Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لاقتفاء أثر المجينية الحمض النووي (جدنا) التلوث في عينات الحمض النووي الريبي. تستخدم طريقة عرض محددة كبسولة تفجير للمنطقة الداخلية يدون مباعدة (البحث عن) ريبوسومال الحمض النووي (المتاشب) الجينات. الأسلوب مناسب للكشف عن التلوث الحمض النووي في معظم حقيقيات النوى وبدائيات النوى موثوقة والحساسة.
Abstract
هو أسلوب واحد المستخدمة على نطاق واسع للتحديد الكمي لتغييرات التعبير الجيني ووفرة نسخة النسخ العكسي الكمي PCR الوقت الحقيقي (RT-qPCR). أنها توفر نتائج دقيقة وحساسة ويمكن الاعتماد عليها واستنساخه. عدة عوامل يمكن أن تؤثر على حساسية وخصوصية RT-قبكر. بقايا الحمض النووي (جدنا) تلويث عينات الحمض النووي الريبي واحد منهم. في تحليل التعبير الجيني، سوف نبالغ في وفرة مستويات نسخة التضخيم غير محددة بسبب تلوث جدنا ويمكن أن تؤثر على نتائج RT-قبكر. عموما، يتم الكشف عن جدنا ببكر qRT التمهيدي باستخدام أزواج الصلب إلى مناطق إينتيرجينيك أو إنترون الجينات للفائدة. ولسوء الحظ، شروح إنترون/إكسون ليست معروفة بعد لجميع الجينات من الفقريات والبكتيريا، طلائعيات، الفطريات، النباتات واللافقاريات الاستراحة.
نقدم هنا بروتوكولا للكشف عن التلوث جدنا في الحمض النووي الريبي العينات باستخدام الحمض النووي ريبوسومال (المتاشب)-على أساس الإشعال. الأسلوب الذي يستند إلى الخصائص الفريدة المتاشب: طبيعتها مولتيجيني وتسلسل المصانة عالية، وعالية التردد في الجينوم. أيضا كدراسة حالة، صممت استناداً إلى مجموعة فريدة من الإشعال في المنطقة المصانة ريبوسومال الحمض النووي (المتاشب) في الأسرة الفصيلة القبئيه. تم اختبار الطابع العالمي لهذه الأزواج التمهيدي قبل تذوب منحنى التحليل و [اغروس] هلام التفريد. على الرغم من أن يشرح لنا طريقة كيف يمكن تطبيقها على أساس المتاشب كبسولة تفجير لفحص التلوث جدنا في الأسرة الفصيلة القبئيه، فإنه يمكن استخدامها بسهولة للأنواع الأخرى بروكاريوتي ويوكاريوتي
Introduction
استكشاف تنظيم النسخي للاهتمام مجموعات الجينات أو إشارات الشبكات ضروري لفهم الآليات الجزيئية المعقدة التي تشارك في الأحداث البيولوجية1. حاليا، يتم تحليل qPCR النهج الأكثر استخداماً للجينات التعبير الدراسات التي يمكن أن تستهدف أما من الحمض النووي (الجينوم) أو الحمض النووي الريبي (الترنسكربيتوم) التي تسمح بتحليل مثيلوم والترنسكربيتوم، على التوالي. النسخ العكسي (RT) تليها qPCR يستخدم على نطاق واسع لتحليل الترنسكربيتوم بقياس مستويات التعبير الجيني في مختلف مجالات البحوث البيولوجية2. بالمقارنة مع غيرها أساليب مثل التهجين الشمالية التقليدية، وكشف الأنسجة محددة عبر راحة التهجين وفحوصات حماية ribonuclease (الجيش الوطني الرواندي) وشبه--الرايت-بكر، الدقة، في الموقع ، وسرعة ودينامية واسعة النطاق من فحوصات على أساس قبكر هي رائعة جداً3،4. وهناك العديد من العوامل الهامة التي يجب أن تؤخذ لإجراء تقييم كمي موثوق لرسول الحمض النووي الريبي (مرناً)، بما في ذلك نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي ابتداء من المواد. وعلاوة على ذلك، التضخيم غير محددة وكفاءة RT qPCR PCR الكفاءة يجب أن تؤخذ5،6.
وجود جدنا مشكلة متأصلة أثناء استخراج الحمض النووي الريبي يرجع، جزئيا، إلى الخصائص الفيزيائية والكيميائية مشابهة ل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي7. بسبب تسلسل هوية جدنا والحمض النووي التكميلية (كدنا) المستمدة من العينات مرناً، يمكن أن يحدث التضخيم غير محددة، التي ستؤثر على دقة نتائج RT-قبكر. جدنا المتبقية سوف يؤدي إلى المبالغة في تقدير الوفرة من استهداف مرناً في تحليل التعبير الجيني8.
أساسا، أمبليكون غير محددة معظمها ينبع من تشكيل ديمر التمهيدي أو التضخيم الخلفية غير محدد نظراً لجدنا، التي يمكن تقييمها باستخدام عينات المراقبة المناسبة. هذه العينات هي لا تحكم قالب (المجلس الوطني الانتقالي) ولا تحكم المنتسخة العكسية (النيكوتين)، على التوالي. حيث تختلف مستويات التلوث جدنا في العينات التي تجري دراستها والحساسية تجاه جدنا يختلف كثيرا بين الجينات تم تحليلها، الضوابط النيكوتين المطلوبة لكل زوج عينة/المقايسة. على الرغم من أن هذا زيادة كبيرة في التكلفة والعمل في دراسات RT-qPCR التنميط، هذه الضوابط هي المطلوبة7،9.
تتضمن أساليب بديلة التعامل مع التلوث جدنا استخدام أزواج التمهيدي الصلب إلى مناطق إينتيرجينيك أو إنترون الجينات لفائدة10، واستخدام كبسولة تفجير الجناح إنترون كبيرة أو تمتد عبر تقاطع إكسون-إكسون، أي مواقع انلينغ غائبة في مرناً ناضجة التسلسل1،4. ومع ذلك، إنترون/إكسون شروح لجميع الجينات من العديد من فقاريات والبكتيريا، طلائعيات، والفطريات، والنبات، واللافقاريات الاستراحة معروفة بعد. وبالإضافة إلى ذلك، لدى العديد من الكائنات الحية حقيقية النواة بسيودوجينيس المستمدة من أحداث ازدواجية. علاوة على ذلك، لا يضمن التصميم التمهيدي عبر introns غير تضخيم جدنا. كما الكروماتين إمكانية الوصول إلى مناطق الجينوم إلى الدناز أنا يختلف، من المستحسن لتصميم أزواج التمهيدي مختلفة تستهدف الكروموسومات مختلفة10.
يمكن أن تشمل الجينوم من الكائنات الحية حقيقية النواة تصل إلى ألف نسخة من الجينات المتاشب ترميز ريبوسومال مفارز اللازمة لتشكيل ريبوسوم. غالباً ما يتم تنظيم هذه الجينات المتاشب في صفيف مفرد أو تكرار tandem11. بوليسيسترونيك ررناس (الشكل 1) بما في ذلك وحدة فرعية كبيرة (LSU) ووحدة فرعية صغيرة (SSU) يتم نسخها من قبل رنا بوليميراز أنا (بول رنا أنا). كذلك تجهز قبل-ررناس الناتجة عن طريق القضاء على هاتين المنطقتين مباعدة يدون الداخلية ITS1 و ITS2. ثلاثة ناضجة كمنتجات نهائية، ررناس، 17-18S الرنا الريباسي (SSU)، 5.8S، و 25-28 الرنا الريباسي (LSU) هي ولدت12. الجينات المتاشب هم الممثلون نموذجي لعائلة مولتيجيني مع تسلسل المصانة عاليا. تحدث مع عالية تردد في الجينوم، ويحتمل أن تكون موجودة في أكثر من موقع الكروموسومات13. تجهيز الرنا الريباسي وتدهور الفواصل يدون عملية سريعة في نوية. نظراً للدرجة العالية من التكرار، هو أقل نسبة عدد النسخ الجينوم والاكتشاف بريموليكوليس الحمض النووي الريبي غير المجهزة بالمقارنة بتسلسل إنترون نسخة منخفضة والسلائف أونسبليسيد. هذه الميزات تجعل الجينات المتاشب مناسبة تماما للكشف عن التلوث جدنا في معظم حقيقيات النوى وبدائيات النوى3موثوقة وحساسة للغاية.
ويرد هنا إجراء جديداً للكشف عن التلوث جدنا في عينات الحمض النووي الريبي. وترد مجموعة من الإشعال العالمي استناداً إلى تسلسل المتاشب حفظت لفحوصات جدنا في العديد من أنواع الفصيلة القبئيه. خصوصية وعالمية الإشعال المقترحة خضعت لتحليل منحنى تذوب باستخدام الحمض النووي كقالب. لدينا البروتوكول لا ينطبق على الفصيلة القبئيه فقط، ولكن يمكن أيضا بسهولة أن تتكيف مع الأنواع الأخرى حقيقية النواة وبدائية.
Protocol
ملاحظة: يمكن استخدام أي الأنسجة.
1. استخراج الحمض النووي
- وضع 100 مغ عينات الأنسجة في أنبوب مل 2.0 وإضافة اثنين 5 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ الخرز ومجانسة الأنسجة في 25-30 هرتز لمدة 30 ق (مدة تجانس والتردد تبعاً لنوع النسيج) لكل من الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي.
- عزل الحمض النووي الريبي المجموع وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- عزل الحمض النووي المجموع وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- التحكم في نقاء وكمية من عينات الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص في 260 و 280 نانومتر.
- التحكم في نقاء وكمية من عينات الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص في 260 و 280 نانومتر.
ملاحظة: في حين الأحماض النووية تمتص الضوء بطول موجي 260 شمال البحر الأبيض المتوسط (A260)، امتصاص الضوء في الطول الموجي 280 (A280) يمكن استخدامها لتحديد مقدار البروتينات والفينول الموجودة في العينة. ولذلك، يمكن استخدام نسبة A260/A280 شمال البحر الأبيض المتوسط لتقييم نقاء الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي المستخرجة من عينة. A260/280 القيم في نطاق ≥1.8 و > 2.0 تعتبر عموما أن يكون "الصرفة" للحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، على التوالي. قد يشير إلى قيم A260/280 أقل تلوث من البروتين أو المواد الكيميائية العضوية. - اختبار نوعية الحمض النووي عن طريق تشغيل نسبة 0.7% [اغروس] هلام التفريد. تحضير الهلام وتشغيل في 1 x buffer يدتا تريس بوريتش (TBE: 89 تريس، وحمض البوريك 89 مم، و 2 ملم يدتا) في 100 الخامس لجدنا 30 دقيقة عالية الجودة يظهر حاد، عالية الوزن الجزيئي (همو) الفرقة مع لا مسحات في مجموعة جزيئات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW).
- الاختيار عزل الحمض النووي الريبي للكمية ونقاء وسلامة تحت يشوه ظروف غوانيدين ثيوسيانات (GTC) [اغروس] هلام التفريد أو رقاقة التفريد الشعرية، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- تحضير هلام بليون طن من الكربون عن طريق إضافة مم 5 بليون طن من الكربون إلى معيار 1 x TBE 1% [اغروس] هلام بعد التبريد أجار إلى 60 درجة مئوية.
ملاحظة: بليون طن من الكربون السامة، وحتى الاستغناء عن ذلك في غطاء دخان، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - إعداد الجيش الملكي النيبالي يشوه تحميل المخزن المؤقت: 95% ميثلامين، 10 مم يدتا pH 8.0، الأزرق بروموفينول 0.1% و 0.1% زيلين نفط سيانولي 10 ميليلتر اثيديوم بروميد.
ملاحظة: ميثلامين واثيديوم بروميد سامة، وينبغي الاستغناء عن في غطاء دخان. - تحميل 1-5 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي في الجيش الملكي النيبالي يشوه تحميل المخزن المؤقت، وحرارة المخلوط لمدة 5 دقائق في 70 درجة مئوية، وضعه على الجليد قبل تحميله إلى هلام، وثم فصل الجيش الملكي النيبالي على جل بليون طن من الكربون في 100 الخامس لعلامة الوزن الجزيئي تحميل الحمض النووي الريبي أو 45 دقيقة كمعيار جنبا إلى جنب مع عينات الحمض النووي الريبي.
- وصمة عار الجل مع اثيديوم بروميد ووضع تصور للعصابات باستخدام أنظمة التقاط صورة تحت الضوء فوق البنفسجي. في حقيقيات النوى، سوف تظهر سليمة من الحمض النووي الريبي مجموع تشغيل في معرفة ظروف اثنين على الأقل واضحة وحادة الرنا الريباسي العصابات (28S و 18S) بنسبة 2:1 كثافة.
- تحضير هلام بليون طن من الكربون عن طريق إضافة مم 5 بليون طن من الكربون إلى معيار 1 x TBE 1% [اغروس] هلام بعد التبريد أجار إلى 60 درجة مئوية.
- إزالة آثار جدنا بالمعاملة مع الدناز (الدناز أنا رناسي الحرة). إضافة إلى أنبوب رناسي خالية في 10 ميليلتر الحجم الإجمالي: 0.1-1 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، وحدة واحدة من الدناز الأول، و 1 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت مع مجكل2. احتضان هذا الخليط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إنهاء رد فعل بإضافة 1 ميليلتر من 50 مم يدتا وتفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إزالة آثار الحمض النووي الريبي من مقتطفات جدنا استخدام الدناز الحرة رناسي A، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة 5 ميليلتر من رناسي 10 ملغ/مل للحمض النووي المجموع واحتضان في 37 درجة مئوية لمقتطفات حاء 1 مخزن الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي في-80 درجة مئوية.
2. تصميم التمهيدي من المتاشب المنطقة لجدنا الإنزيم
ملاحظة: تسلسل كامل طول المتاشب يحتوي على منطقتين (ITS1 و ITS2)، التي تتم إزالة في جزيء الرنا الريباسي ناضجة بواسطة سلسلة من الانشقاقات اندونوكليوليتيك وثم المتدهورة (الشكل 1).
- استرداد تسلسل النوكليوتيدات المتاشب من نكبي (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) للأنواع ذات الأهمية. أفضل الكلمات الرئيسية للبحث في قاعدة البيانات "فاصل يدون الداخلية."
- إدخال تسلسل النوكليوتيدات المستهدفة في بحث بلاستن للعثور على المناطق الداخلية يدون مباعدة (ITSs)، سسو، ووحدة خدمات المتعلمين حفظت مناطق.
- حدد أما الجناح تسلسل ITSs الإشعال أو أن تضخيم متواليات ITSs التي لم تكن موجودة في الرنا الريباسي ناضجة.
- تصميم كبسولة تفجير المرافقة في تسلسل ITS1 أو ITS2: محاذاة المناطق المصانة من الأنواع المختلفة من كلوستالو. تصميم محددة كبسولة تفجير لمنطقتها ترافقه بعد تحليل محددة/الصليب-أنواع الأصناف مع برنامج الليليد. التمهيدي اثنين أزواج سسو زيادة-5.8S و 5.8S-أمبليكونس LSU يمكن أن تصمم على أساس في منطقتي ITS1 ITS2، ترافقه على التوالي. لأن هذه أمبليكونس هي التي تمتد عبر المنطقة للبحث عن، سيتم زيادة طول أمبليكون لمالا يقل عن 300 شركة بريتيش بتروليوم في أمبليكونس من جدنا. ويقلل هذا الزيادة الحساسية.
- المرافقة ITS1: حدد سسو و 5.8S تسلسل الرنا الريباسي. كبسولة تفجير المحدد للفصيلة القبئيه: سسو، سادس: كجتاكاجتتككجتاجتج، ص: جتكاكججاتكتجكات. هذا الزوج التمهيدي (SF: إلى الأمام وعكس r:) يسهب منطقة جزئية من سسو وطول كامل من ITS1، ومنطقة جزئية من 5.8S المتاشب.
- المرافقة ITS2: حدد 5.8S وتسلسل خدمات المتعلمين. كبسولة تفجير المحدد للفصيلة القبئيه: f: أتجكاجاتكككجتجاكك LSU توافق التسلسل، ل. ر: تجكتاايتكاجكججتاجيك. يضاعف هذا الزوج التمهيدي منطقة جزئية من 5.8S، وكامل طول ITS2، ومنطقة جزئية من خدمات المتعلمين (الشكل 1).
ملاحظة: في حالة التصميم التمهيدي استناداً إلى ITSs المرافقة المنطقة، مجالات عالية المصانة سسو، 5.8S، ووحدة خدمات المتعلمين وحددت. الإشعال إلى الأمام وعكس من 5.8S الرنا الريباسي تم تصميمه استناداً إلى فكرة مصانة في النباتات المزهرة14. الإشعال إلى الأمام وعكس صممت على أساس حفظ سسو و LSU على مناطق في الفصيلة القبئيه، على التوالي. الاختلاف في كبسولة تفجير سسو وخدمات المتعلمين لكل نوع من الأنواع يرد في الجدول 1.
- كبسولة تفجير تضخيم تسلسل ITSs: في هذا البروتوكول، كبسولة تفجير تصميم ITS1 على أساس عكرش التسلسل (نكبي تاكسيد رقم: 110873). للإشعال، استخدم: إلى الأمام: جتاتجكجتكاجاكاكت، وعكس: أتاجكاتكجكتجكاجاغت. ووفقا أمبليكونس التي تم إنشاؤها بواسطة التمهيدي أزواج في السيليكون، الحجم يجب أن تتراوح من 60 إلى 200 شركة بريتيش بتروليوم. وهذا هو أيضا الحجم الموصى به لتحليل قبكر.
- تصميم كبسولة تفجير المرافقة في تسلسل ITS1 أو ITS2: محاذاة المناطق المصانة من الأنواع المختلفة من كلوستالو. تصميم محددة كبسولة تفجير لمنطقتها ترافقه بعد تحليل محددة/الصليب-أنواع الأصناف مع برنامج الليليد. التمهيدي اثنين أزواج سسو زيادة-5.8S و 5.8S-أمبليكونس LSU يمكن أن تصمم على أساس في منطقتي ITS1 ITS2، ترافقه على التوالي. لأن هذه أمبليكونس هي التي تمتد عبر المنطقة للبحث عن، سيتم زيادة طول أمبليكون لمالا يقل عن 300 شركة بريتيش بتروليوم في أمبليكونس من جدنا. ويقلل هذا الزيادة الحساسية.
- اختيار أجهزة الإشعال في أثناء النظر في هذه التوصيات: محتوى GC: 40-60%، وطول التمهيدي: طول المنتج بكر قاعدة، 18-23: bp 60-160 (خصيصا لما التمهيدي)، ذوبان درجة الحرارة (Tm): 60 درجة مئوية، Tm النهائية لكلا كبسولة تفجير ولا تختلف أكثر من 5 درجات مئوية، وفي الصف الابتدائي المتطلبات البيئية ليست مكملة لأنفسهم أو شريك الإشعال.
- تحقق من رقم خصوصية ونسخة التمهيدي. إجراء تحليل في السيليكون في التسلسل المحدد التمهيدي بالبرنامج التمهيدي-الانفجار (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).
- قم بفتح صفحة تقديم التمهيدي-الانفجار. أدخل كل تسلسل التمهيدي في المقطع معلمات التمهيدي للنموذج. في زوج خصوصية التحقق من معلمات القسم التمهيدي، أدخل اسم الكائن (أو اسم المجموعة الكائن الحي) وقم بتحديد قاعدة بيانات الجينوم. هذه الإعدادات تعطي خصوصية المعلومات حول معلمات التمهيدي وتسلسل المستهدفة بما في ذلك طول المنتج، موقف على كروموسوم، ونسخ الرقم.
3-أداء qPCR خطوة للتحقق من الصحة على أساس المتاشب كبسولة تفجير "قوالب الحمض النووي"
ملاحظة: يجب التحقق من الأداء الوظيفي لكبسولة تفجير تصميم قبل تنفيذ قبكر باستخدام جدنا كقالب. لإجراء عدة ردود فعل مواز وتقليل الأخطاء بيبيتينج، يوصي بإعداد مزيج الرئيسي. لمزيج رئيسي، وإعداد وحدة تخزين يساوي العدد الإجمالي لرد فعل مزيج بالإضافة إلى ~ 10%.
- إعداد مزيج رئيسي بخلط كافة المكونات برد فعل استثناء القالب الحمض النووي في أنبوب تفاعل PCR. الراقي كما هو مطلوب من رد فعل واحد لإعداد مزيج الرئيسي: 5 ميليلتر سيبر الأخضر (سيبر) إتقان ميكس (2x)، 0.3 ميليلتر التمهيدي (0.3 ميكرومتر كل من الأمام وعكس التمهيدي)، وضبط وحدة التخزين النهائي إلى 10 ميليلتر مع المياه خالية من رناسي. استخدام حوالي دي تو زيرو زيرو نغ في 1 ميليلتر من جدنا قالب للتحليل.
ملاحظة: ذوبان الجليد وتجميع، والاحتفاظ بجميع الكواشف ومكونات وخلطات رد فعل على الجليد. - قاسمة ميكس ماجستير في صفيحة 96-جيدا بصرية. "الماصة؛" 1 ميليلتر من جدنا لكل بئر، ومن ثم تغطية ذلك مع لوحة بصرية ختم الفيلم. وتدور مكان في cycler.
- تشغيل الفحص qPCR cycler حرارية في الوقت الحقيقي تحت الظروف التالية: 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية للخطوة 15 s و 60 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إجراء الحصول على البيانات في 60 درجة مئوية الصلب/التمديد.
- بعد هذا الإجراء التضخيم، تخضع جميع ردود الفعل PCR إلى تحليل منحنى ذوبان مع القياس fluorescence المستمر من 55 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية. بشكل عام، جمع نقطة بيانات واحدة كل دورة بزيادة تدريجية لدرجة الحرارة 0.5 درجة مئوية في كل دورة.
ملاحظة: تشمل على الأقل 2 من عناصر التحكم غير القالب (المجلس الوطني الانتقالي) لكل زوج التمهيدي مزيج الرئيسي. إجراء فحوصات كل في تكرار ثلاثة على الأقل. - تأكيد خصوصية التمهيدي عن طريق تحليل منحنى تذوب. تحليل المنحنيات مع دورة عتبة واحدة ومنحني المطروحة تناسب الأسلوب.
ملاحظة: يشير مظهر ذروة الفردية الحادة إلى amplicon فردية موحدة. يمكن أن تظهر المنتجات ديمر التمهيدي كقمم الفردية عند درجات حرارة منخفضة. - التحقق من صحة حجم كل أمبليكون بالتفريد [اغروس] هلام.
- إعداد 3% [اغروس] هلام بخلط 3 ز [اغروس] مع 100 مل من TBE العازلة (TBE: 89 تريس، وحمض البوريك 89 مم، و 2 ملم يدتا).
- مزيج من 5-10 ميليلتر من منتج PCR مع الحمض النووي و 1-2 ميليلتر من 6 × تحميل المخزن المؤقت. تحميل المنتج بكر جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي على 3% [اغروس] هلام. القيام فصل الغرواني الكهربي في 1 × تريس بوريك يدتا-المخزن المؤقت في 100 الخامس لمدة 45 دقيقة.
- وصمة عار في الجل مع اثيديوم بروميد أو أي عامل آخر إينتيركالاتينج، ووضع تصور للعصابات باستخدام أنظمة التقاط صورة تحت الضوء فوق البنفسجي.
ملاحظة: عملاء إينتيركالاتينج الحمض النووي (مثلاً، اثيديوم بروميد) هي كانسيروجينيك وينبغي التعامل معها بحذر والاستغناء عن كل على حدة. ظهور عصابة حادة فريدة من نوعها (فيما يتعلق بالحجم ودون التمهيدي-ديمر أو التضخيم الخلفية الاصطناعية) يؤكد خصوصية أمبليكون.
4-جدنا التلوث الفحص الداخلي مع "قوالب الحمض النووي الريبي"
ملاحظة: بعد العلاج مع الجيش الملكي النيبالي المنقي من الدناز، يتم اختبار عينة قبل الإشعال المتاشب محددة. بسبب تجهيز ميزة مثل إنترون في ITSs عندما يتم استخدام هذه المناطق للتضخيم، يجب اكتشافها أي إشارة التضخيم في العينات خالية من الحمض النووي الريبي. وبناء على هذا، إذا تم الكشف عن إشارة تضخيم في قبكر أو عصابة في [اغروس] هلام لاحظ مع الحجم المتوقع (مقدرة بالتحليل في السيليكون )، وينبغي أن يكون هذا بسبب تلوث جدنا. تتشابه الخطوات التي يؤديها في هذا الباب، الباب 3، إلا أن كدنا لجميع العينات كقالب بدلاً من جدنا.
- إعداد مزيج رئيسي بخلط جميع مكونات رد فعل ما عدا قالب الجيش الملكي النيبالي في أنبوب تفاعل PCR. سيد تركيبة مزيج لرد فعل واحد: 5 ميليلتر سيبر إتقان ميكس (2x)، 0.3 ميليلتر التمهيدي (0.3 ميكرومتر كل من التمهيدي إلى الأمام وعكس مزيج)، وضبط وحدة التخزين النهائي إلى 10 ميليلتر مع المياه خالية من رناسي. استخدام حوالي 500 نانوغرام قالب الجيش الملكي النيبالي في 1 ميليلتر حجم للتحليل.
- قاسمة مزيج الرئيسي في صفيحة 96-جيدا بصرية. "الماصة؛" 1 ميليلتر الحمض النووي الريبي لكل بئر ومن ثم تغطية ذلك بلوحة بصرية ختم الفيلم. أجهزة الطرد المركزي والمكان في cycler.
ملاحظة: تشمل فرض ضوابط المجلس الوطني الانتقالي اثنين على الأقل وهما جدنا الإيجابية لكل فحص. إجراء جميع الاختبارات في تكرار التقنية الثلاثة. - تشغيل الفحص qPCR cycler حرارية في الوقت الحقيقي تحت الظروف التالية: 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية للخطوة 15 s و 60 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إجراء الحصول على البيانات في 60 درجة مئوية الصلب/التمديد.
- بعد هذا الإجراء التضخيم، تخضع جميع ردود الفعل PCR إلى تحليل منحنى ذوبان مع القياس fluorescence المستمر من 55 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية. عادة، جمع نقطة بيانات واحدة كل دورة بزيادة تدريجية لدرجة الحرارة 0.5 درجة مئوية في كل دورة.
- تحقق من كافة منتجات PCR بتشغيل 3% [اغروس] هلام التفريد.
ملاحظة: ظهور أي الفرقة أو الذروة في رد فعل المجلس الوطني الانتقالي ربما يرتبط بتشكيل التمهيدي-ديمر التي ينظر إليها عادة في درجات الحرارة المنخفضة في منحنى الانصهار، في حين وجود أي الفرقة أو الذروة في عينات الحمض النووي الريبي هو نتيجة لتلوث جدنا. من المستحسن أن أول اختبار جميع عينات الحمض النووي الريبي التي تستند إلى المتاشب كبسولة تفجير ومن ثم تستخدم عينات الحمض النووي غير الملوثة للمتلقين للمعلومات من تطبيقات مثل كدنا توليف وتحليل التعبير الجيني، إلخ.
5-الخطوة RT-PCR لكدنا التوليف و qPCR التحليل
- ذوبان الجليد الدناز-تعامل الجيش الملكي النيبالي والكاشفات توليف كدنا في درجة حرارة الغرفة. بعد ذوبان الجليد، تدور إلى أسفل الكواشف. إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي و 1 ميليلتر من اليغو (dT) 18 التمهيدي في أنبوب نوكلاس مجاناً. ضبط الحجم الإجمالي ميليلتر 12 مع المياه خالية من رناسي، المزيج بلطف، ومن ثم تخزين على الجليد.
- تذوب الهياكل الثانوية من قالب الحمض النووي الريبي التي تفرخ رد فعل عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تدور إلى أسفل وبارد القنينة على الجليد.
- إعداد مزيج رد الفعل الرئيسي (الحجم النهائي 20 ميليلتر لكل رد فعل) على النحو التالي: 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر)، 4 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت (5 س)، 1 ميليلتر من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر) و 2 ميليلتر من دنتب ميكس (10 مم). المزيج بلطف وبارد القنينة على الجليد. إضافة ميليلتر 19 في أنبوب المعدة التي تحتوي على الجيش الملكي النيبالي.
- احتضان رد فعل لمدة 60 دقيقة في 42 درجة مئوية ومن ثم احتضانها في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إنهاء نشاط المنتسخة العكسية. ضع ردود فعل RT على الجليد والمضي قدما إلى تحليل التعبير الجيني من خلال الإجراء الروتيني قبكر (كما هو موضح في القسم 3 و 4).
Representative Results
ونحن نقترح استخدام المستندة إلى المتاشب كبسولة تفجير للتحقق من عدم وجود تلوث جدنا في عينات الحمض النووي الريبي لانسجة نبات. ويرد في الشكل 2المخطط الانسيابي للمقايسة التلوث تحليل وجدنا qPCR. في البروتوكول المقدم، واستخدمت اثنين من الاستراتيجيات التكميلية للتصميم التمهيدي على أساس المتاشب: اختيرت الإشعال 1) إبلاغها من تسلسلات ITSs والإشعال 2) عالمية اختيرت من ITSs المرافقة المناطق. لإثبات المفهوم، قمنا بتصميم كبسولة تفجير محددة العشبة عكرش، والإشعال العالمي استناداً إلى أنواع الفصيلة القبئيه، كما وردت في البروتوكول. 5.8S الإشعال إلى الأمام وعكس اختيرت استناداً إلى فكرة 14 زوج قاعدي (bp) حفظت يوضح التشابه بين النباتات المزهرة، بريوفيتيس، والعديد من الأوامر للطحالب والفطريات14. ميزات تصميم كبسولة تفجير ترد في الجدول 2. العالمية من سسو، 5.8S، ووحدة خدمات المتعلمين التمهيدي تم التحقق من بلاستن، وترد في الشكل 3 كشعار عزر نتائج التماثل التمهيدي. وترد قائمة الأنواع المدرجة في تحليل التماثل، فضلا عن أجهزة الإشعال المتباينة لكل نوع من الأنواع الجدول 1- وكان التحديد التمهيدي الاختيار التمهيدي--انفجار. وقدرت للأنواع التي تتوفر فيها تسلسل الجينوم كله، موقع المتاشب المورثات الصبغية. على سبيل المثال، المتاشب أرز و أعطيت التمويل، الجينات تقع على اثنين من الكروموزومات المختلفة، وفي ميس زيا في الكروموسومات المختلفة الثلاثة.
وكان إجراء التحقق من صحة qPCR كبسولة تفجير المستندة إلى المتاشب مع ذوبان تحليل منحنى أمبليكونس ITS1 والجناح ITS2 استخدام الحمض النووي كقالب. كما عرضت في الرقم 4 و الرقم 5، وأكد تجريبيا خصوصية التمهيدي بملاحظة واحدة ذروة حادة مع لا تشكيل التمهيدي-ديمر في أنواع الفصيلة القبئيه مختلفة بما في ذلك قمح أيستيفوم، فولغاري شعير، و أرز، وفي ديكوتس ساتيفا فصة، الزعفران قثد tabacum نيكوتياناو نفل alexandrinum، بيقية فول، و التمويل نبات. وأظهر اختبار المزيد من منتجات التضخيم بفصل حجم الغرواني الكهربي فرقة فريدة من نوعها. كما هو متوقع، العصابات المستمدة من عينات من مختلف الأنواع التي تختلف في الحجم (الشكل 6 ألف و 6 باء). من المثير للاهتمام، استخدام كبسولة تفجير عالمية مصممة خصيصا لهذه الأنواع الثلاثة من الفصيلة القبئيه ليست فقط مفيدة للفصيلة القبئيه الأنواع الأخرى، ولكن أيضا للأنواع النباتية الأخرى مثل التمويل (أ)، وفطر اندوفيتيك معنى. انديكا بيريفورموسبورا.
وأكدت صحة التمهيدي محددة مصممة (ITS1) أيضا qPCR في العشبة (أ) استخدام جدنا كقالب. وقد لوحظ ذروة واحدة مع لا تشكيل التمهيدي-ديمر. من المستغرب، ولدت التمهيدي ITS1 العشبة ألف (التمهيدي محددة) عصابة حادة واحد ليس فقط في العشبة (أ)، ولكن أيضا لسائر أنواع اختبار باستثناء tabacum نيكوتيانا و نفل alexandrinum، التي أنتجت شريطين (الشكل 6). فحص التلوث جدنا كان يؤديها كبسولة تفجير للبحث عن أو المرافقة لها في جميع عينات الحمض النووي الريبي. ويرد في الشكل 7تمثيل تخطيطي لصفيحة التضخيم في فحص التلوث جدنا، وتفسير النتائج.
الشكل 1: النمط العام لتنظيم تسلسل المتاشب حقيقية النواة.
الجزء المتاشب حقيقية النواة تحتوي على 17-18S (أحمر)، 5.8S (الأزرق)، و 25-28 الرنا الريباسي (الوردي). يتم الإشارة إلى الفواصل يدون الداخلية (البحث عن) كخطوط سوداء. وتشير 5´and 3´ إلى التوجه لجزيء الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: سير العمل فحص تلوث RT-قبكر وجدنا- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فكرة شعار سسو ألف، باء 5.8S والتماثل التمهيدي LSU جيم- سسو، 5.8S، وشيد LSU الإشعال، الشعار عزر بواسطة بلاستن استناداً إلى سجلات النباتات الخضراء 2,000 (نكبي تاكسيد رقم: 33090) مع دي وان زيرو ه-قيمة وقف-10. أ-الأدنين، تي-ثايمين، ز-جوانين، ج-السيتوزين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تذوب منحنى تحليل أمبليكون ITS1 المرافقة في الأنواع المختلفة.
هذا أمبليكون، تضخم سسو و 5.8S-R الإشعال، يحتوي على جزء من التسلسل من منطقة ترميز 17-18S، سلسلة كاملة من ITS1 وتسلسل جزئي من 5.8S. يظهر هي منحنيات ذوبان أمبليكونس التي تم إنشاؤها (الوردي) والمجلس الوطني الانتقالي (أحمر) من قمح aestivum، فولغاري شعير، و أرز، و فصة برميلية، الزعفران قثد، tabacum نيكوتيانا، نفل اليكساندرينوم، فول بيقيةو أعطيت التمويل، انديكا بيريفورموسبورا. يشير الخط الغامق شقة إلى عتبة خط الأساس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: تذوب منحنى تحليل amplicon ITS2 المرافقة في الأنواع المختلفة.
يتم إنشاء هذه أمبليكون باستخدام 5.8S-كبسولة تفجير و ووحدة خدمات المتعلمين. أمبليكون وصف يحتوي على تسلسل جزء من 5.8 S وتسلسل ITS2 كله وتسلسل جزئي من 25-28. يظهر هي منحنيات ذوبان أمبليكونس (الأخضر) والمجلس الوطني الانتقالي (أحمر) التي تم إنشاؤها من قمح aestivum، فولغاري شعير، و أرز، و فصة برميلية، الزعفران قثد، tabacum نيكوتيانا، نفل اليكساندرينوم، فول بيقيةو التمويل نبات انديكا بيريفورموسبورا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: [اغروس] هلام تحليل PCR المنتج على أساس المتاشب.
أمبليكون من ITS1--سطوح السفوح (أ)، ITS2-سطوح السفوح (ب)، و ITS1 (ج) تم تشغيلها على 3% [اغروس] هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: يمكن اعتبار ميزات مثل إنترون ITSs لتصميم أجهزة الإشعال الذي يمكن الكشف عن التلوث جدنا.
أي ذروة أو الفرقة مع الحجم المتوقع في تحليل qPCR تشير إلى تلوث جدنا في عينات الحمض النووي الريبي. Unk: نموذج غير معروف، نقاط البيع: مراقبة إيجابية، المجلس الوطني الانتقالي: التحكم غير القالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| التمهيدي | جنس | معرف تاكسيد | الأنواع | التمهيدي المتباينة | ||
| سسو | نبات | 3701 | كامتشاتكا، والتمويل ، و قيثاري | - | ||
| بيقية | 3904 | موبره، أمريكانا، أونيجوجا، أموناني، أمورية، كراككامال، أوروبوس الزائفة، مولتيكوليس، japonica، راموليفلورا و فول | ||||
| نفل | 3898 | اليكساندرينوم، مونتانوم، ريسوبيناتوم ، و بلميط | - | |||
| نيكوتيانا | 4085 | tabacum، بينثاميانا، أوتوفورا، بيسيلا، bigelovii، بالميري، تومينتوسيفورميس، القط، ديجلوتا، كاواكامي، كليفيلاندي، نيسوفيلا، سولانيفوليا، كورديفوليا، ديبنييي، أرينتسي، ثيرسيفلورا، ويجانديويديس، أوندولاتا، دبق، نوكتيفلورا، بيتونيويديس، أوبتوسيفوليا، ميرسيي، باوسيفلورا، تخفف من حدة،] [اكمينتا]، رمحية، المجنح، sylvestris، rustica و سوافيولينس | - | |||
| قثد | 3655 | أنجوريا، ميلو ، و الزعفران | كجتاكاجتتككجتاجكج | |||
| عكرش | 110873 | - | التمهيدي لم يتم العثور على | |||
| فصة | 3877 | ساتيفا، سوداء، بامفيليكا، لوناتا، روستراتي، مطوي و برميلية | - | |||
| Oryza | 4597 | البركة، جلوميباتولا، روفيبوجون برتي glaberrima الشروريه، لونجيستاميناتا، ميريديوناليس، nivara، ميريديوناليس ، و لونجيستاميناتا | - | |||
| قمح | 4564 | أيستيفوم، عورارتو ، و مونوكوككوم | - | |||
| شعير | 4512 | فولغاري، بولبوسوم، مارينوم، بريفيسوبولاتوم ، و بوجداني | - | |||
| خدمات المتعلمين | نبات | 3701 | البترائيه والتمويل و قيثاري | تجكتااكتكاجكججتاتك | ||
| بيقية | 3904 | أوروبي، تيتراسبيرما، والبركة، أهلب، السياجات، الأزهار، معنقدة، ربيعية، أوروبوس، أوروبوس، بيثينيكا و فول | تجكتااتكاجكججتاجكك | |||
| نفل | 3898 | التظاهر، نيجريسسينس، ريسوبيناتوم، غربي، مطمور، ستريكتوم، أوتشروليوكون، جلوميراتوم، سكواموسوم، أورنيثوبوديويديس ، و بلميط | تجكتااتكاجكججتاجكك | |||
| نيكوتيانا | 4085 | tabacum، بينثاميانا، أوتوفورا، بيسيلا، bigelovii، بالميري، تومينتوسيفورميس، القط، ديجلوتا، كاواكامي، كليفيلاندي، نيسوفيلا، سولانيفوليا، كورديفوليا، ديبنييي، أرينتسي، ثيرسيفلورا، ويجانديويديس، أوندولاتا، دبق، نوكتيفلورا، بيتونيويديس، أوبتوسيفوليا، مرسى، بوسيفلورا، تخفف من حدة،] [اكمينتا]، رمحية، المجنح، sylvestris و سوافيولينس | تجكتااكتكاجكججتاجتك | |||
| قثد | 3655 | ميلو، ريتشي و الجاوي | تجكتااكتكاجكججتاجتك | |||
| عكرش | 110873 | لاجوبويدي، بونجينس ، و العشبة | تجكتااتكاجكججتاتك | |||
| فصة | 3877 | آرابيكا، سوداء، بوليمورفا، روثينيكا، البركة و الحدود الدنيا | تجكتااتكاجكججتاجكك | |||
| بامفيليكا، لوناتا، روستراتي ، و مطوي | تجكتااكتكاجكججتاجتك | |||||
| Oryza | 4597 | البركة، جلوميباتولا، روفيبوجون، بارثييال، جلابيريما، أوسترالينسيس، اوفيسيناليس، أوسترالينسيس، ريدلي، مالامبوزاينسيس، ألتا، nivara، روفيبوجون، ميريديوناليس ، و لونجيستاميناتا | تجكتااكتكاجكججتاجتك | |||
| قمح | 4564 | أيستيفوم، سبيلتا، منتفخ، ديكوككويديس، بيتروبافلوفسكيي، عورارتو ، و مونوكوككوم | تجكتااكتكاجكججتاجتك | |||
| شعير | 4512 | فولغاري، بولبوسوم، الحائط، سيكالينوم، بريفيسوبولاتوم ، و بوجداني | تجكتااكتكاجكججتاجتك | |||
| يتم تعريف تمهيدي منحط كنظام IUPAC لتسمية النوكليوتيدات | ||||||
الجدول 1: قائمة الأنواع التي نظرت للانتقاء على أساس المتاشب كبسولة تفجير.
ونظرا سسو ربط الموقع بالمقارنة مع موقع الربط LSU أظهرت أعلى التسلسل التماثل على جنس.
| طول أمبليكون | منطقة التضخيم | التسلسل | اسم الدليل | أمبليكون | |
| 332-405 bp | تسلسل جزئي سسو، سلسلة كاملة من ITS1 وتسلسل جزئي من 5.8S | كجتاكاجتتككجتاجتج | سسو | ITS1--سطوح السفوح | |
| جتكاكججاتكتجكات | 5.8S--البحث والتطوير | ||||
| 318-361 bp | تسلسل جزئي من 5.8S، سلسلة كاملة من ITS2 وتسلسل جزئي لخدمات المتعلمين | أتجكاجاتكككجتجاكك | 5.8S--و | ITS2-سطوح السفوح | |
| تجكتاايتكاجكججتاجيك | خدمات المتعلمين | ||||
| 100-200 بي بي | ITS1 | جتاتجكجتكاجاكاكت | ITS1 إف | ITS1 | |
| أتاجكاتكجكتجكاجاغت | ITS1-R | ||||
الجدول 2: تسلسل التمهيدي.
Discussion
تحليل التعبير الجيني PCR الكمي قد طبقت على نطاق واسع في السنوات الأخيرة. والفائدة الرئيسية من هذه الطريقة السريعة والفعالة من حيث التكلفة والآلي هو نتيجة دقيقة ودقيقة. ومع ذلك، الحصول على الفوائد المثلى من هذه المزايا يتطلب فهم واضح لإعداد المعلمات المستخدمة في التجربة qPCR. لتلقي نتيجة موثوق بها في تحليل التعبير الجيني قبكر، من الضروري تجنب التضخيم غير محدد أن ينشأ من تلوث التمهيدي-ديمر أو جدنا في3،15عينة الحمض النووي الريبي. ومن المتوقع أن مستويات الحمض النووي الريبي نسخة سوف المغالاة في إطار جدنا التلوث8. هنا، يعتبر السمات الفريدة للجينات المتاشب مقايسة تلوث جدنا في عينات الحمض النووي الريبي.
الخصائص الأساسية المتاشب المستخدمة في هذا البروتوكول: ريبوسومال الجينات تتألف من ITSs اثنين، هما ITS1 و ITS2، وثلاثة ترميز الجينات الرنا الريباسي، 17-18S، 5.8S، و 25-28 وحدة فرعية12. هاتين المنطقتين لها ليست جزءا من تسلسل ترميز ريبوسومال الوحدات الفرعية. يتم إزالتها من على الأقل ثلاثة أنشطة الانزيمية عملية تمهيدا لتنضج الرنا الريباسي: endonuclease وهيليكاز و [ااكسونوكلس] نشاط. كما يتم نسخها الرنا الريباسي كنسخة بوليسيسترونيك، منتج أساسي المتضمن في ITSs هذا التأكيد. التجهيز سريع جداً ويأخذ مكان في نوية، وكمية السلائف القابلة للاكتشاف الجزيئات المحتوية على للبحث عن أقل من حد الكشف عن الأسلوب قبكر. ولذلك، عندما ITS1 أو ITS2 تتضخم بالبحث عن المرافقة الإشعال، يمكن اكتشاف أي تضخيم في عينات الحمض النووي الريبي ما لم يوجد تلوث جدنا. قدرت عدد المتاشب الجينات في جينوم الكائنات الحية حقيقية النواة تشمل نسخ تصل إلى ألف، التي يتم ترتيبها في صفائف واحد أو متعاضدا في الكروموسومات11. ونقترح في هذا البروتوكول، طريقة بديلة، بدلاً من العلاج ببدائل النيكوتين، للكشف عن التلوث جدنا، الذي يستخدم في كل رد فعل/المقايسة.
الفوائد والقيود فيما يتعلق بالأساليب القائمة: العلاج ببدائل النيكوتين يستخدم عادة اختبار ما إذا كانت عينة الحمض النووي الريبي المعدة نظيفة أو ملوثة جدنا. حيث لا يتم توزيع التلوث جدنا موحد بين عينات الحمض النووي الريبي مختلفة، ورد فعل حساسية إلى جدنا هو تأثرا كبيرا بالجينات تم تحليلها، الضوابط النيكوتين المطلوبة لكل زوج عينة/المقايسة7،15. سيقوم هذا بإضافة التكاليف إلى حد كبير، والعمل عند التعامل مع العديد من العينات في وقت واحد3،9. وتشمل أساليب بديلة أخرى موثقة في الأدب استخدام الإشعال إنترون محددة للكشف عن جدنا، أو كبسولة تفجير تصميم الجناح إنترون أو تمتد مفرق إكسون-إكسون. القيود المفروضة على هذه الأساليب تنبع من عدم توافر معلومات تسلسل إنترون، الشروح غير مكتملة من هيكل إنترون/إكسون، ونظرا لعدم إينترونس في الجينات أو بسيودوجينيس للفائدة1،4،10 . نظراً للتطور، توجد جينات المتاشب كأسرة جين مولتيجيني ويحافظ على درجة عالية. وشديدة وفيرة في الجينوم وموجودة على الكروموسومات المختلفة13. بالمقارنة مع جينات أخرى نونكوندينج أو الترميز، تظهر الجينات المتاشب الاحتواء الأفضل للكشف عن التلوث جدنا. في التحليلات المقارنة ترانسكريبتوميك، لا ينصح تطبيع البيانات qPCR بمعايرة الرنا الريباسي لبعض القضايا، مثل الاختلافات في كدنا إعداد (فتيلة بوليا مقابل فتيلة هيكسامير عشوائي)، والاختلافات الكبيرة بين الرنا الريباسي ومرناً في وفرة ، ونشوء حيوي المختلفة التي قد تولد مضللة النتائج10،16. بيد أن المشاكل التي ذكرناها فقط ميزة لفحص التلوث جدنا. على سبيل المثال، فيما يتعلق بوفرة موقع استهداف أعلى في الجينوم والتعريب في الكروموسومات المختلفة، كبسولة تفجير المستندة إلى المتاشب إلى حد كبير تحسين حساسية الكشف عن جدنا بالمقارنة مع الأساليب القائمة.
فيرساليتي على أساس المتاشب للكائنات الحية الأخرى: المتاشب الجينات عائلة جينات مدروسة حددت في معظم الكائنات الحية. وتمثل الطريقة المقترحة على أساس المتاشب نظاما بسيطة وحساسة للغاية، والاقتصادية لفحوصات تلوث جدنا التي يمكن تكييفها بسهولة لسائر الكائنات الحية حقيقية النواة وبدائية النواة (البروتوكول 2-5). كدراسة حالة، أثبتنا هنا فائدة هذا الأسلوب في بعض الأنواع بوسي (الشكل 4 و الشكل 5). الإشعال المستخدمة تظهر نسبة عالية من قابلية للأنواع الأخرى بوسي نظراً للهيكل يحافظ على درجة عالية من مفارز المتاشب بين الأنواع. هذه المشكلة يصبح أكثر أهمية عندما لا تتوفر معلومات كافية في تسلسل الجينوم للتصميم التمهيدي. وهكذا، يمكن استخدام المرافقة للبحث عن كبسولة تفجير تصميم لأحد الأنواع في أنواع ذات صلة. أيضا، 5.8S--F/R كبسولة تفجير اعتقلوا استناداً إلى فكرة مصانة ويبين التشابه عالية في معظم النباتات المزهرة14. على الرغم من زيادة إنتاجية عالية يسلسل تقنيات بشكل دائم عدد مورثات المعروفة، لم يتم الانتهاء من الشرح إكسون-إنترون لمعظم الكائنات الحية، وحتى أنها غالباً ما تكون غير ممكنة لتصميم كبسولة تفجير تمتد إلى حدود إكسون-إكسون. لدينا أسلوب يشرح كيف المستندة إلى المتاشب الإشعال يمكن تطبيقها لفحص التلوث جدنا في تحليل qPCR لبدائيات النوى وحقيقيات النوى بهدف القضاء على الضوابط النيكوتين مكلفة في كل تركيبة الإنزيم/التمهيدي.
Disclosures
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
بتأييد هذه البحوث الوراثية و "معهد التكنولوجيا الحيوية تاباريستان الزراعية" (جابيت) و "ساري العلوم الزراعية" والموارد الطبيعية جامعة (القوابل). ومولت المجموعة البحثية جونيور "اللاأحيائية الإجهاد الجينوم" إيزن (مركز متعدد التخصصات لبحوث المحاصيل النباتية، هالي (Saale)، وألمانيا. ونحن نشكر ماير روندا لقراءة نقدية من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
| 96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
| Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
| Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
| NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
| RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
| TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
| PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
| Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
| Agarose - Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
| bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
| ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
| Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |
References
- Bustin, S. A., Nolan, T. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech. 15 (3), 155-166 (2004).
- Gutierrez, L., Mauriat, M., Pelloux, J., Bellini, C., Van Wuytswinkel, O. Towards a systematic validation of references in real-time RT-PCR. Plant Cell. 20 (7), 1734-1735 (2008).
- Hashemi, S. H., Nematzadeh, G., Ahmadian, G., Yamchi, A., Kuhlmann, M. Identification and validation of Aeluropus littoralis reference genes for Quantitative Real-Time PCR Normalization. J Biol Res (Thessalon). 23 (1), 18 (2016).
- Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 25 (2), 169-193 (2000).
- Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Laurell, H., et al. Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime. Nucleic Acids Res. 40 (7), e51 (2012).
- Galiveti, C. R., Rozhdestvensky, T. S., Brosius, J., Lehrach, H., Konthur, Z. Application of housekeeping npcRNAs for quantitative expression analysis of human transcriptome by real-time PCR. RNA. 16 (2), 450-461 (2010).
- Laurell, H., et al. Correction of RT-qPCR data for genomic DNA-derived signals with ValidPrime. Nucleic Acids Res. 40, e51 (2012).
- Caldana, C., Scheible, W. R., Mueller-Roeber, B., Ruzicic, S. A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors. Plant Methods. 3 (1), 7 (2007).
- Lawrence, R. J., Pikaard, C. S. Perspectives Chromatin Turn Ons and Turn Offs of Ribosomal RNA Genes. Cell Cycle. 3 (7), 880 (2004).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Alvarez, I., Wendel, J. F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Mol Phylogenet Evol. 29 (3), 417-434 (2003).
- Jobes, D. V., Thien, L. B. A conserved motif in the 5.8 S ribosomal RNA (rRNA) gene is a useful diagnostic marker for plant internal transcribed spacer (ITS) sequences. Plant Mol Biol Report. 15 (4), 326-334 (1997).
- Padhi, B. K., Singh, M., Huang, N., Pelletier, G. A PCR-based approach to assess genomic DNA contamination in RNA: Application to rat RNA samples. Anal Biochem. 494, 49-51 (2016).
- Dheda, K., et al. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques. 37 (1), 112-114 (2004).
