13 och dehydratiseringsmedlen 36 har en direkt inverkan på fluorokromernas integritet. Användningen av AlexaFluor-derivat rekommenderas, eftersom de verkar vara ganska stabila i olika protokoll. Men ofta måste andra fluorokrom användas. I detta fall är det definitivt värt att utvärdera användningen av andra clearingmedel ( t.ex. Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , metylsalicylat 40 , 3Disco 32 , BABBLass = "xref"> 6 och ECI 9 ) och andra dehydreringsalternativ ( t ex metanol och tetrahydrofuran 13 ).
Som i många andra LSFM-tillvägagångssätt kräver processen för positionering av det transparenta hjärtat under mikroskopet. Kommersiella system ger tillräckligt med utrymme för att installera prover storleken på musorgan, inklusive lunglober, njurar eller hjärtan. För närvarande finns dock inga standardiserade provhållare för dessa exemplar tillgängliga. Därför var vi tvungna att etablera en monteringsapparat med hjälp av rensade och omformade agarosblock. Fortfarande måste ett visst antal bilddatasatser kasseras på grund av rörelseartefakter. Detta problem ökade också på grund av den långa förvärvstiden av mikroskopet som används här. Potentiellt kommer genereringen av stora datamängder att dra nytta av snabbare system, men vi har inte chansen att använda ett snabbare mikroskop ännu. Vårt mikroskop (se tabell oF material) byggdes runt en zoommikroskopkropp och var utrustad med en lasermodul, en sCMOS-kamera med en pixelstorlek på 6,5 x 6,5 mm 2 och detektionsoptik med ett optiskt förstoringsområde från 1,26x till 12,6x. Den centrala delen av detektionsoptiken var en 0,5 NA objektivlins med ett arbetsavstånd på 5,5 mm vilket möjliggjorde observation av ett stort synfält som varierade mellan 1,7 och 17,6 mm diagonalt. Detta var tillräckligt stor för att utföra den optiska sektionen av hela murina hjärtan. Korrigeringen av kromatisk aberration, mellan 400 och 800 nm, uppnåddes genom mekanisk anpassning av målet. Vid behov utfördes kromatiska korrigeringar under den datorstödda efterbehandlingen. Sfärisk avvikelse, även i tjockare prover, observerades inte i detta system och behövde därför inte korrigeras.
Sammantaget presenterar vi här ett robust protokoll för kemisk clearing och analys av rumslig lEukocytfördelning inuti murina hjärtan med användning av lättmikroskopi. Vid detta tillfälle är det viktigt att betona att detta LSFM-förfarande knappast kan lösa fina vävnadsstrukturer som kapillärer. I detta avseende är denna LSFM väl lämpad för att karakterisera den allmänna immuncellfördelningen och för att beskriva potentiella immuncellackumuleringar inuti organet. Man måste emellertid komma ihåg att LSFM i allmänhet inte är det perfekta valet för att analysera och kvantifiera cellulär lokalisering i småorganets delstrukturer, såsom vasculaturen. För att svara på sådana frågor bör LSFM kompletteras med andra metoder, såsom histologi eller 2-fotonmikroskopi. Ytterligare begränsningar av detta protokoll inkluderar begränsningen till högst 3-4 färger. Den blå kanalen är svår att använda för andra signaler förutom autofluorescens-begränsningen till fasta prov och den maximala samplingsstorleken 30 mm x 30 mm x 15 mm. Den starka lukten och den akuta toxiciteten hos DBE bör också tasN med hänsyn till. Om den senare punkten är problematisk kan etylkinnamat användas som ett alternativt rengöringsmedel 9 . Den största fördelen med att välja denna mikroskopi teknik är möjligheten att analysera hela orgelen samtidigt. I konventionella analyser av hematoxylin och eosinfärgade, formalinfixerade och paraffininkopplade (FFPE) histologiska vävnadssektioner är det hög sannolikhet för att sakna viktiga rumsliga områden om inte varje enskild sektion analyseras. Dessutom möjliggör lakmikroskopi inte bara virtuell skärning av provet i varje tredimensionellt plan, men det erbjuder också denna potential utan att förstöra provet eller orsaka skärande artefakter. Vid behov kan det fasta organet bearbetas för ytterligare analyser, såsom ett korrelativt ljus och elektronmikroskopi tillvägagångssätt för mycket lösa specifika regioner av intresse. En mall för en sådan studie kan hittas i Karreman et al. , Där korrelationsbananWeen en 2-foton mikroskopi bildstapel och tredimensionell elektronmikroskopi data visades framgångsrikt 41 . Ett annat lovande tillvägagångssätt kan vara kombinationen av detta protokoll med den nyligen publicerade uDISCO-metoden som också är baserad på ett organiskt lösningsmedel och det skulle möjliggöra undersökning av mycket större organ genom en standard LSFM 42 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Forskning i Gunzerlaboratoriet stöddes av tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (bidrag nr 0315590 AD) och av tyska forskningsstiftelsen (bidrag nr GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Vi tackar vidare IMCES för teknisk support och Sebastian Kubat för hjälp med 3D-tecknade modellering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/mL] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 mL) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15 x 15 x 5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
