Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55452
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 3, 3, 1
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Summary

تقدم هذه الدراسة منهجية لإعداد 3D، قابلة للتحلل، السقالات خلية تشبه الرغوة على أساس الجانب سلسلة اللدائن الكريستال السائل حيويا (LCEs). تبين التجارب المجهري متحد البؤر التي LCEs مثل رغوة تسمح لمرفق الخلية، والانتشار، والمحاذاة التلقائية للmyoblasts C2C12s.

Abstract

هنا، نقدم إعداد خطوة بخطوة ل3D، قابلة للتحلل، مثل رغوة خلية سقالة. والتي عبر ربط كتلة النجم المشارك البوليمرات يضم وحدات الكولسترول كمجموعات الجانبية سلسلة قلادة، مما أدى إلى smectic-A (SMA) اللدائن الكريستال السائل (LCEs) التي أعدت هذه السقالات. السقالات تشبه الرغوة، أعدت باستخدام قوالب معدنية، ميزة microchannels المترابطة، مما يجعلها مناسبة كما السقالات زراعة الخلايا 3D. الخصائص المشتركة للهيكل منتظم من رغوة المعادن ونتيجة المطاط الصناعي في سقالة خلية 3D تعزز العالي ليس فقط تكاثر الخلايا بالمقارنة مع الأفلام التقليدية التي يسهل اختراقها قالب، ولكن الإدارة أيضا أفضل من النقل الجماعي (أي المواد المغذية والغازات والنفايات ، وما إلى ذلك). طبيعة القالب المعدني تسمح للتلاعب السهل من الأشكال رغوة (أي، لفات أو الأفلام) ولإعداد السقالات أحجام المسام المختلفة للدراسات مختلفة من الخلايا مع الحفاظ على interconnecتيد طبيعة المسامية من القالب. عملية الحفر لا يؤثر على كيمياء اللدائن، والحفاظ على طبيعتها حيويا والقابلة للتحلل. وتبين لنا أن هذه LCEs smectic، عندما نمت لفترات زمنية واسعة، وتمكين دراسة بنيات الأنسجة ذات الصلة ومعقدة سريريا مع تعزيز نمو وانتشار الخلايا.

Introduction

وهناك العديد من الأمثلة من المواد الاصطناعية البيولوجية وحيويا لتطبيقها في دراسات الخلايا وتجديد الأنسجة التي تهدف إلى مرفق الخلية وانتشار 1، 2، 3، 4، 5. وكانت هناك أمثلة قليلة من المواد حيويا، والمعروفة باسم اللدائن الكريستال السائل (LCEs)، يمكن أن يستجيب للمؤثرات الخارجية مع متباين الخواص الجزيئية طلب 6 و 7. LCEs هي مواد المحفزات متجاوبة التي تجمع بين الخواص الميكانيكية ومرنة من اللدائن مع وظيفة البصرية وترتيب الجزيئية من البلورات السائلة 8 و 9. يمكن LCEs تجربة تغييرات في الشكل وتشوه الميكانيكية، وسلوك مرن، والخصائص البصرية ردا على STIM الخارجيةاولي (أي.، الحرارة، والإجهاد، والضوء، وما إلى ذلك) 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16. وقد أظهرت دراسات سابقة أن البلورات السائلة (خطابات الاعتماد) يمكن الشعور نمو وتوجيه الخلايا 4، 17. ومن ثم من الممكن أن نفترض أن LCEs قد تكون مناسبة للتطبيقات البيولوجية والطبية ذات الصلة، بما في ذلك السقالات الخلية والمحاذاة. لقد ذكرت سابقا إعداد smectic الأفلام حيويا، قابلة للتحلل، ويلقي مصبوب، وLCEs رقيقة يضم "نوع السويسري الجبن" مورفولوجيا التي يسهل اختراقها 6، 18. ونحن على استعداد أيضا LCEs حيويا خيطي مع التشكل كروي كما السقالات لنمو الخلايا 19 <سوب>، 20. ويهدف عملنا في ضبط الخواص الميكانيكية للمواد بحيث تتطابق مع تلك الأنسجة من الفائدة 21. أيضا، وتركز هذه الدراسات على فهم التفاعلات المطاط الصناعي خلايا، فضلا عن الاستجابة الخلوية عندما اللدائن تخضع للمؤثرات الخارجية.

كانت التحديات الرئيسية في جزء منه إلى تكييف المسامية من LCEs للسماح لمرفق الخلية وتخلل من خلال مصفوفة المطاط الصناعي والنقل الجماعي أفضل. مسامية من هذه الأفلام رقيقة 6 سمحت تخلل الخلية من خلال الجزء الأكبر من المصفوفة، ولكن لم تكن كل المسام مترابطة كليا أو كان حجم أكثر انتظاما (متجانسة) المسام. نحن بعد ذلك تقريرا عن حيويا اللدائن LCE خيطي مع الأشكال التضاريسية الكروية. هذه اللدائن خيطي سمحت للمرفق وتكاثر الخلايا، ولكن تراوح حجم المسام فقط 10-30 ميكرومتر، والتي منعت أو استخدام هذه محدودةاللدائن مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا 19 و 20.

الأعمال السابقة التي الكونغ آخرون. المتعلقة بتشكيل الرغاوي الجرافين باستخدام "الأضاحي" قالب معدني أظهرت أن رغوة الجرافين التي تم الحصول عليها كان لها التشكل التي يسهل اختراقها العادية جدا التي يمليها قالب معدني اختيار 22. تقدم هذه المنهجية السيطرة الكاملة على المسامية وحجم المسام. في الوقت نفسه، على تطويع والمرونة من القالب المعدني تسمح لتشكيل قالب مختلف الأشكال قبل إعداد الرغوة. تقنيات أخرى، مثل الرشح المواد 23، النموذجيه الغاز 24، أو ألياف نسج الكهربائية 25 و 26 كما تقدم إمكانية إعداد المواد المسامية، لكنها أكثر استهلاكا للوقت، وفي بعض الحالات، يقتصر حجم المسام ل فقط عدد قليل من ميكرومتر. رغوةتشبه LCEs 3D أعدت باستخدام قوالب معدنية تسمح لتحميل خلية العالي؛ تحسين معدل انتشار. شارك في زراعة؛ وأخيرا وليس آخرا، وتحسين إدارة النقل الجماعي (أي المواد الغذائية، والغازات، والنفايات) لضمان تنمية الأنسجة الكاملة 27. تظهر مثل رغوة LCEs 3D أيضا إلى تحسين المواءمة الخلية؛ وهذا هو الأرجح فيما يتعلق المعلقات LC الاستشعار عن نمو الخلايا والتوجه الخلية. وجود الأنصاف LC داخل LCE يبدو لتعزيز التوافق خلية فيما يتعلق موقع خلية داخل سقالة LCE. خلايا محاذاة داخل الدعامات من LCE، في حين لوحظ أي اتجاه واضح حيث تنضم الدعامات معا (تقاطعات) 27.

وعموما، لدينا LCE منصة خلية سقالة كوسيلة دعم الخلية تتيح فرصا لضبط التشكل المطاط الصناعي وخصائص المرونة وتحديدا توجيه محاذاة (الفرد) أنواع الخلايا لخلق أمر والترتيبات المكانية سخلايا مماثلة لو المنظومات الحية. وبصرف النظر عن تقديم سقالة قادرة على الحفاظ وتوجيه نمو الخلايا على المدى الطويل وانتشار، LCEs تسمح أيضا للتجارب الحيوية، حيث يمكن تعديل توجيه الخلايا والتفاعلات على الطاير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الخطوات التالية ل3D LCE إعداد مثل رغوة باستخدام 3-ذراع كتلة نجم من البوليمرات وتظهر في الشكل 1. لتوصيف النووي بالرنين المغناطيسي (NMR)، يتم تسجيل الأطياف في الكلوروفورم بالديوتيريوم (CDCl 3) في درجة حرارة الغرفة على بروكر DMX 400 ميغاهيرتز الصك وداخليا المشار القمم المتبقية في 7.26. تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) الأطياف يتم تسجيلها باستخدام بروكر المتجهات 33 FT-IR مطياف باستخدام الكلي وضع الانعكاس الموهن. لكل خطوة من بروتوكول التالية، من المهم أن ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).

1. توليف α-كلورو-ε-caprolactone (الأحادي) (وفقا لإجراءات في جيروم وآخرون. 28)

  1. قبل البدء في تجميع وتنقية 27 غرام من حامض 3-chloroperbenzoic على النحو التالي:
    1. في 800 مل من الماء المقطر، إضافة 1،28 غرام من الصوديومالفوسفات أحادي القاعدة الهيدرات و8.24 غرام من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة مائى. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك) والاحتياطي 30 مل من هذا الحل. هذا هو الحل العازلة.
    2. باستخدام قمع فصل، ويحل حامض 3-chloroperbenzoic في 35 مل من ايثر. غسل حل العضوي مع 10 مل من محلول منظم (المعد في الخطوة 1.1.1). تكرار غسل ثلاث مرات.
    3. إضافة 3 غرام من كبريتات الصوديوم مباشرة إلى حل العضوي. هذا عامل التجفيف تمتص الماء من المحلول العضوي.
    4. تصفية الحل لإزالة عامل التجفيف. التركيز الترشيح تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية.
  2. إذابة 18.5 غرام من تنقية حامض 3-chloroperbenzoic في 150 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف عن طريق اثارة في حمام بالموجات فوق الصوتية. هذه العملية تستغرق عادة 20 دقيقة. وضع الحل داخل قمع فصل.
  3. داخل الرقبة اثنين، دورق كروي،حل 13،1 غراما من 2 chlorocyclohexanone في 15 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف باستخدام محرك مغناطيسي تحت غاز النيتروجين. الحفاظ على اثارة.
  4. تناسب قمع فصل يحتوي على محلول حمض 3-chloroperbenzoic (من الخطوة 1.2) إلى قارورة اثنين الرقبة في الخطوة 1.3. مسح نظام مع غاز النيتروجين. ضبط افتتاح قمع فصل بحيث يسقط محلول حمض chloroperbenzoic قطرة قطرة في حل 2-chlorocyclohexanone (1 قطرة كل البعض الثاني) وتستمر اثارة الخليط تحت غاز النيتروجين لمدة 96 ساعة.
  5. تبريد خليط التفاعل إلى -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لترسيب ثانوية م حامض -chlorobenzoic (م -CBA).
  6. تصفية حمض -chlorobenzoic م (م -CBA) ويغسل الحل المتبقي مع حلول المشبعة من ثيوكبريتات الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم.
  7. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية. تنقية أصفر باهت، LIQU لزجمعرف عن طريق التقطير تحت ضغط منخفض عند 2.3 عربة و 96 درجة مئوية.
  8. مراقبة نجاح عملية التوليف باستخدام 1 قمم H NMR التالية. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 4،75-4،68 (م، 1H، C H ClCO)، 4،37-4،26 (م، 1H، C H 2 O)، 4،18-4،05 (م، 1H ، C H 2 O)، و2،06-1،58 (م، 6H، -C H 2 -) 6، 27.

2. تجميع α-ثلاثة تسليح ستار كتلة كوبوليمر (SBC-αCl) من خلال حلقة بالتطعيم افتتاح (شارما وآخرون. (6) وأمسدن وآخرون. 29)

  1. قبل التوليف، silanize أمبولة 20 مل من ملئه مع (/ ت ت) حل 2٪ من 1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyltriethoxysilane في التولوين والتحريك لمدة حوالي 24 ساعة. شطف مع ايزوبروبيل وجففها عن طريق وضعها في الفرن على 140 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 30.64 غرام من المقطر ε-caprolactone، 0.5 غرام من α-كلورو-ε-caprolactone، و 0.25 مل من الجلسرين إلى أمبولة. باستخدام مزيج دوامة لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 4.90 غرام من D، L -lactide إلى أمبولة وتخليصها مع النيتروجين. ضع أمبولة في الفرن على 120 درجة مئوية لإذابة D، L -lactide. هذه العملية تستغرق عادة حوالي 2 ساعة. مزيج مرة أخرى باستخدام دوامة للتأكد من أن جميع محتويات مختلطة جيدا وإضافة 66 ميكرولتر من القصدير (II) 2-ethylhexanoate (القصدير (أكتوبر) 2) إلى أمبولة.
    ملاحظة: D، L سوف -lactide يبرد أثناء هذه العملية، وسوف تحتاج إلى إعادة تسخينه في الفرن لتذوب.
  4. بقوة مزيج واحد آخر مرة باستخدام دوامة والاحمرار مع النيتروجين.
  5. إغلاق أمبولة مع سدادة مطاطية. وضع إبرة متصلة فراغ أنبوب (الفراغ المنزل عادة ما يكون بما فيه الكفاية) من خلال سدادة مطاطية. بدوره على فراغ، وباستخدام لهب، تذوب الرقبة طويلة من الزجاج، والتواء ببطء حتى زمعشوقة ينهار على نفسه. كن حذرا حتى لا تذوب سدادة مطاطية. مرة واحدة في أمبولة هو اللهب مختومة، وضعه في حمام الرمل، فرن، أو عنصر التسخين المناسب في 140 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  6. إخراج أمبولة واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة.
  7. كسر أمبولة في علامة مغلقة وحل سائل لزج للغاية وذلك بإضافة 10 مل من ثنائي كلورو ميثان. نقل حل لقمع فصل.
  8. إعداد قارورة تحتوي على 100 مل من الميثانول الباردة (المبردة باستخدام الجاف حمام الثلج / الأسيتون عند درجة حرارة حوالي -78 ° C). إصلاح قمع فصل (الخطوة 2.7) على رأس القارورة. ضبط افتتاح قمع فصل بحيث عن اثنين من قطرات تسقط كل الآخرين الثاني (قطرة قطرة).
  9. جمع راسب أبيض عن طريق الترشيح (باستخدام ورقة فلتر) وجففها في فرن فراغ ما بين 50 و 60 درجة مئوية.
  10. مراقبة نجاح عملية التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 5،29-5،03 (م، COC H C H 3)، 4،43-4،25 (م، C H الكلور)، 4،24-4،12 (م، C H 2 O)، 4،11-4،03 (ر، J = 4.6 هرتز، C H 2 O)، 3،80-3،68 (م، C H C H 2)، 3،09-2،64 (اسعة، S، O H)، 2.39 (ر، J = 4.5 هرتز، H ألفا)، 2.33 (ر، J = 5.1 هرتز، H ألفا)، و1،77-1،25 (م، C H 2، C H 3)؛ FT-IR (1 / λ [سم -1]): 2932 (ق)، 2869 (م)، 1741 (ق)، 961 (ق)، 866، و 735 (م) 6، 27.
    ملاحظة: لإعداد 3D LCE أكثر ماء، وإعداد كتلة كوبوليمر الخطية (LBC) بدلا من SBC، وبعد إجراء عصابة فتح البلمرة (شرطة عمان السلطانية) المذكورة أعلاه.
    1. إضافة 0.3 غرام من البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، 3.15 ز ε-caprolactone، 1.0 غرام من α-كلورو-ε-caprolactone، و 5.0 غرام من D، L-lactide إلى مزيج قارورة silanized.

    3. تعديل الاصطناعية من α-CL-ثلاثة الذراع SBC إلى αN 3 ثلاثة والذراع SBC (SBC-αN 3) (وفقا لشارما وآخرون. 6)

    1. في قارورة ذهابا وأسفل وتحت النيتروجين، ويحل 5 غرام من SBC-αCl في 30 مل من N الجاف، N '-dimethylformamide.
    2. إضافة 0.22 غرام من أزيد الصوديوم والسماح للرد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
      تحذير: أزيد الصوديوم السامة. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).
    3. إزالة N، -dimethylformamide N 'تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 11 مللي بار و 40 درجة مئوية. حل الخليط في 30 مل من التولوين. أجهزة الطرد المركزي في حل ثلاث مرات في 2800 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة الملح تشكيلها. تتبخر التولوين تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 77 مللي بار و 40 درجة مئوية.
    4. مراقبة نجاح استبدال أزيد باستخدام 1 H NMR وFT-IR القمم.
      ملحوظة: -1]): 2928، 2108 (ق، أزيد)، 1754 (ق)، 1450 (ق)، 960 (م)، 865 (ق)، 733 (ق)، و 696 (م).

    4. توليف الكوليسترول 5 Hexynoate (LC شاردة) (وفقا لشارما وآخرون. (6) ودونالدسون وآخرون. 30)

    1. في قارورة ذهابا والقاع، ومزيج 3 غرام من حمض 5-hexynoic و 130 مل من ثنائي كلورو ميثان. بارد 0 درجة مئوية باستخدام حمام جليدي.
    2. في قارورة ذهابا وأسفل أخرى، مزيج 8.28 غرام من N، N '-dicyclohexylcarbodiimide، 10.3 غرام من الكولسترول، و 0.2 غرام من 4 dimethylaminopyridine.
    3. نقل 5-hexynoic حامض حل قطرة قطرة إلى قارورة تحتوي على خليط الكوليسترول في الدم والحفاظ على الخليط النهائي في 0 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. يسمح هذا المزيج على الاحماء لدرجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. إزالة الناتجة يعجل dicyclohexylurea عن طريق الترشيح باستخدام ورق الترشيح الدرجة 415 وتخلص منه.
    5. التركيز الترشيح تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية. حل هذه البقايا التي تم جمعها في 150 مل من الهكسان.
    6. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 335 مليبار و 40 درجة مئوية. إضافة 350 مل من الايثانول إلى بقايا زيتية لجمع المنتج النهائي. غسل من البيض الصلبة شكلت مع الإيثانول وتجفيف المنتجات الصلبة في ظل فراغ عند 50 درجة مئوية.
    7. مراقبة التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 5.39 (د، J = 4.7 هرتز، 1H، C H = C)، 4،70-4،58 (م، 1H، C H OCO)، 2.44 (ر، J = 2.5 هرتز، 2H، C H 2 CO)، 2.34 (م، 2H، C H 2-C H =)، 2.31 (م، 2H، C H 2 C H 2 -COO)، 2.28 (ق، 1H، HC≡C)، 2.27 (د، J = 2.3 هرتز، 2H، ≡CC H 2)، 2،07-1،06 (م، 2H، C H 2، C H)، 0.94 (ق، 3H، C H 3)، 0.89 (د، J = 1.8 هرتز، 3H، C H 3 C H)، و0.88 (د، J = 1.8 هرتز، 6H، C H 3 -C H)، 0.67 (ق، 3H، C H 3). FT-IR (1 / λ [سم -1]): 2،830-2،990 (واسعة وقوية الذروة)، 2104 (م)، 1695 (ق)، 1428 (م)، 1135 (م)، 999 (ق)، 798 (ق)، و 667 (ق).

    5. تعديل الاصطناعية من α-N 3 ثلاثة والذراع SBC إلى ألفا-الكوليسترول-ثلاثة الذراع SBC (SBC-αCLC) عن طريق رد الفعل أزيد-آلكاين Huisgen سيكلو إضافة ( "اضغط على" رد الفعل) للحصول على SBC-تشول (وفقا ل شارما وآخرون. 6)

    1. في قارورة ذهابا والقاع، ويحل 1 المولي يعادل SBC-αN 3 (1.5 غرام) في 100 مل من رباعي هيدرو الفوران المقطر الطازجة (THF). إضافة 1.2 يعادلها الموليطن من الكوليسترول 5 hexynoate (1.94 ز)، أي ما يعادل 0.1 المولي من النحاس (I) يوديد (0.06 ز)، و 0.1 يعادل المولي من ثلاثي الإيثيلامين (0.03 ز). يحرك الخليط بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية تحت النيتروجين.
    2. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 357 مليبار و 40 درجة مئوية.
    3. حل الخليط المتبقي في 80 مل من ثنائي كلورو ميثان وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2800 x ج في درجة حرارة الغرفة لإزالة المواد المتفاعلة والمنتجات الجانبية.
    4. مراقبة التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 7.54 (ق، CH = C-التريازول)، 5،43-5،34 (م، C = CH الكوليسترول)، 5،10-5،06 (م، COCHCH 3)، 4.68 -4.55 (م، O-CH الكوليسترول)، 4،24-4،19 (م، CH 2 O)، 4،18-4،13 (ر، J = 5.0 هرتز، CH 2 O)، 4،11-4،05 (ر، J = 4.4 هرتز، CH 2 O)، 2،47-2،41 (ر، J = 4.9 هرتز، كوتش 2)، 2،31-2،25 (م، كوتش 2)، 2،07-1،02 (م، CH 2 3)، 1،05-1،03 (ق، CH 2، CH 3)، 0،96-0،92 (د، J = 3.3 هرتز، CH 2، CH 3)، 0،91-0،87 (اليوم، J = 1.9 هرتز، J = 1.8 هرتز، CH 3)، و0،71-0،68 (ق، CH 3). FT-IR (1 / λ [سم -1]): 3260 (ق)، 2920 (ق)، 1710 (ق)، 1460 (ق)، 1370 (ق)، 1240 (م)، 1190 (ق)، 733 (ق)، و 668 (ق).

    6. تجميع 2،2-مكرر (1-caprolactone-4-YL) البروبان (Crosslinker، BCP) (وفقا لقاو وآخرون. 27 وAlbertsson وآخرون. 31)

    1. في قارورة ذهابا والقاع، وإعداد محلول يحتوي على 10.8 غراما من 2 مكرر (4-هيدروكسي-cyclohexyl) البروبان و 52 مل من حمض الخليك.
    2. تحضير محلول يحتوي على 11 غرام من أكسيد الكروم في 50 مل من حمض الخليك و 8 مل من الماء المقطر. إضافة هذا الحل قطرة قطرة إلى حل أعدت في الخطوة 6.1 مع الحفاظ على درجة حرارة خليط بين 17 و 20 درجة مئوية (على سبيل المثال، فيحمام الماء)؛ هذه العملية تستغرق قطرة قطرة 2 ساعة. وبمجرد اكتمال العملية، والسماح للحل ليقلب لمدة 30 دقيقة.
    3. إضافة 50 مل من 2-بروبانول. تحريك الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    4. التركيز على حل البنفسجي الغامق تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 137 مليبار و 40 درجة مئوية. إضافة 300 مل من الماء المقطر لترسيب. يجب أن يكون راسب ضوء الأرجواني.
    5. الترشيح الناتج الخام باستخدام ورق الترشيح الصف 415. غسل المواد الصلبة مع ~ 250 مل من الماء المقطر أو حتى الصلبة يصبح أبيض.
    6. حل مادة صلبة في 15 مل من البنزين في 40 ° C والسماح لها أعد بلورة عند 25 درجة مئوية.
    7. إضافة 8.34 غرام من كيتون ثنائي الجاف حله في ثنائي كلورو ميثان الجاف ومحلول يحتوي على 6.0 غرام من حامض 3-chloroperbenzoic في 75 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى قارورة.
    8. ارتداد الحل عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    9. تبريد خليط التفاعل إلى -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لترسيب م
    10. إزالة م حامض -chlorobenzoic عن طريق الترشيح (باستخدام ورقة فلتر) والتركيز على حل تحت ضغط منخفض.
    11. يغسل المنتج الخام فسكوزي مع 200 مل من 2 heptanone وتجفيف راسب في ظل فراغ عند 50 درجة مئوية خلال الليل.
    12. مراقبة التوليف باستخدام التالية 1 H NMR وFT-IR القمم. 1 H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl 3، δ [المليون]): 4،42-4،37 (اليوم، J = 14.2، 7.4 هرتز، 2H، C H 2 OC = O)، 4،21-4،15 (ر، 2H، J = 11.3 هرتز، C H 2 OC = O)، 2،80-2،75 (دي دي تي، J = 14.3، 6.5، 1.6 هرتز، 2H، C H 2 COO)، 2،63-2،57 (ترينيداد وتوباغو، J = 13.3، 2.1 هرتز، 2H، C H 2 COO)، 2،04-1،93 (M، 4H، -C H 2 CH 2 OC = O)، 1،70-1،56 (م، 4H، -C H 2 C H 2 COO)، 1،48-1،38 (م، 2H، - C H C (CH 3) 2)، و0.84 (ق، 6H، C H 3 C-).
      13. 7. إنشاء المسامية 3D المرنة سقالة عن طريق إما Hexamethylene الدي إيزوسيانات (HDI) أو 2،2 مكرر (1-caprolactone-4-YL) البروبان (BCP) 27 كما Crosslinkers (وفقا لقاو وآخرون. 27)

      1. إعداد ثلاث ذراع المطاط الصناعي خليط باستخدام 0.75 غرام من SBC-αCLC بإضافة 0.25 مل من HDI (أو 0.45 مل من BCP) و 0.24 مل من المقطر مونومر ε-caprolactone. إضافة 60 ميكرولتر من القصدير (أكتوبر) 2. في حالة استخدام BCP بدلا من HDI، مزيج SBC-αCLC وBCP باستخدام الدوامة ووضعها في الفرن على 140 درجة مئوية حتى يذوب BCP تماما ويذوب (هذه الخطوة يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 2 ساعة). مرة واحدة وقد تم حل BCP، إخراجها من الفرن و، والقصدير (أكتوبر) 2، ودوامة.
      2. إعداد "الأضاحي" قالب النيكل رغوة بقطع 1 × 4 سم معدن قطعة. لفة من أحد طرفي قصيرة بحيث لفة الأخيرة هي حوالي 1 × 1 سم معدن قطعة (انظر الشكل 4).
        3. <لى> ضع رغوة النيكل في قارورة زجاجية أو الألومنيوم حزمة احباط ويصب الخليط المعد في الخطوة 7.1 لتغطية كامل الرغوة لمدة 2 دقيقة. إزالة الخليط الزائد مع الماصة باستور. ترك الأمر بين عشية وضحاها في الفرن عند 80 درجة مئوية.
      3. تقشر رقائق الألومنيوم أو كسر الزجاج. باستخدام شفرة حلاقة، حلق المطاط الصناعي في جميع أنحاء رغوة المعادن للكشف عن المعادن النيكل.
      4. إعداد 1 M الحديد (III) كلوريد (FeCl 3) حل في 100 مل من الماء. ضع رغوة في قارورة وإضافة 70 مل من FeCl 3 الحل. يحرك المزيج لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة، وتغيير FeCl 3 حل كل يوم. قبل كل تغيير، وإثارة الرغوة مع الماء المؤين عن 0.5 ساعة.
        ملاحظة: عادة ما يتم الانتهاء من عملية الحفر بعد ثلاثة أيام. لضمان أن يتم الانتهاء من عملية الحفر، إجراء اختبارات الضغط عن طريق اللمس حتى يشعر الرغاوي لينة. المقاومة رغوة لاختبارات ضغط اللمس يدل على وجود قالب معدني المتبقية.
      5. شطف ELASTعمر رغوة مع الايثانول ومكان في فراغ فرن بين عشية وضحاها في 40 ° C.
      6. توصيف المواد باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، الكالوري التفاضلية المسح الضوئي (DSC)، اختبارات ضغط الميكانيكية، والتحليل الوزني الحراري (TGA) 27.
        ملاحظة: للحصول على إعداد 3D LCE أكثر ماء، استبدل SBC مع LBC (التأكد من أن LBC يحتوي أيضا على شاردة LC) باتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 7.5.

      8. البذر من المطاط الصناعي سقالة مع خلايا SH-SY5Y العصبية والثقافة عن طريق تقنيات معقمة

      1. تعقيم المطاط الصناعي قبل غسله مرتين مع 1 مل من الايثانول 70٪. أداء أشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة ويغسل مع 1 مل من الايثانول 70٪. شطفه مرتين مع 1 مل من الماء المعقم و 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضع اللدائن في لوحات ثقافة 24-جيدا.
      2. إعداد المتوسطة نمو الخلايا لSH-SY5Y تحتوي على 90٪ Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) supplemented مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين (القلم بكتيريا).
      3. بعد فرز الخلايا باستخدام الكريات، وإعداد 1.5 × 10 5 خلايا SH-SY5Y علقت في 100 ميليلتر من متوسط النمو (حل البذور). إضافة الحل على رأس اللدائن، مع التأكد من تشكيل الهبوط.
      4. احتضان اللدائن المصنفة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ لمدة 2 ساعة لتعزيز التصاق الخلية. إضافة 0.5 مل من متوسط ​​النمو. احتضان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
      5. تغيير المتوسطة كل يوم بعد الغسيل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.

      9. التصوير المجهري المرنة تعبيد

      1. إصلاح الخلايا المزروعة في اللدائن مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. شطف مع 3 مل من PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل ووضع المطاط الصناعي مع الخلايا الثابتة في صحن الثقافة مع ساترة المرفقة.
        تحذير: PFA سامة. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).
      2. ستافي عينات ثابتة بنسبة 0.1٪ من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
      3. على الفور صورة اللدائن باستخدام متحد البؤر المجهري مع دابي مضان، والحصول على مداخن صورة التي تمتد العينة.
        ملاحظة: هنا، تم الحصول على مداخن صورة باستخدام الهدف 20X 60X وهدف.
      4. تحليل مداخن البصرية صورة متحد البؤر باستخدام يماغيج 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين هذا التقرير طريقة إعداد LCE 3D التي يسهل اختراقها كما سقالة للثقافة الخلية باستخدام قالب معدن النيكل. يدل على 3D LCE حصلت شبكة معقدة متداخلة القناة التي تسمح للتسلل خلية سهلة، وكذلك النقل الجماعي أكثر ملاءمة 27. وجد أن الخلايا قادرة على اختراق كامل شبكة قناة مترابطة وهي أيضا قادرة على محاذاة داخل LCE. هنا، رغوة النيكل المعدنية (99٪ نيكل، كثافة 860 غرام / سم 2) وقد تم اختيار التالية نهجا مماثلا لإعداد الرغوة الجرافين ذكر سابقا من قبل كونغ وآخرون. 22. رغوة المعادن والبوليمرات محمل، مع كل الدعامات المعدنية مغطاة بالكامل. اختيار حجم الرغوة المعدنية والكثافة أمر مهم، لأنه يضفي على التشكل النهائي للLCE ويمكن أن تساعد في محاكاة البيئة الأنسجة من الاهتمام.

العمر = "1"> ويستند إعداد الصب من البوليمرات على يشابك من ثلاثة ذراع كتلة نجم من البوليمرات القائم على الجلسرين (SBC) باستخدام البلمرة حلقة الافتتاح (شرطة عمان السلطانية). مونومرات هي ε-caprolactone أو تعديل ε-caprolactone (توليفها لغرض إضافة ذرة الهالوجين التي من شأنها في وقت لاحق أن تكون بديلا من قبل شاردة LC)، وD، lactide لام (الشكل 2). المنتج النهائي هو مسعور 3-الذراع SBC. SBCS مع 4 و 6 الأسلحة، التي تحل محل العقدة الجلسرين مع ثريتول وdipentaerythritol، على التوالي، وقد ذكرت سابقا 18. لSBC أكثر ماء، تم استبدال عقدة مركزية مع أكسيد oligoethylene (انظر الملاحظات البروتوكول). ومع ذلك، لتحل محل الجلسرين مع نتائج أكسيد oligoethylene في كتلة كوبوليمر الخطية (27). استخدمنا التوليف معدلة من يونس وآخرون. 29. نسخة معدلة يسمح لاستخدام معدلة ε-كاليفورنياprolactone مع مجموعة الهالوجين في موقعين مختلفين، ألفا وجاما إلى الكربونيل 6. مرة واحدة يتم تشكيل SBC، كتلة ε-caprolactone تعديل يعاني التشريد للذرة الهالوجين مع مجموعة أزيد. وأكد تشريد مجموعة الهالوجين من قبل مجموعة أزيد من قبل ظهور سم 2100 - 1 الفرقة باستخدام الموهن الانعكاس الكلي (ATR) FT-IR (الشكل 3). يتم استخدام مجموعة أزيد في وقت لاحق إرفاق تساهميا شاردة LC (الكوليسترول hexynoate) إلى كوبوليمر كتلة النجم باستخدام آلكاين-أزيدي Huisgen في رد فعل cycloaddition (المعروف أيضا باسم "فوق رد فعل")، والحصول على كتلة النهائية نجمة البوليمرات مع الجانب وحدة الكولسترول قلادة -chain (SBC-تشول). وأكد تشكيل عصابة التريازول قبل اختفاء سم 2100 - 1 الفرقة وظهور القميص لوحظ في 7.30 جزء في المليون في أطياف 1 H NMR (انظر الشكل3). لقد ذكرت مؤخرا حول تأثير وضع مجموعة الهالوجين إما ألفا (α -Br) أو جاما (γ-CL) إلى الكربونيل على functionalized ε -CL 6. وتجدر الإشارة إلى أن استبدال عقدة مركزية في SBC شارك في البوليمرات مع 4-الذراع و 6 الذراع النوى المركزية له تأثير على الخواص الميكانيكية للLCEs التي تم الحصول عليها لأن العقد المركزية بمثابة كل من المبادرين والجوهرية-linkers عبر 18 .

مرة واحدة وقد تم إعداد SBC-تشول وتتميز بشكل كامل، وعملية يشابك باستخدام قالب معدني هي الخطوة الأخيرة لإعداد الرغوة. كان SBC-تشول مختلطة مع hexamethylene الدي إيزوسيانات (HDI، crosslinker)، ε-caprolactone، والقصدير (أكتوبر) 2 (شرطة عمان السلطانية محفز، راجع الخطوة 7.1). تم استبدال مكرر caprolactone (BCP) crosslinker مع HDI، كما ذكرت سابقا. يتم قطع الرغوة المعدنية وشكل لو المطلوبمكتب إدارة السجلات (الشكل 4). وقد ذكرت سابقا مسارين لإعداد الرغوة، وهي المسامية الأولية (LCEF PP) والمسامية الأولية / الثانوية (LCEF P + SP). هنا، يتم تقديم LCEF P + SP، أو "غمس" الأسلوب، حيث انخفض القالب النيكل بسرعة في خليط البوليمر. يتم وضع رغوة المعادن داخل حاوية مصنوعة من رقائق الألومنيوم أو قارورة التلألؤ التي تحتوي على خليط البوليمر، مع كل الدعامات المعدنية مغمورة تماما في الخليط البوليمر. تتم إزالة الخليط البوليمر الزائد بعناية. يتم وضع هذا القالب النيكل المغطى البوليمر بين عشية وضحاها، لا يزال داخل الحاوية، في الفرن على 80 درجة مئوية. ويتم يشابك في وجود حافز لمدة 2 ساعة. بعد عملية يشابك، تتم إزالة القالب النيكل المغطى البوليمر من الحاوية الخاصة به عن طريق تقشير قبالة رقائق الألومنيوم أو كسر إناء زجاجي. وحلق البوليمر الزائد بعناية من النيكل templ المغطاة البوليمرأكل لفضح حواف القالب النيكل ووضعها داخل وعاء مع حل FeCl 3 المشبعة (الشكل 5). بعد بضع ساعات، والنيكل تماما تقريبا إزالتها، ويتم شطف فقط الرغوة LCE مع (DI) منزوع الأيونات الماء للقضاء على حل النيكل / FeCl 3. يتم وضع رغوة LCE مرة أخرى داخل وعاء مع FeCl 3 محلول مشبع وتشطف بالماء DI مرتين أخريين. بعد عملية الحفر كاملة ويتم التخلص القالب النيكل كامل تماما، وتظهر الرغوة LCE شبكة قناة مترابطة مع الدعامات تجويف (الشكل 6). ويبين الشكل 6 الداخلي التشكل LCE رغوة لوحظ باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). الدعامات LCE رغوة جوفاء، والتشكل المنتظم العام يتوقف على قالب النيكل الرغوة.

سابقا، واستخدام BCP يتطلب عدة خطوات لإبقائه في المحاليلنشوئها (أي ذاب)، لأن BCP يبدأ أعد بلورة حالما يبرد المحلول بنسبة بضع درجات (من 140 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة لإضافة القصدير (أكتوبر) 2، وانظر الخطوة 7.1). وهذا يجعل التلاعب في رغوة المعادن والبوليمرات خليط تحدي قبل يشابك. استخدام HDI باعتباره crosslinker سمح لفترة أسرع يشابك من عند استخدام BCP. BCP هو الصلبة في درجة حرارة الغرفة، مع نقطة انصهار 140 درجة مئوية، في حين HDI هو السائل في درجة حرارة الغرفة. اختيار crosslinkers يؤثر تأثيرا مباشرا على الوقت اللازم لإعداد و، كما في حالتنا، وانخفاض درجة الحرارة يشابك 140-80 ° C، والحد أيضا إعداد المطاط الصناعي.

تم اختبار الرغاوي LCE باستخدام ضغط تشوه (فيلم 1). لوحظ انخفاض 70٪ في حجم LCE، مع عدم وجود تأثير على مقاييس عامة. على الافراج عن ضغط من LCE، فإنه يسترد كامل الصورة الأصليHAPE والحجم. ويعتقد أن وجود جزيئات الكريستال السائل في المواد LCE أمر بالغ الأهمية، واللدائن أعدت تحت ال نفسه شرط من دون كتلة -caprolactone ε الكولسترول لم يتعافى شكلها الأصلي وانهارت في أنفسهم.

مرة واحدة تم الحصول عليها الرغاوي LCE، وكانوا على استعداد ليكون المصنف مع ورم الخلايا البدائية العصبية (SH-SY5Y) باستخدام تقنيات زراعة الخلايا القياسية. تم غسلها الرغاوي LCE مرتين في 70٪ من الإيثانول وشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل البذر الخلية. في غضون 2-3 أيام من البذر الخلية، لوحظت خلايا لتعلقها على جدران شبكة LCE 3D. دراسة كاملة مرفق الخلية والتوسع في شبكة LCE، تم إصلاح الخلايا بعد 30 يوما (الشكل 7). تم إصلاح الخلايا، ملطخة دابي، والتقط باستخدام المجهر مبائر. تم العثور على الخلايا تكاثرت، وتعلق، وتوسيعها لتشمل نطاق واسع على شبكة سقالة 3D LCE. بالإضافة إلى ذلككشف أكثر، تحليلا مفصلا استطالة الخلية نواة، والتي في معظم الحالات لم تتأثر الأجزاء المنحنية شبكة سقالة 3D LCE. ويمكن أيضا أن استطالة الخلية أن يرتبط إلى محاذاة الخلية وهو على الأرجح نتيجة smectic-A سمة المرحلة من LCE المقدمة. وهذا لوحظ سابقا في C2C12 الخلايا المزروعة بعد 14 يوما 27. في هذه الدراسة، وتبين لنا أن الخلايا تستمر في التكاثر لأكثر من 14 يوما. هذا لا يقتصر على الخلايا C2C12 وحدها. استخدام الرغاوي LCE يمكن توسيعها إلى أي خط خلية تقريبا. خلايا المتزايد على 3D LCE السقالات تشبه رغوة تستفيد من ارتفاع كفاءة النقل الجماعي مقارنة السقالات 2D. في السقالات 2D، تنمو الخلايا عادة في طبقات، على رأس واحد آخر. خلايا تنمو على الطبقات العليا هي الوحيدة التي لديها حق الوصول الكامل إلى جميع العناصر الغذائية والغاز، والتخلص من النفايات (النقل الجماعي). الخلايا داخل الطبقات السفلى غير قادرة على الوصول إلى المواد الغذائية، وهناك درجة أعلى من خلية دeath في هذه الحالة. ضمن السقالات 3D، وخلايا لديها (مقارنة السقالات 2D) وصول أكثر كفاءة للمغذيات، عوامل النمو، والغازات، والسماح الخلايا وتجديد الأنسجة دراسات على المدى الطويل. إدارة النفايات الخلية (إزالة النفايات) باستخدام 3D LCE مثل رغوة السقالات هي أيضا أكثر فعالية مما كانت عليه في السقالات 2D. المسامية (و / أو الخصائص الهيكلية الأخرى) من LCEs يسمح للنقل الجماعي السريع وزيادة تحميل خلية مقارنة مع أقل مسامية (أو غيرها) المصفوفات، مما يتيح وسائل الإعلام والوصول الخلوي إلى المناطق الوسطى من المصفوفة. هذه المنصة هي LCE الانضباطي لدعم نمو أنواع عديدة من خطوط الخلايا الأولية وخلد، بما في ذلك العضلات، والأعصاب، والجلد، وغيرها، وكذلك نظم ثقافة متعددة الخلايا. أساسا، وهذا هو واحد من فوائد المنصة، لأنها يمكن أن تستخدم لزراعة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا والنظم لفترات طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على النمو طبقات متعددة من الخلايا في بناء أوثق مستحلبآتش البيئات الطبيعية.

شكل 1
الشكل 1: الإجراء العام واصفا إعداد خطوة بخطوة وتوصيف الرغاوي LCE. راجع المقطع بروتوكول للحصول على التفاصيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: يشابك مخطط SBC 3-الذراع. يظهر مخطط يشابك من SBC 3-الذراع باستخدام biscaprolactone أو HDI كما linkers العرضية في ظل وجود قالب معدني النيكل لإعداد LCEs تشبه الرغوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا فيقوإعادة.

الشكل (3)
الشكل (3): مخطط 1،2،3-التريازول تشكيل (ناجح "فوق" رد فعل)، يليه 1 H NMR وFT-IR. وأكد تشريد مجموعة الهالوجين من قبل مجموعة أزيد من قبل ظهور سم 2100 - 1 الفرقة باستخدام الموهن مجموع الانعكاس (ATR) FT-IR. وأكد تشكيل عصابة التريازول قبل اختفاء سم 2100 - 1 الفرقة وظهور القميص، لوحظ في 7.30 جزء في المليون في أطياف 1 H NMR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الصور البصريةمن مختلف الأشكال رغوة قبل يشابك. يتم قطع الرغوة المعدنية وشكل إلى النموذج المرغوب فيه، كما هو مبين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: رغوة النيكل قبل (A) وبعد (B) يشابك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
لاحظ LCE رغوة التشكل باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM): الشكل (6). صور SEM تمثيلية الرغاوي LCE على أساس اتفاقية بازل (أ و ب) ومقرها LBC (ج ود) اللدائن باستخدام ني-860 كقالب المعدنية. تشير الأسهم الدعامات تجويف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: متحد البؤر الميكروسكوب عرض نوى ملطخة دابي من الخلايا SH-SY5Y تعلق على رغوة المطاط الصناعي بعد 30 يوما البذر. كانت مكدسة الصور 2D في Z -direction، والمقطع العرضي الصور في XZ - تم إنشاؤها و-planes YZ. وتظهر الصور أن الخلايا SH-SY5Y (نقاط مضيئة) المرفقة وتوسعت داخل جدران القنوات جوفاء في رغوة المطاط الصناعي. الخلايا توسيع مكانيا إلى طبقات متعددة وتمتد أكثر من 100 ميكرون من خلال بناء (كما هو موضح في XZ - وYZ صورة -plane عبر ثانيةستعقد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1
فيلم 1: صور الفيديو من تشوه واستعادة لفة LCE. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم مؤخرا دراسة اللدائن البلورية السائلة كما السقالات خلية حيويا بسبب استجابتها المحفزات. وقد ثبت أنها تكون منصات مثالية كما السقالات الخلية. ومع ذلك، عامل مهم أن نأخذ في الاعتبار عند إعداد وتصميم سقالة LCE جديدة غير المسامية. إدراج المواد الصلبة القابلة للترشح 23 أو الغازات لا يؤدي دائما في المسامية متجانسة أو المسام مترابطة تماما. استخدام قالب المعادن التي يمكن أن يكون محفورا من لا يقدم فقط فرصة أن يكون لها هيكل داخلي أكثر تنظيما ومنتظم، ولكنه يسمح أيضا لاختيار حجم المسام والكثافة. وهذا هو ذات الصلة مباشرة إلى القالب المعدنية المستخدمة سابقا لإعداد الرغاوي الجرافين 22. كما توفر قوالب معدنية الفرصة لتشكيل الأشكال قبل يشابك LCE، والسماح مجموعة واسعة من الإمكانيات لإنشاء أبنية متطورة ومعقدة مع منتظم المسامية ديوقعت لتشبه البيئات المحلية. أعد LCEs رغوة باستخدام هذه المنهجية تسمح لدراسة تحسين المواد الخلية، والأهم، المكانية التفاعلات خلية خلية، وهو إنجاز لم يكن ممكنا ضمن ثنائي الأبعاد (2D) البيئات. السقالات خلية 2D لا تسمح للخلايا لتتفاعل بحرية مع الخلايا المجاورة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا تنمو عادة في الطبقات الوحيدة (أو مباشرة على رأس واحد آخر)، دون الوصول الكامل إلى مساحة للنمو، والأهم من ذلك، للتفاعل. محددة مكانيا التفاعل أنواع الخلايا، مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، لهما أهمية قصوى عند تصميم بنيات كما يزرع المحتملة أو المنصات التجريبية طويلة المدى تهدف إلى مرآة المنظومات الحية.

لدينا وحدات، والخالية من المذيبات التوليف LCE باستخدام قالب معدني، المعروضة هنا، ويساعد على ضبط التصاق الخلية عن طريق ضبط التوازن مسعور / ماء عن طريق اختيار العقدة المركزية المناسبة ونسبة أحادية 7 27. وهذا أمر مهم لزرع خلايا من أجل تجنب خطوة إضافية تتضمن إضافة طبقة Matrigel، عادة القيام به لتعزيز مرفق الخلية. كمية وحجم العقدة المركزية، فضلا عن crosslinker، تلعب أدوارا حاسمة في LCE النهائي، لأنها تؤثر على الخواص الحرارية والميكانيكية للاللدائن LC. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا يسمح أيضا ضبط معدلات التحلل البيولوجي، كما وردت من قبل، لتتناسب مع تجديد كامل من الأنسجة مثل LCE يحط 6. حاليا، لدينا تجارب الجارية تركز على التحقيق كيف نوع عبر رابط، نواة مركزية، واستبدال D، L -lactide لL -lactide يؤثر على خصائص المرونة، التصاق الخلية، والانتشار، والمواءمة الخلية.

القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي: (1) مجموعة محدودة من المعدن المتاحة تجاريا (النيكل) الرغاوي ومجموعة محدودة في أبعاد تبختر، (2)شرط أن LCE أو أي غيرها من المواد البوليمر / المطاط الصناعي يجب مقاومة كيميائيا شروط حفر المعادن (هنا، وحفر FeCl 3)، و (3) من أن يظهر محاذاة الخلية إلى أن يقتصر على اللدائن الكريستال تعديل السائلة ذكرت هنا (الأصل اللدائن غير LCE-لم تظهر أي محاذاة الخلية ملموسة).

في الختام، وقد تبين أنه سبق أن LCEs SMA يمكن إعداد باستخدام لدينا إجراءات تركيب وحدات. الأنصاف إضافية LC حيويا يمكن إدراجها لاستكشاف خصائصها الميكانيكية والآثار البلورية السائلة الجديدة على تكاثر الخلايا، وبخاصة محاذاة الخلية. ومن المعروف أن الخواص الميكانيكية، ولا سيما قيم معاملات رجوعية مفروضة يونغ، بالغة الأهمية بالنسبة لالتصاق الخلية، والانتشار، والمواءمة الخلية. أظهرت النتائج هنا أن مسامية LCEs SMA يمكن ضبطها من خلال استخدام قالب معدني لتوفير وسيلة فعالة للسيطرة على حجم المسام ولتكييف LCEشكل (مورفولوجيا أي العلوي). غمس القالب ني في خليط بنك التسليف والادخار البوليمر، تليها الحفر القالب ني توفر نهجا من السهل على الأشكال التضاريسية LCE جديدة. وLCEs مثل رغوة الموصوفة هنا توفر الخلايا (هنا، SH-SY5Y، وهذا نموذج الخلية القياسية لدراسة وظيفة الخلايا العصبية) مع بيئة 3D أكثر واقعية لتحقيق النمو والتفاعل. السماح أنواع الخلايا متعددة لتنمو في طبقات متعددة مشتتين في أنحاء المطاط الصناعي تحاكي بيئات العصبية الذاتية وتوفر إمكانية مثيرة للاهتمام من تجارب زراعة الأنسجة 3D أكثر تطورا. استخدام LCEs الانضباطي وديناميكية لتقليد أبنية الأم يمهد الطريق لنماذج خلية الجيل المقبل لدراسات الخلايا الطولية وذات الصلة سريريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر جامعة كينت ستيت (تعاوني منحة بحثية ودعم مبادرة لطب التجديدي في ولاية كينت - ReMedIKS) للدعم المالي من هذا المشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 122، الكريستال السائل اللدائن، 3D المسامية السقالات، السقالات الخليوي، محاذاة الخلية، اتجاهية الخليوي، حيويا
توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévôt, M. E., Ustunel,… More

Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter