Summary
Denna studie presenterar en metod för att förbereda 3D, bionedbrytbara, skumliknande cell ställningar baserat på biokompatibla sidokedjeegenskaper flytande kristaller elastomerer (LCEs). Konfokalmikroskopi experiment visar att skumliknande LCEs möjliggöra cellvidhäftning, proliferation och den spontana anpassningen av C2C12s myoblaster.
Abstract
Här presenterar vi en steg-för-steg-framställning av en 3D, bionedbrytbar, skumliknande cellbyggnadsställningen. Dessa ställningar framställdes genom tvärbindning av stjärn segmentsampolymerer terar kolesterolheter som sidokedja vidhängande grupper, vilket resulterar i smektisk-A (SmA) flytande elastomerer kristall (LCEs). Skumliknande ställningar, framställes med användning av metallmallar, har med varandra förbundna mikrokanaler, vilket gör dem lämpliga som 3D-cell odlingsställningar. De kombinerade egenskaperna hos den regelbundna strukturen hos metallskum och av elastomer resultatet i en 3D-cellbyggnadsställning som främjar inte bara högre cellproliferation jämfört med konventionella porösa templated filmer, men även en bättre förvaltning av masstransport (dvs näringsämnen, gaser, avfall , etc). Arten av mallen metall möjliggör enkel manipulering av skum former (dvs rullar eller filmer) och för framställning av byggnadsställningar med olika porstorlekar för olika cellstudier samtidigt som interconnected porösa naturen av mallen. Etsningen Processen påverkar inte kemin av elastomerer, bevara deras biokompatibla och bionedbrytbara natur. Vi visar att dessa smekt LCEs, när den odlas under långa tidsperioder, gör det möjligt att studera kliniskt relevanta och komplexa vävnadskonstruktioner och samtidigt främja tillväxt och spridning av celler.
Introduction
Det finns flera exempel på biologiska och biokompatibla syntetiska material avsedda att appliceras i cellstudier och för vävnadsregenerering som syftar till cellvidhäftning och proliferation 1, 2, 3, 4, 5. Det har funnits några exempel på biokompatibla material, kända som flytande kristall-elastomerer (LCEs), som skulle kunna reagera på yttre stimuli med anisotropa molekyl beställning 6, 7. LCEs är stimuli-responsiva material som kombinerar de mekaniska och elastiska egenskaperna hos elastomerer med den optiska funktionalitet och molekyl beställning av vätskekristaller 8, 9. LCEs kan uppleva förändringar i form, mekanisk deformation, elastiskt beteende, och optiska egenskaper som svar på externa stimuli (dvs., värme, stress, ljus, etc.) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Tidigare studier har visat att flytande kristaller (LCS) kan avkänna tillväxt och orientering av celler 4, 17. Är det möjligt att sedan anta att LCEs kan vara lämpliga för biologiskt och medicinskt relevanta tillämpningar, inklusive cell byggnadsställningar och inriktning. Vi har tidigare rapporterat framställningen av smektiska biokompatibla, biologiskt nedbrytbara, gjutna-formade och tunna LCEs filmer presenterar en "Swiss-ost typ" porös morfologi 6, 18. Vi förberedde också nematisk biokompatibla LCEs med klotformiga morfologi som byggnadsställningar för celltillväxt 19 <sup>, 20. Vårt arbete syftade till trimma de mekaniska egenskaperna hos de material för att matcha de vävnaden av intresse 21. Även dessa studier fokuserar på att förstå elastomer-cell interaktioner, samt cellulär respons när elastomerer är föremål för yttre stimuli.
De största utmaningarna var delvis att skräddarsy porositeten hos LCEs för att möjliggöra cellvidhäftning och permeation genom elastomermatrisen och för bättre masstransport. Porositeten hos dessa tunna filmer 6 tillåts för cellgenomträngning genom den största delen av matrisen, men inte alla porer var fullständigt sammankopplade eller hade en mer regelbunden (homogen) porstorlek. Vi rapporterade sedan på biokompatibla nematisk LCE elastomerer med klotformiga morfologier. Dessa nematiska elastomerer tillåts för fastsättning och tillväxt av celler, men porstorleken varierade endast 10-30 um, som förhindras eller begränsat användningen av dessaelastomerer med ett bredare utbud av cellinjer 19, 20.
Tidigare arbete av Kung et al. om bildningen av grafen skum med användning av en "offer" metallmall visade att den erhållna grafen skummet hade en mycket regelbunden porös morfologi dikteras av den valda metallen mallen 22. Denna metod ger full kontroll över porositet och porstorlek. På samma gång, den formbarhet och flexibilitet av mallen metall medge bildning av annan mall former före skumpreparat. Andra tekniker, såsom material urlakning 23, gas schablon 24, eller elektro spunna fibrerna 25, 26 erbjuder även möjligheten för framställning av porösa material, men de är mer tidskrävande och, i vissa fall, är porstorleken begränsad till endast ett fåtal mikrometer. Skum-liknande 3D LCEs ställdes med användning av metallmallar möjliggöra en högre belastningscell; en förbättrad proliferationshastighet; samodling; och sist men inte minst, bättre hantering masstransport (dvs. näringsämnen, gaser och avfall) för att säkerställa full vävnadsutveckling 27. Skumliknande 3D LCEs verkar också för att förbättra cell inriktning; detta är mest sannolikt i förhållande till de LC hängen sensing celltillväxt och cellorienteringen. Närvaron av LC molekyldelar inom LCE synes förstärka cell inriktning med avseende på cell plats inom LCE ställningen. Celler rikta inom stöttorna hos LCE, medan ingen tydlig orientering observeras där stagen förenas (föreningspunkter) 27.
Totalt sett vår LCE cell scaffold plattform som en cellstödmedium erbjuder möjligheter att avstämma elastomer morfologi och elastiska egenskaper och för att specifikt rikta anpassning av (enskilda) celltyper för att skapa en ordnad, rumsliga arrangemang of celler liknande levande system. Bortsett från att tillhandahålla en byggnadsställning som kan upprätthålla och styra långsiktig cellulär tillväxt och proliferation, LCEs tillåter även för dynamiska experiment, där cell orientering och interaktioner kan modifieras på fluga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande steg för 3D LCE skumliknande preparat med användning av 3-armsstjärn segmentsampolymer visas i Figur 1. För kärnmagnetisk resonans (NMR) karakterisering, är de spektra registreras i deutererad kloroform (CDCl 3) vid rumstemperatur på en Bruker DMX 400-MHz-instrument och internt refererade rest toppar vid 7,26. Fouriertransform infraröd (FT-IR) spektra registrerades med användning av en Bruker Vector 33 FT-IR-spektrometer med användning av dämpad total reflektans läge. För varje steg i följande protokoll, är det viktigt att bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE).
1. Syntes av α-kloro-ε-kaprolakton (monomer) (i enlighet med proceduren i Jérôme et al. 28)
- Före början av syntesen, rena 27 g 3-klorperbensoesyra enligt följande:
- I 800 ml destillerat vatten, till 1,28 g natriummonobasiskt monohydrat och 8,24 g natriumfosfat dibasisk heptahydrat. Justera pH till 7,4 (med användning av natriumhydroxid eller klorvätesyra) och reserv 30 ml av denna lösning; detta är buffertlösningen.
- Med användning av en separationstratt, upplösa 3-klorperbensoesyra i 35 ml dietyleter. Tvätta den organiska lösningen med 10 ml av buffertlösning (framställd i steg 1.1.1.). Upprepa tvätta tre gånger.
- Lägg 3 g natriumsulfat direkt till den organiska lösningen; detta torkningsmedel absorberar vatten från den organiska lösningen.
- Filtrera lösningen för att avlägsna torkmedlet. Koncentrera filtratet under reducerat tryck genom användning av en rotationsindunstare vid 850 mbar och 40 ° C.
- Solubilisera 18,5 g renad 3-klorperbensoesyra i 150 ml torr diklormetan genom omrörning i ett ultraljudbad; denna process tar typiskt 20 min. Placera lösningen i en separationstratt.
- Inne i en tvåhalsad, rundbottnad kolv,upplösa 13,1 g av 2-chlorocyclohexanone i 15 ml torr diklormetan under användning av en magnetisk omrörare under kvävgas. Hålla omrörning.
- Passa separationstratt innehållande 3-klorperbensoesyra lösning (från steg 1,2) till två-halsad kolv i steg 1,3. Spola systemet med kvävgas. Justera öppningen av separertratten så att klorperbensoesyra lösningen faller droppvis till 2-chlorocyclohexanone lösning (en droppe varannan sekund) och fortsätt att röra om blandningen under kvävgas under 96 h.
- Kyl reaktionsblandningen till -20 ° C under 1 h för att utfälla m -chlorobenzoic syra (m -CBA) biprodukt.
- Filtrera m -chlorobenzoic syra (m -CBA) och tvätta den återstående lösningen med mättade lösningar av natriumtiosulfat, natriumbikarbonat och natriumklorid.
- Avlägsna lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 850 mbar och 40 ° C. Rena ljusgul, trögflytande LIQUid genom destillation under reducerat tryck vid 2,3 Torr och 96 ° C.
- Övervaka framgången av syntesen med användning av följande 1 H NMR-toppar. 1 H-NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, CH CLCO), 4,37-4,26 (m, 1H, CH 2 O), 4,18-4,05 (m, 1 H , C H 2 O) och 2,06-1,58 (m, 6H, -CH 2 -) 6, 27.
2. Syntes av α-Tre-arm stjärna segmentsampolymer (SBC-αCl) genom ringöppning Sampolymerisation (Sharma et al. 6 och Amsden et al. 29)
- Före syntes, silaniseras en 20-ml ampull genom att fylla den med en 2% (vol / vol) lösning av 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane i toluen och omrörning under ca 24 h. Skölj med isopropylalkohol och torka den genom att placera det i en ugn vid 140 ° C under 30 min.
- Tillsätt 30,64 g destillerad ε-kaprolakton, 0,5 g av α-kloro-ε-kaprolakton, och 0,25 ml glycerol till ampullen. Blanda med användning av en vortex under 1 min.
- Lägga 4,90 g D, L-laktid till ampullen och spola den med kväve. Placera ampullen i en ugn vid 120 ° C för att smälta D, L-laktid; denna process tar typiskt ca 2 timmar. Blanda igen med hjälp av en virvel för att se till att allt innehåll är väl blandade och tillsätt 66 | il av tenn (II) 2-etylhexanoat (Sn (Oct 2)) till ampullen.
OBS: D, kommer L-laktid svalna under denna process och kommer att behöva vara re-heated i ugnen för att smälta. - Kraftigt blanda en sista gång med hjälp av virveln och spola med kväve.
- Stäng ampullen med en gummipropp. Placera en nål ansluten till en vakuumröret (huset vakuumet är oftast tillräckligt) genom gummiproppen. Slå på vakuumet och, med hjälp av en flamma, smälta lång hals av glaset, vrida långsamt tills glass kollapsar på sig själv. Var noga med att inte smälta gummipropp. När ampullen är flamma förseglas, placera den i ett sandbad, en ugn, eller lämpligt värmeelement vid 140 ° C under 48 h.
- Ta ut ampullen och låt den svalna i rumstemperatur.
- Bryta ampullen vid den förseglade märket och upplösa högviskös vätska genom att tillsätta 10 ml diklormetan. Överför lösningen till en separationstratt.
- Förbereda en kolv innehållande 100 ml kall metanol (kyld med användning av ett torris / aceton-bad vid en temperatur kring -78 ° C). Fixera skiljetratten (steg 2,7) ovanpå kolven. Justera öppningen av separertratten så att ungefär två droppar faller varannan sekund (droppvis).
- Samla upp den vita fällningen genom filtrering (med användning av ett pappersfilter) och torka den i en vakuumugn mellan 50 och 60 ° C.
- Övervaka framgången av syntesen med användning av följande 1H NMR och FT-IR-toppar. 1 H-NMR (400 MHz, CDC! 3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC H C H 3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24-4,12 (m, C H 2 O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, C H 2 O), 3,80-3,68 (m, C H C H 2), 3,09-2,64 (bred, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H) och 1,77-1,25 (m, C H 2, CH 3); FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, och 735 (m) 6, 27.
Notera: För att framställa en mer hydrofil 3D LCE, förbereda en linjär segmentsampolymer (LBC) i stället för en SBC, efter ringöppnings sampolymerisation (ROP) ovan beskrivna förfarandet.- Lägg 0,3 g polyetylenglykol (PEG), 3,15 g ε-kaprolakton, 1,0 g av α-kloro-ε-kaprolakton och 5,0 g D, L-laktid till den silaniserade flaskan mix.
3. Syntetisk Modifiering av α-Cl-Three Arm SBC att aN 3 -Tre Arm SBC (SBC-aN 3) (Enligt Sharma et al. 6)
- I en rundbottnad kolv och under kväve, upplösa 5 g SBC-αCl i 30 ml torr N, N' dimetylformamid.
- Lägga 0,22 g natriumazid och låt reagera över natten vid rumstemperatur.
Varning: Natriumazid är giftigt; bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE). - Avlägsnande av N, N' dimetylformamid under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 11 mbar och 40 ° C. Upplösa blandningen i 30 ml toluen. Centrifugera lösningen tre gånger vid 2800 xg under 15 min för att avlägsna det bildade saltet. Indunsta toluenen under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 77 mbar och 40 ° C.
- Övervaka framgången av aziden substitution med användning av 1 H-NMR och FT-IR-toppar.
NOTERA:
4. Syntes av kolesteryl 5-hexynoat (LC ökningsdelen) (Enligt Sharma et al. 6 och Donaldson et al. 30)
- I en rundbottnad kolv, blanda 3 g av 5-hexynsyra och 130 ml diklorometan. Kyl till 0 ° C med användning av ett isbad.
- I en annan rundkolv, blanda 8,28 g N, N'-dicyklohexylkarbodiimid, 10,3 g kolesterol, och 0,2 g av 4-dimetylaminopyridin.
- Överföra 5-hexynsyra lösning droppvis till kolven innehållande den kolesterolblandning och bibehålla den slutliga blandningen vid 0 ° C under 1 h.
- Låt blandningen värmas upp till rumstemperatur över natten. Ta bort den resulterande dicyklohexylkarbamiden fällningen genom filtrering med användning av en klass 415 pappersfilter och kassera den.
- Koncentrera filtratet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 850 mbar och 40 ° C. Upplösa den uppsamlade återstoden i 150 ml hexan.
- Indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 335 mbar och 40 ° C. Lägga 350 ml etanol till den oljiga återstoden att uppsamla den slutliga produkten. Tvätta benvitt fast substans bildades med etanol och torka den fasta produkten under vakuum vid 50 ° C.
- Övervaka syntesen med användning av följande 1 H NMR- och FT-IR-toppar. 1 H-NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1 H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1H, CH-OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H 2 CO), 2,34 (m, 2H, CH 2-CH =), 2,31 (m, 2H, C H 2 C H 2-COO), 2,28 (s, 1 H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H 2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH 2, C-H), 0,94 (s, 3H, CH 3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H 3 C H) och 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH 3 -C-H), 0,67 (s, 3H, CH 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2,830-2,990 (bred och stark topp), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s), och 667 (s).
5. Syntetisk Modifiering av α-N 3-Tre Arm SBC till a-kolesteryl-Three Arm SBC (SBC-αCLC) via en azid-alkyn Huisgen Cyclo-additionsreaktion ( "Click" Reaction) Skaffa SBC-Chol (Enligt Sharma et al. 6)
- I en rundbottnad kolv, lös upp en molekvivalent av SBC-aN 3 (1,5 g) i 100 ml nydestillerad tetrahydrofuran (THF). Lägg 1,2 molära equivalent av kolesteryl 5-hexynoat (1,94 g), 0,1 molekvivalent av koppar (I) jodid (0,06 g) och 0,1 molekvivalent av trietylamin (0,03 g). Rör om blandningen över natt vid 35 ° C under kväve.
- Indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 357 mbar och 40 ° C.
- Lös den återstående blandningen i 80 ml av diklormetan och centrifugera i 5 minuter vid 2800 xg vid rumstemperatur för avlägsnande av oreagerade material och biprodukter.
- Övervaka syntesen med användning av följande 1 H NMR- och FT-IR-toppar. 1 H-NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH-kolesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, O-CH-kolesterol), 4,24-4,19 (m, CH2O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH2O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH 2), 2,31-2,25 (m, COCH 2), 2,07-1,02 (m, CH 2 3), 1,05-1,03 (s, CH 2, CH 3), 0,96 till 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH 2, CH 3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH 3), och 0,71-0,68 (s, CH 3). FT-IR (1 / λ [cm -1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s), och 668 (s).
6. Syntes av 2,2-bis (1-kaprolakton-4-yl) propan (Tvärbindningsmedel, BCP) (Enligt Gao et al. 27 och Albertsson et al. 31)
- I en rundbottnad kolv, bereda en lösning innehållande 10,8 g 2-bis (4-hydroxi-cyklohexyl) propan och 52 ml ättiksyra.
- Bered en lösning innehållande 11 g kromtrioxid i 50 ml ättiksyra och 8 ml destillerat vatten. Lägga till denna lösning droppvis till lösningen som framställts i steg 6,1 under det att blandningens temperatur mellan 17 och 20 ° C (t.ex. bibehålla, i envatten bad); denna droppvis process tar 2 timmar. När processen är klar, låt lösningen omröras under ca 30 min.
- Tillsätt 50 ml av 2-propanol. Rör om lösningen över natten vid rumstemperatur.
- Koncentrera den mörka purpurfärgade lösningen under reducerat tryck med användning av en rotationsindunstare vid 137 mbar och 40 ° C. Tillsätt 300 ml destillerat vatten för att fälla; fällningen bör vara ljuslila.
- Filtrera den råa produkten med användning av en klass 415 pappersfilter. Tvätta det fasta materialet med ~ 250 mL destillerat vatten eller tills det fasta blir vitt.
- Upplösa det fasta materialet i 15 ml bensen vid 40 ° C och låt den omkristalliseras vid 25 ° C.
- Lägga 8,34 g torr diketon upplöstes i torr diklormetan och en lösning innehållande 6,0 g 3-klorperbensoesyra i 75 ml diklormetan till kolven.
- Återloppskoka lösningen vid 40 ° C under 24 timmar.
- Kyl reaktionsblandningen till -20 ° C under 10 min för att fälla ut m
- Avlägsna m -chlorobenzoic syra genom filtrering (med användning av ett pappersfilter) och koncentrera lösningen under reducerat tryck.
- Tvätta viskos råa produkten med 200 ml 2-heptanon och torka fällningen under vakuum vid 50 ° C över natten.
- Övervaka syntesen med användning av följande 1 H NMR- och FT-IR-toppar. 1 H-NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, CH 2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 hz, CH 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -C H 2 CH 2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H 2 C H 2 COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH 3) 2), och 0,84 (s, 6H, CH 3 C-). 7. Skapande av Porös 3D Elastomer Scaffold Använda antingen hexametylendiisocyanat (HDI) eller 2,2-bis (1-kaprolakton-4-yl) propan (BCP) 27 som tvärbindningsmedel (Enligt Gao et al. 27)
- Förbereda trearmad elastomerblandningen med användning av 0,75 g av SBC-αCLC genom tillsats 0,25 mL HDI (eller 0,45 ml av BCP) och 0,24 ml destillerat ε-kaprolakton-monomer. Tillsätt 60 pl av Sn (Oct) 2. Om användning BCP istället för HDI, blanda SBC-αCLC och BCP med användning av en virvel och placera dem i en ugn vid 140 ° C tills BCP smälter och upplöses helt (detta steg kan ta upp till 2 h). När BCP har upplösts, ta ut den ur ugnen och Sn (oktober) 2, och virvel.
- Bereda en "offer" nickelskum mall genom att skära en 1 x 4 cm metallstycke. Rulla den från en av de korta ändarna så att den slutliga valsen är ungefär en 1 x 1 cm metallstycke (se figur 4). <li> Sätt nickelskummet i en glasflaska eller aluminiumfolie pack och häll blandningen framställd i steg 7,1 för att helt täcka skummet för 2 min. Avlägsna överskottet blandningen med en Pasteur-pipett. Lämna den i en ugn över natten vid 80 ° C.
- Dra av aluminiumfolie eller bryta glaset. Med användning av ett rakblad, rakning elastomeren runt metallskummet att exponera nickelmetall.
- Förbereda en M järn (III) klorid (FeCl 3) lösning i 100 ml vatten. Placera skummet i en kolv och tillsätt 70 ml av FeCl 3-lösning. Rör om i tre dagar vid rumstemperatur och ändra FeCl3 lösning varje dag. Före varje förändring, rör skummet med joniserat vatten för 0,5 timmar.
OBS! Etsningsprocessen vanligtvis avslutad efter tre dagar. För att säkerställa att etsningsprocessen är fullbordad, utför taktila kompressionstester tills skummen kännas mjuk. Skum motstånd mot taktila kompressionsprov indikerar närvaron av en restmetallmall. - Skölj Elastomer skum med etanol och placera i en vakuumugn över natten vid 40 ° C.
- Karakterisera material med användning av svepelektronmikroskop (SEM), differentiell svepkalorimetri (DSC), mekaniska kompressionsprov, och termisk gravimetrisk analys (TGA) 27.
OBS: För framställning av en mer hydrofil 3D LCE, ersätta SBC med LBC (och se till att LBC innehåller också en LC-del) genom att följa de steg som beskrivs i steg 7,5.
8. Sådd av Elastomer Scaffold med SH-SY5Y neuroblastomceller och kultur Använda sterila tekniker
- Sterilisera elastomeren genom tvättning två gånger med 1 ml av 70% etanol. Utföra UV-bestrålning under 10 minuter och tvätta med 1 mL av 70% etanol. Skölj den två gånger med 1 ml sterilt vatten och 1 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera elastomerer i 24-brunnsodlingsplattor.
- Förbereda celltillväxtmedium för SH-SY5Y innehållande 90% Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplemsökt med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (Pen-Strep).
- Efter räkning av cellerna med användning av en hematocytometer, framställa 1.5 x 10 5 SH-SY5Y-celler suspenderade i 100 | il tillväxtmedium (frö lösning). Tillsätt lösningen på toppen av elastomerer, och se till att bilda en droppe.
- Inkubera ympade elaster vid 37 ° C och 5% CO2 under 2 h för att befrämja cellvidhäftning. Lägga 0,5 ml tillväxtmedium. Inkubera igen vid 37 ° C med 5% CO2.
- Ändra mediet varannan dag efter tvättning med 1 ml PBS.
9. Mikroskopisk Imaging av Elastomer Construct
- Fixera cellerna odlade på elastomerer med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS under 15 min. Skölj med 3 ml PBS tre gånger under 5 min vardera och placera elastomeren med de fixerade cellerna i en odlingsskål med en bifogad täckglas.
Varning: PFA är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE). - Stai de fasta prover med 0,1% av 4' , 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 500 | il av PBS under 10 minuter och skölj två gånger med 1 ml PBS under 5 min.
- Omedelbart bild elastomerema med användning av konfokalmikroskopi med DAPI fluorescens, förvärva bildstaplar som spänner över provet.
OBS: Här var bildstaplar förvärvats med hjälp av en 20X objektiv och en 60X objektiv. - Analysera de optiska konfokala bildstaplar med ImageJ 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna rapport visar framställningsmetoden av en porös 3D LCE som en ställning för cellkultur med användning av en nickelmetall mall. Den erhållna 3D LCE visar ett komplext sammankopplade kanalnätverk som möjliggör enkel cellinfiltration, såväl som mer lämpliga masstransport 27. Fann man att celler kan fullständigt penetrera det sammankopplade kanalnätet och har även möjlighet att anpassa inom LCE. Här, en metallnickelskum (99% Ni, densitet av 860 g / cm 2) selekterades följa ett liknande tillvägagångssätt för grafen skumpreparat tidigare rapporterats av Kung et al. 22. Metallskum fram polymer gjuts, med alla metallstag helt omfattas. Valet av metallskummet storlek och densitet är viktig, eftersom den ger den slutliga morfologin hos LCE och kan hjälpa i imitera vävnadsmiljön av intresse.
D, L- laktid (Figur 2). Den slutliga produkten är en hydrofob 3-arms SBC. SBC med 4 och 6 armar, gjorda genom att ersätta glycerol nod med pentaerytritol och dipentaerytritol, respektive, har tidigare rapporterats 18. För en mer hydrofil SBC, var den centrala noden ersättas med oligoethylene oxid (se protokoll noterna). Emellertid, att ersätta glycerol med oligoethylene oxid resulterar i en linjär segmentsampolymer 27. Vi använde en modifierad syntes från Younes et al. 29. Den modifierade versionen möjliggör användning av en modifierad ε-caprolactone med en halogengrupp i två olika lägen, alfa- och gamma till karbonyl 6. När SBC bildas, lider den modifierade ε-kaprolakton blocket en förskjutning av halogenatomen med en azidgrupp. Förskjutningen av halogengruppen av azidgruppen bekräftas av utseendet på 2100-cm - ett band med användning av dämpad total reflektans (ATR) FT-IR (Figur 3). Azidgruppen används senare för att kovalent fästa LC-delen (kolesteryl hexynoat) till stjärnan segmentsampolymeren med användning alkyn-azid Huisgen s cykloaddition reaktion (även känd som en "klick reaktion"), erhållande det slutliga stjärn segmentsampolymeren med en sida -kedjan kolesterol hängande enheten (SBC-Chol). Bildandet av triazolringen bekräftas av försvinnandet av 2100-cm - ett band och uppkomsten av en singlett observeras vid 7,30 ppm i ett H-NMR-spektra (se figur3). Vi har nyligen rapporterat om effekten av placeringen av en halogengrupp antingen alfa (α -Br) eller gamma (γ-Cl) till karbonylen på den funktionalise ε -CL 6. Det bör noteras att ersätta den centrala noden i SBC co-polymerer med 4-arm- och 6-arm centrala kärnorna har en effekt på de mekaniska egenskaperna hos de erhållna LCEs eftersom de centrala noderna fungerar som både initiatorer och intrinsiska tvärbindare 18 .
När SBC-Chol har framställts och karakteriserats fullständigt, är tvärbindningsprocess med användning av en metallmall det sista steget för skumframställning. SBC-Chol blandades med hexametylendiisocyanat (HDI, tvärbindningsmedel), ε-kaprolakton, och Sn (OCT) 2 (ROP katalysator, se steg 7,1). Bis-kaprolakton (BCP) tvärbindare ersattes med HDI, som tidigare rapporterats. Metallskummet skärs och formas till den önskade form (Figur 4). Två vägar för framställning skum, nämligen den primära porositeten (LCEF PP) och primär / sekundär porositet (LCEF P + SP), har tidigare rapporterats. Här, är den LCEF P + SP, eller "doppning," metod, presenteras, där nickelmall snabbt doppas i polymerblandningen. Metallskummet är placerad inuti en behållare tillverkad av aluminiumfolie eller en scintillationsflaska innehållande polymerblandningen, med alla metall strävor fullt nedsänkta i polymerblandningen. Överskottet polymerblandningen avlägsnas försiktigt. Denna polymer-täckta nickelmall placeras över natten, fortfarande inuti behållaren, i en ugn vid 80 ° C. Tvärbindningen utförs i närvaro av katalysatorn under ca 2 h. Efter tvärbindningsprocessen, är den polymer täckt nickelmall avlägsnas från sin behållare genom avskalning av aluminiumfolien eller bryta glasbehållare. Överskottet polymeren noggrant rakat från polymeren täckta nickel templåt för att exponera kanterna på nickelmall och placerades inuti en behållare med en mättad FeCl 3-lösning (Figur 5). Efter några timmar, är nickel nästan helt bort, och endast den LCE skummet sköljes med avjoniserat (DI) vatten för att eliminera nickel / FeCl 3-lösning. Den LCE skummet åter placeras inuti en behållare med en mättad FeCl 3-lösning och sköljdes med DI-vatten två gånger till. Efter etsningsprocessen är fullständig och hela nickelmall är helt eliminerad, visar LCE skummet en sammankopplad kanal nätverk med ihåliga strävor (Figur 6). Figur 6 visar den interna LCE skum morfologi observerades med användning av svepelektronmikroskopi (SEM). De LCE skumsträvorna är ihåliga, och den övergripande regelbunden morfologi är knuten nickelskummet mallen.
Tidigare krävde användningen av BCP flera åtgärder för att hålla den i Solution (dvs smält), eftersom BCP börjar att omkristallisera så snart som lösningen kyls ned med ett par grader (från 140 ° C till rumstemperatur för att lägga till Sn (Oct) 2; se steg 7,1). Detta gör manipulering av metallskum och polymerblandningen utmanande före tvärbindning. Användningen av HDI som tvärbindare tillåtet för en snabbare tvärbindning tid än när du använder BCP. BCP är en fast substans vid rumstemperatur, med en smältpunkt av 140 ° C, medan HDI är en vätska vid rumstemperatur. Valet av tvärbindningsmedel direkt påverkar tiden beredningen och, som i vårt fall, reduceras tvärbindningstemperaturen från 140 till 80 ° C, även minska elastomer beredning.
De LCE skummen testades med användning av kompressions deformation (film 1). En minskning av LCE storlek 70% observeras, utan någon effekt på övergripande dimensioner. Vid lanseringen av kompression från LCE, återvinner den helt sin ursprungliga shape och storlek. Det förmodas att närvaron av de flytande kristallmolekyldelar i LCE materialet är kritisk, eftersom elastomerer som framställts under samma betingelser utan kolesterol ε-kaprolakton blocket inte återhämta sin ursprungliga form och kollapsade i sig själva.
Gång erhölls LCE skum, de var redo att ympas med neuroblastom (SH-SY5Y) med användning av standardcellodlingstekniker. LCE skum tvättades två gånger i 70% etanol och sköljdes tre gånger med PBS före cellsådd. Inom 2-3 dagar efter cellsådd cellerna observer att fästa på väggarna i 3D LCE nätet. Att fullständigt studera cellvidhäftning och expansion inom LCE nätverket fixerades celler efter 30 dagar (Figur 7). Celler fixerades, färgades med DAPI och avbildas med konfokalmikroskopi. Cellerna befanns frodats, fäst, och utvidgas till omfattande täcka 3D LCE ställningen nätverk. Ytterligaremer, detaljerad analys avslöjade cellkärnor töjning, vilket i de flesta fall inte påverkades av de krökta delarna av 3D LCE scaffold nätverk. Cellförlängning kan också korreleras till celljustering och är mest sannolikt ett resultat av den smektiska-A-fas karaktäristisk för LCE presenteras. Detta har tidigare observerats i C2C12 celler som odlats efter 14 dagar 27. I denna studie visar vi att cellerna fortsätter att föröka sig i mer än 14 dagar, detta är inte begränsad till C2C12 celler ensam. Användningen av LCE skummen kan expanderas till nästan vilken cellinje. Celler som växer på 3D LCE skumliknande ställningar gynnas av högre effektivitet masstransport jämfört med 2D-ställningar. I 2D-ställningar, celler växer vanligtvis i lager ovanpå varandra. Celler som växer på de översta lagren är de enda som har tillgång till alla näringsämnen, gas och sophämtning (masstransport). Celler inom de lägre skikten inte kan komma åt näringsämnen, och det finns en högre grad av cell death i detta fall. Inom 3D-ställningar, celler har en mer effektiv (jämfört med 2D-ställningar) tillgång till näringsämnen, tillväxtfaktorer, och gaser, vilket medger långtids cell- och vävnadsregenereringsstudier. hantering cellavfall (avlägsnande av avfall) med användning av de 3D LCE skumliknande ställningar är också effektivare än i 2D ställningar. Porositeten (och / eller andra strukturella egenskaper) av de LCEs möjliggör snabb transport och ökad cellbelastning jämfört med mindre porösa (eller andra) matriser, som möjliggör media och cellulär tillgång till centrala områden av matrismassan. Denna LCE plattform är inställbar för att stödja tillväxten av många typer av primära och immortaliserade cellinjer, inklusive muskler, nerver och hud, bland andra, samt flercelliga odlingssystem. I grunden är detta en av fördelarna med plattformen, eftersom det kan användas för att odla många olika typer och system cell under längre perioder. Dessutom kan förmågan att växa flera lager av celler i konstruktionen närmare emuleringsrar naturliga miljöer.
Figur 1: Allmänt förfarande beskriver steg-för-steg-framställning och karakterisering av LCE skum. Se protokoll avsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tvärbindnings ordning med 3-arms SBC. Tvärbindningsschemat för 3-arms SBC användning biscaprolactone eller HDI som tvärbindare i närvaro av en nickelmetall mall för framställning av skumliknande LCEs visas. Klicka här för att se en större version av denna Figure.
Figur 3: Schema av 1,2,3-triazol bildning (framgångsrika "klick" reaktion) följt av ett H-NMR och FT-IR. Förskjutningen av halogengruppen av azidgruppen bekräftas av utseendet på 2100-cm - ett band med användning av dämpad total reflektans (ATR) FT-IR. Bildandet av triazolringen bekräftas av försvinnandet av 2100-cm - ett band och uppkomsten av en singlett, observeras vid 7,30 ppm i ett H-NMR-spektra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Optiska bilderav olika skum former före tvärbindning. Metallskummet skärs och formas till den önskvärda formen, såsom visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Nickel skum före (A) och efter (B) tvärbindning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: LCE skum morfologi observerade med användning av svepelektronmikroskop (SEM). Representativa SEM-bilder av LCE skum på SBC-baserade (a och b) och LBC-baserade (c d) elaster med användning av Ni-860 som mall metall visas. Pilar indikerar urholkade stöttor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Confocal mikrofoton som visar DAPI-färgade kärnor av SH-SY5Y-celler fästa till elastomerskummet 30 dagar efter sådd. 2D-bilder var staplade i z-riktning, och tvärsnittsbilder i XZ - och YZ -planes skapades. Bilderna visar att SH-SY5Y-celler (ljusa punkter) fästa och expanderade inom väggarna hos de ihåliga kanaler i elastomerskum. Cellerna rumsligt expanderat till flera skikt och sträckte sig över 100 ^ m genom konstruktion (såsom visas i xz - och yz -planet bild tvär sektioner). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: videobilder av deformationen och återvinning av en LCE roll. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flytande kristallina elastomerer har nyligen undersökts som biokompatibla cell ställningar på grund av deras stimuli respons. De har visat sig vara idealiska plattformar som cell ställningar. Men det är en viktig faktor att tänka på när de förbereder och utforma en ny LCE ställning porositet. Införlivandet av lakbara fasta ämnen 23 eller gaser inte alltid resultera i homogen porositet eller helt sammankopplade porer. Användningen av en mall metall som kan etsas ut inte bara ger möjlighet att ha en mer organiserad och regelbunden inre struktur, men också möjliggör val av porstorlek och densitet. Detta är direkt relaterad till templatet metall som tidigare använts för framställning av grafen skum 22. Metall mallar ger också möjlighet att bilda former före LCE tvärbindning, vilket möjliggör ett brett spektrum av möjligheter att skapa sofistikerade och komplexa arkitekturer med regelbunden porositet deundertecknat att likna endogena miljöer. Skum LCEs ställdes med användning av denna metod medger den förbättrade studium av cellmaterial och, ännu viktigare, rumsliga cell-cell-interaktioner, en bedrift inte möjligt inom tvådimensionella (2D) miljöer. 2D cell ställningar tillåter inte cellerna att fritt interagera med angränsande celler. Dessutom cellerna växer normalt i monolager (eller direkt ovanpå varandra), utan tillgång till utrymme för tillväxt och, ännu viktigare, för interaktion. Specifika spatialt samverkande celltyper, såsom neuroner och gliaceller, är av största vikt när man utformar konstruktioner som potentiella implantat eller långsiktiga experimentella plattformar är avsedda att spegla levande system.
Vårt modulära, lösningsmedelsfri LCE syntes med användning av en metallmall, som presenteras här, hjälper justera celladhesion genom att avstämma den hydrofoba / hydrofila balansen genom att välja den riktiga centrala noden och förhållandet av monomerema 7
Begränsningarna hos detta protokoll är: (1) den begränsade mängd kommersiellt tillgänglig metall (nickel) skum och deras begränsade intervall i stagdimensioner, (2) denkravet att LCE eller någon annan polymer / elastomermaterial kemiskt måste motstå betingelserna vid metalletsning (här, en FeCl 3 Etch) och (3) det faktum att celljustering verkar vara begränsad till de flytande kristall modifierade elastomerer som rapporteras här (moder icke-LCE elastomerer inte visade någon märkbar celljustering).
Sammanfattningsvis har det tidigare visats att SMA LCEs kan framställas med hjälp av vår modulsyntesförfarande. Ytterligare biokompatibla LC molekyldelar kan införlivas för att utforska sina mekaniska egenskaper och nya vätskekristallina effekter på cellproliferation och, särskilt, celljustering. Det är känt att de mekaniska egenskaperna, i synnerhet Youngs modulvärden, är kritiska för cellvidhäftning, proliferation och celljustering. Resultaten här visar att porositeten hos SMA LCEs kan avstämmas genom användning av en metall mall för att åstadkomma ett effektivt sätt att styra porstorlek och att skräddarsy LCEform (dvs övergripande morfologin). Doppning av Ni-mall i SCB polymerblandningen, följt av etsning av Ni-mallen ger ett enkelt tillvägagångssätt för nya LCE morfologier. Skumliknande LCEs beskrivs här tillhandahåller celler (här, SH-SY5Y, en standardcell modell för att studera neuronal funktion) med en mer realistisk, 3D-miljö för tillväxt och interaktion. Så att flera celltyper att växa i flera lager spridda över hela elastomer efterliknar nära endogena neurala miljöer och erbjuder spännande möjlighet till mer sofistikerade 3D vävnadskulturexperiment. Användningen av avstämbara och dynamiska LCEs att efterlikna nativa arkitekturer banar väg för nästa generations cellmodeller för längsgående och kliniskt relevanta cellstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Kent State University (forskningssamverkan bidrag och stöd för Regenerative Medicine Initiative på Kent State - ReMedIKS) för finansiellt stöd för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane | Alfa Aesar | L16606 | Silanizing agent |
| 2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane | TCI | B0928 | Reagent |
| 2-chlorohexanone | Alfa Aesar | A18613 | Reagent |
| 2-heptanone | Sigma Aldrich | W254401 | Solvent |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | 278475 | Solvent |
| 3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA | Sigma Aldrich | 273031 | Reagent |
| 4-dimethylaminopyridine | Alfa Aesar | A13016 | Reagent |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI | Invitrogen | D1306 | Nuclear Stain |
| 5-hexynoic acid | Alfa Aesar | B25132-06 | Reagent |
| Acetic acid | VWR | 36289 | Solvent |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850 | Solvent |
| Alcohol 200 proof ACS Grade | VWR | 71001-866 | Reagent |
| Benzene | Alfa Aesar | AA33290 | Solvent |
| ε-caprolactone | Alfa Aesar | A10299-0E | Reagent |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | Solvent |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C8503 | Reagent |
| Chromium(VI) oxide | Sigma Aldrich | 232653 | Reagent |
| Copper(I) iodide | Strem Chemicals | 100211-060 | Reagent |
| D,L-Lactide | Alfa Aesar | L09026 | Reagent |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | Solvent |
| Diethyl ether | Emd Millipore | EX0190 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME | CORNING Cellgo | 10-013 | Cell Media |
| Ethanol | Alfa Aesar | 33361 | Solvent |
| Formaldehyde | SIGMA Life Science | F8775 | Fixative |
| Fetal bovine serum, FBS | HyClone | SH30071.01 | Media Component |
| Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe | VWR | 28320 | Filtration |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Central node (3-arm) |
| Hexamethylene diisocyanate, HDI | Sigma Aldrich | 52649 | Crosslinker |
| Iron(III) chloride | Alfa Aesar | 12357 | Etching agent |
| Isopropyl alcohol | VWR | BDH1133 | Solvent |
| Methanol | Alfa Aesar | L13255 | Solvent |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Aldrich | D80002 | Solvent |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 270547 | Solvent |
| Nickel metal template | American Elements | Ni-860 | Foam template |
| Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) | ATCC | CRL-2266 | Cell line |
| Penicillin streptomycin | Thermo SCIENTIFIC | 15140122 | Antibiotics |
| Polyethylene glycol 2000, PEG | Alfa Aesar | B22181 | Reagent |
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | Reagent |
| Sodium bicarbonate | AMRESCO | 865 | Drying salt |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286 | Drying salt |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S-374 | Drying salt |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma Aldrich | S9638 | Drying salt |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | Drying salt |
| Tetrahydrofuran | Alfa Aesar | 41819 | Solvent |
| Thiosulfate de sodium | AMRESCO | 393 | Drying salt |
| Tin(II) 2-ethylhexanoate | Aldrich | S3252 | Reagent |
| Toluene | Alfa Aesar | 22903 | Solvent |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 471283 | Reagent |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | Cell Detachment |
| Olympus FV1000 |
References
- Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
- Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
- Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
- Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
- Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
- Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
- Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
- deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
- Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
- Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
- Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
- Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
- Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
- Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
- Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
- Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
- Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
- Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
- Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
- Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
- McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
- Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
- Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
- Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
- Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
- Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
- Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
- Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
- Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
- Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
- Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).
