Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

En High-throughput Kompatibel Assay å evaluere Drug Effekt mot macrophage passert doi: 10.3791/55453 Published: March 24, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tuberkulose (TB) er fortsatt en alvorlig global helsetrussel tross for tilgjengeligheten av anti-TB kjemoterapiregimer i over 40 år 1. Dette skyldes delvis kravet for lange behandlingsperioder på over seks måneder ved hjelp av flere legemiddelkombinasjoner, noe som fører til pasient avvik 2. Fremveksten av multiresistent tuberkulose i de senere år har ytterligere forverret problemene i et felt hvor vellykket utvikling av klinisk godkjente legemidler er praktisk talt ikke-eksisterende tre. Faktisk, til tross uttømmende anti-TB narkotika utvikling, har bare et enkelt medikament er FDA godkjent for klinisk bruk i de siste 40 årene 4. Dermed er nye generasjoner av anti-tuberkulosemedisiner sterkt behov for å løse dette problemet.

Et sentralt problem i TB medisiner er mangel på vellykket overføring fra forbindelser med in vitro aktivitet til effekt i klinisk setting= "xref"> 5, 6, 7. I utgangspunktet var målet baserte tilnærminger brukes til å screene for anti Mtb narkotika 5, som ikke klarte å oversette til hele bakterieceller. Selv når Mtb-celler blir brukt, er det ofte utført ved anvendelse av buljong dyrket kulturer, som ikke nøyaktig forutsi legemidlets effekt in vivo 8, 9. Disse problemene har blitt anerkjent og narkotika screening-analyser mot makrofager som inneholder Mtb eller latent Mtb har blitt opprettet 8, 10, 11, 12. Men, selv om disse mer avanserte analyser ikke gir tilstrekkelig hensyn til holdbarhetstid barrierer som narkotika møter i de ikke-vaskularisert lungelesjoner, og i nekrotiske foci på stedet av infeksjon. Faktisk, Selv for den første linjen TB stoffet rifampicin, har sub-optimal dosering blitt avhørt på grunn av utilstrekkelig in vivo vev og spinalvæske (CSF) penetrasjon 13, 14, 15 samt redusert effekt mot intracellulære Mtb 8, 9. Som sådan, nye modeller og analyser som ville ta hensyn til disse parametrene i løpet av tidlig ledelse utviklingsprosessen vil utvilsomt forbedre TB legemiddel innsats.

For å møte dette behovet, har vi nylig etablert en billig, rask, og BSL-2 kompatibel alternativ infeksjonsmodell for Mtb legemidlets effekt testing 16. Denne infeksjonen modell produsert tettpakket Mtb innenfor store makro aggregerte strukturer, som rekapitulert fysiologisk relevante mobil penetrasjon barrierer og genererte makrofag-passeres Mtb. Mtb avledet fra denne infeksjonsmodellen ble kombinert med den resazurin mikrotiter-analysen (REMA) for å vurdere medikament-effektivitet, noe som gir resultater i overensstemmelse med andre intracellulære infeksjonsmodeller, og korrelert godt med den rapporterte evnen til felles tuberkulose midler for å oppnå høy CSF-konsentrasjoner i forhold til serumkonsentrasjoner 16.

Her beskriver vi i detalj generering av Mtb / makro samlede strukturer for å produsere makrofag-passert Mtb egnet for resistenstesting ved hjelp av REMA. Spesielt viser vi hvordan denne infeksjonen systemet kunne tilpasses til et 96-brønners format for kompatibilitet med throughput screening av kandidat anti-tuberkulosemedisiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Som M. tuberculosis mc 2 6206 er en avirulent stamme 17, 18, kan alt arbeid i denne protokollen bli utført i et biosikkerhetsnivå 2 anlegg (BSL-2).

1. Kultur betingelser for Green Fluorescent Protein Uttrykke M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb -GFP)

MERK: M. tuberculosis H37Rv avledet auksotrop belastning mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) transformert med GFP uttrykke plasmidet pMN437 er brukt i denne protokollen 16. Det er mulig å erstatte den Mtb -GFP stamme med ikke-GFP som uttrykker villtypestamme for å muliggjøre lettere tilgjengelighet av stammen for forskere. Imidlertid er GFP uttrykk ønskelig for å muliggjøre visuell bekreftelse av fagocytose og dannelse av Mtb / makrofag-aggregater. for long tids lagring, Mtb -GFP ble frosset ved -80 ° C i et fullstendig Brook 7H9 medier (som er beskrevet i trinn 1,1) supplert med 20% glycerol.

  1. Fremstille komp Mtb -GFP media (Brook 7H9-C) ved å supplere Brook 7H9 medium med 10% Middle OADC, 0,02% tyloksapol, 24 ug / ml D-pantotensyre, 50 ug / ml L-leucin og 50 ug / mL Hygromycin B.
  2. Tine en ampulle med Mtb -GFP og legge til 10 ml Brook 7H9-C i en 30 ml rektangulær bunn PETG kolbe.
  3. Inkuber ved 37 ° C på en rotasjonsrister (50 rpm). Ta målinger optisk tetthet (OD 600) med noen dager til OD 600 når 1,0 (ca 5-8 dager).
  4. Fortynn og passasjekultur etter behov for å opprettholde en OD 600 mellom 0,2-1,0.
  5. For infeksjon, bruk en etablert kultur av Mtb -GFP i logaritmisk vekstfase (OD 600 av 0,6-1). For å unngå klumpete kulturer, sonikere Mtb kulturen kolbe i et vannbad (130 W, 3 x 5 s pulser) once eller to ganger i uken

2. Kultur Vilkår for THP-1-celler

  1. Fremstille komp THP-1 celle-medium (RPMI-C) ved å supplere RPMI 1640 medium med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og 10 mM HEPES.
  2. Inkuber cellene i en T-75-kolbe ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2.
  3. Cellene telles ved bruk av et hemocytometer eller strømningscytometri annenhver dag og vedlikeholde THP-1-celler ved en tetthet mellom 0,1-0600000 per ml.

3. Infeksjon protokoll for å generere Mtb / Macrophage Aggregate Structures

  1. THP-1-cellepreparat (per 96-brønns plate)
    1. Sentrifuger 7 x 10 6 THP-1-celler ved 250 xg i 5 min. Resuspender i 7 ml RPMI-C.
  2. Mtb -GFP forberedelse
    1. Sentrifuger 2,8 x 10 8 Mtb -GFP på 3200 xg i 5 min i en svingende bøtte sentrifuge usynge en omdannelse av OD 600 = 1,0 3 x 10 8 bakterier / ml.
    2. Vask en gang med RPMI-C og sentrifuger som i trinn 3.2.1.
    3. Resuspender i 7 ml RPMI-C og vortex i 10 s.
  3. Infeksjon
    MERK: Se figur 1 for mal.
    1. Fremstille en 96-brønns plate ved å tilsette 200 ul sterilt vann i rekkene A og H og kolonnene 1 og 12 for en vann kant for å forhindre fordamping av kulturmedium.
    2. Tilsett 200 mL RPMI-C til kolonne 2 (B2 til G2) for bakgrunnen kontroll (blank).
    3. Å infisere, legge Mtb -GFP suspensjon (trinn 3.2) for å THP-1 cellesuspensjon (trinn 3.1) og bland godt med pipettering. Den endelige THP-1 celle-tetthet er 5 x 10 5 per ml og den tilsvarende mangfold av infeksjon er 40.
    4. Hell THP-1 / Mtb -GFP suspensjonen i et 25 ml reservoar.
    5. Tilsett 200 mL av THP-1 / Mtb -GFP suspensjon til alle gjenværende 96-brønner (B3 gjennom G11) usinga flerkanals pipette.
      MERK: Ved å arbeide med flere 96-brønners plater, regelmessig resuspender den resterende THP-1 / Mtb suspensjon i reservoaret for å sikre en jevn blanding blir tilsatt til hver brønn.
    6. Inkuber ved 37 ° C med 5% CO2 i 7-10 dager.
    7. Endre media hver 2 dager ved langsomt å fjerne 100 ul brukt medium fra toppen av hver brønn og forsiktig tilsetning av 100 ul forvarmet RPMI-C ved anvendelse av en multikanal pipette. Ikke resuspender brønner og forstyrre Mtb / makro tilslag på bunnen av brønnene.
    8. Visuelt undersøke brønner med fluorescens mikroskopi (4-10X objektiv) daglig, ta av størrelsen på Mtb / makro aggregater. Etter dag 7-10, bør Mtb / makro aggregater være tilstrekkelig stor (se Figur 2 for referanse) for å gå videre for narkotika effekt testing (§ 4).
    9. Om ønskelig, ta bilder av 96-brønnene ved hjelp av en automatisert cell imaging system montertmed lyse felt og GFP filter setter dokumentere Mtb / makrofag aggregatdannelse.
      MERK: Hvis brukerne ikke har tilgang til en automatisert bildesystem, kan bilder av representative brønner tas ved hjelp av en passende mikroskop med GFP og lyse felt evner.

4. Vekst Hemningsmetoden å vurdere Drug effekt mot Mtb Avledet fra Mtb / Makrofage Aggregater

  1. Drug forberedelse (tredoble forhold for to medikamenter)
    MERK: Se figur 1A for malen.
    1. I en egen 96-brønns plate, tilsett 125 mL av Brook 7H9-C media til B2 gjennom til G10.
    2. Forbered to medikamenter på det dobbelte av høyeste ønskede sluttkonsentrasjonen i 1 ml Brook 7H9-C for å ta hensyn til fortynning i trinn 4.2.4.
    3. Legg 250 mL av hvert medikament til brønner B11-C11-D11 og E11-F11-G11, henholdsvis for tredoble behandlinger.
    4. Ved hjelp av en flerkanals pipette, serielt dilUte test narkotika to ganger ved å flytte 125 mL fra B11-G11 i B10-G10. Bland ved å pipettere 5 ganger ved hvert trinn.
    5. Fortsette å bevege seg 125 ul fra kolonne til kolonne (høyre mot venstre) på tvers av platen, og stoppe etter kolonne 4.
    6. Etter blanding spalte 4, forkaste 125 ul i en avfallsbeholder. Kolonnene 2 og 3 bør ikke inneholde noen medikamenter for å tillate anvendelse som en bakgrunn (blank) og positive vekstkontroll.
      MERK: Du kan også følge malen i figur 1B for testing narkotika biblioteker. Hver 96-brønns plate kan romme 58 stoffer i en enkel konsentrasjon. Forbered dette stoffet platen med dobbelt den ønskede sluttkonsentrasjon siden det vil bli utvannet i halvparten i trinn 4.2.4.
  2. Medikamentell behandling:
    1. Hent den 96-brønns plate som inneholder Mtb -infected makrofager (Mtb / makroaggregater).
    2. Nøye dekanter alle relevante brønnene (B2 gjennom G11) med en flerkanals pipette.Utfør dette i en to-trinns måte: først fjerne 150 mL uten å vippe platen, og deretter fjerne gjenværende media (~ 50 mL) ved å vippe platen og sette pipettespissen til nedre kant av brønnen. Som Mtb / makrofag-aggregatene er vedheftende til bunnen av brønnen, bør ikke i noe materiale går tapt.
    3. Tilsett 100 ul Brook 7H9-C medier til alle relevante brønner (B2 gjennom G11) i platen inneholdende MTB / makrofag aggregater.
    4. Ved hjelp av en flerkanals pipette, overføre 100 ul fra den medikamentinneholdende 96-brønns plate (trinn 4.1) til de tilsvarende brønner av infeksjonen platen.
    5. Plasseres i lukket pose og inkuber i 3 dager ved 37 ° C.

5. Kvantifisering av legemidlets effekt Bruke Resazurin Microtiter analysen

  1. Fremstille Resazurin stamløsning ved en sluttkonsentrasjon på 0,8 mg / ml i H2O Filtrer gjennom 0,22 um porestørrelse PVDF-membran for sterilisering.
  2. Fremstille resazurin arbeidsløsning ved å blande Resazurin stamløsning, H2O og Tween-80 (20% løsning i H2O) i en 2: 1: 1-forhold. Endelige konsentrasjoner er 0,4 mg / mL, resazurin og 5% Tween-80.
  3. Ved anvendelse av en plateleser, setup et program for å lese fluorescens ved 530 nm eksitering og 590 nm emisjon hvert 30 min i 24 timer ved 37 ° C. Forvarm plateleser til 37 ° C.
  4. Tilsett 20 mL av resazurin arbeidsløsning for alle relevante brønner (B2 gjennom G11) av medikamentet behandlede plate (trinn 4.11) ved anvendelse av en multikanal pipette.
  5. Sett platen på plateleser og start programmet satt opp i trinn 5.3.
    NB: For å forenkle behandlingen av høye volumer av analyseplater, er det tilstrekkelig å utvikle testen i en 37 ° C inkubator og utføre enkelt fluorescens-leser hver 24 timer. Dette gjelder også for brukere som ikke har tilgang til en plateleser med kinetikk og ruge evner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å bekrefte robustheten av å tilpasse denne infeksjonsmodellen til 96-brønners plateformat, vi her undersøkte resistens av Mtb avledet fra vår 96-brønners innrettet infeksjonsmodell mot rifampicin (RIF) og moxifloxacin (Moxi) i henhold til malen gitt i figur 1A. Vi viser at genereringen av Mtb / makrofag-aggregerte strukturer nøkkel til denne analysen kan bli pålitelig produsert i et 96-brønners plateformat (fig 2), for derved å muliggjøre gjennomstrømning kompatibilitet (figur 1B). Makrofag passert Mtb fremstilt på denne måte kan brukes direkte for legemidlets effekt tester ved bruk av godt karakterisert resazurin mikrotiter-analyse (Figur 3).

Som resazurin analysen er avhengig av oksidative artene produsert av metabolsk aktive Mtb å omdanne den blå resazurin til fluorescent rosa resorufin, kan endringen i farge og fluorescens bli brukt som en surrogatmarkør for å bestemme mengden av bakterievekst. I figur 3A, viser vi at det er tilstrekkelig følsomhet innenfor resazurin assay for å påvise en pålitelig måte levedyktige Mtb bakterier i stand til å replikere i fravær av legemidler etter bare 3 dagers inkubering. Mens visuell bekreftelse av endepunkt fargeendring er bare en omtrentlig vurdering av vekst, kan vi nøyaktig kvantifisere dette ved kinetisk å måle konvertering av resazurin til sin fluoriserende metabolitt resorufin med en plateleser (Figur 3B). Ved hjelp av disse data, normal til den positive vekstkontroll (fravær av legemidler) gjør det mulig for beregning av mottakelighet drepende kurver for å visualisere medikament effekt mot makrofag-passaged Mtb (figur 4).

Her er de representative resultatene i figur 3 4 viser at den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) defineres som den laveste konsentrasjon av antibiotikumet ved hvilken 90% veksthemming er observert, er større enn 2 mg / ml for både rifampicin og moxifloxacin mot Mtb avledet fra vår infeksjonsmodell. Dette viser at vår infeksjonsmodell predikerer effekt av anti Mtb legemidler som er mer i tråd med MIC-verdier bestemt mot intracellulære Mtb 8, og dermed reflekterer diffusjon barriereegenskaper som er neglisjert i de fleste Mtb resistensanalyser med buljong vokst bakterieceller.

Viktigere, data innhentet ved hjelp av den beskrevne analyse i 96-brønners format viste sterkt sammenlignbare resultater som de som vi tidligere hadde bestemt for rifampicin og moxifloxacin mot makrofag-passaged Mtb 16.


Figur 1: Narkotika plate layout. (A) Eksempel mal av medikamentet utfordring platen som anvendes i trinn 4. Dette gjør det mulig for den parallelle testing av to medikamenter i triplikate brønner 8 definerte konsentrasjoner. Som representant eksperiment, brukte vi rifampicin (RIF) og moxifloxacin (Moxi) starter på 2 mikrometer og 2,5 mikrometer, henholdsvis. (B) En alternativ mal for throughput screening er også tilveiebrakt for å vise muligheten for testing av 58 forbindelser i en enkel konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Generering av MTB / makrofag-aggregerte strukturer i 96-brønns plateformat. (A) Representant lyse felt og GFP fusjonert bilder av Mtb -macrophage tilslag på dag 9 etter infeksjon. Bilder ble tatt med en 4X mål ved hjelp av en automatisert cell imaging program som dokumenterer hele godt ved å sy en montasje av tre med 3 individuelt bildene. (B) En person som ikke er sammensatt bilde fra synsfeltet vist i (A). (C) En representant fusjonert lyse felt og GFP bilde av en Mtb / makrofag samlede struktur fanget med en 10X objektiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Bruke resazurin mikro analyse for å måle Mtb levedyktighet. (A) Tilstedeværelsen av viable Mtb celler kan ganske enkelt bestemmes ved omdannelse av det blå fargestoff resazurin til sin rosa, redusert form. Representative resultater er vist her ved hjelp av rifampicin (RIF) og moxifloxacin (Moxi) i henhold til malen i figur 1A. (B) For å kvantitativt måle omdannelsen av resazurin, fluorescens fra individuelle brønner (tilsvarende figur 3A) ble overvåket kinetisk i 24 timer som beskrevet i trinn 5. Representative mini kurver viser relative fluorescensenheter (y-akse) versus tid (x -akser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Fastsettelse resistens drepe kurver fra REMA data. Relative fluorescens enheter på tidspunktet for maksimal resazurin signal i (A) rifampicin og (B) moksifloksacin behandlede brønner (fra figur 3B) var normalisert til ingen stoffet kontroll (maksimal vekst Mtb) som 100% overlevelse. Bakgrunn kontroll (blank) signaler ble trukket fra hver prøvebrønnen. Den prosentvise overlevelse ble plottet for hver enkelt konsentrasjon av medikamentbehandling for å generere et drepende kurve. Dataene i denne figuren representerer middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her har vi beskrevet i detalj en alternativ Mtb infeksjonsmodell egnet for legemidlets effekt testing. Denne modellen tar hensyn til to viktige faktorer som bør gis mer hensyn i løpet av tidlig TB narkotika utviklingsprosessen: tilstedeværelse av fysiologisk relevante barrierer mot narkotika penetrasjon og metabolske forandringer av Mtb under infeksjon. Mens vi tidligere har vist fordelene med vår infeksjonsmodell og foreslo muligheten for å skalere opp infeksjonen for gjennomstrømming kompatibilitet 16, her viser vi at dette faktisk er oppnåelig ved å tilpasse systemet direkte inn i 96-brønns plate format. Evnen til å generere Mtb / makrofag-aggregater direkte i 96-brønners plater er fordelaktig da det fjerner kravet til pipetten og fordele aggregatene fra en stor kulturflaske inn i individuelle brønner, som i seg selv er vanskelig som størrelsen på aggregatene kan nå størrelser> 500 um. Den store størrelsen på den infiserte makrostørrelser vil hindre bruk av P200 flerkanals pipetter som er nødvendige for gjennomstrømning analyser som det ville heller tette tips eller omfattende pipettering ville bryte hverandre aggregatene. Den modifikasjon av denne infeksjonen systemet til 96-brønners plater reduserer mengden av manipulasjon trinnene som er nødvendige og genererer jevne brønner med lignende mengder Mtb / makroaggregater. Som sådan, er dette analysesystem spesielt nyttig ikke bare i den tidlige utviklingen fremgangsmåte for å forutsi effekten av bly kandidatforbindelser in vivo, men i throughput screening av legemiddelbibliotek.

En viktig fordel med den beskrevne infeksjonsmodell er utnyttelsen av en BSL-2-kompatible Mtb belastning. Evnen til å arbeide under BSL-2 tilstander er svært kostnadseffektiv, akselererer manipulering av protokollen, og viktigst gjør laboratorier som ikke har tilgang til en BSL-3 anlegg til å utførese avansert narkotika screening-analyser. Den benyttes auxotrofe Mtb mc 2 6206 stamme er et derivat av H37Rv 17, 18 som beholder alle, men 4 gener, panCD og leuCD, som ikke påvirker legemiddelresistens eller toleranse 16. Sammenlignet med andre brukte Mtb surrogater som M. bovis BCG og M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 er mest knyttet til virulente Mtb H37Rv, referansen belastning for patogenesen studier. Viktigere, opprettholder det RD-en locus, som er fraværende fra BCG og spiller en viktig rolle i Mtb virulens og dannelse av arrvev 19. Relativt, Mtb mc 2 6206 er også mer relevant for TB-narkotika utvikling analyser enn M. smegmatis, som er en hurtigvoksende arter som er genomisk forskjellig fra Mtb og har forskjellige antibiotikaresistens profiler.

Analysen som beskrives her er også verdifull på grunn av sin høye grad av fleksibilitet. 96-brønners plater som inneholder Mtb / makro tilslag kan brukes ikke bare for titrering av medikamentell behandling i tre paralleller som vi har vist (figur 3), men også for screening av hele legemiddel bibliotek (Figur 1b). Ved en enkel konsentrasjon, kan hver 96-brønns plate skjermen 58 forbindelser. Dette antallet vil øke drastisk til> 300 Forbindelsene dersom infeksjonen systemet er tilpasset til en 384-brønners plate, som er helt mulig basert på det faktum at vi oppnå sterke Resazurin signaler etter bare tillater bakterier å replikere i 3 dager. Faktisk ville det være relativt lett å tilpasse systemet til 384-brønn plate-format, som annet enn ned-skalering volumene proporsjonalt for å dekke den minste brønners-formatet, ville de fleste av protokollen forblir uendret. For å muliggjøre tilstrekkelig signal for Resazurin analysen, kan det blisom kreves for å utvide inkubasjonstiden i trinn 4.2.5 til 7 dager for å tillate tilstrekkelig bakteriell replikasjon.

Mens kopling denne infeksjonen modellen til resazurin analysen som en lese-out for Mtb levedyktighet har mange fordeler, nemlig sin kostnadseffektivitet og raske analyseprotokollen samtidig oppnå sammenlignbare resultater til andre gullstandardsystemer som BACTEC 460 20, gjør det likevel har noen begrensninger . Den resazurin analysen kan ikke diskriminere mellom bakteriostatiske og bakteriedrepende stoffer, siden den måler bare metabolsk aktivitet. Dette er en viktig begrensning for å huske på, som metabolsk aktivitet er iboende lav i latent Mtb. Imidlertid viktig del av denne analysen er den infeksjonsmodell, som kan være forenlig med lese åpninger for Mtb-resistens annet enn resazurin analysen. For eksempel, etter behandling, brønner kan bli direkte belagt ut for koloni enhet dannelse (CFU) telling, gull standard for å teste baktericide aktivitet av forbindelser (selv om dette ikke er forenlig med throughput screening). Alternativt kan dette systemet bli koplet til luciferase uttrykke Mtb, som har vist seg å korrelere tett til CFU teller 21. For å benytte et system for å måle luciferase-resistens, ville kun to endringer i protokollen være nødvendig: i) erstatning av Mtb -GFP med Mtb -luciferase og ii) bruk av Bright-Glo luciferin-reagenset i stedet for resazurin i trinn 5. bruken av luciferase som uttrykker Mtb ville forkorte utviklingen av analysen til 30 minutter mens den øker analysesensitiviteten til nivåer som vil være lett forenlig med 384-brønners plateformat betraktelig.

Oppsummert har vi lykkes overført denne infeksjonsmodell i et 96-brønners plateformat som har relativt få manipuleringstrinn, høy reproduserbarhet og evne til å produsere uendelige mengder startmateriale, alle viktige faktorer i gjennomstrømming kompatibilitet. Denne analysen er også lett tilpasses mange forskjellige formater og leser-outs, noe som gjør det til en verdifull ressurs for tidlig Mtb drug discovery prosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7H9 BD Difco 271310 Follow manufacturer's recommendations
Middlebrook OADC BD Biosciences 212351
Tyloxapol Sigma T8761 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma P5710 Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
L-leucine MP Biomedicals 194694 Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Hygromycin B EMD Millipore 400051 Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O
Nalgene Square PETG media bottle Thermo Fisher 2019-0030
RPMI 1640 media Hyclone SH30027.01
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S12450H
L-glutamine Corning MT25005CI
HEPES Hyclone SH30237.01
Cytation 3 plate reader Biotek Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope
Gen5 Software Biotek Recording and analysis of rezasurin coversion
Rifampicin  Fisher Scientific BP2679250 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Moxifloxacin Hydrochloride Acros Organics 457960010 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Tween-80 Fisher Scientific T164500 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11, (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149, (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469, (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8, (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10, (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54, (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, (10), e1000645 (2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87, (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52, (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90, (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14, (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72, (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5, (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41, (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67, (9), 4586-4593 (1999).
En High-throughput Kompatibel Assay å evaluere Drug Effekt mot macrophage passert<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).More

Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter