Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese av Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stillas for 3D Spatial cellekulturer

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55452
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 3, 3, 1
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Summary

Denne studien viser en metode for å fremstille 3D, biologisk nedbrytbare, skumlignende cellestillasene basert på biokompatible sidekjede flytende krystall-elastomerer (LCEs). Konfokalmikroskopi forsøk viser at skumlignende LCEs at cellene skulle feste, proliferasjon, og den spontane innretting av C2C12s myoblaster.

Abstract

Her presenterer vi en trinn-for-trinn fremstillingen av en 3D, bionedbrytbar, skumlignende celle stillaset. Disse stillaser ble fremstilt ved tverrbinding av stjerne-blokk-kopolymerer Med kolesterolheter som sidekjede utstikkende grupper, noe som resulterer i smektisk A-(SMA) med flytende krystall-elastomer (LCEs). Skumlignende stillaser, fremstilt ved anvendelse av metallrammer, har innbyrdes forbundne mikrokanaler, noe som gjør dem egnet som 3D-cellekultur stillaser. De kombinerte egenskapene til den vanlige struktur av metallskum og av elastomeren resultat i et 3D-celle stillas som fremmer ikke bare høyere celleproliferasjon sammenlignet med konvensjonelle porøse malbasert filmer, men også bedre styring av massetransport (dvs. næringsstoffer, gasser, avfalls , etc.). Naturen av metall malen gir en enkel manipulering av skum former (dvs. ruller eller filmer) og for fremstilling av stillaser med forskjellige porestørrelser for forskjellige cellestudier og samtidig bevare interconnected porøse natur av malen. Etseprosessen har ingen innvirkning på kjemien av elastomerene, bevare deres biokompatible og biologisk nedbrytbare natur. Vi viser at disse smektiske LCEs, når dyrket for omfattende tidsperioder, aktiverer studier av klinisk relevante og komplekse vev konstruerer mens fremme vekst og spredning av celler.

Introduction

Det er flere eksempler på biologiske og biokompatible syntetiske materialer beregnet for anvendelse i cellestudier og for vevsregenerering sikte på celleadhesjon og celleformering 1, 2, 3, 4, 5. Det har vært noen få eksempler på biokompatible materialer, kjent som flytende krystall elastomerer (LCEs), som kan reagere på ytre stimuli med anisotropisk molekyl bestilling 6, 7. LCEs er stimuli-responsive materialer som kombinerer mekaniske og elastiske egenskaper for elastomerer med optisk funksjonalitet og molekyl ordning av flytende krystaller 8, 9. LCEs kan oppleve endringer i form, mekanisk deformasjon, elastisk oppførsel, og optiske egenskaper som respons på ytre stimuli (f.eks., varme, stress, lys, etc.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Tidligere studier har vist at flytende krystaller (LCS) kan ane vekst og orientering av celler 4, 17. Det er mulig deretter å anta at LCEs kan være egnet for biologisk og medisinsk relevant applikasjoner, inkludert celle stillas og innretting. Vi har tidligere rapportert fremstillingen av smektiske biokompatible, bionedbrytbare, cast-formete, og tynne LCEs filmer med en "Swiss-ostetype" porøs morfologi 6, 18. Vi har også fremstilt nematiske biokompatible LCEs med kuleformede morfologi som stillas for cellevekst 19 <sup> 20. Vårt arbeid var rettet mot tuning de mekaniske egenskapene til materialer for å matche de av vevet av interesse 21. Også disse studier fokuserer på å forstå elastomer-celleinteraksjoner, så vel som den cellulære reaksjonen når elastomerene er utsatt for eksterne stimuli.

De største utfordringene ble delvis å skreddersy porøsiteten til LCEs for å gi rom for cellebinding og gjennomtrengning gjennom det elastomere matrise og for bedre massetransport. Porøsiteten av disse tynne filmer 6 er tillatt for cellegjennomtrengning gjennom hoveddelen av matrisen, men ikke alle porer var fullstendig innbyrdes forbundet, eller hadde en mer vanlig (homogen) er porestørrelsen. Vi rapporterte på biokompatible nematiske LCE elastomerer med kule morfologi. Disse nematisk elastomerer er tillatt for festing og formering av celler, men porestørrelsen varierte bare 10-30 um, som hindret eller begrenset bruken av disseelastomerer med et bredere utvalg av cellelinjer 19, 20.

Tidligere arbeid av Kung et al. i forbindelse med dannelsen av graphene skum ved anvendelse av en "offer" metall mal viste at det oppnådde graphene Skummet hadde en meget vanlig porøs morfologi bestemt av det valgte metall malen 22. Denne metodikken gir full kontroll av porøsitet og pore størrelse. På samme tid, formbarhet og fleksibilitet av metallet malen muliggjøre dannelse av annen mal former før skumfremstilling. Andre teknikker, slik som materiale utvasking 23, gass sjablonmiddel 24, eller elektro-spunnet fiber 25, 26 har også potensialet for fremstilling av porøse materialer, men de er mer tidkrevende og, i noen tilfeller, er porestørrelsen begrenset til bare noen få mikrometer. skum-lignende 3D LCEs fremstilt ved anvendelse av metall-maler tillate en høyere celle belastning; en forbedret spredning hastighet; co-dyrkning; og, sist men ikke minst, bedre massetransport management (dvs. næringsstoffer, gasser og avfall) sikre full vev utvikling 27. Skum-lignende 3D LCEs synes også å forbedre celle justering; Dette er mest sannsynlig i forhold til de LC anheng avføler cellevekst og celle orientering. Tilstedeværelsen av LC grupper innenfor LCE ser ut til å forbedre celle innretting med hensyn til celle sted inne i LCE stillaset. Celler justeres innenfor avstiverne av LCE, mens ingen klar orientering observeres hvor stiverne går sammen (kryss) 27.

