Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/55452
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 3, 3, 1
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

Summary

Bu çalışma, 3D, biyo-uyumlu yan zincir sıvı kristal elastomerler (LCEs) göre biyolojik olarak parçalanabilen, köpük-benzeri hücre iskeleleri hazırlanması için bir yöntem sunar. Konfokal mikroskopi deneyleri köpüğümsü LCEs hücre eki, proliferasyon ve C2C12s miyoblastların kendiliğinden uyum sağlamak olduğunu göstermektedir.

Abstract

Burada, bir 3D, biyolojik olarak parçalanabilen, köpük-benzeri hücre iskelesi bir adım adım hazırlanmasını sunmaktadır. Bu iskeleleri Smektik-A (SmA), sıvı kristal elastomerler (LCEs) 'de elde edilen, yan zincire asılı gruplar halinde kolesterol birimleri içeren yıldız blok ko-polimerler çapraz bağlama ile hazırlanmıştır. Köpük gibi iskeleleri, 3D hücre kültür yapı iskeleti olarak kullanılmasını uygun hale metal şablonları kullanılarak hazırlandı birbirine mikrokanallar bulunmaktadır. Metal köpük ve geleneksel gözenekli şablonu filmler, ancak kitlesel taşıma aynı zamanda daha iyi yönetimi (örneğin, besin maddeleri, gaz, atık ile karşılaştırıldığında yalnızca yüksek hücre çoğalmasını teşvik eden bir 3D cep iskele elastomer sonuç normal yapının birleşik özellikleri vb.) Metal şablon doğası köpük şekillerde (örneğin, rulo veya film) kolayca müdahale edilebilmesini sağlar ve farklı hücre çalışmaları için farklı gözenek boyutlarının ıskelesının interconnec koruyarakşablonun ted gözenekli doğası. Dağlama işlemi, bunların biyolojik olarak uyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilir doğa koruma, elastomerlerin kimyası etkilemez. Biz hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını teşvik ederken bu smektik LCEs, geniş süreler boyunca büyüyünce klinik açıdan ve karmaşık doku yapıları çalışma sağlar göstermektedir.

Introduction

Hücre çalışmalarında ve hücre bağlanması ve yayılması, 1, 2, 3, 4, 5 amaçlayan doku rejenerasyonu için bir uygulama için tasarlanmış biyolojik ve biyolojik olarak uyumlu sentetik malzemelerin çeşitli örnekler vardır. 6, 7 sipariş moleküler anizotropik harici uyaranlara yanıt olabilir sıvı kristal elastomerler (LCEs) olarak bilinen biyolojik olarak uyumlu malzemelerden birkaç örnek, olmuştur. LCEs optik özelliklerin ve sıvı kristal 8 moleküler sipariş, 9 elastomerlerin mekanik ve elastik özellikler kombine uyaranlara yanıt veren malzemelerdir. LCEs dış stimülasyonu yanıt olarak şekil değişiklikleri, mekanik deformasyon, elastik davranış ve optik özellikleri karşılaşabiliruli (yani., ısı, gerilim, ışık, vs.), 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Daha önce yapılan çalışmalar, sıvı kristaller (LCS) hücre 4, 17 büyümesini ve yönünü duyu göstermiştir. LCEs hücre iskele ve hizalama gibi biyolojik ve tıbbi açıdan alakalı uygulamalar için uygun olabileceğini varsaymak mümkündür. Daha önce, bir "Swiss-peynir türü" gözenekli morfolojiyi 6, 18 sahip smektik biyolojik olarak uyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen, döküm kalıplı ve ince LCEs filmlerin hazırlanmasını bildirmektedir. Ayrıca, hücre büyümesi 19 <için iskeleler globüler morfolojisi olan nematik biyo-uyumlu LCEs hazırlanansup>, 20. Çalışmalarımız ilgi 21'in dokusunun içine alacak şekilde malzemelerin mekanik özelliklerinin ayar hedeflendi. Ayrıca, bu çalışmalar elastomer hücre etkileşimleri yanı sıra elastomerler dış uyaranlara maruz hücresel yanıtı anlamak odaklanır.

temel zorluklar elastomer matrisi yoluyla hücre bağlanması ve nüfuz imkan vermek için LCEs gözenekliliğini uygun hale kısmen ve daha iyi kütle transportuna yönelik idi. Bu ince filmler 6 gözenekliliği matrisin kütlesi boyunca hücre geçirgenliği için izin verilir, ancak tüm gözenekler tamamen birbirine bağlandığı veya gözenek (homojen) daha düzenli boyutu vardı. Sonra küresel morfolojileri ile biyouyumlu nematik LCE elastomerler bildirildi. Bu nematik elastomerler bağlanma ve hücre proliferasyonu için izin verilir, ancak gözenek boyutu önlenir 10-30 um, sadece değişmektedir veya bunların kullanımı sınırlıdırhücre çizgileri 19, 20 daha geniş bir çeşitliliği ile elastomerler.

Kung ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir "gözden çıkarılabilir" Metal şablonu kullanılarak grafin köpüklerin oluşumuna ilişkin elde edilen grafin köpük seçilen metal şablon 22 tarafından dikte çok düzenli bir gözenekli morfolojiyi sahip olduğunu göstermiştir. Bu metodoloji gözeneklilik ve gözenek boyutu tam kontrol sunuyor. Farklı şablon oluşumu, köpük hazırlama öncesinde şekiller aynı zamanda, bir metal şablon yumuşaklık ve esneklik sağlar. Bu malzeme süzme 23, gaz çiftleşmiş 24 veya elektro-eğrilmiş elyaflar 25 gibi diğer teknikler, 26 aynı zamanda gözenekli malzemelerin hazırlanması için bir potansiyel sunmaktadır, ancak daha fazla zaman, bazı durumlarda, gözenek boyutu ile sınırlıdır, alıcı ve vardır sadece birkaç mikrometre. Köpük-benzeri 3D LCEs metal şablonları daha yüksek bir hücre yükü için izin kullanılarak hazırlandı; geliştirilmiş bir proliferasyon hızı; eş-kültürleme; ve, son olarak değil, daha iyi toplu taşıma yönetimi (yani besin, gazlar ve atık) tam doku gelişimini 27 sağlamak için. Köpük gibi 3B LCEs hücre uyumu geliştirmek için görünür; Bu hücre büyümesi ve hücre yönünü algılayacak LC kolye göre çok muhtemeldir. LCE içinde LC kısımların varlığı LCE iskele içinde hücre konumu ile ilgili olarak, hücre hizalama artırmaktadır. Dikmeler, birlikte (birleşme) 27 birleştiği yerde açık bir yönlendirme gözlenirken hücreler, LCE direklerinden içinde hizalamak.

Genel olarak, bir hücre destek ortamı olarak LCE hücre iskeleti platformu ayarlamak için bir elastomer morfolojisi ve elastik özellikleri ve özellikle de o sıralı, uzamsal düzenlemeleri oluşturmak için (bireysel) hücre tipleri hizalanmasını yönlendirmek için fırsatlar sunaryaşayan sistemlere benzer f hücreleri. Yanı sıra sürdürülmesi ve uzun süreli hücre büyümesini ve üremesini yönlendirebilen bir iskele sağlamasının, LCEs hücre yönlendirme ve etkileşimler anında değiştirilebilir dinamik deneyler, izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: 3-kollu yıldız blok kopolimeri kullanılarak 3D LCE köpük benzeri hazırlanması için, aşağıdaki aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) karakterizasyonu için, spektrumları bir Bruker DMX 400 MHz aleti üzerinde oda sıcaklığında dötoryumlanmış kloroform (CDCI3) kaydedilir ve içten 7.26 kalıntı tepeleri referans. Fourier zayıflatılmış toplam yansıma modu kullanılarak bir Bruker Vektör 33 FT-IR spektrometresi kullanılarak kaydedilmiştir enfraruj (FT-IR) spektrumları dönüşümü. Aşağıdaki protokolün her adım için, uygun kişisel koruyucu giysiler (PPE) giymek önemlidir.

Α-kloro-ε-kaprolakton 1. N- (monomer) (Jerome et al prosedüre göre. 28)

  1. aşağıdaki gibi sentez başlamadan önce, 3-kloroperbenzoik asit 27 g saflaştırmak:
    1. damıtılmış su, 800 mL'lik, sodyum 1.28 g eklemefosfat monobazik monohidrat ve sodyum fosfat dibazik heptahidrat 8.24 g. ve rezerv Bu çözeltiye 30 mL (sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak) pH'ı 7.4'e ayarlayın; Bu tampon çözümdür.
    2. bir ayırma hunisi kullanılarak, dietil eter ve 35 ml 3-kloroperbenzoik asit çözülür. tampon çözeltisi 10 mL organik çözelti yıkayın (aşama 1.1.1 hazırlanmıştır.). yıkayınız üç kez tekrarlayın.
    3. Organik çözelti, doğrudan, sodyum sülfat, 3 g ekleyin; Bu kurutma maddesi, organik çözelti su emer.
    4. Kurutma maddesinin çıkarılması için solüsyon filtre. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında filtratın konsantre edilir.
  2. bir ultrasonik banyo içinde karıştırıldı, kuru 150 mL diklorometan içinde saflaştırılmış 3-kloroperbenzoik asit 18.5 g çözündürülmesi; Bu işlem tipik olarak 20 dakika sürer. bir ayırma hunisine içinde çözelti yerleştirin.
  3. İki boyunlu içinde, yuvarlak dipli bir reaksiyon kabı,azot gazı altında, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak, kuru diklorometan, 15 mL 2-klorosikloheksanon 13.1 g çözülür. karıştırmaya devam edin.
  4. Adım 1.3'te iki boyunlu bir şişeye (adım 1.2 den), 3-kloroperbenzoik asit çözeltisi ihtiva eden ayırıcı bir huni monte edin. Azot gazı ile sistem yıkayın. kloroperbenzoik asit çözeltisi 2-klorosikloheksanon çözeltisi (saniyede bir 1 damla) içine damla damla düşecek şekilde bir ayırma hunisine açılmasını ayarlamak ve 96 saat boyunca azot gazı altında karıştırmaya devam edin.
  5. M-klorobenzoik asit (m -CBA) yan ürünü çökeltmek için 1 saat boyunca -20 ° C'ye kadar, reaksiyon karışımı soğutulur.
  6. M-klorobenzoik asit (m -CBA) süzülür ve sodyum tiyosülfat, sodyum bikarbonat ve doymuş sodyum klorür çözeltileri ile kalan çözelti yıkayın.
  7. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. Soluk sarı renkli, kıvamlı LIQU saflaştınlırindirgenmiş 2.3 Torr'da basınç ve 96 ° C altında damıtılarak kimliği.
  8. Aşağıdaki 1H NMR zirveleri kullanılarak sentez başarısını izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4.75-4.68 (m, 1 H, CH CICO), 4,37-4,26 (m, 1 H, Cı-H2O), 4,18-4,05 (m, 1 H C H2O) ve 2,06-1,58 (m, 6H, C H2 -) 6, 27.

2. Sentez α-üç kollu yıldız Blok Kopolimer Halka Açma Kopolimerizasyonu ile (SBC-αCl) (Sharma ve diğ. 6 ve Amsden ve ark. 29)

  1. sentezi önce, toluen 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane bir% 2 (v / v) solüsyonu ile doldurulması ve yaklaşık 24 saat boyunca karıştırma ile 20 ml ampul Silanize. izopropil alkol ile durulanır ve 30 dakika boyunca 140 ° C'de bir fırında yerleştirerek kurutun.
  2. 3 ekledamıtılmış ε-kaprolakton .64 gr, α-kloro-ε-kaprolakton 0.5 g, ve ampul gliserolün 0.25 mL. 1 dakika süre ile bir vorteks ile karıştırın.
  3. Ampule D 4.90 g L -lactide ekleyin ve nitrojen ile temizleyin. D, L -lactide eritmek için 120 ° C de bir fırında ampul yerleştirin; Bu işlem tipik olarak yaklaşık 2 saat sürer. Bütün içerikler iyice karışmış olduğundan emin olun ve kalay 66 mcL eklemek için bir girdap kullanarak tekrar karıştırın (II) 2-etilheksanoat (Sn (Ekim) 2) ampule.
    Not: D, L -lactide bu işlem sırasında soğuyacak ve erimeye fırında yeniden ısıtılması gerekmektedir.
  4. Şiddetle vorteks ile son bir kez karıştırın ve nitrojen ile yıkayın.
  5. Bir lastik tıpa ile ampulü kapatın. bir vakum borusuna bağlı bir iğne yerleştirin kauçuk tıpa ile (ev vakumu genellikle yeterlidir). g kadar yavaşça bükerek, vakum açın ve bir alev kullanılarak, uzun cam boyun erimelass kendi üzerine çöker. lastik tıpa eritmek için dikkatli olun. ampul alev sızdırmaz sonra, 48 saat boyunca 140 ° C'de, bir kum banyosu, bir fırın ya da uygun bir ısıtıcı eleman yerleştirin.
  6. ampul çıkarıp oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
  7. sızdırmaz gösterirken ampulü kırmak ve 10 mL diklorometan ilave edilerek son derece yapışkan bir likit çözülür. bir ayırma hunisi çözüm aktarın.
  8. Soğuk 100 mL metanol ihtiva eden bir şişe, hazırlama (bir sıcaklıkta, bir kuru buz / aseton banyosu ile soğutulmuş, yaklaşık -78 ° C). Şişenin üzerine ayırıcı bir huni (aşama 2,7) sabitleyin. iki damla saniyede bir (damla damla) kalacak şekilde ayrı bir huniye açılmasını ayarlayın.
  9. süzme ile beyaz bir çökelti (kağıt filtre kullanılarak) toplayın ve 50 ve 60 ° C arasında bir vakumlu fırın içinde kurutun.
  10. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez başarısını izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC, H CH3), 4.43-4.25 (m, Cı-HCl), 4,24-4,12 (m, J, C H2O), 4,11-4,03 (t, = 4.6 Hz, CH 2 O), 3.80-3.68 (m, CH CH 2), 3,09-2,64 (geniş, 2.33), J = 4.5 Hz, α-, H, OH), 2.39 (t, s, (t, J = 5.1 Hz, α- H) ve 1,77-1,25 (m, Cı-H2, CH3); FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2932 (s), 2.869 (m), 1.741 (s), 961 (s), 866, ve 735 (m), 6, 27.
    Not: Yukarıda tarif edilen halka açma kopolimerizasyon (ROP) prosedür takip edilerek, daha hidrofilik bir 3D LCE hazırlamak yerine SBC bir lineer blok kopolimer (LBC) hazırlanması.
    1. Silanize edilmiş şişe karışımına L-laktid, polietilen glikol (PEG), 3.15 gr ε-kaprolakton 0.3 g, α-kloro-ε-kaprolakton, 1.0 g, ve D'den 5.0 g, ekleyin.

    3 -Üç Kol SBC (SBC-aN 3) aN için α-Cı-üç kol SBC 3. Sentetik modifikasyonu (Sharma ve diğ göre. 6)

    1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, azot altında, kuru N, N' -dimetilformamid 30 mL SBC-αCl 5 g çözülür.
    2. sodyum azid 0.22 g ilave edilir ve oda sıcaklığında gece boyunca reaksiyona girmesine izin verir.
      Dikkat: sodyum azid zehirlidir; uygun kişisel koruyucu giysiler giymelidir (PPE).
    3. N, 11 mbar ve 40 ° C'de döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında N'-dimetilformamid çıkarın. 30 mL toluen içinde bir karışım içinde çözündürülür. oluşan tuzun ayrılması için 15 dakika boyunca 2,800 x g'de üç kere çözelti santrifüjleyin. 77 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında toluen buharlaşır.
    4. 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak azid ikame başarısını izleyin.
      NOT: [cm-1]): 2.928, 2.108 (s, azid), 1.754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s) ve 696 (m).

    4. Kolesteril sentezi 5-Hexynoate (LC Yarımı) (Sharma ve diğ. 6 ve Donaldson ve arkadaşlarına göre. 30)

    1. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, 5-heksinoik asit, 3 g ve 130 ml diklorometan karıştırılır. 0 ° C'ye soğutun, bir buz banyosu kullanılarak.
    2. Başka bir yuvarlak dipli bir şişeye, N, N'-disikloheksilkarbodiimid ve 8,28 g, kolesterol 10.3 g, ve 4-dimetilaminopiridin, 0.2 g karıştırın.
    3. 1 saat boyunca 0 ° C 'de nihai karışımın kolesterol karışımı içeren bir şişeye 5-heksinoik asit çözeltisi damla damla aktarın ve bakımı.
    4. Karışım, gece boyunca oda sıcaklığına kadar ısınmasına izin verin. Bir sınıf 415 kağıt filtre kullanılarak filtreleme ile elde edilen disikloheksilüre çökelti çıkarın ve atın.
    5. 850 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında filtratın konsantre edilir. 150 mL heksan içinde toplanan tortu çözülür.
    6. 335 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. Nihai ürün toplamak için yağlı tortuya, 350 ml etanol ekleyin. Yıkayın, tam beyaz olmayan etanol ile oluşturulur ve 50 ° C'de vakum altında bir katı ürün kuru katı madde.
    7. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 5.39 (d, J = 4.7 Hz, 1 H, CH = C), 4,70-4,58 (m, 1 H, CH CHOCO), 2.44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, CH 2CO), 2.34 (m, 2H, CH 2-C H =), 2.31 (m, 2H, CH 2 CH 2-COO), 2.28 (s, 1 H, 'HC = C), 2.27 (d, J = 2.3 Hz, 2H, ≡CC H2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH 2, CH), 0.94 (s, 3H, CH3), 0.89 (d, J = 1.8 Hz, 3H, CH3 CH) ve 0.88 (d, J = 1.8 Hz, 6H, CH3-C, H), 0.67 (s, 3H, CH3). FT-IR (1 / λ [cm-1]): 2,830-2,990 (geniş ve güçlü bir zirve), 2.104 (m), 1.695 (s), 1.428 (m), 1.135 (m), 999 (s), 798 (s) ve 667 (ler).

    5. Sentetik modifikasyonu a-N3 -Üç Kol SBC a-Kolesteril-üç kol SBC bir Azid-Alkin Huisgen Siklo-eklenmesi Reaksiyonu ile (SBC-αCLC) ( "Klik" Reaksiyon) göre (SBC-Chol elde etmek Sharma ve diğ. 6)

    1. Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, henüz distile edilmiş tetrahidrofuran, 100 mL (THF) içerisinde SBC-aN 3 (1.5 g), 1 molar eşdeğer çözülür. 1.2 mol equivalen eklemekolesteril 5-hexynoate (1.94 g), bakır (I) 'in 0.1 mol eşdeğer iyodür (0.06 g) t, ve 0.1 trietilamin molar eşdeğer (0.03 g) verdi. gece boyunca azot altında 35 ° C'de karıştırın.
    2. 357 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır.
    3. gibi tepkimeye girmemiş malzemenin ve yan ürünleri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 2,800 x g'de 5 dakika için bir diklorometan ve santrifüj 80 mL kalıntı karışımı içinde çözülür.
    4. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 7.54 (s, CH = C-triazol), 5,43-5,34 (m, C = CH kolesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4.68 -4.55 (m, O-CH, kolesterol), 4,24-4,19 (m, CH2 O), 4.18-4.13 (t, J = 5.0 Hz, CH2 O), 4,11-4,05 (t, J = 4.4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4.9 Hz, COCH2), 2,31-2,25 (m, COCH2), 2,07-1,02 (m, CH2 CH3), 1,05-1,03 (s, CH2, CH3), 0.96-0.92 (d, J = 3.3 Hz, CH2, CH3), 0,91-0,87 (dd, J = 1.9 Hz, = 1.8 Hz, CH3), ve 0,71-0,68 (s, CH3). FT-IR (1 / λ [cm-1]): 3.260 (s), 2.920 (s), 1.710 (s), 1.460 (s), 1.370 (s), 1.240 (m), 1.190 (s), 733 (s) ve 668 (ler).

    2,2-Bis (1-kaprolakton-4-il) propan (Çapraz Bağlayıcı BCP) 6. sentezi (Gao ve ark., 27 ve Albertsson ve arkadaşlarına göre. 31)

    1. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, 2-bis (4-hidroksi-sikloheksil) propan ve asetik asit 52 mL, 10.8 g ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır.
    2. asetik asit ve 50 mL damıtılmış su 8 mL krom trioksit 11 g ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. A, örneğin 17 ve 20 ° C arasında (karışım sıcaklığı muhafaza ederken, aşama 6.1'de hazırlanan çözeltiye Bu çözeltiye damla damla ilave edilirsu banyosu); Bu damla damla işlemi 2 saat sürer. İşlem tamamlandıktan sonra, çözelti, yaklaşık 30 dakika boyunca karışmaya bırakın.
    3. 2-propanol, 50 mL ekleyin. Gece boyunca oda sıcaklığında çözelti karıştırılır.
    4. 137 mbar ve 40 ° C'da bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında koyu mor bir çözelti konsantre edilir. çökeltilmesi için damıtılmış su 300 mL; çökelti mor ışık olmalıdır.
    5. Bir sınıf 415 kağıt filtre kullanılarak ham ürün filtre. damıtılmış su ~ 250 mL 'si ile veya beyaz katı hale gelene kadar katı madde yıkanır.
    6. 40 ° C'de 15 mL benzen, katı maddeyi çözündürülür ve 25 ° C'de yeniden kristalize sağlar.
    7. kuru diklorometan ve şişeye 75 mL diklorometan içinde 3-kloroperbenzoik asit 6.0 g ihtiva eden bir çözelti içerisinde çözündürüldü, kuru diketon 8.34 g ekleyin.
    8. 24 saat boyunca 40 ° C'de çözelti, geri akış.
    9. M çökeltmek için 10 dakika boyunca -20 ° C'ye Reaksiyon karışımını soğutun
    10. (Bir kağıt filtre kullanılarak) süzme ile m-klorobenzoik asidin çıkarılması ve indirgenmiş basınç altında çözelti konsantre edilir.
    11. 2-heptanon, 200 mL 'si ile viskoz ham ürün yıkanır ve gece boyunca 50 ° C'de vakum altında bir çökelti kurutulur.
    12. Aşağıdaki 1H NMR ve FT-IR zirveleri kullanılarak sentez izleyin. 1H NMR (400 MHz, CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14.2, 7.4 Hz, 2H, CH 2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2 H, J = 11.3 Hz, CH 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14.3, 6.5, 1.6 Hz, 2H, CH CH2COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13.3, 2.1 Hz, 2H, CH CH2COO), 2,04-1,93 (m, 4H, C H2 CH2OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, C H2 CH CH2COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - Cı, H, C (CH3) 2), ve 0.84 (s, 6H, CH3 = C-).
      13. Heksametilen diizosiyanat (HDI), ya da 2,2-bis (1-kaprolakton-4-il) propan (BCP) 27 birini kullanarak gözenekli 3D Elastomer yapı iskelesinin 7. oluşturulması çapraz bağlayıcılar (Gao göre ve ark. 27) olarak

      1. üç kollu bir elastomer HDI 0.25 mL (veya BCP 0.45 mL) ilave edilerek SBC-αCLC 0.75 g kullanılarak karışımını ve damıtılmış ε-kaprolakton monomer 0.24 mL hazırlayın. Sn (Ekim) 2 60 mcL ekleyin. (Bu adım 2 saat kadar sürebilir) kullanılarak HDI BCP kullanılıyorsa, bir vorteks ile SBC-αCLC ve BCP karıştırmak ve BCP tamamen erir ve çözülene kadar 140 ° C'de bir fırında yerleştirin. BCP çözülmüş edildikten sonra, Sn (Ekim) 2 ve girdap fırının dışına çıkarmak ve.
      2. 1 x 4 cm bir metal parça kesilerek bir "gözden çıkarılabilir" nikel köpüğü şablonu hazırla. Son rulo 1 x 1 sm metal parça civarında olduğu kadar kısa bir ucundan rulo (bakınız Şekil 4).
        3. <li> tamamen 2 dakika için köpük kapsayacak şekilde aşama 7.1 'da hazırlanan karışımın, bir cam şişe ya da alüminyum folyo paketi nikel köpüğü koyun ve dökün. Pasteur pipetiyle fazla karışım çıkarın. 80 ° C de bir gece boyunca fırında bırakın.
      3. alüminyum folyo soyun ya da cam kırmak. Bir traş makinesi bıçak kullanarak, nikel metali ortaya çıkarmak için, metal köpük çevresinde elastomer tıraş.
      4. 1 M, demir (III) klorit (FeCl3) 100 mL su içinde bir çözelti hazırlayın. Bir şişe içinde bir köpük yerleştirin ve FeCl3 çözeltisi 70 ml. Oda sıcaklığında üç gün karıştırınız ve her gün FeCl3 çözeltisi değiştirin. Her bir değişiklikten önce, 0.5 saat boyunca iyonize su ile köpük karıştırın.
        NOT: Aşındırma işlemi üç gün sonra tamamlanır. köpükler yumuşak hissedene kadar dağlama işlemi tamamlandıktan emin olmak için, dokunsal sıkıştırma testleri. dokunsal sıkıştırma testlerine Köpük direnci artık metal şablon varlığını gösterir.
      5. ELAST durulayınfırını içinde gece boyunca 40 ° C'da bir vakum içinde etanol ve yer ile omer köpük.
      6. Tarama elektron mikroskobu (SEM), diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), mekanik sıkıştırma testi ve termal gravimetrik analiz (TGA) 27 kullanılarak malzeme karakterize eder.
        Not: daha hidrofilik bir 3D LCE hazırlamak için, YİM aşama 7.5'de tarif edilen adımları aşağıdaki gibidir (LBC de LC parçasını ihtiva eden emin) ile SBC değiştirin.

      Steril Teknikleri Kullanarak 8. SH-SY5Y Nöroblastom Hücreleri ile Elastomer Scaffold tohumlama ve Kültür

      1. % 70, 1 mL etanol ile iki kere yıkayarak elastomer sterilize edin. 10 dakika boyunca UV-ışını gerçekleştirin ve% 70 etanolün 1 mL'si ile yıkayın. steril su, 1 mL ve fosfat tamponlu tuzlu su, 1 mL (PBS) ile iki kere yıkayın. 24 oyuklu kültür plakaları içinde elastomerleri yerleştirin.
      2. % 90 Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) bağlı ek içeren SH-SY5Y hücre büyüme ortamı hazırlamak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (LTR yükseltici) durumunda ile şubenin kiralama işlemi.
      3. Bir hematositometre kullanılarak hücrelerin sayılmasından sonra büyüme ortamı 100 uL (tohum çözelti) içinde süspansiyon haline getirilmiş, 1.5 x 10 5 SH-SY5Y hücreleri hazırlamak. Bir damla oluşturmak için emin olun, elastomerler üstünde çözümünü ekleyin.
      4. Hücre yapışmasını desteklemek için 2 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2 tohumlanmış elastomerleri inkübe edin. Büyüme ortamı, 0.5 mL ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de daha inkübe edin.
      5. 1 mL PBS ile yıkandıktan sonra ortam her iki günde bir değiştirin.

      Elastomer Construct 9. Mikroskopik Görüntüleme

      1. 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ile elastomerler üzerinde büyütülmüş hücreler sabitleyin. Her biri 5 dakika boyunca PBS üç kez 3 mL ile yıkayın ve ekli bir lamel ile bir kültür kabı içinde sabit hücreleri ile elastomer yerleştirin.
        Dikkat: PFA toksiktir. uygun kişisel koruyucu giysiler (KKE) giyin.
      2. Stave 10 dakika boyunca 500 ul PBS içinde 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI),% 0.1 ile sabit örnekleri 5 dakika boyunca iki kez 1 mL PBS ile yıkayın.
      3. örnek kapsayan görüntü yığınları elde DAPI floresan ile konfokal mikroskopi kullanılarak hemen görüntü elastomerler.
        NOT: Burada görüntü yığınları bir 20X objektif ve 60X objektif kullanılarak elde edildi.
      4. ImageJ 32 kullanan optik konfokal görüntü yığınları analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu rapor, bir nikel şablonu kullanılarak hücre kültürü için bir iskele olarak gözenekli bir 3D LCE hazırlanması yöntemini göstermektedir. Elde edilen 3D LCE kolay bir hücre infiltrasyonu sağlar kompleks birbirine kanal ağı, hem de daha uygun bir kütle transferini 27 göstermektedir. Bu hücreler, tam olarak birbirine bağlanmış kanal ağ nüfuz edebilmek ve aynı zamanda LCE içinde hizalamak için mümkün olduğu bulunmuştur. Burada, bir metal, nikel bir köpük (% 99 Ni, 860 yoğunluğu g / cm2), daha önce Kung ve arkadaşları tarafından rapor grafin, köpük hazırlama için benzer bir yaklaşım, aşağıdaki seçildi. 22. metal köpük polimer tamamen kapalı tüm metal kirişler ile, dökülmüş. Bu LCE nihai morfolojisi verir ve ilgi konusu doku ortamının taklit yardımcı gibi metal köpük boyutu ve yoğunluğu seçimi önemlidir.

D, L-laktid (Şekil 2). Nihai ürün, bir hidrofobik 3 kollu SBC olup. Pentaeritritol ve dipentaeritritol ile gliserol düğümü değiştirilmesi yoluyla yapılır 4 ve 6 kollar ile SBC sırasıyla daha önce 18 bildirilmiştir. Daha hidrofilik SBC için, merkezi düğüm (protokol notlara bakınız) oligoetilen oksit ile değiştirildi. Bununla birlikte, bir lineer blok kopolimeri 27 oligoetilen oksit sonuçlar gliserol değiştirilmesi. Biz Younes ve arkadaşları modifiye edilmiş bir sentez kullanılmaktadır. 29. değiştirilmiş versiyonu değiştirilmiş bir ε-ca kullanımına izin verirKarbonil 6 iki farklı konumda, alfa ve gama bir halojen grubu ile prolactone. SBC oluşturulduğu zaman, tadil edilmiş ε-kaprolakton bloğu bir azid grubu ile halojen atomu bir yer değiştirmesine uğrar. Azid grubu ile halojen grubunun yer değiştirmesi 2.100 cm görünüşü ile doğrulanır - 1 bant zayıflatılmış toplam yansıma kullanılarak (ATR) FT-IR (Şekil 3). azid grubu daha sonra bir tarafı ile nihai yıldız blok kopolimeri elde etmek, kovalent (aynı zamanda bir "tık reaksiyonu" olarak da bilinir) alkin-azit Huisgen en siklo reaksiyonu kullanılarak yıldız blok kopolimer LC yarımı (kolesteril hexynoate) bağlamak için kullanılır y-zinciri kolesterol kolye ünitesi (SBC-Chol). Triazol halka oluşumu 2.100 cm kaybolması ile doğrulanır - 1 bant ve 1H NMR spektrumları 7.30 ppm'de görülen bir tekli görünümünü (bakınız Şekil3). Son zamanlarda işlevselleştirilmiş ε CL 6 karbonile bir halojen grubu, ya alfa yerleştirilmesinin etkisi (α -Br) ya da gama (γ-CI) bildirmiştir. Merkez düğümler başlatma ve iç çapraz bağlayıcılar 18 hem de hizmet için 4-kol ve 6 kollu merkezi çekirdek SBC ko-polimerler içinde merkezi düğüm değiştirilmesi elde LCEs mekanik özellikleri üzerinde bir etkiye sahip olduğunu belirtmek gerekir .

SBC-Chol hazırlandı ve tam karakterize edilmiş ise, bir metal şablon kullanılarak, çapraz bağlama işlemi, köpük hazırlama için son adımdır. SBC-Chol heksametilen diizosiyanat (HDI, çapraz bağlayıcı), ε-kaprolakton ve Sn (oct) 2 ile karıştırılmıştır (PR katalizör, adım 7.1). Daha önce rapor edildiği gibi bis-kaprolakton (BCP) çapraz bağlayıcı, HDI ile değiştirildi. Metal köpük arzu f kesilir ve şekillendirilirorm (Şekil 4). Köpük hazırlama, yani primer porozite (LCEF PP) ve birincil / ikincil porozite (LCEF U + SP) için iki yolları, daha önce rapor edilmiştir. Nikel şablonu hızla polimer karışımı içine daldırılmaktadır burada Burada, LCEF U + SP ya da "daldırma" yöntemi, sunulmuştur. Metal köpük tamamen polimer karışımı içine daldırılmış tüm metal kirişler ile, bir alüminyum folyo ya da bir polimer karışımı içeren bir sintilasyon şişesi yapılmış bir kaba içine yerleştirilir. Fazla polimer karışımı dikkatli bir şekilde çıkarılır. Bu polimer kaplı nikel şablonu, 80 ° C'de bir fırın içinde, hala kap içinde, bir gece boyunca yerleştirilir. Çapraz bağlanma, 2 saat süre ile katalizör varlığında gerçekleştirilir. Çapraz bağlama işleminin ardından, polimer kaplı nikel şablon alüminyum folyo soyulması veya cam kap kırarak konteynerinden kaldırılır. Fazla polimer dikkatli bir şekilde, polimer kaplı nikel templ traş edilirNikel şablonu kenarları ortaya çıkarmak için yedi ve doymuş FeCl3 çözeltisi (Şekil 5) ile bir kap içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra, nikel hemen hemen bütünüyle giderileceği ve sadece LCE köpük nikel / FeCl3 çözeltisi ortadan kaldırmak için deiyonize (Di) su ile durulanır. LCE köpük tekrar iki kez daha doymuş FeCl3 çözeltisi ile bir kap içine yerleştirilir ve Dİ su ile durulanır. Aşındırma işlemi tamamlandıktan ve tüm nikel şablonu tam giderildikten sonra, LCE köpük içi boş dikmeler (Şekil 6) ile birbirine bağlı bir kanal şebekesini göstermektedir. Şekil 6, tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak gözlemlenen iç LCE köpük morfolojisi gösterir. LCE köpük dikmeler içi boş olan ve genel düzenli morfolojisi nikel köpük şablonuna etmesine bağlıdır.

Daha önce, BCP kullanılması Solu içinde tutmak için çeşitli adımlar gereklidirtion (örneğin, eritilmiş) BCP çözeltisi birkaç derece soğur kısa sürede yeniden kristalleşme başlar, çünkü (Sn (Ekim) 2 ilave 140 ° C ila oda sıcaklığı, adım 7.1). Bu durum, bilinen çapraz bağlama zorlu metal köpük ve polimer karışımının manipülasyonu yapar. BCP kullanıldığında daha hızlı bir çapraz bağlama süresi için izin verilen bir çapraz bağlayıcı olarak HDI kullanımı. HDI, oda sıcaklığında sıvı halde iken BCP, 140 ° C bir erime noktasına sahip, oda sıcaklığında bir katıdır. , Elastomer hazırlama azaltarak 140 ila 80 ° C'ye kadar bir çapraz bağlama sıcaklığına düşük eden durumunda olduğu gibi çapraz bağlayıcıların seçimi doğrudan, hazırlık süresi etkiler.

LCE köpükler kompresyon deformasyonu (Film 1) kullanılarak test edildi. LCE büyüklüğü 70% azalma genel boyutları üzerinde hiçbir etki olmadan, görülmektedir. LCE gelen sıkıştırma açıklaması üzerine, bütünüyle başlangıç ​​s kurtarırhape ve boyutu. Elastomerler orijinal şekline geri değil kolesterol ε-kaprolakton blok olmaksızın aynı koşullar altında hazırlanmış ve kendi içine çöktü LCE malzeme sıvı kristal kısımların varlığı, önemli olduğuna inanılmaktadır.

LCE köpükler elde edilmiştir sonra, standart hücre kültürü teknikleri kullanılarak nöroblastomlar (SH-SY5Y) ile tohumlanabilir hazırdılar. LCE köpükler,% 70 etanol içinde iki kez yıkandı ve daha önceki bir hücre ekim için PBS ile üç kez durulanmıştır. hücre ekiminden sonra 2-3 gün içinde, hücreler 3D LCE ağının yüzeyine yapışırlar gözlemlenmiştir. Tam LCE ağı içinde hücre bağlanması ve genişleme incelemek için, hücreler, 30 gün (Şekil 7) daha sonra sabitlendi. Hücreler, DAPI ile boyanmış, sabit ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Hücreler, çoğaldı bağlı ve yoğun 3D LCE iskele ağı kapsayacak şekilde genişlemiştir bulunmuştur. ayrıcadaha ayrıntılı analizi, çoğu durumda 3D LCE iskele ağın eğimli bölümleri etkilenmemiştir hücre çekirdekleri uzama, ortaya koymuştur. Hücre uzaması, hücre hizalama korelasyon ve büyük olasılıkla sunulan LCE ait smektik-faz özelliği sonucu olabilir. Bu daha önce 14 gün sonra 27 büyüdü C2C12 hücrelerinde gözlenmiştir. Bu çalışmada, hücrelerin fazla 14 gün süreyle çoğalmaya devam ettiğini göstermektedir; Bu tek başına C2C12 hücrelerinde sınırlı değildir. LCE köpüklerin kullanılması, hemen hemen herhangi bir hücre hattı için genişletilebilir. 3D LCE köpük benzeri İskeleler üzerinde büyüyen hücreler 2B iskeleleri kıyasla daha yüksek kütle aktarım verimliliği yarar. 2B iskeleler, hücreler genellikle birbirinin üstüne, tabakalar halinde büyür. Üst katmanlar üzerinde büyüyen hücreler tam bütün besin erişimi, gaz ve atık kaldırma (kütle aktarım) tek olanlardır. alt katmanları içinde hücreler besin erişmek mümkün değildir ve hücre d daha yüksek bir derecede olduğunuBu durumda eath. 3D iskelelerinin içinde, hücreler uzun süreli hücre ve doku rejenerasyonu çalışmaları izin veren elementler, büyüme faktörleri ve gazlara daha verimli (2B iskeleleri kıyasla) erişebilir. 3D LCE köpük benzeri iskele kullanarak Hücre atık yönetimi (atık uzaklaştırma) ayrıca 2D iskeleleri daha etkilidir. LCEs gözenekliliği (ve / veya diğer yapısal özellikleri) hızlı kitle taşımacılığı ve daha az gözenekli (veya diğer) matrisler, izin ortam ve matris merkezi bölgelerine hücresel erişim ile karşılaştırıldığında artmış bir hücre yüklenmesine olanak sağlar. Bu LCE platformu diğerleri arasında kas, sinir ve deri dahil olmak üzere, birinci ve ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri, birçok türde büyüme, hem de çok-hücreli kültür sistemleri destek tarafından ayarlanabilir. Uzun süreler boyunca birçok farklı hücre tiplerini ve sistemleri büyümek için kullanılabilir beri Esasen, bu, platformun faydalarından biridir. Buna ek olarak, yetenek daha yakından emülsiyonun yapısındaki hücrelerin çok katmanlı büyümeyeates doğal ortamları.

Şekil 1
Şekil 1: LCE köpüklerin adım adım hazırlanmasını ve tanımlanmasını tarif genel prosedür. Detaylar için protokol bölümüne bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: 3 kollu SBC çapraz bağlama düzeni. köpük benzeri LCEs hazırlanması için bir nikel metal şablonunun varlığında çapraz bağlayıcılar olarak biscaprolactone veya HDI kullanılarak 3-kol SBC çapraz bağlama düzeni gösterilmektedir. Bu figu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınyeniden.

Şekil 3,
Şekil 3: 1 H NMR ve FT-IR ve ardından 1,2,3-triazol oluşumu (başarılı bir "klik" reaksiyonu) Şema. Azid grubu ile halojen grubunun yer değiştirmesi 2.100 cm görünüşü ile doğrulanır - 1 bant kullanılarak zayıflatılmış toplam yansıma (ATR) FT-IR. 1 bant ve 1H NMR spektrumları 7.30 ppm'de görülen bir tekli görünümünü, - triazol halkası oluşumu 2.100 cm kaybolması ile teyit edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
Şekil 4: Optik görüntülerçapraz bağlamadan önce çeşitli köpük şekillerinin. gösterildiği gibi metal köpük, kesme ve istenen forma şekillendirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,
Şekil 5: (A) ve (B) görünüşü çapraz bağlanma öncesinde Nikel köpük. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6: LCE köpük morfoloji, tarama elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak gözlenmiştir. SBC bazlı (a ve b) ve YİM bazlı (c LCE köpüklerin Örnek SEM görüntüleri d) elastomerler gösterilmiştir. Oklar çukur dikmeler göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 7,
Şekil 7: 30 gün sonra tohumlama, elastomer köpük bağlı SH-SY5Y hücrelerinin DAPI ile boyanmış çekirdekler sergileyen Konfokal mikrografları. 2D görüntüler z yönü içinde istiflenmiş ve kesit XZ görüntüler - ve yz -planes oluşturulmuştur. görüntüleri göstermektedir ki, SH-SY5Y hücreleri (parlak noktalar) eklenmiş ve elastomer köpükten mamul içi boş kanalların duvarları içinde büyüdü. Hücreler uzamsal çoklu katmanlar genişletilir ve XZ 'de gösterildiği gibi (bir yapı ile 100 um üzerinde genişletilmiş - ve yz -plane görüntü çapraz sekları). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Film 1
Film 1: Bir LCE rulo deformasyon ve kurtarma video görüntüleri. Bu videoyu görüntülemek için buraya tıklayın. (Indirmek için sağ tıklayın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sıvı kristal elastomerler son zamanlarda nedeniyle uyaranlar tepki için biyouyumlu hücre yapı iskeleti olarak incelenmiştir. Bunlar hücre yapı iskeleti olarak ideal bir platform olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hazırlama ve yeni bir LCE iskele tasarlarken akılda tutulması gereken önemli bir faktördür gözeneklilik olduğunu. Sızabilir katı 23 ya da gazların dahil, her zaman homojen gözenekli ya da tamamen birbirine gözenekler ile sonuçlanmaz. kazınmış edilebilir bir metal şablonun kullanılması, hem daha organize ve düzenli iç yapıya sahip imkanı sunuyor, aynı zamanda gözenek boyutu ve yoğunluğu seçilmesine izin verir. Bu, daha önce grafin köpüklerin 22 hazırlanması için kullanılan metal şablon doğrudan ilişkilidir. Metal şablonları da düzenli porozite de sofistike ve karmaşık yapımında da olasılıklar geniş bir dizi izin veren LCE çapraz bağlama öncesi şekiller oluşturacak şekilde fırsatyakından endojen ortamları benzemeye imzaladı. Köpük LCEs Bu metodoloji kullanılarak hazırlanan hücre maddenin daha iyi çalışma ve daha da önemlisi, izin uzamsal hücre-hücre etkileşimleri, iki boyutlu (2D) ortamlar içinde mümkün olmayan bir başarı. 2B hücre iskeleleri hücreler serbestçe komşu hücrelerle etkileşime izin vermez. Buna ek olarak, hücreler tipik olarak etkileşim için daha da önemlisi, büyüme için alan ve, tam erişim olmadan tek tabaka halinde (ya da doğrudan birbiri üstünde) büyür. Potansiyel implantlar veya oturma sistemlerini yansıtmak üzere tasarlanmış uzun vadeli deneysel platformlar olarak yapıları tasarlarken böyle nöronlar ve glial hücreler gibi özel mekansal etkileşim hücre tipleri, büyük önem arz etmektedir.

Burada sunulan için modüler bir metal şablon kullanılarak solvent içermeyen LCE sentezi, monomerlerin 7 doğru merkezi düğüm ve oranı seçerek hidrofilik / hidrofobik dengesi ayarlanması, hücre yapışmasını ayarlamalar yapılmasını sağlar 27. Bu Matrigel katman eklenmesini içeren fazladan bir adım önlemek için hücre ekiminden ilgilendirmektedir, genellikle hücre eki tanıtmak için aferin. bunlar LC elastomerlerinin termal ve mekanik özelliklerini etkileyebilir olarak miktarı ve merkezi düğüm boyutu, hem de çapraz bağlayıcı, son LCE kritik roller oynar. LCE 6 olarak azaldıkça dokusunun tam rejenerasyonu uyacak şekilde, daha önce sunulan ek olarak, bu aynı zamanda, biyolojik oranlarının olarak ayarlanmasına olanak tanır. Şu anda, çapraz bağlayıcı, merkez çekirdeğin, ve D değiştirilmesi tipi, L -lactide L -lactide elastik özellikler, hücre yapışmasını, proliferasyon ve hücre hizalama nasıl etkilediğini araştıran odaklanan eden deneyler vardır.

Bu protokolün sınırlamaları şunlardır: (1) ticari olarak temin edilebilen metal (nikel) köpükler ve payanda boyutlarında sınırlı aralığın sınırlı çeşitli, (2)LCE veya başka bir polimer / elastomer malzeme kimyasal olarak (burada, bir FeCl3 aşındırma), metal etch koşullarını karşı ve hücre hizalama Burada bildirilen sıvı kristal tadil edilmiş elastomerler ile sınırlı görünmektedir ki (3) gerçek zorunluluğu (ana olmayan LCE elastomerler kayda değer herhangi bir hücre hizalama göstermemiştir).

Sonuç olarak, daha önce SmA LCEs modüler sentez prosedürü kullanılarak hazırlanabilir gösterilmiştir. Ilave biyo-uyumlu LC kısımları kendi mekanik özelliklerini ve hücre proliferasyonu ve, özellikle de, hücre hizalama yeni sıvı kristalin etkilerini araştırmak için dahil edilebilir. Mekanik özellikler, özel olarak, Young modülü değerleri, hücre adezyonu, çoğalması ve hücre hizalama için kritik olduğu bilinmektedir. Burada sonuç SmA LCEs gözenekliliği gözenek boyutunu kontrol etmek için etkili bir yol temin etmek üzere ve LCE uyarlamak için bir metal şablon kullanılarak ayarlanmış edilebileceğini göstermektedirşekil (yani, genel olarak morfoloji). Ni şablonu oyma ardından SCB polimer karışımı içine Ni şablonu, Daldırma yeni LCE morfolojileri için kolay bir yaklaşım sağlar. Burada tarif edilen köpük benzeri LCEs hücrelerini temin (burada, SH-SY5Y nöronal fonksiyonu çalışma için standart bir hücre modeli) büyüme ve etkileşim için daha gerçekçi bir 3D ortam ile. çok sayıda hücre tipleri elastomer yakından endojen nöral ortamlar taklit ediyor ve daha gelişmiş 3D doku kültürü deneylerin ilginç imkanı sunuyor boyunca dağılmış birden fazla katmanda büyümeye izin vermek. yerli mimarileri taklit etmek ayarlanabilir ve dinamik LCEs kullanımı boyuna ve klinik olarak anlamlı hücre çalışmaları için yeni nesil cep modelleri için önünü açıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu projenin mali destek için - Yazarlar Kent State University (ReMedIKS Kent State Rejeneratif Tıp Girişimi ortak araştırma hibe ve destek) teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9 (2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Tags

Biyomühendislik Sayı 122 Sıvı Kristal elastomerler 3D Gözenekli Yapı iskeleleri Hücre Yapı iskeleleri Hücre Hizalama Hücre Directionality Biyouyumlu
3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prévôt, M. E., Ustunel,… More

Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter