Introduction
결핵 (TB)는 40 년 1 항 결핵 화학 요법의 유용성에도 불구하고 심각한 세계 보건 위협 남아있다. 이 비 준수 (2) 환자에 이르게 여러 약물 조합을 사용하여 6 개월의 긴 치료 기간에 대한 요구에 부분적으로 기인한다. 임상 적으로 승인 된 약물의 개발에 성공 3 사실상 존재이다 최근 약제 내성 결핵의 출현은 상기 전계의 문제를 배합했다. 사실, 철저한 항 결핵 약물 개발에도 불구하고, 단 하나의 약물은 FDA가 지난 40 년 4 임상 사용이 승인되었습니다. 따라서, 항 결핵 약물의 새로운 세대는 시급히이 문제를 해결하기 위해 필요하다.
결핵 신약 개발의 핵심 문제는 임상에서 효능을 시험 관내 활성을 가진 화합물에서 성공적으로 전송의 부족이다= "외부 참조"> 5, 6, 7. 처음에, 목표 기반의 접근 방식은 전체 박테리아 세포로 번역하는 데 실패 방지 MTB 약 5,을 선별하기 위해 사용되었다. MTB 세포가 사용되는 경우에도, 그것은 종종 정확하게 생체 8,9 약물 효능을 예측할 수없는 배양액 성장 배양 물을 사용하여 수행된다. 이러한 문제가 인식되었고 MTB 잠복 또는 MTB 대 식세포를 함유하는 약물 스크리닝 분석은 성공적으로 8, 10, 11, 12을 확립하고있다. 그러나, 이들 고급 분석법 약물 비 혈관 폐 병변 발생 관통 장벽 충분한 고려를하고,하지 감염 부위의 괴사 병소이다. 과연심지어 첫번째 줄 TB 약물 리팜피신위한 차선 투여 인해 생체 조직 및 뇌척수액 (CSF)의 불충분으로 문제시 된 세포 MTB (8, 9)에 대해 효능을 감소뿐만 아니라 13 14 15 침투. 의심 할 여지없이 TB 신약 개발 노력을 향상시킬 것이다 초기 리드 개발 과정에서 계정에 이러한 매개 변수를 걸릴 것 같은, 새로운 모델과 분석으로.
이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 최근 MTB 약물 효능 검사 (16)에 대한 저렴하고 신속하고 BSL-2 호환 대안 감염 모델을 설립했다. 생리 학적으로 관련 세포 침투 장벽을 효과적으로 요약 및 대 식세포 계대를 생성 밀도가 생산 큰 식세포 집계 구조 내에서 MTB 포장이 감염 모델,
여기서는 상세히 REMA를 사용 약제 감수성 테스트 식세포 계대 MTB 적합한 생산하는 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 설명한다. 특히,이 감염 시스템을 후보 항 결핵 약물의 스크리닝과의 호환성을 위해 96- 웰 포맷으로 구성 될 수있는 방법을 보여준다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 :이 6206는 avirulent 변형 17, 18 결핵균의 MC 바와 같이,이 프로토콜의 모든 작품은 바이오 안전성 레벨 2 시설 (BSL-2)에서 수행 할 수 있습니다.
M. 결핵 엠씨 2 표현 녹색 형광 단백질 1. 문화 조건 6206 (MTB -GFP)
참고 : M. 결핵 H37Rv는 영양 요구 균주에게 6206 엠씨 (2) 유도 (Δ panCD, Δ leuCD) 플라스미드 pMN437을 발현하는 GFP가이 프로토콜 16에서 사용되는 형질 전환. 비 GFP 연구자의 변형 쉽게 접근 가능하도록 야생형 균주를 발현과 MTB -GFP의 피로를 대체 할 수있다. 그러나, GFP 발현은 식균 작용과 MTB / 대식 세포의 응집체 형성을 육안으로 확인 가능하게하는 것이 바람직하다. 경도의 경우g의 장기 저장은, MTB -GFP 20 % 글리세롤로 보충 (단계 1.1에서 설명) 전체 7H9 미디어에서 -80 ° C에서 동결했다.
- 10 % 미들 OADC, 0.02 %의 틸록 사폴, 24 μg의 / mL의 D-판토텐산, 50 μg의 / ML의 L-류신 50 μg의 / mL의 하이 그로 마이신 B를 함께 7H9 매체를 보완하여 완전한 MTB -GFP 미디어 (7H9-C)를 준비
- MTB -GFP의 한 유리 병을 해동하고, 30 mL의 사각형 바닥이 PETG 플라스크에 7H9-C 10 mL를 추가 할 수 있습니다.
- 회전 진탕 (50 회전)에 37 ° C에서 품어. 광학 밀도 측정 (OD 600) 며칠마다 OD 600 1.0 (약 5-8일)에 도달 할 때까지 가져 가라.
- OD를 0.2 ~ 600 사이에 유지하기 위해 희석 통로 배양.
- 감염의 경우, 대수 성장 단계 (OD 0.6-1 600) 내에서 MTB -GFP의 확립 된 문화를 사용합니다. 큰 덩어리의 문화를 방지하기 위해 수조에 MTB 문화 플라스크를 초음파 처리 (130 W 3 × 5의 펄스) ONC전자 또는 일주일에 두 번
2. 문화 조건 THP-1 세포
- 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민 및 10 mM의 HEPES과 RPMI 1640 배지를 보충함으로써 완전한 THP-1 세포 배지 (RPMI-C)를 준비한다.
- 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 37 ℃에서 T-75 플라스크에서 세포를 부화.
- 혈구를 사용하여 세포를 계산하거나 매일 유동 세포 계측법 0.1 mL를 당 만 0.6 사이의 밀도 THP-1 세포를 유지한다.
3. 감염 프로토콜 MTB / 대 식세포 집계 구조를 생성합니다
- THP-1 세포의 준비 (96 웰 플레이트 당)
- 5 분 250 XG에 원심 분리기 7 × 10 6 THP-1 세포. 7 mL의 RPMI-C에 재현 탁.
- MTB -GFP 준비
- 원심 분리기 2.8 × 10 8 MTB -GFP 스윙 - 양동이 원심 분리기에서 3,200 XG에 5 분에서 유OD 600 1.0 = 3 × 10 8 박테리아 / mL로의 변환을 노래.
- 단계 3.2.1에서와 같이 RPMI-C와 원심 분리기로 한 번 씻으십시오.
- 10 초 7 mL의 RPMI-C에 재현 탁하고 소용돌이.
- 감염
참고 : 템플릿 그림 1을 참조하십시오.- 배지의 증발을 방지하기 위해 물 림 로우 A 및 H 및 칼럼 1, 12 멸균 물 200 μL를 첨가하여 96- 웰 플레이트를 준비한다.
- 배경 제어 (빈)에 대한 2 열 (G2에 B2) 200 μL RPMI-C를 추가합니다.
- 감염, THP-1 세포 현탁액 (3.1 단계)에 MTB -GFP 서스펜션 (단계 3.2)을 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. 최종 THP-1 세포 밀도는 용액 당 5 × 105이고, 감염에 대응하는 다수의 40이다.
- 25 mL의 저수지에 THP-1 / MTB -GFP 서스펜션을 따르십시오.
- (G11를 통해 B3) THP-1 나머지 96 우물에 / MTB -GFP 서스펜션의 200 μL 날기 추가GA 멀티 채널 피펫.
참고 : 여러 96 웰 플레이트로 작업하는 경우, 정기적으로 더 혼합물을 각 웰에 첨가되어 있는지 확인하기 위해 탱크에 남아있는 THP-1 / MTB 서스펜션을 재현 탁. - 7-10일 5 % CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션.
- 천천히 (100)을 제거하여 2 일마다 미디어를 변경 μL 100 μL 멀티 채널 피펫을 사용하여 RPMI-C를 미리 예열 추가 잘 부드럽게 각각의 상단에서 미디어를 보냈다. 우물을 재현 탁하고 우물의 바닥에있는 MTB / 대 식세포 집계를 방해하지 마십시오.
- 시각 MTB / 대식 세포 응집체의 크기의 노트를 가지고, 매일 형광 현미경 (4-10X 목적)에 의해 우물을 검사합니다. 하루에 7-10으로 MTB / 대 식세포 집계가 충분히 커야한다 약효 시험 (제 4 절) 동안 진행 (참조 그림 2 참조).
- 원하는 경우, 자동 세포 이미징 시스템을 이용하여 96 웰 캡처 이미지 끼워밝은 필드와 GFP 필터 MTB / 대 식세포 골재 형성을 문서로 설정합니다.
주 : 사용자가 자동화 된 이미징 시스템에 대한 액세스 권한이없는 경우, 대표적인 웰 GFP 이미지 및 시야 기능을 가진 임의의 적당한 현미경을 사용하여 측정 할 수있다.
4. 성장 억제 분석은 MTB / 대 식세포 집계에서 파생 의약품 효능에 대해 MTB 평가하기
- 약물 준비 (두 약물에 대한 세중의 조건)
참고 : 템플릿도 1a를 참조하십시오.- 별도의 96 웰 플레이트에서 G10까지 B2에 7H9-C 미디어의 125 μL를 추가합니다.
- 단계 4.2.4의 희석을 고려하여 7H9-C의 1 mL에 이중 가장 원하는 최종 농도에서 두 약물을 준비합니다.
- 세중 트리트먼트 각각 우물에 B11-C11-D11와 E11-F11-G11 각 약물의 250 μL를 추가합니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 직렬 DILUTE 시험 약물 B10-G10에 B11-G11에서 125 μL를 이동하여 두 가지. 각 단계에서 5 회 피펫 팅하여 섞는다.
- 플레이트에서 (오른쪽에서 왼쪽) 열에 열에서 125 μL를 이동하고, 열 4 후 중지를 계속합니다.
- 4 열을 혼합 한 후, 폐기물 용기에 125 μL를 폐기합니다. 열 2와 3은 배경 (빈)과 긍정적 인 성장 컨트롤로 사용할 수 있도록 어떤 약물을 포함 할 수 없습니다.
, 또는 테스트 약물 라이브러리도 1b에 템플릿을 따르 참고. 각각의 96 웰 플레이트는 단일 농도에서 58 약물을 수용 할 수있다. 이 단계 4.2.4 절반에 희석되기 때문에 이중 원하는 최종 농도를 사용하여이 약물 플레이트를 준비합니다.
- 약물 치료 :
- MTB를 포함하는 96 웰 플레이트는 대 식세포 (MTB / 대 식세포 집계) -infected 검색합니다.
- 조심 멀티 채널 피펫과 관련된 모든 웰 (G11 내지 B2)을 디 캔트.두 단계의 방법이 수행 첫번째 플레이트 기울임없이 150 μL를 제거하고 플레이트를 기울 웰의 저부 에지에 피펫 팁을 삽입하여 나머지 미디어 (~ 50 μL)을 제거한다. 대 식세포 MTB / 집계가 잘 바닥에 부착 한, 어떤 자료가 손실 될 수 없습니다.
- 조심스럽게 MTB / 대식 세포 집합체를 포함하는 판의 모든 관련 우물 (G11를 통해 B2)에 7H9-C 미디어의 100 μL를 추가합니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 감염 판의 대응 웰에 96 웰 플레이트 (단계 4.1)을 함유하는 약물의 100 μL 옮긴다.
- 밀폐 된 가방에 넣어 37 ℃에서 3 일간 배양한다.
레사 주린 미세 적정 분석을 사용하여 정량 약물 효능의 (5)
- 0.8 mg의 최종 농도 원액 레사 주린 준비 / ㎖가 H 2 O.은 멸균 0.22 ㎛의 공극 크기의 PVDF 막 필터를 통해.
- 1 : 1 비율의 2 레사 주린 원액, H 2 O 및 트윈 80 (H 2 O 20 % 용액)을 혼합하여 용액을 준비 작업 레사 주린. 최종 농도가 0.4 ㎎ / ㎖ 레사 주린의 5 % 트윈 80이다.
- 플레이트 판독기 설치 530 nm의 여기 및 590 nm의 발광 37 ° C에서 24 시간 동안 매 30 분에서 형광을 판독 할 수있는 프로그램을 사용. 37 ° C까지 사전 따뜻한 플레이트 리더.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 약물 치료 플레이트 (단계 4.11)의 모든 관련 우물 (G11를 통해 B2)에 레사 주린 작업 용액 20 μL를 추가합니다.
- 플레이트 리더에 접시를 놓고 단계 5.3에서 설정 프로그램을 시작합니다.
주 : 분석 플레이트의 대량의 처리를 용이하게하기 위해, 37 ° C의 배양기에서 분석을 개발하고 단일 형광 24 시간마다 판독을 수행하기에 충분하다. 이것은 또한 운동 기능 배양 플레이트 리더에 대한 액세스 권한이없는 사용자들에 적용 가능하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
96 웰 플레이트 형식으로이 감염 모델을 적응의 견고성을 확인하기 위해, 우리는 여기에 그림에 주어진 템플릿에 따라 약물 우리의 96 웰에서 파생 된 MTB의 감수성 감염 리팜피신에 모델 (RIF) 및 목시 플록 사신 (MOXI를) 적응을 조사 (1A). 우리는이 분석의 핵심 MTB / 대식 세포 집합체 구조의 생성을 확실하게함으로써, 스루풋의 호환성 (도 1b)를 가능하게하는 96- 웰 플레이트 포맷 (도 2)에서 생성 될 수 있음을 보여준다. 대 식세포 MTB 직접 잘 특성화 레사 주린 미세 적정 분석 (도 3)를 사용하여 약효 시험에 이용 될 수있는이 방법으로 제조 계대.
레사 주린 분석은 불소에 푸른 레사 주린 변환 대사 활성 MTB에 의해 생성 된 산화 종에 의존로서핑크 레조 루핀 (resorufin)를 escent 색상과 형광의 변화는 박테리아의 성장의 양을 결정하기 위해 대리 마커로서 사용할 수있다. 도 3a에서는 확실 배양 불과 3 일 후 약물의 부재하에 복제 할 수있는 가능한 MTB 세균을 검출하는 분석법 레사 주린 내의 충분한 감도가 있다는 것을 보여준다. 종료점 색 변화를 시각적으로 확인 성장의 대략적인 평가하지만, 우리는 정확하게 역학적 플레이트 리더 (도 3b)을 이용하여 그 형광 레조 루핀 (resorufin) 레사 주린 대사로의 전환을 측정함으로써 정량 할 수있다. 긍정적 인 성장 제어 (약물의 부재)에 정상화, 이러한 데이터를 사용하여 대 식세포 계대 MTB에 대한 약물의 효능을 시각화하는 감수성 죽이는 곡선의 계산 (그림 4) 수 있습니다.
다음으로,도에서 대표적인 결과 3 4 90 % 성장 억제가 관찰되는 항생제의 최저 농도로서 정의 최소 억제 농도 (MIC)는, 우리의 감염 모델로부터 유도 MTB에 대해 모두 리팜피신 및 목시 플록 사신에 대한보다 2 μg의 / ㎖임을 보여준다. 이것은 우리 감염 모델 세포 MTB 8에 대해 측정 MIC 값에 맞춰 더있는 안티 MTB 약물의 효능을 예측하는 것을 보여 주며, 따라서 배양액 성장 세균 세포를 사용하는 대부분의 MTB 약물 감수성 검정에서 무시 확산 장벽 특성을 반영한다.
중요한 것은, 96 웰 형식으로 기술 된 분석법을 사용하여 얻어진 데이터는 우리가 이전 식세포 계대 MTB 16 대 리팜피신 및 목시 플록 사신 결정했던 것과 매우 유사한 결과를 보였다.
그림 1 : 약물 플레이트 레이아웃. 4 단계에서 사용되는 약물 도전 판 (A) 예 템플릿이 8 정의 농도 세중의 우물에서 두 약물의 병렬 테스트 할 수 있습니다. 대표적인 실험으로, 우리는 각각 2 μM 2.5 μM에서 시작 리팜피신 (RIF) 및 목시 플록 사신 (MOXI)을 사용했다. (B) 스크리닝에 대한 대안 템플릿은 하나의 농도에서 화합물 (58)의 테스트 가능성을 보여주기 위해 제공된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : MTB의 생성 / 대 식세포 집계 구조 96 웰 플레이트에체재. (A) 대표 밝은 필드와 GFP는 9 일 후 감염에 MTB -macrophage 골재의 이미지를 합병했다. 이미지는 3 개별적으로 촬영 된 이미지에 의해 3의 몽타주를 바느질하여 전체 잘 문서화 자동화 된 세포 이미징 프로그램을 사용하여 4X 목표로 촬영되었다. (B) (A)에 도시 한 시야에서 개별 비 스티치 이미지. (C) 대표는 10 배의 목적으로 촬영 된 MTB / 대 식세포 집계 구조의 밝은 필드와 GFP 이미지를 합병했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : MTB 생존율을 측정 레사 주린 미세 적정 분석을 이용하여. (A)의 존재 viablE MTB 세포는 단순히 핑크, 환원 된 형태로 청색 레사 주린 염료의 변환에 의해 결정될 수있다. 대표 결과는 그림 1A에 템플릿에 따라 리팜피신 (RIF) 및 목시 플록 사신 (MOXI)를 사용하여 여기에 표시됩니다. 단계에 기재된 바와 같이 (B) 정량적 개별 웰의 형광 (도 3a에 상당), 레사 주린의 전환율을 측정 5. 대표적인 미니 그래프는 시간에 대한 상대적인 형광 단위 (y 축)를 보여준다 24 시간 동안 동 역학적으로 모니터링 하였다 (X -중심선). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : REMA 데이터에서 곡선을 죽이는 약물 감수성을 결정. 최대 resaz시 상대 형광 단위(A) 및 리팜피신 (도 3B)에서 (B) 목시 플록 사신 처리 웰 urin 신호는 100 % 생존율로 약물없이 제어 (최대 MTB 성장)로 표준화 하였다. 배경 제어 (빈) 신호는 잘 모든 샘플에서 제외되었다. 생존율 %가 사멸 곡선을 생성하는 약물 치료의 각각의 농도에 대해 플롯 하였다. 이 그림의 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 SD ± 수단을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서는 상세히 약효 시험에 적합한 다른 MTB 감염 모델을 설명 하였다. 이 모델은 계정 초기 결핵 약물 개발 과정에서 더 고려를 부여해야 두 가지 주요 요인을 취 약물 침투와 감염시 MTB의 대사 변화에 생리 학적으로 관련 장벽의 존재. 우리는 이전에 우리 감염 모델의 이점을 도시 처리량 호환성 16 감염을 스케일링 가능성을 제시하고 있지만, 여기에서 우리는 96 웰 플레이트 형식으로 직접 시스템을 채택함으로써 실제로 달성 할 수 있음을 보여준다. 이 피펫에 요구를 제거하고, 응집체의 크기는 크기에 도달 할 수있는 본래 어려운 개별 웰에 큰 배양 플라스크로부터 응집체를 분산으로 MTB / 대식 세포를 생성하는 능력은 96 웰 플레이트에서 직접 집계 유리한> 500 μm의. 감염된 대 식세포 응집체의 큰 사이즈는 팁을 막히게 있거나 광범위한 피펫이 집계 깨지 것처럼 처리량 분석에 필요한 P200 멀티 채널 피펫을 사용하지 않도록한다. 96 웰 플레이트에 감염이 시스템의 변형은 필요한 조작 단계의 양을 감소시키고 MTB / 대식 세포 응집체 유사한 양의 균일 웰를 생성한다. 이와 같이, 상기 분석 장치뿐만 아니라 생체 내에서 리드 후보 화합물의 효과를 예측하는 초기 개발 프로세스에서 특히 유용하지만, 약물 라이브러리를 스크리닝한다.
설명 감염 모델의 주요 장점은 BSL-2 호환 MTB 균주의 활용이다. BSL-2 조건에서 작동 할 수있는 능력은 매우 비용 효율적이다 프로토콜의 조작을 촉진하고, 가장 중요한을 수행하는 BSL -3- 설비에 액세스 할 수없는 실험실있게그 자체로는 약물 스크리닝 분석을 진행. 이용 된 영양 요 MTB의 MC 2 6206 균주는 약물 내성 또는 내성 (16)에 영향을주지 않습니다 4 유전자, panCD 및 leuCD 있지만, 모든 유지 H37Rv 17, 18의 유도체이다. 이러한 M.의 우형 BCG와 M.가 smegmatis, 6206이 가장 밀접하게 MTB H37Rv, 발병 기전 연구를위한 기준의 피로를 악성 관련이 MTB의 MC 2와 같은 다른 일반적으로 사용되는 MTB의 대리에 비해. 중요한 것은 BCG에서 결석과 MTB의 독성과 육아종 형성 (19)에 중요한 역할을하는 RD-1 궤적을 유지합니다. 비교적, MTB의 MC 2 6206은 MTB에서 genomically 다른 빠르게 성장하는 종과 다른 항생제 내성 프로파일을 가지고 M. smegmatis보다 TB-신약 개발 분석에 더 관련이.
여기에 설명 된 분석으로 인해 유연성의 높은 수준으로도 가치가있다. 우리는 (도 3)뿐만 아니라, 전체 약물 라이브러리 (도 1b)의 스크리닝 도시 한 바와 같이 MTB / 대식 세포 응집체를 함유하는 96- 웰 플레이트뿐만 아니라 삼중 약물 치료의 적정을 위해 사용될 수있다. 단일 농도에서, 각각의 96 웰 플레이트 (58)의 화합물을 스크리닝 할 수있다. 감염 시스템의 기반이 완전히 실현하는 384- 웰 플레이트로 구성되는 경우,이 번호는 급격 300>에 화합물 증가 우리가 단지 박테리아 3 일간 복제시킨 후 강한 레사 주린 신호를 얻는 사실있다. 사실, 다운 스케일링 작고 웰 포맷에 맞게 볼륨을 비례 기타 같은 프로토콜의 대부분은 그대로 유지하는 것보다, 384 웰 플레이트 형식으로이 시스템을 적용하기가 비교적 간단하다. 레사 주린 분석에 적합한 신호를 사용하려면이 될 수있다충분한 박테리아 복제 허용 4.2.5 7 일 단계에서 배양을 확장하는 데 필요한.
MTB 생존에 대한 판독과 레사 주린 분석이 감염 모델을 결합하는 것은 많은 장점, 즉 비용 효율성과 빠른 분석 프로토콜 등 BACTEC 460 (20)와 같은 다른 골드 표준 시스템에 필적하는 결과를 가져 오는 동안을 가지고 있지만, 그럼에도 불구하고 몇 가지 한계를 가지고있다 . 그것은 단지 신진 대사 활동을 측정하기 때문에 레사 주린 분석은 정균 및 살균 약물 구별 할 수 없습니다. 이것은 신진 대사 활동이 잠재 MTB에서 본질적으로 낮은으로, 기억해야 할 중요한 제약 조건입니다. 그러나, 이러한 분석의 핵심 요소는 레사 주린 분석 이외 MTB 약물 감수성에 대한 판독 - 아웃과 호환 될 수있는 감염 모델이다. 예를 들어, 약물 투여 후, 웰을 직접 금 스탠 콜로니 형성 단위 (CFU) 계산 밖으로 도금 될 수도(이 스크리닝와 호환되지 않습니다하지만) dard은 화합물의 살균 작용을 테스트합니다. 대안 적으로,이 시스템은 21 CFU를 카운트 밀접한 상관 관계를 도시 한 발현 MTB를 루시퍼 라제에 결합 될 수있다. 약물 감수성을 측정하기 위해 루시퍼 라제 시스템을 이용하려면 프로토콜 만이 변화가 요구된다 : MTB의 -luciferase 및 5 단계에서 레사 주린 대신에 밝은-글로의 루시페린 시약 II)을 사용하여 MTB -GFP의 난) 교체. 상당히 384- 웰 플레이트 포맷에 쉽게 호환 될 수준 분석 감도를 증가시키면서 MTB 30 분으로 분석의 개발을 단축 할 발현 루시퍼 용도.
요약하면, 우리는 성공적으로 비교적 적은 조작 단계, 재현성이있는 96- 웰 플레이트 형식으로이 감염 모델 및 시동 무단 양을 생산하는 능력을 전환 된소재, 처리량 호환성의 모든 핵심 요소. 이 분석은 초기 MTB 신약 개발 과정에 소중한 자산 만들기, 또한 다양한 형식과 읽기 아웃에 쉽게 적응할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
