Introduction
Tuberkulose (TB) er fortsat en alvorlig global sundhedstrussel trods af tilgængeligheden af anti-TB kemoterapi i over 40 år 1. Dette skyldes til dels, at kravet om lange behandlingsperioder på over seks måneder ved hjælp af flere lægemiddelkombinationer, hvilket fører til patient manglende overholdelse 2. Fremkomsten af multiresistent tuberkulose i de seneste år har yderligere forværret problemer på et område, hvor vellykket udvikling af klinisk godkendte lægemidler er nærmest ikke-eksisterende 3. Trods omfattende anti-TB lægemiddeludvikling, har kun et enkelt lægemiddel været FDA godkendt til klinisk brug i de sidste 40 år 4. Således er der et akut behov for nye generationer af anti-TB-medicin for at løse dette problem.
Et centralt problem i TB lægemiddelforskning er manglen på vellykket overførsel fra forbindelser med in vitro-aktivitet til effekten i kliniske omgivelser= "xref"> 5, 6, 7. I første omgang blev mål tilgange der anvendes til at screene for anti Mtb lægemidler 5, som har undladt at oversætte til hele bakterieceller. Selv når der anvendes Mtb-celler, er det ofte udført under anvendelse bouillon dyrket kulturer, som ikke nøjagtigt forudsige lægemiddel effektivitet in vivo 8, 9. Disse problemer er blevet anerkendt og lægemiddelscreeningsassays mod makrofager indeholder Mtb eller latent Mtb succes er blevet etableret 8, 10, 11, 12. Men selv disse mere avancerede analyser ikke give tilstrækkelig hensyn til de Indtrængningsbarriererne at narkotika møder i de ikke-vaskulariserede lungelæsioner, og i den nekrotiske foci på stedet for infektion. Ja, Selv for den første linje TB stof rifampicin, har suboptimal dosering sat spørgsmålstegn på grund af utilstrækkelig in vivo væv og cerebral spinalvæske (CSF) penetration 13, 14, 15 samt nedsat effektivitet mod intracellulær Mtb 8, 9. Som sådan, nye modeller og analyser, der ville tage hensyn til disse parametre i den tidlige bly udviklingsprocessen vil utvivlsomt forbedre TB drug discovery indsats.
For at imødekomme dette behov, vi for nylig etableret en billig, hurtig og BSL-2 kompatibel alternativ infektion model for Mtb narkotika effektivitetsforsoegene 16. Denne infektion model produceret tæt pakket Mtb inden for store makrofag aggregerede strukturer, som er gengivet fysiologisk relevante cellulære Indtrængningsbarriererne og genererede makrofag-passage
Her beskriver vi i detaljer generation af Mtb / makrofag samlede strukturer til at producere makrofag-passeret Mtb egnet til resistensbestemmelse hjælp REMA. Især viser vi, hvordan denne infektion system kan tilpasses til en 96-brønds format for kompatibilitet med throughput screening af kandidat anti-TB-medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Da M. tuberculosis mc 2 6206 er en avirulent stamme 17, 18, kan alle arbejde i denne protokol udføres i en biosikkerhedsniveau 2 facilitet (BSL-2).
1. Kultur Betingelser for Green Fluorescent Protein udtrykker M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb GFP)
BEMÆRK: M. tuberculosis H37Rv afledt auxotrof stammen mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) transformeret med GFP udtrykkende plasmid pMN437 anvendes i hele denne protokol 16. Det er muligt at erstatte Mtb GFP stamme med ikke- GFP udtrykkende vildtypestamme for at muliggøre lettere tilgængelighed af stammen for forskere. Men GFP-ekspression er ønskeligt, at visuel bekræftelse af fagocytose og dannelse af Mtb / makrofag aggregater. For long opbevaring sigt, blev Mtb -GFP frosset ved -80 ° C i komplette 7H9 medier (beskrevet i trin 1.1) suppleret med 20% glycerol.
- Forbered komplet Mtb GFP medier (7H9-C) ved at supplere 7H9 medium med 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 ug / ml D-pantothensyre, 50 ug / ml L-leucin og 50 ug / ml hygromycin B.
- Tø et hætteglas af Mtb GFP og tilføje til 10 ml 7H9-C i en 30 ml firkantet bund PETG kolbe.
- Der inkuberes ved 37 ° C på roterende ryster (50 rpm). Tag densitet målinger optiske (OD 600) hver par dage, indtil OD600 når 1,0 (ca. 5-8 dage).
- Fortynd og passage kultur efter behov for at opretholde en OD600 mellem 0,2-1,0.
- For infektion, bruge en etableret kultur af Mtb GFP inden den logaritmiske vækstfase (OD600 på 0,6-1). For at undgå clumpy kulturer, sonikeres den Mtb kultur kolben i et vandbad (130 W; 3 x 5 s impulser) once eller to gange om ugen
2. Kultur Betingelser for THP-1-celler
- Forbered komplet THP-1-celle-medier (RPMI-C) ved at supplere RPMI 1640 medium med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og 10 mM HEPES.
- Inkubér cellerne i en T-75 kolbe ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer eller flowcytometri hver anden dag og vedligeholde THP-1-celler ved en densitet mellem 0,1 og 0,6 millioner pr ml.
3. Infektion protokol til Generer Mtb / makrofag Aggregerede Structures
- THP-1 cellepræparat (per 96-brønds plade)
- Centrifuger 7 x 10 6 THP-1-celler ved 250 xg i 5 minutter. Resuspender i 7 ml RPMI-C.
- Forberedelse Mtb GFP
- Centrifuger 2,8 x 10 8 Mtb GFP ved 3.200 xg i 5 minutter i en svingende spand-centrifuge usynge en konvertering af OD 600 1,0 = 3 x 10 8 bakterier / mL.
- Der vaskes én gang med RPMI-C og centrifugeres som i trin 3.2.1.
- Resuspender i 7 ml RPMI-C og vortex i 10 s.
- Infektion
BEMÆRK: Se figur 1 for skabelon.- Der fremstilles en 96-brønds plade ved tilsætning af 200 pi sterilt vand i rækker A og H, og kolonnerne 1 og 12 for en vand rand for at forhindre fordampning af dyrkningsmedium.
- Tilsæt 200 pi RPMI-C til kolonne 2 (B2 til G2) til baggrunden kontrol (blind).
- For at inficere, tilføje Mtb GFP suspension (trin 3.2) til THP-1 cellesuspension (trin 3.1) og bland godt ved pipettering. Den endelige THP-1 celledensitet er 5 x 10 5 pr ml og den tilsvarende mangfoldighed af infektion er 40.
- Hæld THP-1 / Mtb GFP suspension i en 25 ml reservoir.
- Tilsæt 200 pi af THP-1 / Mtb GFP suspensionen til alle resterende 96 brønde (B3 gennem G11) usinga multi-kanal pipette.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med flere plader med 96 brønde, regelmæssigt resuspender resterende THP-1 / Mtb suspension i reservoiret for at sikre en jævn blanding sættes til hver brønd. - Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-10 dage.
- Skift medier hver 2. dag ved langsomt at fjerne 100 pi brugt medium fra toppen af hver brønd og forsigtigt at tilsætte 100 pi forvarmet RPMI-C ved anvendelse af en multi-kanal pipette. Må ikke resuspender brøndene og forstyrre Mtb / makrofag aggregater på bunden af brøndene.
- Visuelt undersøge brøndene ved fluorescens mikroskopi (4-10X mål) dagligt, der noterer størrelsen af Mtb / makrofag aggregater. Ved dag 7-10, bør Mtb / makrofag aggregater være tilstrækkeligt stort (se Figur 2 for reference) for at fortsætte til narkotika effektivitetsforsoegene (afsnit 4).
- Hvis det ønskes, tage billeder af de 96-brønde med en automatiseret celle billeddannende system monteretmed lyse felt og GFP filter sætter dokumentere Mtb / makrofag aggregatdannelse.
BEMÆRK: Hvis brugerne ikke har adgang til en automatiseret imaging system, kan tages billeder af repræsentative brønde ved hjælp af enhver egnet mikroskop med GFP og lyse felt kapaciteter.
4. Vækst inhiberingsassay at vurdere Drug effekt mod Mtb Stammer fra Mtb / Makrofager Aggregates
- Drug forberedelse (tredobbelte betingelser for to lægemidler)
BEMÆRK: Se figur 1A til skabelon.- I en separat plade med 96 brønde tilsættes 125 pi 7H9-C medier til B2 igennem til G10.
- Forbered to lægemidler på det dobbelte af højeste ønskede slutkoncentration i 1 ml 7H9-C for at tage højde for fortyndingen i trin 4.2.4.
- Tilsæt 250 pi hvert lægemiddel til brønde B11-C11-D11 og E11-F11-G11, henholdsvis tredobbelte behandlinger.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, serielt dilute testlægemidlerne dobbelt ved at flytte 125 pi fra B11-G11 i B10-G10. Bland ved pipettering 5 gange på hvert trin.
- Fortsæt med at flytte 125 uL fra kolonne til kolonne (højre mod venstre) hen over pladen, og stopper efter kolonne 4.
- Efter blanding kolonne 4, kassere 125 uL ind i en affaldsbeholder. Kolonne 2 og 3 må ikke indeholde stoffer for at muliggøre brug som en baggrund (tom) og positive kontroller vækst.
BEMÆRK: Alternativt kan du følge skabelonen i figur 1B til test narkotika biblioteker. Hver plade med 96 brønde kan rumme 58 narkotika på en enkelt koncentration. Forberede dette stof plade med dobbeltklæbende den ønskede slutkoncentration, da det vil blive fortyndet i halvdelen i trin 4.2.4.
- Drug behandling:
- Hent den 96-brønds plade indeholdende Mtb-inficerede makrofager (Mtb / makrofag aggregater).
- dekanteres forsigtigt alle de relevante brønde (B2 gennem G11) med en multi-kanal pipette.Udfør denne i en to-trins måde: først fjerne 150 uL uden at vippe pladen, og derefter fjerne de resterende medier (~ 50 pi) ved at vippe pladen og indsætte pipettespidsen til den nederste kant af brønden. Som Mtb / makrofag aggregater er klæbende til bunden af brønden, bør intet materiale tabt.
- Forsigtigt tilsættes 100 pi 7H9-C medier til alle relevante brønde (B2 gennem G11) af plade indeholdende MTB / makrofag aggregater.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 100 pi fra lægemiddelholdige 96-brønds plade (trin 4.1) til de tilsvarende brønde i infektionen pladen.
- Anbringes i en forseglet pose og inkuberes i 3 dage ved 37 ° C.
5. Kvantificering af medikamenteffektivitet Brug af Resazurin mikrotiteranalyse
- Forbered resazurin stamopløsning til en slutkoncentration på 0,8 mg / ml i H2O filtreres gennem 0,22 um porestørrelse PVDF-membran til sterilisering.
- Forbered resazurin arbejdsopløsning ved at blande resazurin stamopløsning, H2O og Tween-80 (20% opløsning i H2O) i et 2: 1: 1 forhold. Slutkoncentrationer er 0,4 mg / ml resazurin og 5% Tween-80.
- Anvendelse af en pladelæser, opsætning et program til at læse fluorescens ved 530 nm excitation og 590 nm emission hver 30 min i 24 timer ved 37 ° C. Pre-varm pladelæser til 37 ° C.
- Tilsæt 20 pi resazurin arbejdsopløsning til alle relevante brønde (B2 gennem G11) af lægemidlet behandlede plade (trin 4.11) med en multikanals pipette.
- Placer pladen på pladen læseren og start programmet oprettet i trin 5.3.
BEMÆRK: For at lette behandlingen af store mængder assayplader, er det tilstrækkeligt at udvikle analysen i et 37 ° C inkubator og udfører enkelt fluorescens læser hver 24 timer. Dette gælder også for brugere, som ikke har adgang til en plade-læser med kinetiske og inkuberingsbetingelser kapaciteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bekræfte robustheden af tilpasning denne infektion model til 96-brønds pladeformat, vi her undersøgte lægemiddel modtagelighed Mtb afledt fra vores 96-veltilpasset infektion model overfor rifampicin (RIF) og moxifloxacin (Moxi) ifølge skabelonen angivet i figur 1A. Vi viser, at frembringelsen af Mtb / makrofag aggregatstrukturer nøglen til dette assay kan pålideligt fremstilles i en 96-brønds plade-format (figur 2), hvorved throughput kompatibilitet (figur 1B). Makrofag passeret Mtb fremstillet på denne måde kan anvendes direkte til lægemiddeleffektivitet test vha velkarakteriserede resazurin mikrotiteranalyse (figur 3).
Som resazurin assay er afhængig af de oxidative stoffer produceret af metabolisk aktiv Mtb at konvertere den blå resazurin til fluoratorenescent pink resorufin, kan ændringen i farve og fluorescens anvendes som en surrogatmarkør for at bestemme mængden af bakteriel vækst. I figur 3A viser vi, at der er tilstrækkelig følsomhed i resazurin assay til detektere levedygtige Mtb bakterier, der kan replikere i fraværet af lægemidler efter kun 3 dages inkubation. Mens visuel bekræftelse af endpoint farveændring er kun en omtrentlig vurdering af vækst, kan vi nøjagtigt kvantificere dette ved kinetisk måling af omdannelsen af resazurin til dens fluorescerende metabolit resorufin anvendelse af en pladelæser (figur 3B). Ved hjælp af disse data, normalisering til den positive vækstkontrol (fravær af lægemidler) tillader beregningen af modtagelighed drab kurver for at visualisere medikamenteffektivitet mod makrofag-passeret Mtb (figur 4).
Her er de repræsentative resultater i figur 3 4 viser, at den minimale inhiberende koncentration (MIC), defineret som den laveste koncentration af antibiotikummet hvor der er observeret 90% vækstinhibering, er større end 2 ug / ml for både rifampicin og moxifloxacin mod Mtb afledt fra vores infektion model. Dette viser, at vores infektion model forudsiger effekten af anti Mtb lægemidler, som er mere i overensstemmelse med MIC værdier bestemt mod intracellulær Mtb 8, og dermed afspejler de diffusion barriereegenskaber, der er forsømt i de fleste Mtb stof modtagelighed analyser ved hjælp bouillon vokset bakterieceller.
Vigtigere, opnået under anvendelse af beskrevne assay i 96-brønds format data viste meget sammenlignelige resultater til dem vi tidligere havde bestemt for rifampicin og moxifloxacin mod makrofag-passeret Mtb 16.
Figur 1: Drug plate layout. (A) Eksempel skabelon af lægemidlet udfordring plade anvendt i trin 4. Dette muliggør parallel prøvning af to lægemidler i tredobbelte brønde på 8 definerede koncentrationer. Som repræsentant eksperiment, brugte vi rifampicin (RIF) og moxifloxacin (Moxi) starter ved 2 uM og 2,5 uM, hhv. (B) En alternativ skabelon til screening er også at vise muligheden for afprøvning af 58 forbindelser ved en enkelt koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generering af Mtb / makrofag aggregatstrukturer i 96-brønds pladeformat. (A) Repræsentant lyse felt og GFP fusionerede billeder af Mtb -macrophage aggregater på dag 9 efter infektion. Billeder blev taget med en 4X mål ved hjælp af en automatiseret cell imaging program, der dokumenterer hele godt ved syning en montage af 3 af 3 individuelt optagne billeder. (B) En individuel ikke-sys billede fra synsfeltet vist i (A). (C) En repræsentant fusioneret lyse felt og GFP billede af en Mtb / makrofag samlet struktur fanget med en 10X mål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Brug af resazurin mikrotiteranalyse at måle Mtb levedygtighed. (A) Tilstedeværelsen af viable Mtb celler kan simpelthen bestemmes ved omdannelsen af det blå Resazurinfarvestof til sin lyserøde, reduceret form. Repræsentative resultater er vist her ved hjælp af rifampicin (RIF) og moxifloxacin (Moxi) ifølge skabelonen i figur 1A. (B) for kvantitativt at måle omdannelsen af resazurin, fluorescens af individuelle brønde (svarende til figur 3A) blev overvåget kinetisk i 24 timer som beskrevet i trin 5. Repræsentative mini-grafer viser relative fluorescensenheder (y-akse) versus tid (x -akse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Bestemmelse drug modtagelighed dræbe kurver fra REMA data. Relative fluorescens enheder på tidspunktet for maksimal resazurin signal i (A) rifampicin og (B) moxifloxacin behandlede brønde (fra figur 3B) blev normaliseret til den intet lægemiddel kontrol (maksimal Mtb vækst) som 100% overlevelse. Baggrund kontrol (blind) signaler blev trukket fra hver prøvebrønd. Den procentvise overlevelse blev plottet for hver enkelt koncentration af lægemiddelbehandling til at generere en dræbende kurve. Data i denne figur repræsenterer middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet detaljeret et alternativ Mtb infektion model velegnet til lægemiddeleffektivitet testning. Denne model tager hensyn til to vigtige faktorer, der bør gives mere hensyn i den tidlige TB lægemiddeludvikling proces: tilstedeværelsen af fysiologisk relevante barrierer for indtrængen narkotika og metaboliske ændringer af Mtb under infektion. Mens vi tidligere har vist fordelene ved vores infektion model og foreslået muligheden for opskalering af infektionen for gennemløb kompatibilitet 16, her demonstrerer vi, at dette faktisk opnås ved at tilpasse systemet direkte ind i 96-brønds pladeformat. Evnen til at generere Mtb / makrofag aggregater direkte i 96-brønds plader er fordelagtig, da den fjerner kravet til pipette og distribuere aggregaterne fra en stor dyrkningskolbe i individuelle brønde, som i sagens natur er vanskeligt som størrelserne af aggregaterne kan nå størrelser> 500 um. Den store størrelse af de inficerede makrofag aggregater ville forhindre brugen af P200 multi-kanal pipetter, der er nødvendige for gennemløb analyser, da det enten ville blokere de tips eller omfattende pipettering ville bryde ud aggregaterne. Modifikationen af denne infektion systemet til plader med 96 brønde reducerer mængden af manipulerende nødvendige skridt og genererer ensartede brønde med tilsvarende mængder af Mtb / makrofag aggregater. Som sådan er denne assaysystem er særligt værdifuldt, ikke kun i den tidlige udvikling proces til at forudsige effektiviteten af lead kandidatforbindelser in vivo, men i throughput screening af lægemiddel-biblioteker.
En væsentlig fordel ved den beskrevne infektion model er udnyttelsen af en BSL-2 kompatibel Mtb stamme. Evnen til at arbejde under BSL-2 betingelser er meget omkostningseffektiv, accelererer manipulation af protokollen, og vigtigst giver laboratorier, der ikke har adgang til en BSL-3 mulighed for at udføreSE avancerede lægemiddelscreeningsassays. Den anvendte auxotrofe Mtb mc 2 6206 stammen er et derivat af H37Rv 17, 18, der bevarer alle men 4 gener, panCD og leuCD, der ikke påvirker resistens eller tolerance 16. Sammenlignet med andre almindeligt anvendte Mtb surrogater såsom M. bovis BCG og M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 er mest tæt forbundet med virulent Mtb H37Rv henvisningen stamme til patogenese studier. Vigtigt er det, det fastholder RD-1 locus, som er fraværende fra BCG og spiller en stor rolle i Mtb virulens og granuloma 19. Forholdsvis, Mtb mc 2 6206 er også mere relevant for udvikling TB-drug-analyser end M. smegmatis, hvilket er en hurtigtvoksende arter, der er genomisk forskellig fra Mtb og har forskellige antibiotisk resistens profiler.
Den her beskrevne assay er også værdifuld på grund af sin høje grad af fleksibilitet. De 96-brønds plader indeholdende MTB / makrofag-aggregater kan ikke blot anvendes til titrering af lægemiddelbehandlinger tredobbelt som vi har vist (figur 3), men også til screening af hele drug biblioteker (figur 1b). Ved en enkelt koncentration, kan hver plade med 96 brønde screene 58 forbindelser. Dette antal drastisk ville stige til> 300 forbindelser hvis infektionen er indrettet til en 384-brønds plade, som er helt muligt på grundlag af, at den kendsgerning, at vi opnår stærke tilsætte Resazurin signaler efter kun tillader bakterierne at replikere i 3 dage. Faktisk ville det være relativt enkelt at tilpasse dette system til 384-brønds pladeformat, som andre end ned-skalering mængderne proportionalt at passe til den mindre godt format ville størstedelen af protokollen forblive uændret. At muliggøre passende signal for resazurin assay, kan det væreforpligtet til at forlænge inkubationen i trin 4.2.5 til 7 dage for at give mulighed for tilstrækkelig bakteriel replikation.
Mens koble denne infektion model til resazurin analysen som en udlæsning for Mtb levedygtighed har mange fordele, nemlig dens omkostningseffektivitet og hurtig assay-protokol mens få sammenlignelige resultater til andre guld standardsystemer såsom BACTEC 460 20, ikke desto mindre gør det har nogle begrænsninger . Den resazurin analysen kan ikke diskriminere mellem bakteriostatiske og baktericide stoffer, da den kun måler metaboliske aktivitet. Dette er en alvorlig begrænsning at huske på, som metabolisk aktivitet er i sagens natur lav i latent Mtb. Men det centrale element i denne analyse er infektionen model, som kan være forenelige med udlæsninger for Mtb stof modtagelighed andet end resazurin analysen. For eksempel, efter lægemiddelbehandling, brønde kunne direkte udpladet til dannelse koloni enhed (CFU) optælling, guld standard for at teste baktericide aktivitet af forbindelser (selv om dette ikke er forenelig med throughput screening). Alternativt kunne dette system kobles til luciferase udtrykkende Mtb, som er blevet vist at korrelere godt efter CFU tælle 21. For at udnytte et luciferase system til at måle stof modtagelighed, ville være påkrævet kun to ændringer af protokollen: i) udskiftning af Mtb GFP med Mtb -luciferase og ii) anvendelse af Bright-Glo luciferin reagens i stedet for resazurin i trin 5. anvendelsen af luciferase som udtrykker Mtb ville forkorte udvikling af assayet til 30 minutter, medens en betydelig forøgelse af analysesensitiviteten til niveauer, der ville være let kompatibel med 384-brønds pladeformat.
Sammenfattende har vi med succes overflyttet denne infektion model i en 96-brønds pladeformat som har relativt få manipulation trin, høj reproducerbarhed, og evnen til at producere endeløse mængder af udgangsmaterialemateriale, alle vigtige faktorer i gennemløb kompatibilitet. Denne analyse er også let at tilpasse til mange forskellige formater og udlæsninger, hvilket gør det til et værdifuldt aktiv for tidligt Mtb lægemiddelforskning processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
