Summary
Questo studio presenta una metodologia per preparare 3D, biodegradabili, schiuma come scaffold cellulari basate su elastomeri cristalli liquidi catena laterale biocompatibili (LCEs). esperimenti di microscopia confocale mostrano che LCEs schiuma come permettere l'attacco, proliferazione, e l'allineamento spontaneo dei mioblasti C2C12s.
Abstract
Qui vi presentiamo una preparazione step-by-step di un 3D, biodegradabili, gomma-come impalcatura delle cellule. Tali ponteggi sono stati preparati mediante reticolazione blocchi a stella copolimeri dotati di unità di colesterolo come gruppi pendenti catena laterale, con conseguente smectic-A (SMA) elastomeri a cristalli liquidi (LCEs). impalcature Schiuma-like, preparati utilizzando forme in metallo, sono dotate di microcanali interconnessi, che li rende adatti come impalcature di coltura cellulare 3D. Le proprietà combinate della struttura regolare della schiuma metallo e del risultato elastomero in un'impalcatura cellule 3D che favorisce non solo superiore proliferazione cellulare rispetto alle tradizionali pellicole templated porosi, ma anche una migliore gestione del trasporto di massa (cioè, nutrienti, gas, rifiuti , ecc). La natura del modello di metallo permette una facile manipolazione del materiale espanso (cioè, rotoli o film) e per la preparazione di supporti di differenti dimensioni dei pori per diversi studi sulle cellule preservando di interfacciamentoted natura porosa del modello. Il processo di incisione non influenza la chimica degli elastomeri, conservando la loro natura biocompatibile e biodegradabile. Abbiamo dimostrato che questi LCEs smectiche, quando coltivato per lunghi periodi di tempo, permettono lo studio di clinicamente rilevanti e complessi costrutti di tessuto, favorendo la crescita e la proliferazione delle cellule.
Introduction
Esistono numerosi esempi di materiali sintetici biologici e biocompatibili destinati ad essere applicati in studi cellulari e per la rigenerazione tissutale obiettivo di adesione cellulare e la proliferazione 1, 2, 3, 4, 5. Ci sono stati alcuni esempi di materiali biocompatibili, noti come elastomeri a cristalli liquidi (LCEs), che potrebbe rispondere a stimoli esterni con anisotropico molecolare ordinare 6, 7. LCEs sono materiali di stimoli reattivi che combinano le proprietà meccaniche ed elastiche elastomeri con la funzionalità ottica e ordine molecolare di cristalli liquidi 8, 9. LCEs possono sperimentare cambiamenti di forma, deformazione meccanica, comportamento elastico, e proprietà ottiche in risposta a STIM esterniuli (es., calore, stress, luce, ecc) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Studi precedenti hanno dimostrato che i cristalli liquidi (LC) possono percepire la crescita e l'orientamento delle cellule 4, 17. È quindi possibile supporre che LCEs possono essere adatti per applicazioni biologicamente e clinicamente rilevante, compresi ponteggi cellulare e allineamento. Abbiamo già riferito la preparazione di smectiche film biocompatibili, biodegradabili, cast-stampati, e LCEs sottili con un "tipo Swiss-formaggio" morfologia porosa 6, 18. Abbiamo anche preparato LCEs biocompatibili nematici con morfologia sferica come supporti per la crescita cellulare 19 <sup>, 20. Il nostro lavoro è stato rivolto a punto delle proprietà meccaniche dei materiali da corrispondere a quelli del tessuto di interesse 21. Inoltre, questi studi si concentrano sulla comprensione interazioni elastomero-cellula, così come risposta cellulare quando gli elastomeri sono soggetti a stimoli esterni.
Le sfide principali erano in parte per adattare la porosità dei LCEs per permettere l'attacco cellulare e permeazione attraverso la matrice elastomerica e per un migliore trasporto di massa. La porosità di questi film sottili 6 consentito per permeazione attraverso la massa delle cellule della matrice, ma non tutti i pori erano completamente interconnesso o aveva una dimensione più regolare (omogenea) poro. Abbiamo poi riportato su biocompatibili elastomeri nematici LCE con morfologie globulari. Questi elastomeri nematici consentiti per il fissaggio e la proliferazione delle cellule, ma la dimensione dei pori compresa soltanto 10-30 um, che ha impedito o limitato l'uso di questielastomeri con una più ampia varietà di linee cellulari 19, 20.
Precedente lavoro di Kung et al. relativa alla formazione di schiume grafene utilizzando un modello metal "sacrificale" si evince che la schiuma grafene ottenuto aveva una morfologia porosa molto regolare dettata dal modello metallo scelto 22. Questa metodologia offre il pieno controllo di porosità e dimensione dei pori. Allo stesso tempo, la malleabilità e flessibilità del modello metallo consentono la formazione di diverse forme template prima della preparazione di schiuma. Altre tecniche, come lisciviazione materiale 23, templating gas 24, o fibre elettro-filato 25, 26 offrono anche il potenziale per la preparazione di materiali porosi, ma sono più tempo e, in alcuni casi, la dimensione dei pori è limitata a solo pochi micrometri. Schiuma-come LCEs 3D preparati utilizzando forme in metallo consentono una cella di carico più elevato; un tasso di proliferazione migliorata; co-coltura; e, non ultimo, una migliore gestione del trasporto di massa (cioè, nutrienti, gas e rifiuti) per assicurare sviluppo tessuto pieno 27. LCEs 3D gomma-come appaiono anche per migliorare l'allineamento delle cellule; questo è più probabile in relazione alle pendenti LC sensing crescita cellulare e l'orientamento delle cellule. La presenza di frazioni LC all'interno LCE sembra aumentare allineamento delle celle rispetto alla posizione della cella all'interno del scaffold LCE. Cellule allineati entro i puntoni della LCE, mentre nessun chiaro orientamento si osserva in cui i puntoni uniscono (giunzioni) 27.
Nel complesso, la nostra piattaforma impalcatura cella LCE fungere da supporto cellulare offre la possibilità di regolare la morfologia elastomero e proprietà elastiche e di indirizzare specificamente l'allineamento (individuali) tipi cellulari per creare un ordine, disposizioni spaziali ocellule F simili ai sistemi viventi. Oltre ad un'impalcatura in grado di sostenere e dirigere la crescita cellulare a lungo termine e la proliferazione, LCEs anche consentire esperimenti dinamici, in cui l'orientamento delle cellule e interazioni possono essere modificate al volo.
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Protocol
NOTA: Le seguenti operazioni per la preparazione 3D LCE gomma-come utilizzando il blocco stella 3-braccio copolimero sono mostrati in Figura 1. Per la caratterizzazione Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), gli spettri vengono registrati in cloroformio deuterato (CDCl 3) a temperatura su uno strumento Bruker DMX 400 MHz camera e internamente riferimento picchi residui a 7.26. Fourier Transform Infrared spettri (FT-IR) vengono registrati con un Bruker Vector 33 FT-IR spettrometro utilizzando la modalità riflettanza totale attenuata. Per ogni passo del seguente protocollo, è importante indossare indumenti protettivi adeguati (DPI).
1. Sintesi di α-cloro-ε-caprolattone (monomero) (secondo il procedimento in Jérôme et al. 28)
- Prima di iniziare la sintesi, purificare 27 g di acido 3-cloroperbenzoico come segue:
- In 800 ml di acqua distillata, aggiungere 1,28 g di sodiofosfato monobasico monoidrato e 8,24 g di fosfato di sodio bibasico eptaidrato. Regolare il pH a 7,4 (utilizzando idrossido di sodio o acido cloridrico) e riserva 30 ml di questa soluzione; questa è la soluzione tampone.
- Utilizzando un imbuto separatore, sciogliere l'acido 3-cloroperbenzoico in 35 mL di dietil etere. Lavare la soluzione organica con 10 mL di soluzione tampone (preparata nella fase 1.1.1.). Ripetere il lavaggio per tre volte.
- Aggiungere 3 g di solfato di sodio direttamente alla soluzione organica; questo agente essiccante assorbe l'acqua dalla soluzione organica.
- Filtrare la soluzione per rimuovere l'agente essiccante. Concentrare il filtrato sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante a 850 mbar e 40 ° C.
- Solubilizzare 18,5 g di purificato acido 3-cloroperbenzoico in 150 mL di diclorometano anidro per agitazione in un bagno ad ultrasuoni; questo processo richiede in genere 20 min. Mettere la soluzione in un imbuto separatore.
- All'interno di una a due colli, pallone a fondo tondo,sciogliere 13,1 g di 2-chlorocyclohexanone in 15 mL di diclorometano anidro con un agitatore magnetico sotto gas azoto. Continuate a mescolare.
- Montare l'imbuto separatore contenente soluzione di acido 3-cloroperbenzoico (dal punto 1.2) al pallone a due colli nel passaggio 1.3. Lavare il sistema con azoto. Regolare l'apertura dell'imbuto separatore in modo che la soluzione di acido cloroperbenzoico cade goccia a goccia nella soluzione di 2-chlorocyclohexanone (1 goccia ogni due secondi) e continuare a mescolare la miscela sotto azoto per 96 h.
- Raffreddare la miscela di reazione a -20 ° C per 1 h per precipitare il sottoprodotto acido m -chlorobenzoic (m -CBA).
- Filtrare l'acido -chlorobenzoic m (m -CBA) e lavare la soluzione rimanente con soluzioni sature di tiosolfato di sodio, bicarbonato di sodio, e cloruro di sodio.
- Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 850 mbar e 40 ° C. Purificare il giallo pallido, sapone liquid viscosoid mediante distillazione sotto pressione ridotta a 2,3 Torr e 96 ° C.
- Monitorare il successo della sintesi utilizzando i seguenti 1 H NMR picchi. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H 2 O), 4,18-4,05 (m, 1H , C H 2 O), e 2,06-1,58 (m, 6H, -CH 2 -) 6, 27.
2. Sintesi di α-tre braccia Stella copolimero a blocchi (SBC-αCl) da Ring Copolimerizzazione di apertura (Sharma et al. 6 e Amsden et al. 29)
- Prima di sintesi, silanizzare un'ampolla 20 mL riempiendolo con (v / v) soluzione al 2% di 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane in toluene e agitazione per circa 24 ore. Lavare con alcool isopropilico e asciugare ponendolo in un forno a 140 ° C per 30 min.
- Aggiungere 3.64 g di distillato ε-caprolattone, 0,5 g di α-cloro-ε-caprolattone, e 0,25 ml di glicerolo al ampolla. Mescolare con un vortice per 1 minuto.
- Aggiungere 4,90 g di D, L -lactide per la fiala e spurgo con azoto. Posizionare la fiala in stufa a 120 ° C per fondere il D, L -lactide; questo processo richiede in genere circa 2 ore. Mescolare di nuovo utilizzando un vortice per assicurarsi che tutti i contenuti sono ben miscelati e aggiungere 66 ml di stagno (II) 2-etilesanoato (Sn (ott) 2) alla fiala.
NOTA: D, L -lactide si raffredda durante questo processo e deve essere ri-riscaldata in forno per fondere. - Mescolare energicamente per l'ultima volta con il vortex e lavare con azoto.
- Chiudere la fiala con un tappo di gomma. Inserire un ago collegato ad un tubo a vuoto (il vuoto casa è di solito sufficiente) attraverso il tappo di gomma. Attivare il vuoto e, utilizzando una fiamma, sciogliere il lungo collo del bicchiere, torcendo lentamente fino alla glass collassa su se stessa. Fare attenzione a non sciogliere il tappo di gomma. Una volta che la fiala è fiamma sigillato, posizionarlo in un bagno di sabbia, un forno, o appropriato elemento riscaldante a 140 ° C per 48 h.
- Estrarre la fiala e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
- Rompere la fiala in boa sigillato e sciogliere il liquido altamente viscoso aggiungendo 10 mL di diclorometano. Trasferire la soluzione in un imbuto separatore.
- Preparare un pallone contenente 100 mL di metanolo freddo (raffreddato con un bagno di ghiaccio secco / acetone a una temperatura di circa -78 ° C). Fissare l'imbuto separatore (passo 2.7) sulla parte superiore del pallone. Regolare l'apertura dell'imbuto separatore in modo che circa due gocce cadono ogni due secondi (a gocce).
- Raccogliere il precipitato bianco mediante filtrazione (utilizzando un filtro di carta) e asciugare in un forno sotto vuoto tra 50 e 60 ° C.
- Monitorare il successo della sintesi utilizzando i seguenti 1 H NMR e FT-IR picchi. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC H C H 3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24-4,12 (m, C H 2 O), 4,11-4,03 (t, J = 4.6 Hz, C H 2 O), 3,80-3,68 (m, C H C H 2), 3,09-2,64 (ampio, s, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-), e 1,77-1,25 (m, C H 2, C H 3); FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2.932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, e 735 (m) 6, 27.
Nota: Per preparare un LCE 3D più idrofila, preparare un copolimero a blocchi lineare (LBC) invece di uno SBC, seguendo la procedura di apertura dell'anello copolimerizzazione (ROP) sopra descritto.- Aggiungere 0,3 g di polietilene glicole (PEG), 3,15 g ε-caprolattone, 1,0 g di α-cloro-ε-caprolattone, e 5,0 g di D, L-lattide al mix flaconcino silanizzato.
3. Modifica sintetico di α-Cl-braccio tre SBC αN 3 -Three Braccio SBC (SBC-αN 3) (Secondo Sharma et al. 6)
- In un pallone a fondo tondo e sotto azoto, sciogliere 5 g di SBC-αCl in 30 mL di N secca, dimetilformammide N'.
- Aggiungere 0,22 g di sodio azide e lasciare reagire per una notte a temperatura ambiente.
Attenzione: sodio azide è tossica; indossare indumenti di protezione adeguati (DPI). - Rimuovere la N, N-dimetilformammide' sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 11 mbar e 40 ° C. Sciogliere il composto in 30 mL di toluene. Centrifugare la soluzione tre volte a 2800 xg per 15 minuti per eliminare il sale formatosi. Evaporare il toluene sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 77 mbar e 40 ° C.
- Monitorare il successo della sostituzione azide mediante 1 H NMR e FT-IR picchi.
NOTA:
4. Sintesi di Cholesteryl 5-Hexynoate (LC Moiety) (Secondo Sharma et al. 6 e Donaldson et al. 30)
- In un pallone a fondo tondo, miscela 3 g di acido 5-hexynoic e 130 mL di diclorometano. Raffreddare a 0 ° C con un bagno di ghiaccio.
- In un altro pallone a fondo tondo, mescolare 8,28 g di N, N -dicyclohexylcarbodiimide', 10,3 g di colesterolo, e 0,2 g di 4-dimetilamminopiridina.
- Trasferire la soluzione di acido 5-hexynoic goccia a goccia al pallone contenente la miscela colesterolo e mantenere la miscela finale a 0 ° C per 1 h.
- Lasciare il composto si riscaldi a temperatura ambiente per una notte. Rimuovere la dicicloesilurea precipitato risultante mediante filtrazione con un filtro di carta di grado 415 e scartarla.
- Concentrare il filtrato sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 850 mbar e 40 ° C. Sciogliere il residuo raccolto in 150 ml di esano.
- Evaporare il solvente sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 335 mbar e 40 ° C. Aggiungere 350 ml di etanolo al residuo oleoso per raccogliere il prodotto finale. Lavare il solido biancastro formata con etanolo e asciugare il prodotto solido sotto vuoto a 50 ° C.
- Monitorare la sintesi utilizzando i seguenti 1 H NMR e FT-IR picchi. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C = C H), 4,70-4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2.5 Hz, 2H, C H 2 CO), 2,34 (m, 2H, H C 2 -C = H), 2,31 (m, 2H, C H 2 C H 2 COO), 2,28 (s, 1H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2.3 Hz, 2H, ≡CC H 2), 2,07-1,06 (m, 2H, C H 2, C H), 0,94 (s, 3H, C H 3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H 3 C H), e 0.88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H 3 -C H), 0,67 (s, 3H, C H 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2,830-2,990 (ampio e forte picco), 2.104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1.135 (m), 999 (s), 798 (s), e 667 (s).
5. Modifica sintetico di α-N 3 -Tre Braccio SBC di alfa-del colesterolo-braccio tre SBC (SBC-αCLC) tramite una reazione Azide-Acetilene Huisgen Cyclo-addizione ( "Click" Reaction) per ottenere SBC-Chol (Secondo Sharma et al. 6)
- In un pallone a fondo tondo, sciogliere 1 equivalente molare di SBC-αN 3 (1,5 g) in 100 mL di tetraidrofurano distillata di fresco (THF). Aggiungere 1,2 equivalen molarit di colesteril-5 hexynoate (1,94 g), 0,1 equivalenti molari di rame (I) ioduro (0,06 g), e 0,1 equivalente molare di trietilammina (0,03 g). Agitare la miscela per una notte a 35 ° C sotto azoto.
- Evaporare il solvente sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 357 mbar e 40 ° C.
- Sciogliere la miscela residua in 80 mL di diclorometano e centrifugare per 5 min a 2800 xga temperatura ambiente per rimuovere i materiali non reagiti e prodotti collaterali.
- Monitorare la sintesi utilizzando i seguenti 1 H NMR e FT-IR picchi. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazolo), 5,43-5,34 (m, C = CH colesterolo), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, O-CH colesterolo), 4,24-4,19 (m, CH 2 O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH 2 O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH 2), 2,31-2,25 (m, COCH 2), 2,07-1,02 (m, CH 2 3), 1,05-1,03 (s, CH 2, CH 3), 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH 2, CH 3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH 3), e 0,71-0,68 (s, CH 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 3.260 (s), 2.920 (s), 1710 (s), 1.460 (s), 1.370 (s), 1.240 (m), 1190 (s), 733 (s), e 668 (s).
6. Sintesi di 2,2-bis (1-caprolattone-4-il) propano (Crosslinker, BCP) (Secondo Gao et al. 27 e Albertsson et al. 31)
- In un pallone a fondo tondo, preparare una soluzione contenente 10,8 g di 2-bis (4-idrossi-cicloesil) propano e 52 ml di acido acetico.
- Preparare una soluzione contenente 11 g di triossido di cromo in 50 mL di acido acetico e 8 ml di acqua distillata. Aggiungere questa soluzione goccia a goccia alla soluzione preparata nella fase 6.1, mantenendo la temperatura della miscela tra 17 e 20 ° C (ad esempio, in unbagnomaria); questo processo richiede goccia a goccia 2 h. Una volta che il processo è completo, riportare la soluzione a mescolare per circa 30 min.
- Aggiungere 50 ml di 2-propanolo. Agitare la soluzione notte a temperatura ambiente.
- Concentrare la soluzione viola scuro sotto pressione ridotta in evaporatore rotante a 137 mbar e 40 ° C. Aggiungere 300 ml di acqua distillata per precipitare; il precipitato deve essere leggera viola.
- Filtrato il prodotto grezzo utilizzando un filtro di carta di grado 415. Lavare il materiale solido con ~ 250 mL di acqua distillata o finché il solido diventa bianco.
- Sciogliere il materiale solido in 15 mL di benzene a 40 ° C e lasciate ricristallizzare a 25 ° C.
- Aggiungere 8,34 g di dichetone secca disciolto in diclorometano anidro ed una soluzione contenente 6,0 g di acido 3-cloroperbenzoico in 75 mL di diclorometano nel matraccio.
- Riflusso la soluzione a 40 ° C per 24 h.
- Raffreddare la miscela di reazione a -20 ° C per 10 minuti per precipitare il m
- Rimuovere l'acido -chlorobenzoic m per filtrazione (utilizzando un filtro di carta) e concentrare la soluzione a pressione ridotta.
- Lavare il prodotto grezzo di viscosa con 200 ml di 2-eptanone ed essiccare il precipitato sotto vuoto a 50 ° C durante la notte.
- Monitorare la sintesi utilizzando i seguenti 1 H NMR e FT-IR picchi. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H 2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -CH 2 CH 2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H 2 C H 2 COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH 3) 2), 0,84 (s, 6H, C H 3 C-). 7. Creazione di Porous 3D elastomero impalcatura Utilizzando uno esametilendiisocianato (HDI) o 2,2-bis (1-caprolattone-4-il) propano (BCP) 27 come reticolante (Secondo Gao et al. 27)
- Preparare miscela di elastomero tre bracci utilizzando 0,75 g di SBC-αCLC aggiungendo 0,25 mL di HDI (o 0,45 ml di BCP) e 0,24 mL di acqua distillata monomero ε-caprolattone. Aggiungere 60 ml di Sn (ottobre) 2. Se si utilizza BCP invece di HDI, mescolare SBC-αCLC e BCP utilizzando un vortice e metterli in forno a 140 ° C fino a quando la BCP fonde e si dissolve completamente (questo passaggio può richiedere fino a 2 ore). Una volta che la BCP è stato sciolto, estrarlo dal forno e, Sn (ottobre) 2, e vortex.
- Preparare un modello di spugna di nickel "sacrificale" tagliando un pezzo di metallo cm 1 x 4. Rotolare da uno dei lati corti in modo che il rotolo finale è di circa un pezzo metallico 1 x 1 cm (vedi Figura 4). <li> Inserire la spugna di nickel in un pacchetto foglio fiala in vetro o alluminio e versare il composto preparato al punto 7.1 a coprire completamente la schiuma per 2 min. Rimuovere l'impasto in eccesso con una pipetta Pasteur. Lasciarlo in una notte forno a 80 ° C.
- Staccare il foglio di alluminio o rompere il vetro. Utilizzando una lama di rasoio, radere l'elastomero intorno alla schiuma metallica per esporre il metallo nichel.
- Preparare la soluzione in 100 mL di acqua 1 M di ferro (III) cloruro (FeCl 3). Mettere la schiuma in un pallone e aggiungere 70 ml di FeCl 3 soluzione. Mescolare per tre giorni a temperatura ambiente e cambiare il 3 soluzione di FeCl ogni giorno. Prima di ogni cambiamento, mescolare la schiuma con acqua ionizzata per 0,5 h.
NOTA: Il processo di incisione è tipicamente completato dopo tre giorni. Per garantire che il processo di attacco viene completata, effettuare prove di compressione tattili fino schiume ritengono molli. resistenza schiuma per prove di compressione tattili indica la presenza di un modello di metallo residuo. - Sciacquare l'elastschiuma omer con etanolo e posto in un forno sotto vuoto per una notte a 40 ° C.
- Caratterizzare i materiali utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM), calorimetria a scansione differenziale (DSC), prove di compressione meccanica, e analisi gravimetrica termica (TGA) 27.
NOTA: Nel preparare un LCE 3D più idrofila, sostituire lo SBC con LBC (assicurandosi che il LBC contiene anche una porzione LC) seguendo la procedura descritta nel passaggio 7.5.
8. Semina di elastomero Ponteggio a cellule SH-SY5Y neuroblastoma e coltura utilizzando tecniche sterili
- Sterilizzare l'elastomero lavandolo due volte con 1 ml di etanolo al 70%. Eseguire irradiazione UV per 10 minuti e lavare con 1 ml di etanolo al 70%. Risciacquare due volte con 1 ml di acqua sterile e 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Posizionare gli elastomeri in piastre di coltura da 24 pozzetti.
- Preparare terreno di coltura cellulare per SH-SY5Y contenente il 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplemENTED con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (Pen-Strep).
- Dopo contando le cellule utilizzando un hematocytometer, preparare 1,5 x 10 5 cellule SH-SY5Y sospesi in 100 ml di mezzo di crescita (soluzione seme). Aggiungere la soluzione sulla parte superiore degli elastomeri, avendo cura di formare una goccia.
- Incubare le elastomeri seminati a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 h per favorire l'adesione delle cellule. Aggiungere 0,5 ml di terreno di coltura. Incubare nuovamente a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Cambiare il mezzo di ogni altro giorno dopo il lavaggio con 1 ml di PBS.
9. Imaging microscopico di elastomero Construct
- Fissare le cellule cresciute su elastomeri con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 min. Risciacquare con 3 mL di PBS tre volte per 5 minuti ciascuno e posizionare l'elastomero con le cellule fissate in un piatto di coltura con un coprioggetto allegata.
Attenzione: PFA è tossico. Indossare indumenti di protezione adeguati (DPI). - Stanei campioni fisse con 0,1% di 4' , 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in 500 ml di PBS per 10 minuti e risciacquare due volte con 1 ml di PBS per 5 min.
- Immediatamente immagine elastomeri usando la microscopia confocale a fluorescenza con DAPI, acquisendo pile di immagini che abbracciano il campione.
NOTA: Qui, pile di immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo 20X e un obiettivo 60X. - Analizzare le pile di immagini confocale ottico utilizzando ImageJ 32.
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Representative Results
Questo rapporto mostra il metodo di preparazione di un LCE 3D poroso come impalcatura per la coltura cellulare utilizzando un modello di nichel metallico. Il ottenuto 3D LCE dimostra una complessa rete di canali interconnessi che permette una facile infiltrazione di cellule, così come più adatto trasporto di massa 27. Si è constatato che le cellule sono in grado di penetrare completamente la rete di canali interconnessi e sono anche in grado di allineare all'interno LCE. Qui, una schiuma metallica nichel (99% Ni, densità 860 g / cm 2) è stato selezionato seguendo un approccio simile alla preparazione di schiuma grafene precedentemente riportata da Kung et al. 22. La schiuma polimerica metallo è stato colato, con tutti i puntoni di metallo completamente coperti. La selezione della dimensione schiuma metallica e la densità è importante, in quanto conferisce la morfologia finale della LCE e può aiutare nel riprodurre nell'ambiente tessuto di interesse.
D, lattide L- (Figura 2). Il prodotto finale è un idrofobo SBC 3-braccio. SBC a 4 e 6 bracci, realizzati sostituendo il nodo glicerolo con pentaeritrite e dipentaeritritolo, rispettivamente, sono stati precedentemente riportati 18. Per uno SBC più idrofila, il nodo centrale è stato sostituito con ossido oligoethylene (vedi note di protocollo). Tuttavia, sostituendo glicerolo con risultati ossido oligoethylene in un copolimero a blocchi lineare 27. Abbiamo usato una sintesi modificata da Younes et al. 29. La versione modificata consente l'utilizzo di un ε-ca modificatoprolactone con un gruppo alogeno in due posizioni differenti, alfa e gamma al carbonile 6. Una volta che la SBC è formata, il blocco ε-caprolattone modificato subisce uno spostamento dell'atomo di alogeno con un gruppo azide. Lo spostamento del gruppo alogeno dal gruppo azide è confermata dalla comparsa di oltre 2100 cm - 1 banda mediante riflettanza totale attenuata (ATR) FT-IR (figura 3). Il gruppo azide viene successivamente utilizzato per collegare in modo covalente porzione LC (colesteril hexynoate) per il copolimero a blocchi stella utilizzando alchino-azide reazione di cicloaddizione di Huisgen (noto anche come "click reazione"), ottenendo il copolimero a blocchi stella finale con un lato unità ciondolo colesterolo, catenelle (SBC-Chol). La formazione dell'anello triazolico è confermato dalla scomparsa della 2100 cm - 1 fascia e la comparsa di un singoletto osservata a 7,30 ppm negli spettri 1 H NMR (vedere Figura3). Abbiamo recentemente riportato l'effetto del posizionamento di un gruppo alogeno o alfa (α Br) o gamma (γ-Cl) al carbonile sul funzionalizzato ε -CL 6. Va notato che la sostituzione del nodo centrale nei copolimeri SBC con 4 bracci e 6-braccio nuclei centrali ha un effetto sulle proprietà meccaniche dei LCEs ottenuti perché i nodi centrali servono come iniziatori e intrinseche reticolanti 18 .
Una volta che lo SBC-Chol è stato preparato e completamente caratterizzati, il processo di reticolazione utilizzando un modello di metallo è l'ultimo passo per la preparazione di schiuma. L'SBC-Chol è stato miscelato con esametilendiisocianato (HDI, reticolante), ε-caprolattone, e Sn (oct) 2 (ROP catalizzatore, vedere la fase 7.1). Bis-caprolattone (BCP) reticolante è stato sostituito con HDI, come precedentemente riportato. La schiuma metallo viene tagliato e sagomato al f desiderataorm (Figura 4). Due percorsi per la preparazione di schiuma, cioè la porosità primaria (LCEF PP) e porosità primario / secondario (LCEF P + SP), sono stati precedentemente riportati. Qui, il LCEF P + SP, oppure "dipping", metodo, viene presentata, in cui il modello di nichel è rapidamente immersa nella miscela di polimeri. La schiuma metallica è inserito all'interno di un contenitore in foglio di alluminio o una fiala di scintillazione contenente la miscela polimerica, con tutti i puntoni metallo completamente immersi nella miscela polimerica. La miscela polimerica eccesso viene accuratamente rimosso. Questo modello nichel polimero rivestito viene posto durante la notte, ancora all'interno del contenitore, in un forno a 80 ° C. La reticolazione viene effettuata in presenza del catalizzatore per circa 2 ore. Dopo il processo di reticolazione, il modello nichel polimero rivestito viene rimosso dal contenitore staccando il foglio di alluminio o rottura del contenitore di vetro. L'eccesso di polimero viene accuratamente rasato dal templ nichel polimero rivestitomangiato per esporre i bordi del modello nichel e posto all'interno di un contenitore con una soluzione satura di FeCl 3 (figura 5). Dopo alcune ore, il nichel è quasi completamente rimosso, e solo la schiuma LCE viene risciacquata con (DI) acqua deionizzata per eliminare la soluzione di nichel / FeCl 3. La schiuma LCE viene nuovamente collocato all'interno di un contenitore con una soluzione satura FeCl 3 e risciacquata con acqua deionizzata altre due volte. Dopo il processo di attacco è completo e l'intero modello nichel viene completamente eliminata, la schiuma LCE mostra una rete interconnessa con canale puntoni incavati (Figura 6). La figura 6 mostra la morfologia schiuma LCE interna osservato mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). I puntoni schiuma LCE sono cave, e la morfologia regolare complessiva è subordinato il modello spugna di nickel.
In precedenza, l'uso di BCP richiesto diversi passaggi per mantenere in soluzione (cioè fuso), perché BCP inizia a ricristallizzare appena la soluzione si raffredda di alcuni gradi (da 140 ° C a temperatura ambiente per aggiungere l'Sn (ottobre) 2; vedi punto 7.1). Questo rende la manipolazione della miscela schiuma metallica e polimerica sfidando prima reticolazione. L'uso di HDI come reticolante consentito per un tempo di reticolazione più veloce di quando si utilizza BCP. BCP è un solido a temperatura ambiente, con un punto di fusione 140 ° C, mentre HDI è un liquido a temperatura ambiente. La scelta di reticolanti influenza direttamente il tempo di preparazione e, come nel nostro caso, ridotta la temperatura di reticolazione da 140 a 80 ° C, riducendo anche la preparazione elastomero.
Le schiume LCE sono stati testati utilizzando la compressione-deformazione (Film 1). Una riduzione del 70% in termini di dimensioni LCE si osserva, senza alcun effetto sulla ingombri. Al rilascio della compressione dalla LCE, recupera pienamente la sua s originaleHAPE e dimensione. Si ritiene che la presenza delle porzioni cristalli liquidi nel materiale LCE è critica, come elastomeri preparati nelle stesse condizioni senza il blocco caprolattone ε colesterolo non recuperare la loro forma originale e compressi in sé.
Una volta schiume LCE sono stati ottenuti, erano pronti per essere seminati con neuroblastomi (SH-SY5Y) utilizzando tecniche standard di coltura cellulare. schiume LCE state lavate due volte in 70% di etanolo e risciacquati tre volte con PBS prima di semina delle cellule. Entro 2-3 giorni di semina delle cellule, sono state osservate le cellule per attaccare alle pareti della rete LCE 3D. Per studiare completamente l'adesione cellulare e l'espansione all'interno della rete LCE, le cellule sono state fissate dopo 30 giorni (Figura 7). Le cellule sono state fissate, macchiato con DAPI, e ripreso con la microscopia confocale. Le cellule sono risultate sono moltiplicate, attaccato, e ampliato per coprire ampiamente rete scaffold 3D LCE. Ulteriorepiù, un'analisi dettagliata rivelato allungamento nuclei delle cellule, che nella maggior parte dei casi non è stata influenzata da tratti curvi della rete scaffold 3D LCE. Cellule allungamento può anche essere correlata allineamento delle celle ed è probabilmente il risultato della smettica-A caratteristica di fase della LCE presentato. Ciò è stato già osservato in C2C12 cellule coltivate dopo 14 giorni 27. In questo studio, abbiamo dimostrato che le cellule continuano a proliferare per più di 14 giorni; questo non è limitato alle sole cellule C2C12. L'uso delle schiume LCE può essere espansa a quasi qualsiasi linea cellulare. Le cellule che crescono su 3D LCE impalcature di schiuma come beneficiare di una maggiore efficienza del trasporto di massa rispetto ai ponteggi 2D. In ponteggi 2D, le cellule crescono di solito in strati, uno sopra l'altro. Le cellule che crescono sugli strati superiori sono gli unici che hanno pieno accesso a tutte le sostanze nutritive, gas, e la rimozione dei rifiuti (trasporto di massa). Cellule entro gli strati inferiori sono in grado di accedere nutrienti, e v'è un livello di cella death in questo caso. Da scaffold 3D, cellule hanno un più efficiente (rispetto ai ponteggi 2D) accesso ai nutrienti, fattori di crescita, e gas, permettendo studi su cellule e la rigenerazione dei tessuti a lungo termine. la gestione dei rifiuti delle cellule (rimozione dei rifiuti) utilizzando i 3D LCE ponteggi schiuma-come è anche più efficace rispetto ai ponteggi 2D. La porosità (e / o di altre proprietà strutturali) delle LCEs permette di trasporto rapido di massa e aumento di carico cellulare rispetto a meno porosi (o altri) matrici, mezzi che consentono e accesso cellulare alle regioni centrali della matrice. Questa piattaforma LCE è regolabile per sostenere la crescita di molti tipi di linee cellulari primarie e fotografati, compresi muscoli, nervi e pelle, tra gli altri, nonché sistemi di coltura multicellulari. Essenzialmente, questo è uno dei vantaggi della piattaforma, poiché può essere usato per coltivare diversi tipi di cellule e sistemi per periodi prolungati. Inoltre, la capacità di crescere più strati di cellule nel costrutto più strettamente emulambienti naturali ates.
Figura 1: Procedura generale descrive la preparazione passo-passo e caratterizzazione delle schiume LCE. Vedere la sezione protocollo per i dettagli. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: schema reticolazione di 3-braccio SBC. è mostrato lo schema di reticolazione del SBC 3 bracci utilizzando biscaprolactone o HDI come reticolanti in presenza di un modello nichel metallico per la preparazione di LCEs schiuma-like. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figuri.
Figura 3: Schema di 1,2,3-triazolo formazione (buon "click" reazione) seguito da 1 H NMR e FT-IR. Lo spostamento del gruppo alogeno dal gruppo azide è confermata dalla comparsa di oltre 2100 cm - 1 banda mediante riflettanza totale attenuata (ATR) FT-IR. La formazione dell'anello triazolico è confermato dalla scomparsa della 2100 cm - 1 fascia e la comparsa di un singoletto, osservato a 7.30 ppm negli spettri 1 H NMR. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini ottichedi varie forme di schiuma prima reticolazione. La schiuma metallo viene tagliato e sagomato alla forma desiderabile, come mostrato. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: schiuma Nickel prima (A) e dopo (B) reticolazione. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: LCE schiuma morfologia osservato mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Immagini rappresentative SEM di schiume LCE su SBC-based (A e B) e basata LBC (c d) utilizzando Ni-860 come modello di metallo. Le frecce indicano puntoni scavate. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: confocale micrografie visualizzazione nuclei DAPI-macchiati di cellule SH-SY5Y allegate alla schiuma elastomero 30 giorni dopo la semina. Immagini 2D sono accatastate in z-direzione, e le immagini di sezione del xz - e -planes yz stati creati. Le immagini mostrano che le cellule SH-SY5Y (punti luminosi) attaccate e espanse all'interno delle pareti dei canali vuoti nella schiuma elastomero. Le cellule spazialmente espanse in più strati ed estese oltre 100 um attraverso il costrutto (come mostrato nella xz - e immagine -Plane yz sec crocezioni). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1: le immagini video della deformazione e recupero di un rotolo di LCE. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
elastomeri liquido cristallini sono stati recentemente studiati come scaffold cellulari biocompatibili a causa della loro reattività stimoli. Essi hanno dimostrato di essere le piattaforme ideali come ponteggi cellulari. Tuttavia, un fattore importante da tenere a mente durante la preparazione e la progettazione di un nuovo scaffold LCE è la porosità. L'incorporazione di solidi lisciviabili 23 o gas non sempre comporta porosità omogenea o pori completamente interconnessi. L'uso di un modello di metallo che può essere inciso partenza non solo offre la possibilità di avere una struttura interna più organizzata e regolare, ma anche permette la selezione delle dimensioni dei pori e la densità. Questo è direttamente correlato al modello metallo precedentemente utilizzato per la preparazione di schiume grafene 22. forme in metallo forniscono anche la possibilità di formare figure prima LCE reticolazione, permettendo una vasta gamma di possibilità per creare architetture sofisticate e complesse con regolare porosità defirmato per assomigliare da vicino gli ambienti endogeni. LCEs schiuma preparati usando questa metodologia consentire la migliore studio di materiale cellulare e, soprattutto, spaziali interazioni cellula-cellula, caratteristica che non possibile all'interno di ambienti bidimensionali (2D). ponteggi cellulari 2D non consentono alle cellule di interagire liberamente con le cellule vicine. Inoltre, le cellule crescono tipicamente in monostrati (o direttamente su uno sopra l'altro), senza un pieno accesso allo spazio per la crescita e, soprattutto, per l'interazione. tipi di cellule che interagiscono spazialmente specifici, come i neuroni e cellule gliali, sono di fondamentale importanza nella progettazione di costrutti come potenziali impianti o piattaforme sperimentali a lungo termine destinati a rispecchiare sistemi viventi.
Il nostro modulare, sintesi LCE senza solvente utilizzando un modello di metallo, qui presentato, aiuta regolare adesione cellulare sintonizzando l'equilibrio idrofobo / idrofilo scegliendo il nodo centrale corretta e il rapporto di monomeri 7
Le limitazioni di questo protocollo sono: (1) la limitata varietà di metalli disponibili in commercio (nichel) schiume e loro limitata gamma di dimensioni puntone, (2) larequisito che LCE o qualsiasi altro materiale polimero / elastomero devono resistere chimicamente le condizioni della etch metallo (qui, un FeCl 3 etch), e (3) il fatto che l'allineamento delle cellule sembra essere limitato agli elastomeri cristalli modificato liquidi registrati qui (il genitore elastomeri non LCE non hanno mostrato alcun allineamento delle cellule apprezzabile).
In conclusione, è stato precedentemente dimostrato che LCEs SMA possono essere preparati usando la procedura di sintesi modulare. Ulteriori porzioni LC biocompatibili possono essere incorporati per esplorare le loro proprietà meccaniche e nuovi effetti cristallini liquidi sulla proliferazione cellulare e, in particolare, l'allineamento delle cellule. È noto che le proprietà meccaniche, in particolare i valori di moduli di Young, sono fondamentali per l'adesione cellulare, la proliferazione e l'allineamento delle cellule. I risultati qui dimostrano che la porosità del LCEs SMA può essere sintonizzato attraverso l'uso di un modello di metallo per fornire un modo efficace per controllare la dimensione dei pori e di adeguare il LCEforma (morfologia cioè complessiva). Immergendo il modello Ni nella miscela polimerica SCB, seguita da attacco del modello Ni fornisce un metodo facile per i nuovi morfologie LCE. I LCEs schiuma-come qui descritte forniscono cellule (qui, SH-SY5Y, un modello di cella standard per studiare la funzione neuronale) con un ambiente 3D più realistico per la crescita e l'interazione. Consentire più tipi di cellule di crescere in strati multipli sparsi l'elastomero imita da vicino gli ambienti neurali endogene e offre la possibilità intrigante di più sofisticati esperimenti di coltura tissutale in 3D. L'uso di LCEs sintonizzabili e dinamiche per simulare architetture native apre la strada a modelli cellulari di nuova generazione per studi su cellule longitudinali e clinicamente rilevanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Kent State University (assegno di ricerca in collaborazione e il supporto per la Medicina Rigenerativa iniziativa alla Kent State - ReMedIKS) per il sostegno finanziario di questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper(I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
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