Summary
Cette étude présente une méthode pour préparer 3D, biodégradables, des échafaudages de cellules en forme de mousse à base d'élastomères à cristaux liquides biocompatibles de la chaîne latérale (LCES). Des expériences de microscopie confocale montrent que LCES comme mousse permettent la fixation des cellules, la prolifération et l'alignement spontané de myoblastes C2C12s.
Abstract
Nous présentons ici une préparation étape par étape d'un échafaudage cellulaire 3D, biodégradable, comme la mousse. Ces échafaudages ont été préparés par co-polymères séquences de réticulation étoile comportant des unités de cholestérol en tant que groupes latéraux de la chaîne latérale, ce qui entraîne smectique A (SmA) des élastomères à cristaux liquides (LCES). Echafauds comme mousse, préparés en utilisant des modèles métalliques, disposent microcanaux interconnectés, ce qui les rend appropriés comme échafauds de culture cellulaire 3D. Les propriétés combinées de la structure régulière de la mousse métallique et du résultat élastomère dans un échafaudage cellulaire 3D qui favorise non seulement la prolifération cellulaire supérieure par rapport aux films templated poreux classiques, mais aussi une meilleure gestion du transport de masse (c. -à- nutriments, gaz, déchets , etc.). La nature du modèle métallique permet la manipulation aisée des formes en mousse ( par exemple, des rouleaux ou des films) et pour la préparation des échafauds de différentes tailles de pores pour les études de cellules différentes , tout en préservant la interconnected nature poreuse du modèle. Le procédé de gravure ne modifie pas la composition chimique des élastomères, en préservant leur nature biocompatible et biodégradable. Nous montrons que ces LCES smectiques, lorsqu'elles sont cultivées pendant des périodes longues, permettent l'étude des constructions de tissus cliniquement pertinentes et complexes, tout en favorisant la croissance et la prolifération des cellules.
Introduction
Il existe plusieurs exemples de matériaux synthétiques et biologiques biocompatibles destinés à être appliqués dans des études cellulaires et pour la régénération des tissus visant à la fixation des cellules et la prolifération 1, 2, 3, 4, 5. Il y a eu quelques exemples de matériaux biocompatibles, connus comme des élastomères de cristaux liquides (LCES), qui peut répondre à des stimuli externes avec la commande anisotrope moléculaire 6, 7. LCES sont des matériaux stimuli sensibles qui combinent les propriétés mécaniques et élastiques des élastomères avec la fonctionnalité optique et la commande moléculaire de cristaux liquides 8, 9. LCES peuvent subir des modifications de forme, la déformation mécanique, un comportement élastique et des propriétés optiques en réponse à stim externesuli (ie., de la chaleur, le stress, la lumière, etc.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Des études antérieures ont montré que les cristaux liquides (LC) peuvent détecter la croissance et l' orientation des cellules 4, 17. Il est donc possible de supposer que LCES peuvent être appropriés pour des applications pertinentes biologiquement et médicalement, notamment échafaudage de cellules et d'alignement. Nous avons déjà signalé la préparation de smectiques LCES biocompatibles, biodégradables, coulé moulés et des films minces , avec une morphologie poreuse « type suisse de fromage » 6, 18. Nous avons également préparé LCES biocompatibles nématiques avec la morphologie globulaire comme Echafaudages pour la croissance des cellules 19 <sup>, 20. Notre travail vise à affiner les propriétés mécaniques des matériaux pour correspondre à celles du tissu d'intérêt 21. En outre, ces études mettent l'accent sur la compréhension des interactions cellule-élastomère, ainsi que la réponse cellulaire lorsque les élastomères sont soumis à des stimuli externes.
Les principaux défis étaient en partie pour adapter la porosité des LCES pour permettre la fixation des cellules et la pénétration à travers la matrice élastomère et pour un meilleur transport de masse. La porosité de ces couches minces 6 a permis de permeation cellulaire à travers la masse de la matrice, mais pas tous les pores sont entièrement interconnectés ou avaient une taille de pores plus régulière (homogène). Nous avons rapporté ensuite les élastomères LCE nématiques biocompatibles avec morphologies globulaires. Ces élastomères nématiques autorisés pour la fixation et la prolifération des cellules, mais la taille des pores ne variaient de 10 à 30 um, ce qui a empêché ou limité l'utilisation de cesles élastomères ayant une plus grande variété de lignées de cellules 19, 20.
Les travaux antérieurs de Kung et al. relative à la formation de mousses de graphène à l' aide d' un gabarit métallique « sacrificielle » a montré que la mousse de graphène obtenu avait une morphologie poreuse très régulier imposé par le gabarit métallique choisi 22. Cette méthode offre un contrôle total de la taille de la porosité et pores. En même temps, la malléabilité et la flexibilité du modèle métallique permettent la formation de différentes formes modèle avant la préparation de la mousse. D' autres techniques, telles que le lessivage matériau 23, le gaz texturation 24, ou des fibres électro-filage 25, 26 offrent également le potentiel pour la préparation de matériaux poreux, mais ils sont plus longues et, dans certains cas, la taille des pores est limitée à seulement quelques micromètres. Mousse-comme LCES 3D préparés en utilisant des gabarits métalliques permettent une charge de cellule plus élevée; un taux de prolifération améliorée; co-culture; et, last but not least, une meilleure gestion des transports de masse (c. -à- nutriments, les gaz et les déchets) afin d' assurer le plein développement des tissus 27. Mousseuse LCES 3D apparaissent également pour améliorer l'alignement des cellules; cela est probablement en relation avec les pendentifs LC détection de la croissance cellulaire et l'orientation des cellules. La présence de fragments de LC au sein du LCE semble améliorer l'alignement des cellules par rapport à l'emplacement de la cellule à l'intérieur de l'échafaudage pour LCE. Les cellules alignées dans les entretoises du LCE, alors qu'aucune orientation claire est observée lorsque les entretoises se rejoignent (jonctions) 27.
Dans l'ensemble, notre plate-forme d'échafaudage de cellules LCE comme milieu de support cellulaire offre la possibilité de régler la morphologie des élastomères et des propriétés élastiques et pour diriger spécifiquement l'alignement des types de cellules (individuels) pour créer un arrangements spatiaux ordonnés, of cellules semblables à des systèmes vivants. En plus de fournir un échafaudage capable de soutenir et de diriger la croissance cellulaire à long terme et la prolifération, LCES permettent également des expériences dynamiques, où l'orientation des cellules et les interactions peuvent être modifiées à la volée.
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Protocol
REMARQUE: Les étapes suivantes pour la préparation de mousse de type LCE 3D en utilisant le copolymère séquencé en étoile 3-bras sont représentés sur la figure 1. Pour la caractérisation par résonance magnétique nucléaire (RMN), les spectres sont enregistrés dans le chloroforme deutéré (CDCI3) à la température ambiante sur un instrument Bruker DMX 400 MHz et interne référencée pics résiduels à 7,26. Transformation de Fourier des spectres infrarouge (FT-IR) sont enregistrés en utilisant un spectromètre 33 Bruker Vector FT-IR en utilisant le mode de réflectance totale atténuée. Pour chaque étape du protocole suivant, il est important de porter des vêtements de protection individuelle (EPI).
1. Synthèse de l' α-chloro-ε-caprolactone (monomère) (selon la procédure de Jérôme et al. 28)
- Avant de commencer la synthèse, purifier 27 g d'acide 3-chloroperbenzoïque comme suit:
- Dans 800 ml d'eau distillée, ajouter 1,28 g de sodiummonohydrate monobasique de phosphate et 8,24 g de phosphate de sodium dibasique heptahydraté. Ajuster le pH à 7,4 (en utilisant de l'hydroxyde de sodium ou d'acide chlorhydrique) et de réserve de 30 ml de cette solution; ceci est la solution tampon.
- En utilisant une ampoule à décanter, on dissout de l'acide 3-chloroperbenzoïque dans 35 ml d'éther diéthylique. Laver la solution organique avec 10 ml de solution tampon (préparé à l'étape 1.1.1.). Répétez le lavage à trois reprises.
- Ajouter 3 g de sulfate de sodium directement à la solution organique; cet agent de séchage absorbe l'eau de la solution organique.
- Filtrer la solution pour éliminer l'agent de séchage. On concentre le filtrat sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 850 mbar et 40 ° C.
- Solubiliser 18,5 g de purifié acide 3-chloroperbenzoïque dans 150 ml de dichlorométhane anhydre en agitant dans un bain à ultrasons; ce procédé prend typiquement 20 min. Placer la solution dans une ampoule à décanter.
- A l'intérieur d'un à deux cols, ballon à fond rond,dissoudre 13,1 g de 2-chlorocyclohexanone dans 15 ml de dichlorométhane sec à l'aide d'un agitateur magnétique sous atmosphère d'azote. Continuez à remuer.
- Monter l'ampoule à décanter contenant une solution d'acide 3-chloroperbenzoïque (à partir de l'étape 1.2) dans le ballon à deux cols dans l'étape 1.3. Rincer le système avec de l'azote gazeux. Régler l'ouverture de l'entonnoir de séparation de telle sorte que la solution d'acide chloroperbenzoïque tombe goutte à goutte dans la solution de 2-chlorocyclohexanone (1 goutte toutes les deux secondes) et continuer à agiter le mélange sous azote gazeux pendant 96 h.
- On refroidit le mélange réactionnel à -20 ° C pendant 1 heure pour précipiter l'acide m - chlorobenzoïque (m -CBA) sous - produit.
- On filtre le m - chlorobenzoïque acide (m -CBA) et laver la solution résiduelle avec des solutions saturées de thiosulfate de sodium, le bicarbonate de sodium, et de chlorure de sodium.
- Eliminer le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 850 mbar et 40 ° C. Purifier le LIQU jaune pâle, visqueuxid par distillation sous pression réduite à 2,3 torr et 96 ° C.
- Surveiller le succès de la synthèse en utilisant les pics 1 H RMN suivants. 1 H RMN (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 4,75 à 4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37 à 4,26 (m, 1H, C H 2 O), 4.18 à 4.5 (m, 1 H , C H 2 O), et 2,06 à 1,58 (m, 6H, -C H 2 -) 6, 27.
2. Synthèse de l' α-étoile à trois bras copolymère à blocs (SBC-αCl) par copolymérisation Anneau d'ouverture (Sharma et al 6. Et Amsden et al. 29)
- Avant la synthèse, silaniser une ampoule de 20 ml en le remplissant avec une solution de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane 2% (v / v) dans du toluène et on agite pendant environ 24 h. Rincer avec de l'alcool isopropylique et le sécher en le plaçant dans un four à 140 ° C pendant 30 min.
- Ajouter 30,64 g d'ε-caprolactone distillée, 0,5 g d'α-chloro-ε-caprolactone et 0,25 ml de glycerol à l'ampoule. Mélanger à l'aide d'un vortex pendant 1 min.
- Ajouter 4,90 g de D, L - lactide à l'ampoule et le purger avec de l' azote. Placer l'ampoule dans une étuve à 120 ° C pour faire fondre le D, L - lactide; ce processus prend environ 2 h. Mélanger à l' aide à nouveau un vortex pour vous assurer que tous les contenus sont bien mélangés et ajouter 66 pl d'étain (II) 2-éthylhexanoate (Sn (Oct) 2) à l'ampoule.
NOTE: D, L - lactide se refroidira au cours de ce processus et devra être réchauffés au four pour faire fondre. - Vigoureusement mélanger une dernière fois à l'aide du vortex et rincer avec de l'azote.
- Fermer l'ampoule par un bouchon en caoutchouc. Placer une aiguille reliée à un tube à vide (le vide interne est généralement suffisant) à travers le bouchon en caoutchouc. Allumer le vide et, à l'aide d'une flamme, faire fondre le long cou du verre, la torsion lentement jusqu'à ce que le glass s'effondre sur lui-même. Veillez à ne pas faire fondre le bouchon en caoutchouc. Une fois que l'ampoule est scellée à la flamme, le placer dans un bain de sable, un four, ou d'un élément chauffant approprié à 140 ° C pendant 48 h.
- Sortez l'ampoule et le laisser refroidir à la température ambiante.
- Briser l'ampoule à la marque scellé et on dissout le liquide très visqueux en ajoutant 10 mL de dichlorométhane. Transférer la solution dans une ampoule à décanter.
- Préparer un ballon contenant 100 ml de methanol froid (refroidi en utilisant un bain de glace / acétone sec à une température d'environ -78 ° C). Fixer l'ampoule à décanter (étape 2.7) sur le dessus du flacon. Régler l'ouverture de l'ampoule à décanter afin que environ deux gouttes tombent toutes les deux secondes (goutte à goutte).
- Recueillir le précipité blanc par filtration (en utilisant un filtre en papier) et le sécher dans un four sous vide entre 50 et 60 ° C.
- Surveiller le succès de la synthèse en utilisant les pics de RMN 1 H et FT-IR suivantes. 1 H RMN (400 MHz, CDCl 3, Δ [ppm]): 5.29 à 5.3 (m, COC H CH3), 4,43 à 4,25 (m, C H Cl), 4.24 à 4.12 (m, C H 2 O), 04.11 à 04.03 (t, J = 4,6 Hz, C H 2 O), 3,80 à 3,68 (m, C H C H 2), 3,09 à 2,64 (s large, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, H α-), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-) et 1,77 à 1,25 (m, C H 2, C H 3); FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, et 735 (m) 6, 27.
Remarque: Pour préparer une procédure LCE 3D plus hydrophile, préparer un copolymère séquencé linéaire (LBC) à la place d'un SBC, après la copolymérisation par ouverture de cycle (ROP) décrit ci-dessus.- Ajouter 0,3 g de polyethylene glycol (PEG), 3,15 g ε-caprolactone, 1,0 g d'α-chloro-ε-caprolactone et 5,0 g de D, L-lactide dans le mélange flacon silanisé.
3. Modification de synthèse de α-Cl-Three Arm SBC à aN 3 (selon Sharma et al. 6) -trois Arm SBC (SBC-aN 3)
- Dans un ballon à fond rond et sous atmosphère d' azote, on dissout 5 g de SBC-αCl dans 30 ml de N, N » -diméthylformamide.
- Ajouter 0,22 g d'azoture de sodium et laisser réagir pendant une nuit à la température ambiante.
Attention: azoture de sodium est toxique; porter des vêtements de protection individuelle (EPI). - Retirer le N, N » -diméthylformamide sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 11 mbar et 40 ° C. On dissout le mélange dans 30 ml de toluène. Centrifuger la solution trois fois à 2800 g pendant 15 min pour éliminer le sel formé. On évapore le toluène sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 77 mbar et 40 ° C.
- Surveiller le succès de la substitution de l' azide en utilisant des pics 1 H RMN et FT-IR.
REMARQUE:
4. Synthèse de cholestéryle 5-Hexynoate (LC Moitié) (Selon Sharma et al 6. Et Donaldson et al. 30)
- Dans un ballon à fond rond, mélanger 3 g d'acide 5-hexynoïque et 130 ml de dichlorométhane. On refroidit à 0 ° C en utilisant un bain de glace.
- Dans un autre ballon à fond rond, mélanger 8,28 g de N, N » dicyclohexylcarbodiimide, 10,3 g de cholestérol et 0,2 g de 4-diméthylaminopyridine.
- Transférer la solution goutte à goutte de l'acide 5-hexynoïque dans le ballon contenant le mélange de cholestérol et de maintenir le mélange final à 0 ° C pendant 1 h.
- Laisser le mélange se réchauffer à température ambiante jusqu'au lendemain. Retirez le précipité de dicyclohexylurée obtenu par filtration en utilisant une teneur 415 filtre en papier et le jeter.
- On concentre le filtrat sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 850 mbar et 40 ° C. Dissoudre le résidu recueilli dans 150 ml d'hexane.
- On évapore le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 335 mbar et 40 ° C. Ajouter 350 ml d'éthanol au résidu huileux pour recueillir le produit final. Laver le solide blanc cassé formé avec de l'éthanol et sécher le produit solide sous vide à 50 ° C.
- Surveiller la synthèse en utilisant les pics 1 H RMN et FT-IR suivantes. 1 H RMN (400 MHz, CDCI3, [ppm] δ): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C H = C), 4,70 à 4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H 2 CO), 2,34 (m, 2H, C H 2 -C H =), 2,31 (m, 2H, C H 2 C H 2 -COO), 2,28 (s, 1H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H 2), 2.7 à 1.6 (m, 2H, C H 2, C H), 0,94 (s, 3H, C H 3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H 3 C H) et 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H 3 -C H), 0,67 (s, 3H, C H 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2,830-2,990 (large et pic intense), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s) et 667 (s).
5. Modification synthétique de α-N 3 -Trois Arm SBC a-cholestéryle-trois bras SBC (SBC-αCLC) via un azoture-Acétylène Huisgen réaction de cyclo-addition (réaction "Cliquez") pour obtenir SBC-Chol (Selon Sharma et al. 6)
- Dans un ballon à fond rond, on dissout 1 équivalent molaire de SBC-aN 3 (1,5 g) dans 100 ml de tétrahydrofuranne fraîchement distillé (THF). Ajouter 1,2 équivalen molairest de cholestéryle 5-hexynoate (1,94 g), 0,1 équivalent molaire de cuivre (I) de l'iodure (0,06 g) et de 0,1 équivalent molaire de triéthylamine (0,03 g). On agite le mélange pendant une nuit à 35 ° C sous atmosphère d'azote.
- On évapore le solvant sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 357 mbar et 40 ° C.
- Dissoudre le mélange résiduel dans 80 ml de dichlorométhane et on centrifuge pendant 5 min à 2800 x g à température ambiante pour éliminer les matériaux non réagis et les produits secondaires.
- Surveiller la synthèse en utilisant les pics 1 H RMN et FT-IR suivantes. 1 H RMN (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazole), 5,43 à 5,34 (m, C = cholestérol CH), 05.10 à 05.06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, cholestérol O-CH), 4.24 à 4.19 (m, CH 2 O), 4.18 à 4.13 (t, J = 5,0 Hz, CH 2 O), 4.11 à 4.5 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47 à 2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH 2), 2.31 à 2.25 (m, COCH 2), 2.7 à 1.2 (m, CH 2 CH3), 1.5 à 1.3 (s, CH2, CH3), 0,96 à 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH2, CH3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH3), et de 0,71 à 0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s) et 668 (s).
6. Synthèse du 2,2-bis (1-caprolactone-4-yl) propane (agent de réticulation, BCP) (Selon Gao et al. 27 et Albertsson et al. 31)
- Dans un ballon à fond rond, de préparer une solution contenant 10,8 g de 2-bis (4-hydroxy-cyclohexyl) propane et 52 ml d'acide acétique.
- Préparer une solution contenant 11 g de trioxyde de chrome dans 50 ml d'acide acétique et 8 ml d'eau distillée. Ajouter cette solution goutte à goutte à la solution préparée à l' étape 6.1 , tout en maintenant la température du mélange entre 17 et 20 ° C (par exemple dans unbain d'eau); ce procédé de goutte à goutte dure 2 h. Une fois que le processus est terminé, permettre à la solution sous agitation pendant environ 30 min.
- Ajouter 50 ml de 2-propanol. Incorporer la solution pendant la nuit à la température ambiante.
- Concentrer la solution violet foncé sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif à 137 mbar et 40 ° C. Ajouter 300 ml d'eau distillée pour précipiter; le précipité doit être violet clair.
- Filtrer le produit brut en utilisant une teneur 415 filtre en papier. Laver la matière solide avec ~ 250 mL d'eau distillée ou jusqu'à ce que le solide devient blanc.
- Dissoudre la matière solide dans 15 ml de benzène à 40 ° C et laisser recristalliser à 25 ° C.
- Ajouter 8,34 g de dicétone sec dissous dans du dichlorométhane anhydre et une solution contenant 6,0 g d'acide 3-chloroperbenzoïque dans 75 ml de dichlorométhane dans le ballon.
- Reflux la solution à 40 ° C pendant 24 h.
- On refroidit le mélange réactionnel à -20 ° C pendant 10 minutes pour précipiter le m
- Retirer l' acide m - chlorobenzoïque par filtration ( en utilisant un filtre en papier) et on concentre la solution sous pression réduite.
- Laver le produit brut de viscose avec 200 ml de 2-heptanone et sécher le précipité sous vide à 50 ° C pendant une nuit.
- Surveiller la synthèse en utilisant les pics 1 H RMN et FT-IR suivantes. 1 H RMN (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 4,42 à 4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H 2 OC = O), 4.21 à 4.15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H 2 OC = O), 2,80 à 2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,63 à 2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,04 à 1,93 (m, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1,70 à 1,56 (m, 4H, -C H 2 C H 2 COO), 1,48 à 1,38 (m, 2H, - C H C (CH 3) 2), et 0,84 (s, 6H, C H 3 C-). 7. Création d'Porous 3D Elastomère Échafaudage utilisant soit hexaméthylène diisocyanate (HDI) ou le 2,2-bis (1-caprolactone-4-yl) propane (PCA) 27 comme agents de reticulation (Selon Gao et al. 27)
- Préparer le mélange d'élastomère à trois bras en utilisant 0,75 g de SBC-αCLC en ajoutant 0,25 ml de HDI (ou 0,45 mL de PCA) et 0,24 ml de monomère ε-caprolactone distillée. Ajouter 60 pi de Sn (Oct) 2. Si vous utilisez BCP au lieu de HDI, mélanger SBC-αCLC et BCP à l'aide d'un vortex et placez-les dans un four à 140 ° C jusqu'à ce que le BCP fond complètement et se dissout (cette étape peut prendre jusqu'à 2 h). Une fois que le BCP a été dissous, le sortir du four et, le Sn (Oct) 2 et vortex.
- Préparer un modèle en mousse de nickel « sacrificielle » par découpe d'un 1 x 4 cm pièce métallique. Passer à partir de l' une des extrémités courtes de telle sorte que le rouleau final est d' environ un 1 x 1 cm pièce métallique (voir la figure 4). <li> Mettre la mousse de nickel dans un emballage de feuille flacon en verre ou en aluminium et verser le mélange préparé à l'étape 7.1 pour couvrir entièrement la mousse pendant 2 min. Retirez le mélange en excès avec une pipette Pasteur. Laissez-le dans un four pendant la nuit à 80 ° C.
- Décoller la feuille d'aluminium ou de briser le verre. En utilisant une lame de rasoir, raser l'élastomère autour de la mousse métallique afin d'exposer le métal de nickel.
- Solution dans 100 ml d'eau Préparer 1 M de fer (III) chlorure (FeCl 3). Placez la mousse dans un flacon et ajouter 70 ml de solution FeCl3. Remuez pendant trois jours à la température ambiante et changer la solution FeCl3 tous les jours. Avant chaque changement, mélanger la mousse avec de l'eau désionisée pendant 0,5 h.
NOTE: Le processus de gravure est généralement terminée au bout de trois jours. Pour veiller à ce que le processus de gravure est terminée, effectuer des tests de compression tactiles jusqu'à ce que les mousses se sentent doux. la résistance de la mousse à des essais de compression tactiles indique la présence d'un modèle de métal résiduel. - Rincer le elastmousse omer avec de l'éthanol et le placer dans un four à vide pendant une nuit à 40 ° C.
- Caractériser les matériaux en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM), la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), des essais mécaniques de compression, et l' analyse gravimétrique thermique (TGA) 27.
NOTE: Pour la préparation d'un LCE 3D plus hydrophile, remplacer le SBC avec LBC (en veillant à ce que la LBC contient également un fragment LC) suivant les étapes décrites à l'étape 7.5.
8. Ensemencement des Échafaudage avec Elastomère SH-SY5Y neuroblastome et culture stériles Utilisation des techniques
- Stériliser l'élastomère en lavant deux fois avec 1 ml d'éthanol à 70%. Effectuer une irradiation UV pendant 10 minutes et on lave avec 1 ml d'éthanol à 70%. Rincer deux fois avec 1 mL d'eau stérile et 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placer les élastomères dans 24 puits des plaques de culture.
- Préparer un milieu de croissance des cellules SH-SY5Y pour contenant 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémENTED avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep).
- Après avoir compté les cellules en utilisant un hémocytomètre, préparer 1,5 x 10 5 cellules SH-SY5Y en suspension dans 100 ul de milieu de croissance (solution d'amorçage). Ajouter la solution au-dessus des élastomères, en veillant à former une goutte.
- Incuber les élastomères ensemencées à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 heures pour favoriser l' adhérence cellulaire. Ajouter 0,5 ml de milieu de croissance. Incuber à nouveau à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Changer le support tous les jours après le lavage avec 1 ml de PBS.
9. L'imagerie microscopique de Construct Elastomère
- Fixer les cellules cultivées sur les élastomères avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 15 min. Rincer avec 3 ml de PBS trois fois pendant 5 minutes chacune et placer l'élastomère avec les cellules fixées dans une boîte de culture avec une lamelle couvre-joint.
Attention: PFA est toxique. Porter des vêtements de protection individuelle (EPI). - Stadans les échantillons fixés avec 0,1% de 4' , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 500 pl de PBS pendant 10 minutes et rincer deux fois avec 1 ml de PBS pendant 5 min.
- Immédiatement images élastomères en utilisant la microscopie confocale à fluorescence DAPI, l'acquisition des piles d'images qui couvrent l'échantillon.
REMARQUE: Ici, des piles d'images ont été acquises à l'aide d'un objectif 20x et un objectif 60x. - Analyser les piles d'images confocale optique en utilisant ImageJ 32.
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Representative Results
Ce rapport indique le procédé de préparation d'un LCE 3D poreux comme un échafaudage pour la culture cellulaire en utilisant une matrice de métal de nickel. Le 3D obtenu LCE démontre un réseau de canaux interconnectés complexe qui permet l' infiltration de cellules facile, ainsi que le transport de masse plus appropriée 27. Il a été constaté que les cellules sont capables de pénétrer entièrement le réseau de canaux interconnectés et sont également en mesure d'aligner dans le LCE. Ici, une mousse de nickel de métal (99% de Ni, de densité 860 g / cm 2) a été sélectionné en suivant une approche similaire à la préparation de mousse de graphène rapporté précédemment par Kung et al. 22. La mousse de métal a été coulé polymère, toutes les entretoises métalliques entièrement couverts. La sélection de la taille de la mousse métallique et la densité est importante car elle donne la morphologie finale de la LCE et peut aider à imiter l'environnement de tissu d'intérêt.
D, L- lactide (Figure 2). Le produit final est un SBC 3-bras hydrophobe. SBC avec 4 et 6 bras, réalisés par le remplacement du noeud de glycérol avec du pentaérythritol et le dipentaérythritol, respectivement, ont été précédemment 18. Pour un SBC plus hydrophile, le noeud central a été remplacé par de l'oxyde d'oligoéthylène (voir les notes de protocole). Toutefois, en remplaçant le glycérol avec les résultats de l' oxyde d'oligoéthylène dans un copolymère séquence linéaire 27. Nous avons utilisé une synthèse modifiée de Younes et al. 29. La version modifiée permet l'utilisation d'un ε-ca modifiéprolactone avec un groupe halogène dans deux positions différentes, alpha et gamma par rapport au carbonyle 6. Une fois que le SBC est formée, le bloc ε-caprolactone modifié subit un déplacement de l'atome d'halogène par un groupe azoture. Le déplacement du groupe d'halogène par le groupe azide est confirmé par l'apparition du 2.100 cm - bande en utilisant une réflectance totale atténuée (ATR) FT-IR (figure 3). Le groupe azoture est utilisé plus tard pour fixer de manière covalente le fragment LC (cholestéryle de hexynoate) au copolymère séquencé en étoile en utilisant la réaction de cycloaddition de alcyne-azide Huisgen (aussi connu comme un « clic réaction »), pour obtenir le copolymère séquencé en étoile finale avec un côté unité de suspension de cholestérol -chaîne (SBC-Chol). La formation du cycle triazole est confirmé par la disparition de la 2.100 cm - bande 1 et l'apparition d'un singulet à 7,30 ppm observée dans les spectres RMN 1 H (voir Figure3). Nous avons récemment rapporté sur l'effet de la mise en place d'un groupe d'halogène , soit alpha (α -Br) ou gamma (γ-Cl) au carbonyle sur le fonctionnalisé ε -CL 6. Il convient de noter que le remplacement du noeud central dans les co-polymères SBC avec 4 bras et le 6-bras noyaux centraux a un effet sur les propriétés mécaniques des LCES obtenus parce que les nœuds centraux servent à la fois des initiateurs et des agents de reticulation intrinsèques 18 .
Une fois que le SBC-Chol a été préparé et entièrement caractérisés, le procédé de reticulation à l'aide d'un gabarit métallique est la dernière étape pour la préparation de la mousse. Le mélange a été SBC-Chol avec du diisocyanate d'hexaméthylène (HDI, agent de reticulation), ε-caprolactone, et Sn (Oct) 2 (ROP catalyseur, voir étape 7.1). Le bis-caprolactone (BCP) a été remplacé par agent de réticulation HDI, comme indiqué précédemment. La mousse métallique est découpée et formée à la f souhaitéeorm (Figure 4). Deux chemins pour la préparation de la mousse, à savoir la porosité primaire (LCEF PP) et de la porosité primaire / secondaire (LCEF P + SP), ont été rapportés. Ici, le LCEF P + SP, ou « immersion », la méthode, est présenté, dans lequel le modèle de nickel est trempé rapidement dans le mélange polymère. La mousse de métal est placé dans un récipient en feuille d'aluminium ou d'un flacon à scintillation contenant le mélange de polymère, toutes les entretoises métalliques entièrement immergées dans le mélange de polymères. L'excès de mélange de polymères est soigneusement éliminé. Ce modèle de nickel recouvert de polymère est placée pendant une nuit, toujours à l'intérieur du récipient, dans un four à 80 ° C. La réticulation est effectuée en présence du catalyseur pendant environ 2 h. Après le processus de réticulation, le modèle de nickel recouvert de polymère est retiré de son emballage en enlevant la feuille d'aluminium ou de rupture du récipient en verre. Le polymère en excès est soigneusement rasés du templ de nickel recouverte de polymèremangé pour exposer les bords de la matrice de nickel et placé à l' intérieur d' un récipient avec une solution saturée de FeCl3 (figure 5). Après quelques heures, le nickel est presque complètement enlevé, et que la mousse de LCE est rincé avec de l' eau désionisée (DI) pour éliminer la solution de nickel / FeCl 3. La mousse de LCE est à nouveau placé à l' intérieur d' un récipient avec une solution saturée de FeCl3 et on le rince avec de l' eau déminéralisée deux fois de plus. Une fois le processus de gravure est terminée et le modèle de nickel entier est entièrement éliminée, la mousse de LCE montre un réseau de canaux interconnectés avec des entretoises creuses (figure 6). La figure 6 montre la morphologie de la mousse de LCE interne observée par microscopie électronique à balayage (SEM). Les entretoises en mousse de LCE sont creuses, et la morphologie régulière global est subordonnée à la matrice de mousse de nickel.
Auparavant, l'utilisation de BCP a nécessité plusieurs étapes pour le maintenir en Solution (c. -à- fondu), parce que BCP commence à recristalliser dès que la solution se refroidit par quelques degrés (de 140 ° C à la température ambiante pour ajouter le Sn (Oct) 2, voir étape 7.1). Ceci rend la manipulation de la mousse métallique et du mélange polymère stimulant avant la reticulation. L'utilisation de HDI comme agent de réticulation a permis un temps de réticulation plus rapide que lors de l'utilisation du PCA. BCP est un solide à la température ambiante, avec un point de fusion de 140 ° C, tandis que l'IDH est un liquide à température ambiante. Le choix d'agents de reticulation affecte directement le temps de préparation et, comme dans notre cas, une réduction de la température de réticulation de 140 à 80 ° C, ce qui réduit également la préparation d'élastomère.
Les mousses de LCE ont été testées en utilisant la compression-déformation (film 1). Une réduction de 70% de la taille de LCE est observée, sans effet sur les dimensions globales. Lors de la libération de la compression de la LCE, il récupère pleinement son origine sHape et la taille. On croit que la présence des fragments de cristaux liquides dans le matériau LCE est critique, comme les élastomères préparés sous la même condition , sans le bloc de cholesterol ε caprolactone n'a pas recouvré leur forme originale et se sont effondrés en eux - mêmes.
Une fois que les mousses de LCE ont été obtenus, ils étaient prêts à être ensemencé avec neuroblastomes (SH-SY5Y) en utilisant des techniques de culture cellulaire standard. Les mousses de LCE ont été lavées deux fois dans 70% d'éthanol et on les rince trois fois avec du PBS avant l'ensemencement des cellules. Dans les 2-3 jours de l'ensemencement des cellules, les cellules ont été observées pour fixer aux parois du réseau LCE 3D. Pour étudier complètement l' attachement des cellules et à l' expansion au sein du réseau LCE, les cellules ont été fixées au bout de 30 jours (figure 7). Les cellules ont été fixées, colorées avec DAPI et imagées par microscopie confocale. Les cellules ont été trouvées avoir proliféré, attaché, et élargi pour couvrir largement le réseau d'échafaudage LCE 3D. Plus loinDe plus, une analyse détaillée a révélé l'allongement des noyaux de cellules, qui, dans la plupart des cas n'a pas été affectée par les sections courbes du réseau d'échafaudage LCE 3D. l'élongation des cellules peut également être corrélée à l'alignement des cellules et est le plus probablement le résultat de la smectique-A caractéristique de phase du LCE présenté. Ceci a été observé précédemment dans les cellules cultivées après C2C12 14 jours 27. Dans cette étude, nous montrons que les cellules continuent de proliférer pendant plus de 14 jours; ce ne se limite pas aux cellules C2C12 seul. L'utilisation des mousses de LCE peut être étendu à presque toute lignée cellulaire. Les cellules en croissance sur des échafauds comme mousse LCE 3D bénéficient de l'efficacité du transport de masse supérieure par rapport à échafauds 2D. En 2D échafauds, les cellules se développent habituellement dans les couches, les uns sur les autres. Les cellules en croissance sur les couches supérieures sont les seuls qui ont un accès complet à tous les éléments nutritifs, le gaz et l'élimination des déchets (transport de masse). Les cellules dans les couches inférieures ne sont pas capables d'accéder à des éléments nutritifs, et il existe un degré plus élevé de cellules death dans ce cas. Au sein échafauds 3D, les cellules ont une plus efficace (par rapport à échafauds 2D) l'accès aux nutriments, facteurs de croissance, et les gaz, ce qui permet cellulaires à long terme et des études de régénération des tissus. la gestion des déchets cellulaires (élimination des déchets) à l'aide des échafaudages de type mousse LCE 3D est aussi plus efficace que dans les échafaudages 2D. La porosité (et / ou d'autres propriétés structurales) des LCES autorise le transport de masse rapide et le chargement cellulaire accrue par rapport aux matrices poreuses moins (ou autres), ce qui permet médias et l'accès cellulaire aux régions centrales de la matrice. Cette plate-forme LCE est réglable pour soutenir la croissance de plusieurs types de lignées cellulaires primaires et immortalisés, y compris les muscles, les nerfs et la peau, entre autres, ainsi que des systèmes de culture multi-cellulaires. Pour l'essentiel, c'est l'un des avantages de la plate-forme, car il peut être utilisé pour développer de nombreux types de cellules et systèmes pendant de longues périodes. En outre, la capacité de développer plusieurs couches de cellules dans la construction de plus près emulAtes milieux naturels.
Figure 1: Procédure générale décrivant la préparation et la caractérisation étape par étape des mousses de LCE. Voir la section de protocole pour plus de détails. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Schéma de SBC 3 Réticulation-bras. Le système de réticulation du SBC 3-bras à l'aide biscaprolactone ou HDI comme agents de reticulation en présence d'une matrice de métal de nickel pour la préparation de LCES de type mousse est représenté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figuré.
Figure 3: Schéma du 1,2,3-triazole formation (réaction réussie "clic") suivie par RMN 1 H et FT-IR. Le déplacement du groupe d'halogène par le groupe azide est confirmé par l'apparition du 2.100 cm - bande en utilisant une réflectance totale atténuée (ATR) FT-IR. La formation du cycle triazole est confirmé par la disparition de la 2.100 cm - bande 1 et l'apparition d'un singulet, observé à 7,30 ppm dans le spectre RMN 1 H. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: images optiquesde diverses formes en mousse avant la reticulation. La mousse de métal est découpée et formée à la forme souhaitable, tel qu'illustré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: mousse de nickel avant (A) et après réticulation (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: la morphologie de la mousse LCE observée par microscopie électronique à balayage (SEM). Des images représentatives SEM de mousses de LCE sur base de SBC (a et b) et à base de LBC (c d) des élastomères à l' aide de Ni-860 en tant que matrice métallique sont représentés. Les flèches indiquent entretoises évidées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7: confocale micrographies présentant des noyaux colorés au DAPI des cellules SH-SY5Y attachés à la mousse d'élastomère 30 jours après l' ensemencement. Des images 2D ont été empilés dans la -direction z, et les images en coupe transversale du xz - et -plans yz ont été créés. Les images montrent que les cellules SH-SY5Y (taches lumineuses) fixés et élargis à l'intérieur des parois des canaux creux dans la mousse d'élastomère. Les cellules spatialement étendu en plusieurs couches et étendus au-dessus de 100 um à travers la construction (comme représenté sur la xz - yz et l' image croisée -Plane sections). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1: les images vidéo de la déformation et la récupération d'un rouleau LCE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo. (Faites un clic droit pour télécharger.)
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Discussion
élastomères cristaux liquides ont récemment été étudiés comme échafauds de cellules biocompatibles en raison de leur réactivité stimuli. Ils se sont avérés être des plates-formes idéales comme échafauds cellulaires. Cependant, un facteur important de garder à l'esprit lors de la préparation et la conception d'un nouvel échafaudage LCE est la porosité. L'incorporation de solides lessivables 23 ou de gaz ne se traduit pas toujours dans la porosité homogène ou pores totalement interconnectés. L'utilisation d'un modèle de métal qui peut être gravé sur offre non seulement la possibilité d'avoir une structure interne plus organisée et régulière, mais permet également la sélection de la taille des pores et la densité. Cela est directement lié à la matrice métallique utilisée précédemment pour la préparation de mousses de graphène 22. modèles métalliques offrent également la possibilité de former des formes avant la réticulation LCE, ce qui permet une vaste gamme de possibilités pour créer des architectures sophistiquées et complexes avec une porosité régulière designé pour ressembler étroitement les environnements endogènes. LCES de mousse préparés en utilisant cette méthodologie permettre l'étude de l'amélioration de matériel cellulaire et, plus important encore, les interactions cellule-cellule spatiale, un exploit pas possible dans un environnement en deux dimensions (2D). échafauds cellulaires 2D ne permettent pas aux cellules d'interagir librement avec les cellules voisines. En outre, les cellules se développent dans des monocouches (ou directement au-dessus de l'autre), sans accès à l'espace pour la croissance et, plus important encore, pour l'interaction. Spécifiques types de cellules qui interagissent dans l'espace, comme les neurones et les cellules gliales, sont d'une importance primordiale lors de la conception des constructions comme implants potentiels ou des plates-formes expérimentales à long terme conçus pour refléter les systèmes vivants.
Notre modulaire, la synthèse de LCE sans solvant à l' aide d' un gabarit métallique, présentée ici, permet d' ajuster l' adhérence cellulaire par réglage de l'équilibre hydrophobe / hydrophile en choisissant le noeud central approprié et un rapport de monomères 7
Les limites de ce protocole sont: (1) les mousses variété limitée de métal disponible dans le commerce (nickel) et leur gamme limitée en dimensions d'entretoises, (2) lecondition que le LCE ou tout autre matériau polymère / élastomère doivent résister chimiquement aux conditions de la gravure chimique du métal ( en l' occurrence, une gravure FeCl 3), et (3) le fait que l' alignement des cellules semble être limitée à des élastomères modifiés par des cristaux liquides rapportés ici (les parents élastomères non LCE ne présentaient aucun alignement cellulaire appréciable).
En conclusion, il a été montré précédemment que LCES SmA peuvent être préparés en utilisant notre procédé de synthèse modulaire. On peut incorporer des groupements biocompatibles LC supplémentaires pour explorer leurs propriétés mécaniques et de nouveaux effets cristallins liquides sur la prolifération cellulaire et, en particulier, l'alignement des cellules. Il est connu que les propriétés mécaniques, en particulier les valeurs de Young, moduli sont essentiels pour l'adhésion cellulaire, la prolifération et l'alignement des cellules. Les résultats montrent ici que la porosité de LCES SmA peut être accordée par l'utilisation d'un modèle de métal pour fournir un moyen efficace de contrôler la taille des pores et d'adapter la LCEforme ( par exemple, la morphologie générale). Immersion de la matrice de Ni dans le mélange de polymère de SCB, suivi par la gravure de la matrice Ni offre une approche facile pour les nouveaux morphologies LCE. Les LCES comme mousse décrits ici fournissent des cellules (ici, SH-SY5Y, un modèle cellulaire standard pour étudier la fonction neuronale) avec un environnement 3D plus réaliste pour la croissance et l'interaction. Permettre à plusieurs types de cellules à croître dans plusieurs couches dispersées dans l'élastomère imite étroitement les environnements neuronaux endogènes et offre la possibilité intéressante d'expériences de culture de tissus 3D plus sophistiqués. L'utilisation de LCES accordables et dynamique pour imiter les architectures natives ouvre la voie à des modèles cellulaires de nouvelle génération pour les études de cellules longitudinales et cliniquement pertinentes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l'Université Kent State (subvention de collaboration de recherche et de soutien à l'Initiative de médecine régénératrice à Kent State - ReMedIKS) pour le soutien financier de ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper(I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
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