Introduction
La tubercolosi (TB) rimane una grave minaccia globale la salute nonostante la disponibilità di regimi chemioterapici anti-TB per oltre 40 anni 1. Ciò è dovuto in parte al requisito per periodi lunghi di trattamento di più di 6 mesi utilizzando più combinazioni di farmaci, che porta al paziente non conformità 2. L'emergere di TBC resistente ai farmaci negli ultimi anni ha ulteriormente aggravato i problemi in un campo in cui il successo dello sviluppo di farmaci clinicamente approvati è praticamente inesistente 3. Infatti, nonostante esaustivo anti-TB sviluppo di farmaci, solo un singolo farmaco è stato approvato dalla FDA per l'uso clinico negli ultimi 40 anni 4. Così, le nuove generazioni di farmaci anti-TB sono urgentemente necessari per affrontare questo problema.
Un problema fondamentale nella scoperta TB farmaco è la mancanza di trasferimento di successo da composti con attività in vitro all'efficacia in ambito clinico= "xref"> 5, 6, 7. Inizialmente, gli approcci target basati sono stati usati per lo screening per anti-Mtb farmaci 5, che non è riuscito a tradurre in cellule batteriche intere. Anche quando si usano le cellule Mtb, è spesso eseguita utilizzando brodo cresciuto culture, che non calcolano accuratamente l'efficacia dei farmaci in vivo 8, 9. Questi problemi sono stati riconosciuti e test di screening di droga nei confronti di macrofagi contenenti Mtb o latente Mtb sono state stabilite con successo 8, 10, 11, 12. Tuttavia, anche questi test più avanzati non danno sufficiente attenzione alle barriere di penetrazione che i farmaci incontrano nelle lesioni polmonari non vascolarizzati, e di foci necrotici al sito di infezione. Infatti, Anche per la prima linea TB rifampicina farmaco, il dosaggio sub-ottimale è stata messa in discussione a causa di inadeguata nel tessuto vivo e liquido cerebrospinale (CSF) penetrazione 13, 14, 15, così come è diminuito l'efficacia contro intracellulare Mtb 8, 9. Come tali, i nuovi modelli e le analisi che tengano conto di questi parametri durante il processo di sviluppo del cavo in anticipo sarebbe senza dubbio migliorare TB sforzi scoperta di nuovi farmaci.
Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente istituito un poco costoso, rapido, e BSL 2-modello di infezione compatibile alternativo per Mtb droga prove di efficacia 16. Questo modello di infezione prodotta densamente Mtb all'interno di grandi strutture aggregate macrofagi, che ricapitolava fisiologicamente rilevanti barriere di penetrazione cellulare e ha generato macrofagi diversi passaggi
Qui si descrive in dettaglio la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate per produrre macrofagi diversi passaggi Mtb adatto per i test di sensibilità ai farmaci utilizzando REMA. In particolare, si mostra come questo sistema di infezione potrebbe essere adattato in un formato a 96 pozzetti per la compatibilità con throughput screening di candidati farmaci anti-TB.
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Protocol
NOTA: Come M. tuberculosis mc 2 6206 è un ceppo non virulento 17, 18, tutti i lavori in questo protocollo può essere eseguita in un impianto di 2 livello di biosicurezza (BSL-2).
1. condizioni di coltura per la proteina fluorescente verde Esprimere M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb-GFP)
NOTA: il M. tuberculosis H37Rv deriva auxotroph ceppo mc 2 6206 (Δ panCD, Δ Leucò) trasformato con la GFP esprimere plasmide pMN437 è utilizzato in tutto questo protocollo 16. E 'possibile sostituire il ceppo di Mtb-GFP con non GFP che esprimono ceppo selvatico per consentire una più agevole accessibilità del ceppo per i ricercatori. Tuttavia, l'espressione GFP è opportuno attivare la conferma visiva della fagocitosi e la formazione di aggregati Mtb / macrofagi. per long conservazione a lungo termine, Mtb-GFP sono stati congelati a -80 ° C in piena 7H9 media (descritti al punto 1.1) integrato con il 20% di glicerolo.
- Preparare completo supporto Mtb-GFP (7H9-C), completandola 7H9 media con il 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, 24 mg / ml D-acido pantotenico, 50 mg / ml di L-leucina e 50 mg / ml Hygromycin B.
- Scongelare una fiala di Mtb-GFP e aggiungere 10 ml di 7H9-C in un pallone a fondo quadro PETG 30 ml.
- Incubare a 37 ° C su shaker rotativo (50 rpm). Prendere le misure della densità ottica (OD 600) ogni pochi giorni fino a OD 600 raggiunge 1,0 (circa 5-8 giorni).
- Diluire e cultura passaggio come necessario per mantenere un OD 600 tra 0,2-1,0.
- Per l'infezione, utilizzare una cultura consolidata di Mtb-GFP all'interno della fase di crescita logaritmica (OD 600 di 0,6-1). Per evitare le culture clumpy, sonicare il pallone di coltura Mtb in un bagno d'acqua (130 W; 3 x 5 s impulsi) ONCe o due volte alla settimana
2. Condizioni di coltura per Cellule THP-1
- Preparare completa THP-1 mezzi di cella (RPMI-C) completandolo terreno RPMI 1640 con 10% di siero fetale inattivato al calore bovini, 2 mM L-glutammina e 10 mM HEPES.
- Incubare le cellule in un pallone T-75 a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro o citometria a flusso ogni altro giorno e mantenere le cellule THP-1 ad una densità tra ,1-0.600.000 per ml.
3. Infezione protocollo per generare strutture Mtb / macrofagi di aggregazione
- THP-1 preparazione cellulare (per piastra a 96 pozzetti)
- Centrifuga 7 x 10 6 cellule THP-1 a 250 xg per 5 min. Risospendere in 7 mL RPMI-C.
- Preparazione Mtb-GFP
- Centrifuga 2,8 x 10 8 Mtb-GFP a 3.200 xg per 5 minuti in una centrifuga oscillante bucket ucantare una conversione di OD 600 = 1.0 3 x 10 8 batteri / mL.
- Risciacquare una volta con RPMI-C e centrifugare come al punto 3.2.1.
- Risospendere in 7 mL RPMI-C e vortex per 10 s.
- Infezione
NOTA: Vedere la Figura 1 per il modello.- Preparare una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 200 ml di acqua sterile in righe A e H e colonne 1 e 12 per un cerchione di acqua per evitare l'evaporazione del terreno di coltura.
- Aggiungere 200 ml RPMI-C a colonna 2 (B2 per G2) per il controllo di sfondo (vuoto).
- Per infettare, aggiungere sospensione Mtb-GFP (punto 3.2) per sospensione cellulare THP-1 (passo 3.1) e mescolare bene pipettando. La densità delle cellule THP-1 finale è 5 x 10 5 per ml e la corrispondente molteplicità di infezione è 40.
- Versare il THP-1 sospensione / Mtb-GFP in un serbatoio di 25 mL.
- Aggiungere 200 ml di THP-1 / Mtb-GFP sospensione per tutti i restanti 96-pozzetti (B3 tramite G11) usinga multicanale pipetta.
NOTA: Se si lavora con più lastre da 96 pozzetti, risospendere regolarmente il restante THP-1 sospensione / Mtb nel serbatoio per assicurare una miscela viene aggiunta a ciascun pozzetto. - Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 7-10 giorni.
- Cambiare i media ogni 2 giorni, eliminando lentamente 100 ml trascorso supporto dalla parte superiore di ogni bene e delicatamente aggiungendo 100 ml di pre-riscaldato RPMI-C usando una pipetta multicanale. Non risospendere pozzi e disturbare gli aggregati Mtb / macrofagi sul fondo dei pozzetti.
- Visivamente esaminare i pozzi di microscopia a fluorescenza (obiettivo 4-10X) tutti i giorni, prendendo atto della dimensione di Mtb aggregati / macrofagi. Di giorno 7-10, Mtb aggregati / macrofagi devono essere sufficientemente grande (fare riferimento alla Figura 2 per riferimento) di procedere per prove di efficacia della droga (sezione 4).
- Se lo si desidera, catturare le immagini dei 96-pozzetti usando un sistema di imaging cellulare automatizzato montaticon campo chiaro e filtro GFP imposta per documentare Mtb / macrofagi formazione di aggregati.
NOTA: Se gli utenti non hanno accesso ad un sistema di imaging automatizzato, immagini di pozzi rappresentative possono essere scattate con qualsiasi microscopio adeguato con funzionalità di GFP e di campo luminoso.
4. inibizione della crescita Assay per valutare Drug efficacia contro Mtb Derivato da Mtb / macrofagi Aggregati
- Preparazione della droga (condizioni triplicato per due farmaci)
Nota: vedere Figura 1A per il modello.- In una piastra da 96 pozzetti separati, aggiungere 125 ml di mezzi 7H9-C di B2 fino al G10.
- Preparare due farmaci a doppia più alta concentrazione finale desiderata in 1 mL di 7H9-C per spiegare la diluizione nel passaggio 4.2.4.
- Aggiungere 250 ml di ogni farmaco per pozzi B11-C11-D11 e E11-F11-G11, rispettivamente, per i trattamenti in triplicato.
- Utilizzando una pipetta multicanale, in serie dilute i farmaci di prova duplice spostando 125 microlitri da B11-B10-G11 in G10. Mescolare pipettando 5 volte ad ogni passo.
- Continuare a muoversi 125 microlitri da una colonna all'altra (da destra a sinistra) attraverso la piastra, e fermarsi dopo colonna 4.
- Dopo la miscelazione colonna 4, scartare 125 microlitri in un contenitore per rifiuti. Le colonne 2 e 3 non devono contenere tutte le droghe per consentire l'uso come sfondo (vuoto) ei controlli di crescita positivi.
NOTA: In alternativa, seguire modello in figura 1B per le librerie di prova della droga. Ciascuna piastra da 96 pozzetti può ospitare 58 farmaci ad un'unica concentrazione. Preparare questa piastra farmaco utilizzando il doppio della concentrazione finale desiderata poiché sarà diluito a metà in fase 4.2.4.
- Trattamento farmacologico:
- Recuperare la piastra a 96 pozzetti contenente la Mtb con infezione macrofagi (aggregati Mtb / macrofagi).
- decantare con attenzione tutti i pozzi rilevanti (B2 attraverso G11) con una pipetta multicanale.Eseguire questo in un modo a due fasi: dapprima rimuovere 150 microlitri senza inclinare il piatto, e quindi rimuovere rimanenti mezzi (~ 50 microlitri) inclinando la piastra e inserire la punta della pipetta al bordo inferiore del pozzo. Come Mtb / macrofagi aggregati sono aderenti al fondo del pozzo, nessun materiale dovrebbe essere perso.
- Delicatamente aggiungere 100 ml di 7H9-C media per tutti i pozzetti rilevanti (B2 attraverso G11) della piastra contenente gli aggregati / macrofagi Mtb.
- Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri dal farmaco contenente 96 pozzetti (passo 4.1) ai corrispondenti pozzetti della piastra infezione.
- Mettere in busta sigillata e incubare per 3 giorni a 37 ° C.
5. Quantificazione del farmaco efficacia usando il saggio resazurina microtitolazione
- Preparare resazurina soluzione madre ad una concentrazione finale di 0,8 mg / ml in H 2 O. filtro attraverso 0,22 micron dimensione dei pori della membrana PVDF per la sterilizzazione.
- Preparare resazurin soluzione di lavoro miscelando resazurina soluzione madre, H 2 O e Tween-80 (soluzione al 20% in H 2 O) in un rapporto 2: 1: 1. Le concentrazioni finali sono 0,4 mg / mL resazurina e il 5% di Tween-80.
- Utilizzando un lettore di piastre, impostare un programma per leggere la fluorescenza a 530 nm di eccitazione e di emissione 590 nm ogni 30 min per 24 ore a 37 ° C. lettore di piastre pre-riscaldare a 37 ° C.
- Aggiungere 20 ml di soluzione di lavoro resazurina a tutti i pozzetti rilevanti (B2 tramite G11) della piastra droga trattata (passo 4.11) usando una pipetta multicanale.
- Mettere piatto sul lettore di piastre e avviare il programma creato nel passo 5.3.
NOTA: Per facilitare il trattamento di elevati volumi di piastre di dosaggio, è sufficiente per sviluppare il saggio in un incubatore a 37 ° ed eseguire singola fluorescenza legge ogni 24 h. Questo vale anche per gli utenti che non hanno accesso a un lettore di piastre con funzionalità cinetici e di incubazione.
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Representative Results
Per confermare la robustezza di adattare questo modello infezione per 96 pozzetti formato piatto, abbiamo qui esaminato la sensibilità ai farmaci di Mtb derivato dal nostro 96-ben adattata modello di infezione alla rifampicina (RIF) e moxifloxacina (Moxi) secondo il modello di data nella figura 1A. Abbiamo dimostrato che la generazione di Mtb / macrofagi strutture aggregate chiave per questa analisi può essere prodotto in maniera affidabile in un formato a 96 pozzetti (Figura 2), consentendo così compatibilità flusso (Figura 1B). Macrofagi diversi passaggi Mtb prodotta in questo modo può essere utilizzato direttamente per prove di efficacia farmaco utilizzando il saggio resazurina microtitolo ben caratterizzati (Figura 3).
Come il saggio resazurina si basa su delle specie ossidanti prodotte da Mtb metabolicamente attivo per convertire il resazurina blu per la Fluorescent resorufina rosa, il cambiamento di colore e fluorescenza può essere utilizzata come marker surrogato per determinare la quantità di crescita batterica. Nella Figura 3A, mostriamo che c'è abbastanza sensibilità all'interno del saggio resazurina per rilevare in modo affidabile i batteri Mtb vitali in grado di replicare in assenza di farmaci dopo soli 3 giorni di incubazione. Mentre conferma visiva del cambiamento di colore endpoint è solo una valutazione approssimativa della crescita, possiamo quantificare con precisione misurando cineticamente la conversione di resazurina nel suo metabolita fluorescente resorufina utilizzando un lettore di piastre (Figura 3B). Utilizzando questi dati, normalizzando al controllo della crescita positiva (assenza di farmaci) permette il calcolo di curve uccidere suscettibilità visualizzare efficacia dei farmaci contro macrofagi diversi passaggi Mtb (Figura 4).
Qui, i risultati rappresentativi delle Figure 3 4 mostrano che la concentrazione minima inibente (MIC), definito come la più bassa concentrazione dell'antibiotico alla quale si osserva inibizione della crescita del 90%, è superiore a 2 mg / ml sia rifampicina e moxifloxacina contro Mtb derivato dal nostro modello di infezione. Questo dimostra che il nostro modello di infezione prevede efficacia dei farmaci anti-Mtb che sono più in linea con i valori di MIC determinati contro intracellulare Mtb 8, e, quindi, riflette le proprietà barriera di diffusione che vengono trascurati nella maggior parte dei test di suscettibilità farmaco Mtb con brodo cresciuto cellule batteriche.
È importante sottolineare che i dati ottenuti con il saggio descritto in formato da 96 pozzetti hanno mostrato risultati molto simili a quelle che avevamo precedentemente determinata per rifampicina e moxifloxacina contro macrofagi diversi passaggi Mtb 16.
Figura 1: layout della piastra di droga. (A) template Esempio della piastra sfida farmaco utilizzato nel passaggio 4. Ciò consente la prova parallelo di due farmaci in pozzetti in triplicato a 8 concentrazioni definite. Come un esperimento rappresentativo, abbiamo usato rifampicina (RIF) e moxifloxacina (moxi) a partire da 2 micron e 2,5 micron, rispettivamente. (B) Un modello alternativo per throughput screening è prevista anche per dimostrare la possibilità di sperimentazione di 58 composti in un'unica operazione di concentrazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Generazione di Mtb / strutture aggregate macrofagi in piastra a 96 pozzettiformato. (A) Rappresentante campo chiaro e GFP immagini di Mtb aggregati -macrophage incorporata il 9 ° giorno dopo l'infezione. Le immagini sono state catturate con un obiettivo 4X utilizzando un programma di imaging cellulare automatizzato che documenta l'intero ben cucendo un montaggio di 3 da 3 immagini catturate singolarmente. (B) Un'immagine individuo non cucita dal campo visivo mostrato in (A). Campo immagine e GFP luminosa (C) Un rappresentante fusa di un / macrofagi struttura aggregata Mtb catturato con un obiettivo 10X. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Usando il test di microtiter resazurina per misurare la vitalità Mtb. (A) La presenza di viablcellule e Mtb possono essere semplicemente determinato dalla conversione del colorante resazurina blu al suo colore rosa, forma ridotta. Risultati rappresentativi sono mostrati qui con rifampicina (RIF) e moxifloxacina (Moxi) secondo il modello in figura 1A. (B) Per misurare quantitativamente la conversione di resazurina, fluorescenza dei singoli pozzi (corrispondente alla figura 3A) è stata monitorata cineticamente per 24 ore come descritto al punto 5. Rappresentante mini-grafici mostrano unità di fluorescenza relativa (asse y) in funzione del tempo (x -asse). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Determinazione della sensibilità ai farmaci uccidendo curve dai dati REMA. unità di fluorescenza relativa al momento della massima resazSegnale urin in (A) rifampicina e (B) moxifloxacina trattati pozzi (da figura 3B) sono stati normalizzati al nessun controllo della droga (crescita Mtb massima) del 100% di sopravvivenza. controllo di sfondo segnali (in bianco) sono stati sottratti da ogni pozzetto. La sopravvivenza è stata tracciata cento per ogni singola concentrazione di trattamento farmacologico per generare una curva di abbattimento. I dati in questa figura rappresentano i mezzi ± SD di tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto in dettaglio un modello di infezione Mtb alternativo adatto per test efficacia del farmaco. Questo modello tiene conto di due fattori chiave che dovrebbe essere dato più considerazione durante il processo di sviluppo TB farmaci precoce: la presenza di barriere fisiologicamente rilevanti alla penetrazione di droga e cambiamenti metabolici di Mtb durante l'infezione. Mentre abbiamo già dimostrato i vantaggi del nostro modello di infezione e ha proposto la possibilità di scalare l'infezione per la compatibilità di throughput 16, qui dimostriamo che questo è davvero realizzabile adattando il sistema direttamente in formato piastra da 96 pozzetti. La capacità di generare Mtb / macrofagi aggregati direttamente in piastre da 96 pozzetti è vantaggioso in quanto elimina la necessità di pipetta e distribuire gli aggregati da un grande pallone di coltura in singoli pozzetti, che è intrinsecamente difficile come le dimensioni degli aggregati possono raggiungere dimensioni> 500 micron. Le grandi dimensioni degli aggregati di macrofagi infettati impedirebbe l'uso di P200 pipette multicanale che sono necessari per i test di throughput come sarebbe né intasare le punte o estesa pipettaggio avrebbe spezzare gli aggregati. La modifica di questo sistema infezione per piastre da 96 pozzetti riduce la quantità di fasi di manipolazione necessarie e genera pozzetti uniformi con quantità simili di Mtb aggregati / macrofagi. Come tale, questo sistema di analisi è particolarmente importante non solo nel processo di sviluppo presto per prevedere l'efficacia di composti candidati piombo in vivo, ma nel throughput screening di librerie di droga.
Uno dei principali vantaggi del modello di infezione descritto è l'utilizzo di un BSL-2 compatibile ceppo Mtb. La capacità di lavorare in condizioni BSL-2 è molto conveniente, accelera la manipolazione del protocollo, e, soprattutto, permette ai laboratori che non hanno accesso ad un impianto BSL-3 per eseguire laSE avanzata test di screening di droga. La utilizzato auxotrophic Mtb mc 2 6206 ceppo è un derivato del H37Rv 17, 18 che conserva tutti, ma 4 geni, panCD e Leucò, che non influenzano la resistenza ai farmaci o la tolleranza 16. Rispetto ad altri surrogati Mtb di uso comune come il BCG M. bovis e M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 è più strettamente legato al virulenti Mtb H37Rv, il ceppo di riferimento per gli studi di patogenesi. È importante sottolineare che mantiene l'RD-1 locus, che è assente da BCG e svolge un ruolo importante nella Mtb virulenza e granulomi 19. Comparativamente, Mtb mc 2 6206 è anche più rilevante per i test di sviluppo TB-farmaco di M. smegmatis, che è una specie a rapido accrescimento che è genomicamente diverso da Mtb e ha diversi profili di resistenza agli antibiotici.
Il saggio descritto qui è anche importante per la sua elevata flessibilità. Le piastre a 96 pozzetti contenenti gli aggregati Mtb / macrofagi possono essere utilizzati non solo per la titolazione di trattamenti farmacologici in triplicato abbiamo mostrato (Figura 3), ma anche per lo screening di librerie di droga intere (Figura 1B). Ad un'unica concentrazione, ciascuna piastra da 96 pozzetti può schermo 58 composti. Questo numero sarebbe aumentare drasticamente a> 300 composti se il sistema infezione è adattato ad una piastra a 384 pozzetti, che è completamente fattibile in base che il fatto che si ottiene forti segnali resazurina dopo solo permettendo ai batteri di replicare per 3 giorni. Infatti, sarebbe relativamente semplice adattare questo sistema formato piastra a 384 pozzetti, come diverso demoltiplicazione i volumi proporzionalmente adatto al formato ben più piccolo, la maggior parte del protocollo rimarrebbe invariata. Per attivare il segnale adeguata per il saggio resazurina, può esserenecessaria per estendere l'incubazione nel passaggio 4.2.5 a 7 giorni per consentire replicazione batterica sufficiente.
Mentre l'accoppiamento questo modello di infezione per il test resazurina come un read-out per la Mtb vitalità ha molti vantaggi, vale a dire la sua efficacia dei costi e il protocollo del test rapido ottenendo risultati paragonabili ad altri sistemi d'oro standard come BACTEC 460 20, lo fa tuttavia alcune limitazioni . Il test resazurina non può discriminare tra farmaci batteriostatici e battericida in quanto misura solo l'attività metabolica. Si tratta di un vincolo importante da tenere a mente, come l'attività metabolica è intrinsecamente a basso contenuto di latente Mtb. Tuttavia, il componente chiave di questo saggio è il modello di infezione, che può essere compatibile con read-out per la Mtb sensibilità ai farmaci diversi da quelli del test resazurina. Ad esempio, dopo trattamento farmacologico, pozzi potrebbero essere direttamente piastrate per la formazione dell'unità colonia (CFU) conteggio, l'oro standard per testare l'attività battericida di composti (se questo non è compatibile con throughput screening). In alternativa, questo sistema potrebbe essere accoppiato alla luciferasi esprimere Mtb, che ha dimostrato di correlare strettamente per CFU contando 21. Per utilizzare un sistema di luciferasi per misurare la sensibilità ai farmaci, sarebbero necessari solo due modifiche al protocollo: la sostituzione i) di Mtb-GFP con Mtb -luciferase e ii) l'uso di Bright-Glo reagente luciferina al posto di resazurina al punto 5. l'uso di luciferasi esprimere Mtb sarebbe abbreviare lo sviluppo del test per 30 min, aumentando notevolmente la sensibilità del test a livelli che difficilmente compatibili con il formato 384 pozzetti.
In sintesi, abbiamo la transizione con successo questo modello di infezione in un formato piatto a 96 pozzetti che ha relativamente pochi passi di manipolazione, di alta riproducibilità, e la capacità di produrre quantità infinite di partenzamateriale, tutti i fattori chiave per la compatibilità di throughput. Questo test è anche facilmente adattabile a diversi formati e-out di lettura, che lo rende una risorsa preziosa per la precoce processo di scoperta di nuovi farmaci Mtb.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
