Summary
Este estudio presenta una metodología para preparar 3D,, andamios celulares similares a espuma biodegradables a base de la cadena lateral elastómeros de cristal líquido biocompatibles (LCE). experimentos de microscopía confocal muestran que las LCE similares a espuma permiten para la fijación celular, la proliferación y la alineación espontánea de mioblastos C2C12s.
Abstract
A continuación, presentamos una preparación paso a paso de un 3D, andamio celular biodegradable, similar a la espuma. Estos andamios se prepararon mediante reticulación bloque en estrella co-polímeros que ofrecen unidades de colesterol como grupos colgantes de la cadena lateral, lo que resulta en esméctica-A (SMA) elastómeros de cristal líquido (LCE). andamios de tipo espuma, preparados utilizando plantillas de metal, disponen de microcanales interconectados, lo que permite adaptarse como andamios de cultivo de células 3D. Las propiedades combinadas de la estructura regular de la espuma metálica y del resultado elastómero en un andamio celular 3D que promueve la proliferación celular no sólo mayor en comparación con las películas convencionales porosos con plantilla, sino también una mejor gestión de transporte de masa (es decir, nutrientes, gases, residuos , etc.). La naturaleza de la plantilla de metal permite la fácil manipulación de formas de espuma (es decir, rollos o películas) y para la preparación de los andamios de diferentes tamaños de poro para diferentes estudios de células mientras que preserva el interconexionested naturaleza porosa de la plantilla. El proceso de grabado no afecta a la química de los elastómeros, preservando su naturaleza biocompatible y biodegradable. Se demuestra que estos LCE esmécticas, cuando se cultiva durante períodos de tiempo extensos, permiten el estudio de construcciones de tejido clínicamente relevantes y complejos mientras que la promoción del crecimiento y proliferación de las células.
Introduction
Hay varios ejemplos de materiales sintéticos biológicos y biocompatibles diseñado para su aplicación en estudios de células y para la regeneración de tejidos con el objetivo de fijación y proliferación 1, 2, 3, 4, 5 de la célula. Ha habido unos pocos ejemplos de materiales biocompatibles, conocidos como elastómeros de cristal líquido (LCE), que podrían responder a los estímulos externos con anisotrópico molecular ordenar 6, 7. LCE son materiales estímulos-respuesta que combinan las propiedades mecánicas y elásticas de los elastómeros con la funcionalidad óptica y ordenamiento molecular de los cristales líquidos 8, 9. LCE pueden experimentar cambios de forma, la deformación mecánica, comportamiento elástico, y propiedades ópticas en respuesta a stim externosuli (es decir., calor, estrés, luz, etc.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Estudios anteriores han demostrado que los cristales líquidos (CL) pueden detectar el crecimiento y la orientación de células 4, 17. Es posible entonces asumir que las LCE pueden ser adecuados para aplicaciones biológica y médicamente relevantes, incluyendo andamiaje celular y alineación. Hemos informado anteriormente de la preparación de esmécticas películas biocompatibles, biodegradables, moldeados a presión, y LCE delgadas que ofrece un "tipo de queso suizo" morfología porosa 6, 18. También preparamos LCE biocompatibles nemáticos con morfología globular como andamios para el crecimiento celular 19 <sup> 20. Nuestro trabajo se ha dirigido a la sintonía de las propiedades mecánicas de los materiales para que coincida con las del tejido de interés 21. Además, estos estudios se centran en la comprensión de las interacciones célula-elastómero, así como la respuesta celular cuando los elastómeros están sujetos a los estímulos externos.
Los principales retos fueron en parte para adaptar la porosidad de las LCE para permitir la unión celular y permeación a través de la matriz de elastómero y para un mejor transporte de masa. La porosidad de estas películas delgadas 6 permitido para la permeación celular a través de la mayor parte de la matriz, pero no todos los poros eran totalmente interconectada o tenía un tamaño más regular (homogénea) poro. a continuación, se informó sobre biocompatibles elastómeros LCE nemáticos con morfologías globulares. Estos elastómeros nemáticos permitidos para la fijación y proliferación de células, pero el tamaño de poro variaron solamente a partir de 10-30 micras, lo que impidió o limitado el uso de estoselastómeros con una amplia variedad de líneas de células de 19, 20.
El trabajo previo de Kung et al. relativa a la formación de espumas de grafeno utilizando una plantilla de metal "sacrificial" mostró que la espuma de grafeno obtenido tenía una morfología porosa muy regular dictada por la plantilla de metal elegido 22. Esta metodología ofrece un control total de la porosidad y tamaño de poro. Al mismo tiempo, la maleabilidad y flexibilidad de la plantilla de metal permiten la formación de una plantilla diferente da forma antes de la preparación de espuma. Otras técnicas, tales como la lixiviación de la materia 23, de plantillas gas 24, o fibras electro-hilado 25, 26 también ofrecen el potencial para la preparación de materiales porosos, pero son más tiempo y, en algunos casos, el tamaño de poro está limitado a sólo unos pocos micrómetros. Espuma-como las LCE 3D prepararon usando plantillas de metal permiten una carga de la célula superior; una tasa de proliferación mejorada; co-cultivo; y, por último pero no menos importante, una mejor gestión de transporte de masa (es decir, los nutrientes, gases y desechos) para asegurar el desarrollo del tejido completo 27. LCE 3D similares a espuma también parecen mejorar la alineación de celdas; esto es más probable en relación con los colgantes LC detección de crecimiento celular y la orientación de la celda. La presencia de restos de LC en el LCE parece mejorar la alineación de células con respecto a la localización de células dentro del andamio LCE. Las células se alinean dentro de los puntales de la LCE, mientras que no se observa ninguna orientación clara donde los puntales se unen (uniones) 27.
En general, nuestra plataforma de andamio celular LCE como un medio de soporte celular ofrece oportunidades para sintonizar la morfología de elastómero y las propiedades elásticas y dirigir específicamente la alineación de los tipos de células (individuales) para crear un pedido, arreglos espaciales océlulas F similares a los sistemas vivos. Además de proporcionar un andamio capaz de sostener y dirigir el crecimiento celular a largo plazo y la proliferación, las LCE también permiten para los experimentos dinámicos, donde la orientación de células y las interacciones pueden ser modificados sobre la marcha.
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Protocol
NOTA: Los siguientes pasos para la preparación de espuma como LCE 3D utilizando el copolímero de bloques en estrella 3-brazo se muestran en la Figura 1. Para la caracterización por resonancia magnética nuclear (RMN), los espectros se registran en cloroformo deuterado (CDCl3) a temperatura ambiente en un espectrómetro Bruker DMX instrumento 400-MHz e internamente referencia picos residuales a 7,26. Transformada de Fourier de infrarrojos espectros (FT-IR) se registran usando un espectrómetro 33 FT-IR de Bruker Vector usando el modo de reflectancia total atenuada. Para cada paso de la siguiente protocolo, es importante usar ropa de protección personal adecuado (PPE).
1. Síntesis de α-cloro-ε-caprolactona (monómero) (según el procedimiento en Jérôme et al. 28)
- Antes de iniciar la síntesis, purificar 27 g de ácido 3-cloroperbenzoico como sigue:
- En 800 ml de agua destilada, añadir 1,28 g de sodiofosfato monobásico monohidrato y 8,24 g de fosfato dibásico de sodio heptahidrato. Ajustar el pH a 7,4 (usando hidróxido sódico o ácido clorhídrico) y reserva 30 ml de esta solución; esta es la solución tampón.
- Usando un embudo de separación, se disuelve ácido 3-cloroperbenzoico en 35 ml de éter dietílico. Se lava la solución orgánica con 10 ml de solución tampón (preparado en la etapa 1.1.1.). Repita el lavado tres veces.
- Añadir 3 g de sulfato de sodio directamente a la solución orgánica; este agente de secado absorbe el agua de la solución orgánica.
- Se filtra la solución para eliminar el agente de secado. Se concentra el filtrado a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 850 mbar y 40 ° C.
- Solubilizar 18,5 g de ácido 3-cloroperbenzoico purificada en 150 ml de diclorometano seco mediante agitación en un baño de ultrasonidos; este proceso típicamente tarda 20 min. Coloque la solución dentro de un embudo de separación.
- Dentro de una de dos bocas, de fondo redondo,disolver 13,1 g de 2-clorociclohexanona en 15 ml de diclorometano seco usando un agitador magnético en atmósfera de gas nitrógeno. Mantener la agitación.
- Montar el embudo separador que contenía solución de ácido 3-cloroperbenzoico (del paso 1.2) al matraz de dos bocas en el paso 1.3. Enjuague el sistema con gas nitrógeno. Ajustar la apertura del embudo de separación de modo que la solución de ácido cloroperbenzoico cae gota a gota en la solución de 2-clorociclohexanona (1 gota cada dos segundos) y continuar agitando la mezcla bajo gas nitrógeno durante 96 h.
- Se enfría la mezcla de reacción a -20 ° C durante 1 h para precipitar el subproducto ácido m-clorobenzoico (m -CBA).
- Filtrar el ácido clorobenzoico m (m -CBA) y lavar la solución remanente con soluciones saturadas de tiosulfato de sodio, bicarbonato de sodio, y cloruro de sodio.
- Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio a 850 mbar y 40 ° C. Se purifica el amarillo jabón l pálido, viscosoIdentificación por destilación a presión reducida a 2,3 Torr y 96 ° C.
- Monitorear el éxito de la síntesis, usando los siguientes 1 picos H RMN. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H 2 O), 4.18 a 4.5 (m, 1H , C H 2 O), y 2,06-1,58 (m, 6H, -C H 2 -) 6, 27.
2. Síntesis de α-Three-brazo de la estrella de Copolímero de Bloque (SBC-αCl) por Ring Copolimerización de apertura (Sharma et al. 6 y Amsden et al. 29)
- Antes de la síntesis, silanizar una ampolla de 20 ml llenándolo con un (v / v) de solución al 2% de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilano en tolueno y de agitar durante aproximadamente 24 h. Enjuague con alcohol isopropílico y se seca colocándolo en un horno a 140 ° C durante 30 min.
- Añadir 30,64 g de agua destilada ε-caprolactona, 0,5 g de α-cloro-ε-caprolactona, y 0,25 ml de glicerol a la ampolla. Mezclar utilizando un vortex durante 1 min.
- Añadir 4,90 g de D, L-lactida a la ampolla y purgar con nitrógeno. Coloque la ampolla en un horno a 120 ° C para fundir la D, L-lactida; Este proceso generalmente dura aproximadamente 2 h. Mezclar de nuevo usando un vórtice para asegurarse de que todos los contenidos se mezclan bien y añadir 66 l de estaño (II) 2-etilhexanoato (Sn (Oct) 2) a la ampolla.
NOTA: D, L-lactida se enfriará durante este proceso y tendrá que ser re-calentado en el horno para fundir. - Mezclar vigorosamente por última vez usando el vórtice y enjuague con nitrógeno.
- Cierre la ampolla con un tapón de goma. Coloque una aguja conectada a un tubo de vacío (el vacío de la casa es generalmente suficiente) a través del tapón de goma. A su vez en el vacío y, usando una llama, fundir el cuello largo del cristal, torciendo lentamente hasta que la glass colapsa sobre sí misma. Tenga cuidado de no fundir el tapón de goma. Una vez que la ampolla es de llama sellado, colocarlo en un baño de arena, un horno, o elemento de calentamiento adecuado a 140 ° C durante 48 h.
- Sacar la ampolla y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
- Romper la ampolla en la marca de sellado y se disuelve el líquido altamente viscoso mediante la adición de 10 ml de diclorometano. Transferir la solución a un embudo de decantación.
- Preparar un matraz que contenía 100 ml de metanol frío (enfriado utilizando un baño de hielo seco / acetona a una temperatura alrededor de -78 ° C). Fijar el embudo de separación (etapa 2.7) en la parte superior del matraz. Ajustar la apertura del embudo de separación de manera que aproximadamente dos gotas caen cada otro segundo (gota a gota).
- Recoger el precipitado blanco por filtración (usando un filtro de papel) y se seca en una estufa de vacío entre 50 y 60 ° C.
- Monitorear el éxito de la síntesis, usando los siguientes 1 H RMN y FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, Δ [ppm]): 5.29 a 5.3 (m, COC H C H 3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4.24 a 4.12 (m, C H 2 O), 4.11 a 4.3 (t, J = 4,6 Hz, C H 2 O), 3,80-3,68 (m, C H C H 2), 3,09-2,64 (ancho, S, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, H α-), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-), y 1,77-1,25 (m, C H 2, C H 3); FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, y 735 (m) 6, 27.
Nota: Para preparar un LCE 3D más hidrófilo, preparar un copolímero de bloque lineal (LBC) en lugar de un SBC, siguiendo el procedimiento de apertura del anillo de copolimerización (ROP) descrito anteriormente.- Añadir 0,3 g de polietilenglicol (PEG), 3,15 g ε-caprolactona, 1,0 g de α-cloro-ε-caprolactona, y 5,0 g de D, L-lactida a la mezcla vial silanizado.
3. Modificación sintético de α-Cl de tres brazos SBC a αN 3 -Tres Arm SBC (SBC-αN 3) (Según Sharma et al. 6)
- En un matraz de fondo redondo y en atmósfera de nitrógeno, se disuelven 5 g de SBC-αCl en 30 ml de seco N, N'-dimetilformamida.
- Añadir 0,22 g de azida de sodio y se deja reaccionar durante la noche a temperatura ambiente.
Precaución: La azida sódica es tóxica; usar ropa de protección personal (EPP) apropiado. - Eliminar la N, N'-dimetilformamida bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio a 11 mbar y 40 ° C. Disolver la mezcla en 30 ml de tolueno. Centrifugar la solución tres veces a 2.800 xg durante 15 min para eliminar la sal formada. Se evapora el tolueno a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 77 mbar y 40 ° C.
- Monitorear el éxito de la sustitución de azida usando 1 H RMN y FT-IR picos.
NOTA:
4. Síntesis de colesterilo 5-Hexynoate (LC Resto) (Según Sharma et al. 6 y Donaldson et al. 30)
- En un matraz de fondo redondo, la mezcla 3 g de ácido 5-hexinoico y 130 ml de diclorometano. Enfriar a 0 ° C usando un baño de hielo.
- En otro matraz de fondo redondo, mezclar 8,28 g de N, N'-diciclohexilcarbodiimida N', 10,3 g de colesterol y 0,2 g de 4-dimetilaminopiridina.
- Transferir la solución de ácido gota a gota 5-hexinoico al matraz que contiene la mezcla de colesterol y mantener la mezcla final a 0 ° C durante 1 h.
- Dejar que la mezcla se caliente a la temperatura ambiente durante la noche. Eliminar la diciclohexilurea precipitado resultante por filtración usando un filtro de papel de grado 415 y descartarlo.
- Se concentra el filtrado a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 850 mbar y 40 ° C. Disolver el residuo recogido en 150 ml de hexano.
- Se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 335 mbar y 40 ° C. Añadir 350 ml de etanol al residuo oleoso para recoger el producto final. Lavar el sólido formado con etanol y se seca el producto sólido bajo vacío a 50 ° C de color blanquecino.
- Monitorear la síntesis, usando los siguientes 1 H RMN y FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C H = C), 4,70-4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H 2 CO), 2,34 (m, 2H, C H 2 -C H =), 2,31 (m, 2H, C H 2 C H 2 -COO), 2,28 (s, 1H, MARIDOC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H 2), 2.7 hasta 1.6 (m, 2H, C H 2, C H), 0,94 (s, 3H, C H 3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H 3 C H), y 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H 3 -C H), 0,67 (s, 3H, C H 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2,830-2,990 (amplio y pico fuerte), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s), y 667 (s).
5. modificación sintética de α-N 3 -Tres Arm SBC a alfa-colesterilo de tres brazos SBC (SBC-αCLC) mediante una reacción de azida-alquino Huisgen Ciclo-adición ( "Click" Reaction) para obtener SBC-Chol (Según Sharma et al. 6)
- En un matraz de fondo redondo, se disuelven 1 equivalente molar de SBC-αN 3 (1,5 g) en 100 ml de tetrahidrofurano recién destilado (THF). Añadir 1,2 equivalenciadet molarest de colesterilo 5-hexynoate (1,94 g), 0,1 equivalente molar de cobre (I) yoduro (0.06 g), y 0,1 equivalente molar de trietilamina (0,03 g). Se agita la mezcla durante la noche a 35 ° C en atmósfera de nitrógeno.
- Se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio a 357 mbar y 40 ° C.
- Disolver la mezcla residual en 80 ml de diclorometano y se centrifuga durante 5 min a 2800 xg a temperatura ambiente para eliminar los materiales sin reaccionar y los productos secundarios.
- Monitorear la síntesis, usando los siguientes 1 H RMN y FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH colesterol), 5.10 a 5.6 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, O-CH colesterol), 4.24 a 4.19 (m, CH 2 O), 4.18 a 4.13 (t, J = 5,0 Hz, CH 2 O), 4.11 a 4.5 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH 2), 2.31 a 2.25 (m, COCH 2), 2.7 a 1.2 (m, CH 2 CH3), 01.05 a 01.03 (s, CH 2, CH 3), 0,96 a 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH 2, CH 3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH 3), y 0,71 a 0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s), y 668 (s).
6. Síntesis de 2,2-Bis (1-caprolactona-4-il) propano (Crosslinker, BCP) (De acuerdo con Gao et al. 27 y Albertsson et al. 31)
- En un matraz de fondo redondo, preparar una solución que contiene 10,8 g de 2-bis (4-hidroxi-ciclohexil) propano y 52 ml de ácido acético.
- Preparar una solución que contiene 11 g de trióxido de cromo en 50 ml de ácido acético y 8 ml de agua destilada. Añadir esta solución gota a gota a la solución preparada en el paso 6.1, manteniendo la temperatura de la mezcla entre 17 y 20 ° C (por ejemplo, en unabaño de agua); este proceso gota a gota tarda 2 h. Una vez que el proceso se ha completado, permitir que la solución en agitación durante aproximadamente 30 min.
- Añadir 50 ml de 2-propanol. Se agita la solución durante la noche a temperatura ambiente.
- Se concentra la solución de color púrpura oscuro bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio a 137 mbar y 40 ° C. Añadir 300 ml de agua destilada para precipitar; el precipitado debe ser ligero de color púrpura.
- Filtrado el producto bruto usando un filtro de papel de grado 415. Se lava el material sólido con ~ 250 ml de agua destilada o hasta que el sólido se convierte en blanco.
- Se disuelve el material sólido en 15 ml de benceno a 40 ° C y se deja recristalizar a 25 ° C.
- Añadir 8,34 g de dicetona seco se disolvió en diclorometano seco y una solución que contiene 6,0 g de ácido 3-cloroperbenzoico en 75 ml de diclorometano al matraz.
- Se calienta a reflujo la solución a 40 ° C durante 24 h.
- Se enfría la mezcla de reacción a -20 ° C durante 10 min para precipitar el m
- Retire m ácido clorobenzoico mediante filtración (usando un filtro de papel) y se concentra la solución a presión reducida.
- Se lava el producto en bruto de viscosa con 200 ml de 2-heptanona y secar el precipitado a vacío a 50 ° C durante la noche.
- Monitorear la síntesis, usando los siguientes 1 H RMN y FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H 2 OC = O), 04/21 a 04/15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H 2 C H 2 COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH3) 2), y 0,84 (s, 6H, C H 3 C-). 7. Creación de Porous 3D Elastómero Andamios Utilizando cualquiera de diisocianato de hexametileno (HDI) o 2,2-Bis (1-caprolactona-4-il) propano (BCP) 27 como reticulantes (Según Gao et al. 27)
- Preparar la mezcla de elastómero de tres brazos usando 0,75 g de SBC-αCLC mediante la adición de 0,25 ml de HDI (o 0,45 mL de BCP) y 0,24 ml de monómero de ε-caprolactona destilada. Añadir 60 l de Sn (Oct) 2. Si se utiliza BCP en lugar de HDI, mezclar SBC-αCLC y BCP utilizando un vórtice y colocarlos en un horno a 140 ° C hasta que la BCP se funde y se disuelve completamente (este paso puede tardar hasta 2 h). Una vez que el BCP se ha disuelto, se saca del horno y, el Sn (Oct) 2, y vórtice.
- Preparar una plantilla de espuma de níquel "sacrificial" cortando un trozo cm de metal 1 x 4. Rodar desde uno de los extremos cortos de modo que el rollo final es aproximadamente una pieza de metal 1 x 1 cm (véase la figura 4). <li> Ponga la espuma de níquel en un paquete de la hoja vial de vidrio o aluminio y verter la mezcla preparada en la etapa 7.1 para cubrir totalmente la espuma de 2 min. Eliminar el exceso de mezcla con una pipeta Pasteur. Dejarlo en una noche horno a 80 ° C.
- Desprenda la lámina de aluminio o romper el vidrio. Utilizando una hoja de afeitar, afeitar el elastómero alrededor de la espuma metálica para exponer el metal de níquel.
- Preparar M de hierro (III) cloruro de 1 (FeCl 3) solución en 100 ml de agua. Coloque la espuma en un matraz y añadir 70 ml de solución de FeCl3. Agitar durante tres días a temperatura ambiente y cambiar la solución de FeCl3 todos los días. Antes de cada cambio, se agita la espuma con el agua ionizada durante 0,5 h.
NOTA: El proceso de grabado se completa generalmente después de tres días. Para asegurar que el proceso de grabado se ha completado, realizar pruebas de compresión táctiles hasta las espumas sienten suaves. resistencia de la espuma a ensayos de compresión táctiles indica la presencia de una plantilla de metal residual. - Enjuague el ELASTespuma Omer con etanol y colocar en un horno de vacío durante la noche a 40 ° C.
- Caracterizar los materiales usando microscopía electrónica de barrido (SEM), calorimetría diferencial de barrido (DSC), pruebas de compresión mecánica, y el análisis termogravimétrico (TGA) 27.
NOTA: Para la preparación de un LCE 3D más hidrófilo, reemplace la SBC con LBC (asegurándose de que la LBC también contiene un resto LC) siguiendo los pasos descritos en el paso 7.5.
8. La siembra de elastómero Andamios con células SH-SY5Y neuroblastoma y de cultivo utilizando técnicas estériles
- Esterilizar el elastómero por lavado dos veces con 1 ml de etanol al 70%. Realizar la irradiación UV durante 10 min y se lava con 1 ml de etanol al 70%. Enjuague dos veces con 1 ml de agua estéril y 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Coloque los elastómeros en placas de cultivo de 24 pocillos.
- Preparar medio de crecimiento celular para SH-SY5Y que contiene 90% Dulbecco Modificado suplem medio Eagle (DMEM)entados con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
- Después de contar las células usando un hematocitómetro, la obtención de 1.5 x 10 5 células SH-SY5Y en suspensión en 100 l de medio de crecimiento (solución de semillas). Añadir la solución en la parte superior de los elastómeros, asegurándose para formar una gota.
- Incubar los elastómeros sembraron a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 h para promover la adhesión celular. Añadir 0,5 ml de medio de crecimiento. Incubar de nuevo a 37 ° C con 5% de CO2.
- Cambiar el medio cada dos días después de lavado con 1 ml de PBS.
9. Imaging microscópico de Elastómero Construct
- Fijar las células cultivadas en elastómeros con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 15 min. Enjuague con 3 ml de PBS tres veces durante 5 min cada uno y colocar el elastómero con las células fijadas en una placa de cultivo con un cubreobjetos adjunto.
Precaución: PFA es tóxico. Use ropa de protección personal (EPP) apropiado. - Staen las muestras fijadas con 0,1% de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en 500 l de PBS durante 10 min y enjuague dos veces con 1 ml de PBS durante 5 min.
- Inmediatamente los elastómeros imagen utilizando microscopía confocal de fluorescencia con DAPI, la adquisición de pilas de imágenes que abarcan la muestra.
NOTA: En este caso, las pilas de imágenes fueron adquiridas utilizando un objetivo de 20x y un objetivo de 60X. - Analizar las pilas de imágenes confocal óptica usando ImageJ 32.
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Representative Results
Este informe muestra el método de preparación de un LCE 3D poroso como un andamio para el cultivo celular utilizando una plantilla de metal de níquel. El LCE 3D obtenida demuestra una compleja red interconectada de canal que permite la infiltración de células fácil, así como el transporte de masa más adecuado 27. Se encontró que las células son capaces de penetrar completamente la red de canales interconectados y también son capaces de alinear dentro del LCE. Aquí, una espuma de metal de níquel (99% de Ni, densidad de 860 g / cm 2) fue seleccionada después de un enfoque similar a la preparación de espuma de grafeno previamente reportado por Kung et al. 22. La espuma metálica se coló polímero, con todos los puntales de metal completamente cubiertos. La selección del tamaño de la espuma metálica y la densidad es importante, ya que imparte la morfología final del LCE y puede ayudar en la imitación de las condiciones del tejido de interés.
D, lactida L- (Figura 2). El producto final es un hidrófobo SBC 3-brazo. SBC con 4 y 6 brazos, hechos mediante la sustitución del nodo de glicerol con pentaeritritol y dipentaeritritol, respectivamente, se han descrito previamente 18. Para un SBC más hidrófilo, el nodo central se reemplazó con óxido de oligoetilenglicol (ver las notas de protocolo). Sin embargo, la sustitución de glicerol con resultados de óxido de oligoetileno en un copolímero de bloques lineal 27. Se utilizó una síntesis modificada de Younes et al. 29. La versión modificada permite el uso de un ε-ca modificadoprolactone con un grupo halógeno en dos posiciones diferentes, alfa y gamma al carbonilo 6. Una vez formada la SBC, el bloque de ε-caprolactona modificada sufre un desplazamiento del átomo de halógeno con un grupo azida. El desplazamiento del grupo halógeno por el grupo azida se confirma por la aparición de la 2100-cm - 1 banda utilizando reflectancia total atenuada (ATR) FT-IR (Figura 3). El grupo azida se utiliza más tarde para unir covalentemente el resto de LC (colesterilo hexynoate) al copolímero de bloques en estrella usando alquino-azida reacción de cicloadición de Huisgen (también conocida como una "reacción de Click"), obteniendo el copolímero de bloques en estrella final con un lado unidad colgante colesterol -cadenas (SBC-Chol). La formación del anillo de triazol se confirma mediante la desaparición de la 2100-cm - 1 banda y la aparición de un singlete observado en 7,30 ppm en los espectros de RMN de 1H (véase la figura3). Recientemente hemos informado sobre el efecto de la colocación de un grupo halógeno, ya sea alfa (α -Br) o gamma (γ-Cl) al carbonilo en el funcionalizado ε -CL 6. Cabe señalar que la sustitución del nodo central en los co-polímeros de SBC con 4 brazos y de 6 brazos núcleos centrales tiene un efecto sobre las propiedades mecánicas de los LCE obtenidos porque los nodos centrales sirven como ambos iniciadores y intrínsecos reticuladores 18 .
Una vez que el SBC-Chol se ha preparado y caracterizado completamente, el proceso de reticulación mediante una plantilla de metal es el último paso para la preparación de espuma. El SBC-Chol se mezcló con diisocianato de hexametileno (HDI, agente de reticulación), ε-caprolactona, y Sn (oct) 2 (ROP catalizador, véase el paso 7.1). El bis-caprolactona (BCP) reticulante se reemplazó con HDI, como se informó anteriormente. La espuma metálica se corta y se forma a la f deseadoORM (Figura 4). Dos caminos para la preparación de la espuma, es decir, la porosidad primaria (LCEF PP) y la porosidad primaria / secundaria (LCEF P + SP), se ha informado anteriormente. Aquí, el LCEF P + SP, o "inmersión", método, se presentan, en el que el modelo de níquel se sumerge rápidamente en la mezcla de polímero. La espuma metálica se coloca dentro de un recipiente hecho de papel de aluminio o un vial de centelleo que contiene la mezcla de polímero, con todos los puntales de metal totalmente sumergidos en la mezcla de polímeros. La mezcla de polímero en exceso se retira cuidadosamente. Esta plantilla de níquel polímero cubierto se coloca durante la noche, todavía dentro del recipiente, en un horno a 80 ° C. La reticulación se lleva a cabo en presencia del catalizador durante aproximadamente 2 h. Después de que el proceso de reticulación, la plantilla de níquel polímero cubierta se retira de su envase desprendiendo la lámina de aluminio o romper el recipiente de vidrio. El exceso de polímero se afeitó cuidadosamente del templ níquel polímero cubiertocomió para exponer los bordes de la plantilla de níquel y colocado dentro de un recipiente con una solución de FeCl 3 saturado (Figura 5). Después de unas horas, el níquel es casi completamente eliminado, y sólo la espuma LCE se enjuaga con agua desionizada (DI) para eliminar la solución de níquel / FeCl3. La espuma LCE se coloca de nuevo dentro de un recipiente con una solución saturada de FeCl3 y se enjuagó con agua DI dos veces más. Después de que el proceso de grabado es completa y todo el modelo de níquel está completamente eliminada, la espuma LCE muestra una red de canales interconectados con puntales ahuecados (Figura 6). La Figura 6 muestra la morfología de espuma LCE interna observada mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Los puntales de la espuma LCE son huecos, y la morfología normal general es contingente sobre la plantilla de espuma de níquel.
Anteriormente, el uso de BCP requiere varios pasos para mantenerlo en Solución (es decir, fundido), porque BCP empieza a recristalizar tan pronto como la solución se enfría en unos pocos grados (de 140 ° C a temperatura ambiente para añadir el Sn (Oct) 2; véase el paso 7.1). Esto hace que la manipulación de la mezcla de espuma de metal y polímero desafiando antes de la reticulación. El uso de HDI como reticulante permitió un tiempo de reticulación más rápida que cuando se utiliza BCP. BCP es un sólido a temperatura ambiente, con un punto de 140 ° C de fusión, mientras que HDI es un líquido a temperatura ambiente. La elección de agentes de reticulación afecta directamente al tiempo de preparación y, como en nuestro caso, la reducción de la temperatura de reticulación 140-80 ° C, reduciendo también la preparación de elastómero.
Las espumas LCE se ensayaron usando compresión-deformación (Película 1). Se observa una reducción del 70% en el tamaño LCE, sin efecto sobre las dimensiones generales. Tras la liberación de la compresión de la LCE, que se recupere plenamente su s originaleshape y tamaño. Se cree que la presencia de los restos de cristal líquido en el material LCE es crítica, como elastómeros preparados en las mismas condiciones sin el bloque de caprolactona ε colesterol no recuperar su forma original y se derrumbó en sí mismos.
Una vez que se obtuvieron espumas LCE, que estaban listos para ser sembrado con neuroblastomas (SH-SY5Y) usando técnicas estándar de cultivo celular. espumas LCE se lavaron dos veces en etanol al 70% y se enjuagaron tres veces con PBS antes de la siembra de células. Dentro de 2-3 días de la siembra de células, se observaron las células se unieran a las paredes de la red LCE 3D. Para estudiar completamente la unión celular y la expansión dentro de la red LCE, las células se fijaron después de 30 días (Figura 7). Las células se fijaron, se tiñeron con DAPI, y la imagen mediante microscopía confocal. Se encontró que las células que han proliferado, que se adjunta, y ampliado para cubrir ampliamente la red andamio LCE 3D. Promovermás, el análisis detallado reveló alargamiento núcleos de células, que en la mayoría de los casos no se vio afectada por las secciones curvadas de la red andamio LCE 3D. elongación celular también se puede correlacionar a la alineación celular y es más probable el resultado de la esméctica-A característica de fase de la LCE presentada. Esto se observó previamente en C2C12 células cultivadas después de 14 días 27. En este estudio, mostramos que las células continúan proliferando durante más de 14 días; esto no está restringida a células C2C12 solo. El uso de las espumas LCE se puede ampliar a casi cualquier línea celular. Las células que crecen en los andamios de espuma como LCE 3D se benefician de una mayor eficiencia de transporte de masa en comparación con los andamios 2D. En andamios 2D, las células usualmente crecen en capas, una encima de la otra. Las células que crecen en las capas superiores son los únicos que tienen acceso total a todos los nutrientes, gas, y la eliminación de desechos (transporte de masa). Las células dentro de las capas inferiores no pueden acceder a los nutrientes, y hay un mayor grado de célula death en este caso. Dentro de andamios 3D, las células tienen una forma más eficiente (en comparación con los andamios 2D) acceso a los nutrientes, factores de crecimiento y gases, permitiendo estudios de células y la regeneración tisular a largo plazo. la gestión de residuos de la célula (eliminación de residuos) utilizando los andamios de espuma-como LCE 3D también es más eficaz que en los andamios 2D. La porosidad (y / o otras propiedades estructurales) de las LCE permite el transporte de masa rápida y aumento de la carga celular en comparación con matrices menos porosas (u otros), medios de comunicación que permiten y acceso celular a las regiones centrales de la matriz. Esta plataforma LCE es sintonizable para apoyar el crecimiento de muchos tipos de líneas celulares primarias y inmortalizadas, incluyendo el músculo, nervio, y la piel, entre otros, así como sistemas de cultivo multi-celulares. En esencia, este es uno de los beneficios de la plataforma, ya que puede ser usada para cultivar diferentes tipos de células y sistemas durante periodos prolongados. Además, la capacidad de crecer múltiples capas de células en el constructo más estrechamente emulates entornos naturales.
Figura 1: Procedimiento general que describe la preparación paso a paso y la caracterización de las espumas LCE. Vea la sección de protocolo para obtener más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La reticulación esquema de SBC 3-brazo. Se muestra el esquema de reticulación de la SBC 3-brazo utilizando biscaprolactone o HDI como agentes de reticulación en presencia de una plantilla de metal de níquel para la preparación de las LCE espuma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
Figura 3: Esquema de 1,2,3-triazol formación (exitoso "clic" de reacción) seguido de 1 H RMN y FT-IR. El desplazamiento del grupo halógeno por el grupo azida se confirma por la aparición de la 2100-cm - 1 banda utilizando reflectancia total atenuada (ATR) FT-IR. La formación del anillo de triazol se confirma mediante la desaparición de la 2100-cm - 1 banda y la aparición de un singlete, observado en 7,30 ppm en los espectros de RMN de 1H. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Las imágenes ópticasde diversas formas de espuma antes de la reticulación. La espuma metálica se corta y se forma a la forma deseable, como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: espuma de níquel antes y después de la reticulación (A) (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: morfología de espuma LCE observó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Imágenes representativas de SEM de espumas LCE sobre a base de SBC (A y B) y por motivos de LBC (c d) usando Ni-860 como el molde de metal. Las flechas indican los puntales ahuecados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Confocal micrografías que muestran núcleos teñidos-DAPI de células SH-SY5Y unidas a la espuma de elastómero 30 días después de la siembra. Imágenes 2D se apilan en la dirección x z, y las imágenes de la sección transversal en la xz - y -planes yz fueron creados. Las imágenes muestran que las células SH-SY5Y (puntos brillantes) adjuntas y expandido dentro de las paredes de los canales huecos en la espuma de elastómero. Las células espacialmente expandido en múltiples capas y se extendieron más de 100 micras a través de la construcción (como se muestra en la xz - y la imagen un plano yz sec cruzciones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Las imágenes de vídeo de la deformación y la recuperación de un rollo de LCE. Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)
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Discussion
elastómeros cristalinas líquidas han sido recientemente estudiado como andamios celulares biocompatibles debido a su capacidad de respuesta estímulos. Ellos han demostrado ser plataformas ideales como andamios celulares. Sin embargo, un factor importante a tener en cuenta en la preparación y el diseño de un nuevo andamiaje LCE es la porosidad. La incorporación de los sólidos lixiviables 23 o gases no siempre resulta en la porosidad homogénea o poros totalmente interconectados. El uso de una plantilla de metal que puede ser grabado a cabo no sólo ofrece la oportunidad de tener una estructura interna más organizada y regular, pero también permite la selección de tamaño de poro y densidad. Esto está directamente relacionado a la plantilla de metal usado previamente para la preparación de espumas de grafeno 22. plantillas de metal también proporcionan la oportunidad de formar formas antes de la reticulación LCE, permitiendo una amplia gama de posibilidades para crear arquitecturas sofisticadas y complejas Regular con porosidad defirmado a parecerse mucho a los entornos endógenos. LCE espuma preparada usando esta metodología permitir el estudio mejorada de material celular y, más importante, las interacciones célula-célula espaciales, una hazaña no es posible dentro de los entornos de dos dimensiones (2D). andamios celulares 2D no permiten que las células puedan interactuar libremente con las células vecinas. Además, las células crecen típicamente en monocapas (o directamente uno encima del otro), sin acceso completo al espacio para el crecimiento y, más importante, para la interacción. tipos de células que interactúan espacialmente específicos, tales como neuronas y células gliales, son de suma importancia en el diseño de construcciones como implantes potenciales o plataformas experimentales a largo plazo diseñados para reflejar los sistemas vivos.
Nuestra modular, la síntesis LCE libre de disolvente utilizando una plantilla de metal, que aquí se presenta, ayuda a ajustar la adhesión celular mediante la regulación del balance hidrofóbico / hidrofílico por elegir el nodo central apropiada y relación de monómeros 7
Las limitaciones de este protocolo son: (1) la limitada variedad de espumas de metal disponible en el comercio (níquel) y su gama limitada en dimensiones de puntal, (2) larequisito de que el LCE o cualquier otro material de polímero / elastómero deben resistir químicamente las condiciones del ataque químico del metal (aquí, un grabado FeCl 3), y (3) el hecho de que la alineación celular parece estar limitado a, los elastómeros de cristal modificado líquidos reportados aquí (los elastómeros no LCE padres no mostraron ninguna alineación celular apreciable).
En conclusión, se ha demostrado previamente que las LCE SMA se pueden preparar usando nuestro procedimiento de síntesis modular. restos LC biocompatibles adicionales se pueden incorporar a explorar sus propiedades mecánicas y nuevos efectos cristalinos líquidos sobre la proliferación celular y, en particular, la alineación celular. Se sabe que las propiedades mecánicas, en particular los valores de módulos de Young, son críticos para la adhesión celular, la proliferación, y la alineación celular. Los resultados aquí muestran que la porosidad de las LCE SMA se puede ajustar mediante el uso de una plantilla de metal para proporcionar una manera eficaz de controlar el tamaño de poro y para adaptar el LCEde forma (morfología es decir, en general). Inmersión de la plantilla de Ni en la mezcla de polímero SCB, seguido por ataque químico la plantilla Ni proporciona un enfoque sencillo para las nuevas morfologías LCE. Los LCE similares a espuma descritos aquí proporcionan células (aquí, SH-SY5Y, un modelo de célula estándar para estudiar la función neuronal) con un entorno más realista, 3D para el crecimiento y la interacción. Lo que permite múltiples tipos de células que crecen en múltiples capas dispersas por todo el elastómero imita ambientes neurales endógenas y ofrece la posibilidad intrigante de más sofisticados experimentos de cultivo de tejidos en 3D. El uso de las LCE sintonizables y dinámicas para imitar arquitecturas nativas allana el camino para los modelos celulares de la próxima generación para estudios de células longitudinales y clínicamente relevantes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Universidad Estatal de Kent (beca de investigación en colaboración y apoyo a la Iniciativa de Medicina Regenerativa en Kent State - ReMedIKS) por el apoyo financiero de este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper(I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
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