Samlet vår LCE celle stillasgulv som en celle-støttemedium gir muligheter for å justere elastomer morfologi og elastiske egenskaper og for spesifikt å styre innrettingen av (enkelt) celletyper for å skape en ordnet, romlige arrangementer of celler som ligner på levende systemer. Bortsett fra å tilveiebringe et stillas i stand til å støtte og lede langvarig cellevekst og proliferasjon, LCEs også tillate dynamiske eksperimenter, hvor cellen orientering og interaksjoner kan modifiseres på fly.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Følgende trinn for 3D-LCE skumlignende preparat ved hjelp av tre-armet stjerne-blokk-kopolymer er vist i figur 1. For kjernemagnetisk resonans (NMR) karakterisering, er spektrene tatt opp i deuterert kloroform (CDCI3) ved romtemperatur på et Bruker DMX 400 MHz instrument og internt referert rest topper ved 7,26. Fourier transform infrarød (FT-IR) spektra ble registrert med en Bruker Vector 33 FT-IR spektrometer ved anvendelse av attenuert total reflektans. For hvert trinn av den følgende protokollen, er det viktig å bruke passende personlig verneutstyr (PPE).

1. Syntese av α-klor-ε-kaprolakton (monomer) (i henhold til prosedyren i Jerome et al. 28)

  1. Før begynnelsen av syntesen, rense 27 g 3-klorperbenzosyre som følger:
    1. I 800 ml destillert vann, tilsett 1,28 g natrium-fosfat monobasisk monohydrat og 8,24 g dibasisk natriumfosfat-heptahydrat. Juster pH til 7,4 (ved hjelp av natriumhydroksid eller saltsyre) og reserve 30 ml av denne oppløsning; Dette er den bufferoppløsning.
    2. Ved hjelp av en skilletrakt, oppløses 3-klorperbenzosyre i 35 ml dietyleter. Vask den organiske løsning med 10 ml bufferløsning (fremstilt i trinn 1.1.1.). Gjenta vask tre ganger.
    3. Tilsett 3 g natriumsulfat direkte til den organiske løsning; Dette tørkemiddelet absorberer vann fra den organiske oppløsning.
    4. Oppløsningen filtreres for å fjerne tørkemidlet. Konsentrer filtratet under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 850 mbar og 40 ° C.
  2. Oppløse 18,5 g renset 3-klor-perbenzosyre i 150 ml tørr diklormetan ved omrøring i et ultrasonisk bad; Dette tar vanligvis 20 minutter. Plasser løsningen inne i en skilletrakt.
  3. Inne i en to-halset, rundbunnet kolbe,oppløse 13,1 g 2-klorcykloheksanon i 15 ml tørr diklormetan ved anvendelse av en magnetisk rører under nitrogengass. Rør.
  4. Sett på skilletrakt inneholdende 3-klorbenzosyreoppløsning (fra trinn 1,2) til den to-halskolbe i trinn 1.3. Spyl systemet med nitrogengass. Juster åpningen av skilletrakten, slik at klorperbenzosyre løsningen faller dråpevis i 2-klorcykloheksanon-løsning (1 dråpe hvert annet sekund) og fortsett omrøringen av blandingen under nitrogengass i 96 timer.
  5. Avkjøl reaksjonsblandingen til -20 ° C i 1 time for å felle ut den m-klorbenzosyre (m -CBA) biprodukt.
  6. Filtrering av m-klorbenzosyre (m -CBA) og vaske den gjenværende oppløsning med mettede løsninger av natriumtiosulfat, natriumbikarbonat og natriumklorid.
  7. Fjern løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 850 mbar og 40 ° C. Rens det blekgule, viskøse væskerid ved destillasjon under redusert trykk ved 2,3 torr og 96 ° C.
  8. Måle effekten av syntesen ved hjelp av følgende 1 H-NMR-topper. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37 til 4,26 (m, 1H, CH2-O), 4,18 til 4,05 (m, 1 H , CH2-O) og 2,06 til 1,58 (m, 6H, -CH2 -) 6, 27.

2. Syntese av α-Tre-arm stjerne-blokk-kopolymer (SBC-αCl) ved Ringåpning Kopolymerisering (Sharma et al. 6 og Amsden et al. 29)

  1. Før syntese, silanize en 20-ml ampulle ved å fylle den med en 2% (v / v) oppløsning av 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane i toluen og omrøring i omkring 24 timer. Skyll med isopropylalkohol og tørk det ved å plassere den i en ovn ved 140 ° C i 30 min.
  2. Legg 30,64 g destillert ε-kaprolakton, 0,5 g α-klor-ε-kaprolakton, og 0,25 ml glycerol til ampullen. Bland ved hjelp av en vortex i 1 min.
  3. Legg 4,90 g D, L -lactide til ampullen og rense det med nitrogen. Plasser ampullen i en ovn ved 120 ° C for å smelte D, L -lactide; Dette tar vanligvis ca. 2 timer. Bland igjen ved hjelp av en hvirvel for å sikre at hele innholdet er godt blandet og tilsett 66 ul tinn (II) -2-etylheksanoat (Sn (Oct) 2) til ampullen.
    MERK: D, vil L -lactide kjøle seg ned i løpet av denne prosessen og må re-varmet i ovnen for å smelte.
  4. Kraftig blande en siste gang anvendelse av en hvirvelfri og spyle med nitrogen.
  5. Lukke ampullen med en gummipropp. Plassere en nål forbundet med en vakuumrøret (huset vakuum er vanligvis nok) gjennom gummiproppen. Slå på vakuum og, ved hjelp av en flamme, smelte lang hals av glasset, vridning langsomt til glass kollapser på seg selv. Vær nøye med å ikke smelte gummiproppen. Når ampullen er flamme-forsegles, plassere den i et sandbad, en ovn eller passende varmeelement ved 140 ° C i 48 timer.
  6. Ta ut ampullen og la den avkjøles i romtemperatur.
  7. Bryte ampullen ved den forseglede mark og oppløse den høyviskøse væske ved å tilsette 10 ml diklormetan. Overfør løsningen til en skilletrakt.
  8. Fremstill en kolbe inneholdende 100 ml kald metanol (avkjølt ved å anvende et tørt is / aceton-bad ved en temperatur rundt -78 ° C). Feste skilletrakten (trinn 2.7) på toppen av kolben. Juster åpningen av skilletrakten, slik at omtrent to dråper falle hvert annet sekund (dråpevis).
  9. Oppsaml det hvite bunnfallet ved filtrering (ved hjelp av et papirfilter), og tørke den i en vakuum-ovn mellom 50 og 60 ° C.
  10. Måle effekten av syntesen ved hjelp av følgende 1H NMR og FT-IR-topper. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, Δ [ppm]): 5,29 til 5,03 (m, COC H C H 3), 4,43-4,25 (m, CH Cl), 4,24 til 4,12 (m, CH2-O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, CH2-O), 3,80 til 3,68 (m, CH CH2), 3,09 til 2,64 (bred, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H), og 1,77 til 1,25 (m, CH2, CH3); FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2,932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, og 735 (m) 6, 27.
    Merk: For å fremstille en mer hydrofil 3D LCE, fremstille en lineær blokk-kopolymer (LBC) i stedet for en SBC, som følge av ringåpnings kopolymerisasjonen (ROP) fremgangsmåten beskrevet ovenfor.
    1. Legg 0,3 g polyetylenglykol (PEG), 3,15 g ε-kaprolakton, 1,0 g α-klor-ε-kaprolakton og 5,0 g D, L-laktid og den silaniserte ampullen blandingen.

    3. Syntetisk Modifikasjon av α-Cl-Three Arm SBC til αN 3-Tre Arm SBC SBC (-αN 3) (i henhold til Sharma et al. 6)

    1. I en rundbunnet kolbe og under nitrogen, oppløse 5 g av SBC-αCl i 30 ml tørt N, N'-dimetylformamid.
    2. Legg 0,22 g natriumazid og tillates å reagere natten over ved romtemperatur.
      Forsiktig: Natriumazid er giftig; bruke passende personlig verneutstyr (PPE).
    3. Fjerne N, N'-dimetylformamid under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 11 mbar og 40 ° C. Oppløs blandingen i 30 ml toluen. Sentrifuger oppløsningen tre ganger ved 2800 xg i 15 minutter for å fjerne det salt som dannes. Fordamp toluen under redusert trykk ved anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 77 mbar og 40 ° C.
    4. Måle effekten av azidet substitusjon ved hjelp av 1H NMR og FT-IR-topper.
      MERK: [cm-1]): 2,928, 2,108 (s, azid), 1754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), og 696 (m).

    4. Syntese av Cholesteryl 5-heksynoat (LC-andel) (i henhold til Sharma et al. 6 og Donaldson et al. 30)

    1. I en rundbunnet kolbe, bland 3 g 5-heksynsyre og 130 ml diklormetan. Avkjøl til 0 ° C ved anvendelse av et isbad.
    2. I en annen rundbunnet kolbe, bland 8,28 g N, N'-dicykloheksylkarbodiimid, 10,3 g av kolesterol, og 0,2 g 4-dimetylaminopyridin.
    3. Overfør 5-heksynsyre løsning dråpevis til kolben inneholdende kolesterol blandingen og opprettholde den sluttelige blanding ved 0 ° C i 1 time.
    4. La blandingen varmes opp til romtemperatur over natten. Fjern det resulterende dicykloheksylurea bunnfall ved filtrering under anvendelse av en klasse 415 papirfilter og kast den.
    5. Konsentrer filtratet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 850 mbar og 40 ° C. Oppløs residuet samlet opp i 150 ml heksan.
    6. Fordamp løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 335 mbar og 40 ° C. Legg 350 ml etanol til den oljeaktige rest for å samle det endelige produkt. Vask den off-white fast stoff ble dannet med etanol og tørker det faste produktet under vakuum ved 50 ° C.
    7. Overvåk syntesen ved hjelp av følgende 1H NMR og FT-IR-topper. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, CH = C), 4,70 til 4,58 (m, 1H, CHOCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2 H, CH2 CO), 2,34 (m, 2H, CH2-CH =), 2,31 (m, 2H, CH2-CH2-COO), 2,28 (s, 1H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H2), 2,07 til 1,06 (m, 2H, CH2, CH), 0,94 (s, 3 H, CH3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3 H, CH3 CH), og 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH3-CH), 0,67 (s, 3H, CH3). FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2,830-2,990 (bred og sterk topp), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (e), og 667 (s).

    5. Syntetisk Modifikasjon av α-N3-Tre Arm SBC til a-Cholesteryl-Three Arm SBC SBC (-αCLC) via et azid-alkyn Huisgen Cyclo-addisjonsreaksjon ( "klikk" reaksjon) for å få SBC-Chol (Ifølge Sharma et al. 6)

    1. I en rundbunnet kolbe, oppløse en molar ekvivalent av SBC-αN 3 (1,5 g) i 100 ml nylig destillert tetrahydrofuran (THF). Tilsett 1,2 molar ekvivalentt av kolesteryl-5-heksynoat (1,94 g), 0,1 molar ekvivalent av kobber (I) jodid (0,06 g) og 0,1 molar ekvivalent av trietylamin (0,03 g). Omrør blandingen over natten ved 35 ° C under nitrogen.
    2. Fordamp løsningsmidlet under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 357 mbar og 40 ° C.
    3. Oppløs restblandingen i 80 ml diklormetan og sentrifuger i 5 minutter ved 2800 xg ved romtemperatur for å fjerne ikke-omsatte materialer og biprodukter.
    4. Overvåk syntesen ved hjelp av følgende 1H NMR og FT-IR-topper. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazol), 5,43 til 5,34 (m, C = CH-kolesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, O-CH-kolesterol), 4,24 til 4,19 (m, CH2-O), 4,18 til 4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH2-O), 4,11 til 4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47 til 2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH 2), 2,31 til 2,25 (m, COCH2), 2,07 til 1,02 (m, CH2 CH3), 1,05 til 1,03 (s, CH2, CH3), 0,96 til 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH2, CH3), 0,91 til 0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH3), og 0,71 til 0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm-1]): 3,260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (e), og 668 (s).

    6. Syntese av 2,2-bis (1-kaprolakton-4-yl) propan (Kryssbindingsmiddel, BCP) (i henhold til Gao et al. 27 og Albertsson et al. 31)

    1. I en rundbunnet kolbe, en oppløsning inneholdende 10,8 g 2-bis (4-hydroksycykloheksyl) propan og 52 ml eddiksyre.
    2. Fremstill en løsning inneholdende 11 g kromtrioksyd i 50 ml eddiksyre og 8 ml destillert vann. Til denne løsning tilsettes dråpevis til løsningen fremstilt i trinn 6.1 under opprettholdelse av blandingens temperatur mellom 17 og 20 ° C (for eksempel i envann bad); Dette dråpevis prosessen tar 2 timer. Når prosessen er fullført, tillat oppløsningen å omrøres i ca. 30 min.
    3. Tilsett 50 ml av 2-propanol. Oppløsningen omrøres over natten ved romtemperatur.
    4. Konsentrer den mørke purpur oppløsningen under redusert trykk under anvendelse av en rotasjonsfordamper ved 137 mbar og 40 ° C. Legg 300 ml destillert vann for å felle ut; bunnfallet bør være lys lilla.
    5. Filtratet det rå produkt ved bruk av en klasse 415 papirfilter. Vask det faste materiale med ~ 250 ml med destillert vann, eller inntil det faste stoff blir hvit.
    6. Oppløs det faste materiale i 15 ml benzen ved 40 ° C og lar det krystallisere ved 25 ° C.
    7. Legg 8,34 g tørr diketon oppløst i tørr diklormetan, og en oppløsning inneholdende 6,0 g 3-klorperbenzosyre i 75 ml diklormetan til kolben.
    8. Tilbakeløpskokning løsningen ved 40 ° C i 24 timer.
    9. Avkjøl reaksjonsblandingen til -20 ° C i 10 minutter for å utfelle m
    10. Fjerne m-klorbenzosyre ved filtrering (ved hjelp av et papirfilter) og konsentrer løsningen under redusert trykk.
    11. Vask det viskose råprodukt med 200 ml 2-heptanon og bunnfallet tørkes under vakuum ved 50 ° C over natten.
    12. Overvåk syntesen ved hjelp av følgende 1H NMR og FT-IR-topper. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,42 til 4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, CH2-OC = O), 4,21 til 4,15 (t, 2H, J = 11.3 Hz, CH2-OC = O), 2,80 til 2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2 H, CH2 COO), 2.63-2.57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, CH 2 COO), 2,04 til 1,93 (m, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1,70 til 1,56 (m, 4H, -C H 2 CH2 COO), 1,48 til 1,38 (m, 2H, - C H C (CH3) 2), og 0,84 (s, 6H, CH3 C-).
      13. 7. Opprettelse av porøse 3D Elastomer Stillas enten ved hjelp av heksametylendiisocyanat (HDI) eller 2,2-bis (1-kaprolakton-4-yl) propan (BCP) 27 som tverrbindingsmidler (i henhold til Gao et al. 27)

      1. Tilberede tre-arm elastomer blanding ved anvendelse av 0,75 g av SBC-αCLC ved å tilsette 0,25 ml av HDI (eller 0,45 ml av BCP) og 0,24 ml destillert ε-kaprolakton-monomer. Legg 60 ul av Sn (oktober) 2. Ved anvendelse av BCP istedenfor HDI, blande SBC-αCLC og BCP ved hjelp av en vortex og plassere dem i en ovn ved 140 ° C inntil BCP helt smelter og oppløses (dette trinnet kan ta opp til 2 timer). Når BCP er blitt oppløst, ta det ut av ovnen og, Sn (Oct) 2, og virvle.
      2. Forberede en "offer" nikkel skum-mal ved å skjære et 1 x 4 cm metallstykke. Rull den fra en av de korte ender, slik at den endelige rullen er omtrent en 1 x 1 cm metallstykke (se figur 4).
        3. <li> Sett nikkel skum i en glassflaske eller aluminiumsfolie pakke og hell blandingen fremstilt i trinn 7.1 til fullt ut dekker skummet i 2 min. Fjerne overflødig blanding med en Pasteur-pipette. La det stå i en ovn over natten ved 80 ° C.
      3. Skrelle av aluminiumsfolie eller bryte glasset. Ved hjelp av et barberblad, barbere elastomeren rundt metallskum for å eksponere den nikkelmetall.
      4. Fremstill en M jern (III) klorid (FeCl3) oppløsning i 100 ml vann. Plasser skum i en kolbe og tilsett 70 ml av FeCl3-oppløsning. Rør i tre dager ved romtemperatur og endre FeCl3 løsning hver dag. Før hver endring, rør skummet med ionisert vann i 0,5 timer.
        MERK: etsning prosessen er vanligvis ferdig etter tre dager. For å sikre at etseprosessen er fullført, utføres taktile trykkprøver inntil skummet føles myke. Skum motstand mot taktile trykkprøver indikerer tilstedeværelsen av en metallrester mal.
      5. Skyll elastomer skum med etanol og sted i en vakuumovn natten over ved 40 ° C.
      6. Karakterisere materialer ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM), differensiell scanning kalorimetri (DSC), mekaniske trykkprøver, og termisk gravimetrisk analyse (TGA) 27.
        NB: For fremstilling av et mer hydrofilt 3D LCE, erstatte SBC med LBC (å sørge for at LBC inneholder også en LC-del) ved å følge fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 7,5.

      8. såing av Elastomer Stillas med SH-SY5Y neuroblastomceller og kultur under anvendelse av sterile teknikker

      1. Steril elastomeren ved å vaske to ganger med 1 ml 70% etanol. Utføre UV-bestråling i 10 minutter og vask med 1 ml 70% etanol. Skyll det to ganger med 1 ml sterilt vann og 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS). Plasser elastomerer i 24-brønners kulturplater.
      2. Forbered cellevekstmedium for SH-SY5Y inneholdende 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kompletteresented med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
      3. Etter telling av celler ved å anvende en hematocytometer, forberede 1,5 x 10 5 SH-SY5Y celler suspendert i 100 ul vekstmedium (seed oppløsning). Legg løsningen på toppen av elastomerer, og pass på å danne en dråpe.
      4. Inkuber podede elastomerer ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer for å fremme celleadhesjon. Tilsett 0,5 ml av vekstmediet. Inkuber igjen ved 37 ° C med 5% CO2.
      5. Endre medium annenhver dag etter vask med 1 ml PBS.

      9. Mikroskopisk Imaging of Elastomer Construct

      1. Fikser cellene dyrket på elastomerer med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 min. Skyll med 3 ml PBS tre ganger i 5 minutter hver, og plasser elastomer med de fikserte cellene i en kulturskål med en tilknyttet dekkglass.
        Forsiktig: PFA er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr (PVU).
      2. Stai de faste prøver med 0,1% av 4' , 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 500 ul PBS i 10 minutter og skylles to ganger med 1 ml PBS i 5 min.
      3. Umiddelbart bilde elastomerene ved hjelp av konfokal mikroskopi med DAPI fluorescens, anskaffe bildestakker som strekker seg over prøven.
        MERK: Her ble bildestakker anskaffet ved hjelp av en 20X objektiv og en 60X objektiv.
      4. Analyser optiske konfokal bildestakker ved hjelp ImageJ 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne rapporten viser fremgangsmåten for fremstilling av en porøs 3D LCE som et stillas for cellekultur ved anvendelse av en nikkel-metall-mal. Den oppnådde 3D LCE viser et komplekst sammenkoplet kanal nettverk som gir mulighet for enkel celleinfiltrasjon, så vel som mer egnet massetransporten 27. Det ble funnet at celler som er i stand til fullt ut trenge inn i det sammenkoplede kanalnettet og er også i stand til å justere innenfor LCE. Her, et metall nikkel skum (99% Ni, densitet på 860 g / cm 2) ble valgt å følge en lignende fremgangsmåte til den graphene skumfremstilling tidligere rapportert av Kung et al. 22. Metallet Skummet ble støpt polymer, med alle metall stag fullstendig dekket. Utvelgelsen av metallskum størrelse og tetthet på er viktig, fordi den gir den endelige morfologi av LCE og kan bidra til å etterligne vevet miljø av interesse.

D, L- laktid (figur 2). Sluttproduktet er en hydrofob 3-arm SBC. SBCer med 4 og 6 armer, laget ved å erstatte glyserol node med pentaerytritol og dipentaerytritol, henholdsvis, har tidligere blitt rapportert 18. For en mer hydrofil SBC, ble sentral node erstattet med oligoetylen oksyd (se protokollen noter). Imidlertid, ved å erstatte glyserol med oligoetylen oksid resulterer i en lineær blokk-kopolymer 27. Vi brukte en modifisert syntese fra Younes et al. 29. Den modifiserte versjon muliggjør anvendelse av en modifisert ε-ca.prolactone med en halogengruppe i to forskjellige stillinger, alfa og gamma-stilling til karbonylgruppen 6. Når SBC er dannet, lider den modifiserte ε-kaprolakton blokk en fortrengning av halogenatomet med en azidgruppe. Forskyvningen av den halogengruppe ved azidgruppen er bekreftet ved utseendet av det 2100-cm - 1 band ved hjelp av svekket total refleksjon (ATR) FT-IR (Figur 3). Azidgruppen blir senere brukt til å kovalent binde LC-delen (kolesteryl heksynoat) til den stjerne-blokk-kopolymer ved anvendelse av alkyn-azid Huisgen s cykloaddisjonsreaksjon (også kjent som et "klikk reaksjon"), hvorved det oppnås den endelige stjerne-blokk-kopolymer med en side -kjeden kolesterol pendant enhet (SBC-Chol). Dannelsen av triazolringen er bekreftet ved forsvinningen av 2100-cm - 1 båndet og tilsynekomst av en singlett ved 7,30 ppm observert i 1H-NMR-spektra (se figur3). Vi har nylig rapportert om effekten av plassering av en halogengruppe enten alfa (α -Br) eller gamma (γ-Cl) til karbonylgruppen på den funksjonaliserte ε -Cl 6. Det bør bemerkes at erstatte den sentrale node i SBC-kopolymerer med 4-arm og 6-arm sentrale kjerner har en virkning på de mekaniske egenskaper for de oppnådde LCEs fordi de sentrale noder tjene både som initiatorer og iboende tverrbindere 18 .

Når SBC-Chol er blitt fremstilt og fullstendig karakterisert, tverrbindingsprosessen ved anvendelse av en metall mal er det siste trinnet for skumfremstilling. SBC-Chol ble blandet med heksametylendiisocyanat (HDI, tverrbindingsmiddel), ε-kaprolakton, og Sn (oktober) 2 (ROP-katalysator, se trinn 7.1). Bis-kaprolakton (BCP) tverrbindingsmiddel ble erstattet med HDI, som tidligere rapportert. Metallskummet er kuttet og formet til den ønskede form (figur 4). To baner for skumfremstilling, nemlig den primære porøsitet (LCEF PP) og primær / sekundær porøsitet (LCEF P + SP), er tidligere blitt rapportert. Her blir LCEF P + SP, eller "dypping" -metoden, presentert, hvor nikkel malen er raskt dyppes i polymerblandingen. Metallskummet er plassert inne i en beholder laget av aluminiumsfolie eller et scintillasjonsglass som inneholdt polymerblandingen, med alle metall avstivere fullstendig nedsenket i polymerblandingen. Overskuddet av polymerblandingen forsiktig fjernet. Denne polymer-dekket nikkel malen er plassert over natten, fremdeles inne i beholderen, i en ovn ved 80 ° C. Tverrbinding utføres i nærvær av katalysatoren i ca. 2 timer. Etter at tverrbindingsprosessen er polymerbelagt nikkel templaten fjernet fra beholderen ved å trekke av aluminiumsfolie eller bryte glassbeholderen. Overskuddet av polymeren omhyggelig barbert fra polymerbelagt nikkel templspiste for å eksponere kantene av nikkel malen og plassert inne i en beholder med en mettet FeCl3-løsning (figur 5). Etter noen timer er nikkel nesten helt fjernet, og bare de LCE skum renses med deionisert (DI) vann for å fjerne nikkel / FeCl3-oppløsning. Den LCE Skummet blir igjen plassert inne i en beholder med en mettet FeCl3-løsning og vasket med DI vann to ganger til. Etter etseprosessen er fullført, og hele nikkel malen er fullstendig eliminert, viser LCE skum et sammenkoplet nettverk kanal med uthulte stag (figur 6). Figur 6 viser den interne LCE skum morfologi observert ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM). De LCE skumstiverne er hul, og den samlede jevn morfologi, er betinget av at nikkel skum-mal.

Tidligere bruk av BCP krevde flere skritt for å holde den i solusjon (dvs. smeltet), fordi BCP begynner å omkrystallisere så snart løsningen kjøles ned ved noen få grader (fra 140 ° C til romtemperatur for å tilsette Sn (oktober) 2; se trinn 7.1). Dette gjør manipulering av metallskum og polymerblandingen utfordrende før tverrbinding. Bruken av HDI som et tverrbindingsmiddel er tillatt for en hurtigere tverrbinding tid enn ved bruk av BCP. BCP er et fast stoff ved romtemperatur, med et smeltepunkt på 140 ° C, mens HDI er en væske ved romtemperatur. Valget av tverrbindingsmidlene påvirker direkte forberedelsestid og, som i vårt tilfelle, reduserte tverrbindingstemperaturen 140 til 80 ° C, også redusere elastomer preparat.

De LCE skum ble testet ved hjelp av kompresjons-deformasjon (Film 1). En 70% reduksjon i LCE størrelse er observert, uten å påvirke totaldimensjoner. Ved frigjøring av kompresjons fra LCE, er det fullt ut gjenvinner sin opprinnelige shape og størrelse. Det antas at tilstedeværelsen av de flytende krystalldelene i LCE materialet er kritisk, som elastomerer fremstilt under de samme betingelser uten kolesterol-ε kaprolakton blokken ikke gjenvinne sin opprinnelige form og kollapset i seg selv.

Når LCE skum ble oppnådd, var de klare til å bli sådd med neuroblastomer (SH-SY5Y) ved bruk av standard cellekulturteknikker. LCE skum ble vasket to ganger i 70% etanol og skylt tre ganger med PBS før celleutsåingen. I løpet av 2-3 dager etter celle utsåing ble cellene observert å feste seg til veggene i 3D-LCE nettverket. For fullt ut å studere cellebinding og ekspansjon innen LCE nettverket ble cellene fiksert etter 30 dager (Figur 7). Celler ble løst, farget med DAPI, og avbildes ved hjelp av konfokal mikroskopi. Cellene ble funnet å ha proliferert, festet, og utvidet til å dekke omfattende 3D-LCE stillaset nettverk. Lengremer, nærmere analyse avslørte cellekjerner forlengelse, som i de fleste tilfeller ikke var påvirket av de buede delene av 3D-LCE stillaset nettverk. Celleforlengelse kan også være korrelert til celle innretting og er mest sannsynlig resultatet av smektisk A-fase som er karakteristisk for den LCE presenteres. Dette ble observert tidligere i C2C12 celler dyrket etter 14 dager 27. I denne studien viser vi at cellene fortsetter å spre seg i mer enn 14 dager, Dette er ikke begrenset til C2C12 celler alene. Bruken av LCE skum kan utvides til nesten alle cellelinje. Celler som vokser på 3D LCE skumlignende stillaser benytte seg av høyere massetransporteffektivitet sammenliknet med 2D-stillas. I 2D-stillas, celler vanligvis vokser i lag, på toppen av hverandre. Celler som vokser på de øverste lagene er de eneste som har full tilgang til alle næringsstoffer, gass og søppel (massetransport). Celler i det nedre sjikt er i stand til å få tilgang til næring, og det er en høyere grad av celle dEath i dette tilfellet. Innenfor 3D-stillas, cellene har en mer effektiv (sammenlignet med 2D stillasene) tilgangen på næringsstoffer, vekstfaktorer og gasser, som tillater langtids celle og vevsregenerering studier. Celle avfallshåndtering (fjernelse av avfall) ved bruk av 3D LCE skumlignende stillasene er også mer effektivt enn i de 2D stillaser. Porøsiteten (og / eller andre strukturelle egenskaper) av LCEs muliggjør hurtig massetransport og øket cellelasten i forhold til mindre porøse (eller andre) matriser, slik at medier og cellulær tilgang til sentrale områder av matrisen. Dette LCE plattformen er fleksibel for å understøtte veksten av mange typer av primære og udødeliggjorte cellelinjer, inkludert muskel, nerve, og hud, blant andre, så vel som multi-cellulære dyrkingssystemer. I hovedsak er dette en av fordelene med plattformen, siden det kan brukes til å dyrke mange forskjellige celletyper og systemer for lengre perioder. I tillegg til evnen til å vokse flere lag av celler i konstruksjonen nærmere emulates naturlige miljøer.

Figur 1
Figur 1: Generell prosedyre som beskriver den trinnvise fremstillingen og karakteriseringen av de LCE skum. Se protokollen for detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Tverrbinding ordningen av 3-arm SBC. Tverrbindings ordningen av 3-arm SBC ved hjelp biscaprolactone eller HDI som tverrbindingsmidler i nærvær av en nikkelmetall mal for fremstilling av skumaktige LCEs er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.

Figur 3
Figur 3: Skjema av 1,2,3-triazol-dannelse (vellykkede "klikk" reaksjon), etterfulgt av 1H NMR og FT-IR. Forskyvningen av den halogengruppe ved azidgruppen er bekreftet ved utseendet av det 2100-cm - 1 band ved hjelp av svekket total refleksjon (ATR) FT-IR. Dannelsen av triazolringen er bekreftet ved forsvinningen av 2100-cm - 1 båndet og tilsynekomst av en singlett, observert ved 7,30 ppm i 1H-NMR-spektra. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Optiske bilderav forskjellige skum former før tverrbinding. Metallskummet er kuttet og formet til den ønskede formen, som vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Nikkel skum før (A) og etter (B) tverrbinding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: LCE skum morfologi observert ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (SEM). Representative SEM bilder av LCE skum på SBC-baserte (a og b) og LBC-baserte (c d) elastomerer ved hjelp av Ni-860 som metallet malen er vist. Piler indikerer uthulte struts. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: Confocal mikrografer som viser DAPI-fargede kjerner av SH-SY5Y celler festet til det elastomere skum 30 dager etter såing. 2D-bilder ble stablet i z-retningen, og tverrsnittsbilder i xz - og yz -planes ble opprettet. Bildene viser at SH-SY5Y celler (lyse flekker) festet og ekspanderes innenfor veggene i de hule kanaler i elastomeren skum. Cellene romlig ekspandert inn i flere lag, og strakte seg over 100 pm gjennom mellomproduktet (som vist i xz - og YZ -planet bilde kryss seksjoner). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

film 1
Film 1: Videobilder av deformasjon og gjenvinning av en LCE roll. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flytende krystallinske elastomerer har nylig blitt studert som biokompatible cellestillasene på grunn av deres reaksjonsevne stimuli. De har vist seg å være ideelle plattformer som celle stillaser. Men en viktig faktor å huske på når du forbereder og utforme en ny LCE stillaset er porøsitet. Inkorporeringen av utlutbare faststoffer 23 eller gasser ikke alltid resulterer i homogen porøsitet eller fullstendig innbyrdes forbundet porer. Bruken av et metall mal som kan være etset seg ikke bare tilbyr muligheten til å ha en mer organisert og regelmessig intern struktur, men også gir mulighet for valg av pore størrelse og tetthet. Dette er direkte relatert til den metallsjablong tidligere anvendt for fremstilling av skum graphene 22. Metal maler gir også mulighet til å danne figurer før LCE kryssbinding, tillater et stort utvalg av muligheter til å lage avanserte og komplekse arkitekturer med regelmessig porøsitet detegnet skal ligne endogene miljøer. Skum LCEs fremstilt ved anvendelse av denne metoden tillater den forbedrede studier av cellemateriale og, enda viktigere, romlige celle-celleinteraksjoner, en prestasjon ikke mulig i løpet av to-dimensjonale (2D) miljøer. 2D celle stillaser ikke la cellene til fritt samhandle med nabocellene. I tillegg blir vanligvis dyrket i monolag (eller direkte på toppen av hverandre), uten full tilgang til plass for vekst og, enda viktigere, for interaksjon. Spesifikke romlig samvirkende celletyper, så som neuroner og gliaceller, er av avgjørende betydning ved utforming av konstruksjoner som potensielle implantater eller langtids eksperimentelle plattformer som skal gjenspeile levende systemer.

Vår modulær, løsningsmiddelfritt LCE syntese ved å bruke et metall mal, presenteres her, bidrar til å justere celleadhesjon ved å justere den hydrofobe / hydrofile balanse ved å velge den riktige sentralnode og monomerforhold 7 27. Dette er relevant for celleutsåingen for å unngå en ekstra trinn som omfatter tilsetning av en Matrigel lag, vanligvis gjøres for å fremme cellefesting. Mengden og størrelsen av den sentrale node, så vel som tverrbindingsmiddel, spiller viktige roller i den endelige LCE, da de påvirker de termiske og mekaniske egenskaper av LC elastomerer. I tillegg tillater denne også innstilling av biologisk nedbrytbarhet priser, som presentert tidligere, for å passe til den fullstendige regenerering av vev som LCE degraderer 6. Foreløpig har vi løpende eksperimenter med fokus på å undersøke hvordan den type kryssbinder, sentral kjerne, og erstatning av D, L -lactide for L -lactide påvirker de elastiske egenskaper, celleadhesjon, proliferasjon og cellejustering.

Begrensningene for denne protokollen, er: (1) den begrensede utvalg av kommersielt tilgjengelig metall (nikkel) skum og deres begrensede rekkevidde i strevernes dimensjoner, (2)krav om at LCE eller hvilken som helst annen polymer / elastomer materiale må kjemisk motstå betingelsene for metallet etch (her, en FeCl3 merke), og (3) det faktum at cellen innretting synes å være begrenset til de flytende krystall modifisert elastomerer som er rapportert her (foreldre ikke-LCE elastomerer ikke viste noen nevneverdig celle justering).

Som konklusjon, har det tidligere blitt vist at SMA LCEs kan fremstilles ved anvendelse av vårt modulære synteseprosedyren. Ytterligere biokompatible LC grupper kan inkorporeres for å utforske sine mekaniske egenskaper og nye flytende krystallinske effekter på celleproliferasjon og, spesielt, celle innretting. Det er kjent at mekaniske egenskaper, spesielt Youngs modul- verdier, er kritiske for celleadhesjon, proliferasjon og cellejustering. Resultatene her viser at porøsiteten av SMA LCEs kan være innstilt ved hjelp av en metall mal for å tilveiebringe en effektiv måte for å regulere porestørrelsen og for å skreddersy LCEform (dvs. generelle morfologi). Dypping av Ni mal i SCB polymerblandingen, etterfulgt av etsing av det Ni sjablonen gir en enkel tilnærming for nye LCE morfologi. De skumlignende LCEs som er beskrevet her gir celler (her, SH-SY5Y, en standard celle modell for å studere neuronal funksjon) med en mer realistisk, 3D-miljø for vekst og interaksjon. Slik at flere celletyper å vokse i flere lag spredt over hele elastomer etterligner endogene nevrale miljøer og gir spennende muligheter for mer avanserte 3D vev kultur eksperimenter. Bruken av avstembare og dynamiske LCEs for å etterligne naturlige arkitekturer baner vei for neste generasjons cellemodeller for langsgående og klinisk relevante cellestudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Kent State University (forskningssamarbeid stipend og støtte for Regenerative Medicine Initiative ved Kent State - ReMedIKS) for økonomisk støtte fra dette prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Tags

Bioteknologi Liquid Crystal elastomerer 3D Porøse Stillas Cell Stillas Cell Justering Cell direksjonalitet biokompatible
Syntese av Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stillas for 3D Spatial cellekulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévôt, M. E., Ustunel,… More

Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter