Introduction
A tuberculose (TB) continua a ser uma séria ameaça à saúde global, apesar da disponibilidade de regimes de quimioterapia anti-tuberculose há mais de 40 anos 1. Isto é devido em parte à exigência de períodos de tratamento longo de mais de seis meses usando várias combinações de medicamentos, o que leva a paciente a não conformidade 2. O surgimento de tuberculose resistente a medicamentos nos últimos anos tem agravado os problemas em um campo onde o desenvolvimento bem sucedido de drogas clinicamente aprovados é praticamente inexistente 3. Na verdade, apesar do desenvolvimento exaustiva de drogas anti-TB, apenas uma única droga foi aprovada pela FDA para uso clínico nos últimos 40 anos 4. Assim, as novas gerações de medicamentos anti-tuberculose são urgentemente necessárias para resolver este problema.
Um problema fundamental na descoberta TB é a falta de sucesso da transferência a partir de compostos com actividade in vitro para a eficácia no ambiente clínico= "xref"> 5, 6, 7. Inicialmente, as abordagens baseadas alvo foram utilizadas para pesquisar drogas anti-Mtb 5, que não se traduziu em células bacterianas inteiras. Mesmo quando são utilizadas células de M. tuberculosis, que é frequentemente realizada usando caldo cultivado culturas, que não prevêem com precisão a eficácia do fármaco in vivo, 8, 9. Estes problemas têm sido reconhecidas e ensaios de rastreio de drogas contra macrófagos contendo M. tuberculosis ou M. tuberculosis latente foram estabelecidas com êxito 8, 10, 11, 12. No entanto, mesmo esses ensaios mais avançados, não dão conta suficiente para as barreiras de penetração que as drogas encontram nas lesões pulmonares não vascularizados, e na focos de necrose no local da infecção. De fato, Até mesmo para a primeira linha TB rifampicina droga, a dose sub-óptima tem sido questionada devido à inadequada no tecido vivo e líquido cefalorraquidiano (LCR) penetração 13, 14, 15, bem como diminuição da eficácia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, os novos modelos e ensaios que tenham em conta esses parâmetros durante o processo de desenvolvimento de liderança no início, sem dúvida, melhorar a TB esforços de descoberta de drogas.
Para atender a essa necessidade, que recentemente estabeleceu um 2 BSL-modelo de infecção barato, rápido e compatível alternativa para Mtb droga testes de eficácia 16. Este modelo de infecção produzida densamente Mtb dentro de grandes estruturas agregadas de macrófagos, que recapitulou as barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes e gerou macrófagos passadas
Aqui nós descrevemos em detalhe a geração de Mtb / estruturas de agregação de macrófagos para produzir e macrófagos passadas Mtb apropriado para o teste de sensibilidade às drogas usando REMA. Em particular, mostra-se como este sistema de infecção poderia ser adaptado a um formato de 96 poços para compatibilidade com throughput screening de candidatos de drogas anti-TB.
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Protocol
NOTA: Como M. tuberculosis mc 2 6206 é uma estirpe avirulenta 17, 18, todo o trabalho neste protocolo pode ser realizada em uma instalação de segurança biológica 2 Nível (BSL-2).
1. As condições de cultura para Green Fluorescent Protein Expressando M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb GFP)
NOTA: O M. tuberculosis H37Rv derivado auxotróf ica estirpe MC 6206 2 (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada com o plasmídeo que expressa GFP pMN437 é utilizado ao longo deste protocolo 16. É possível substituir a tensão Mtb-GFP com não expressando GFP do tipo selvagem tensão para permitir mais fácil acessibilidade da estirpe para os investigadores. No entanto, a expressão da GFP é desejável para permitir a confirmação visual da fagocitose e formação de agregados de M. tuberculosis / macrófagos. para lonarmazenagem a longo prazo g, Mtb -GFP foram congeladas a -80 ° C em meio completo (7H9 descritos no passo 1.1) suplementado com 20% de glicerol.
- Prepare completa meios de Mtb -GFP (7H9-C), completando 7H9 meio com 10% de Middlebrook OADC, 0,02% de tiloxapol, 24 ug / mL de ácido D-pantoténico, 50 ug / ml de L-leucina e 50 ug / ml de higromicina B.
- Descongelar um frasco de Mtb -GFP e adicionar a 10 ml de 7H9-C num frasco de PETG fundo rectangular 30 mL.
- Incubar a 37 ° C num agitador rotativo (50 rpm). Tome as medições de densidade óptica (DO 600) todos os dias até DO600 atinge 1.0 (aproximadamente 5-8 dias).
- Diluir e da cultura passagem como necessário para manter um OD 600 entre 0,2-1,0.
- Para a infecção, utilizar uma cultura estabelecida de Mtb -GFP dentro da fase de crescimento logarítmico (DO600 de 0,6-1). Para evitar culturas aglomerada, sonicar o frasco de cultura de M. tuberculosis num banho de água (130 W; 3 x 5 s pulsos) ONCe ou duas vezes por semana
2. Condições de cultura para As células THP-1
- Prepare completa meios de células THP-1 (meio RPMI-C), completando meio RPMI 1640 com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES.
- Incubar as células em um frasco T-75 a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou por citometria de fluxo em dias alternados e manter as células THP-1 a uma densidade entre 0,1-0600000 por mL.
3. Infecção protocolo para gerar estruturas Mtb / macrófagos agregadas
- THP-1 preparação de células (por placa de 96 poços)
- Centrífuga 7 X 10 6 células THP-1 a 250 xg durante 5 min. Ressuspender em 7 mL de meio RPMI-C.
- Preparação Mtb -GFP
- Centrifugar 2,8 x 10 8 Mtb -GFP a 3200 xg durante 5 minutos numa centrifuga-L baldecantar uma conversão de OD 600 1.0 = 3 x 10 8 bactérias / mL.
- Lavar uma vez com RPMI-C e centrifuga-se tal como no passo 3.2.1.
- Ressuspender em 7 mL de meio RPMI-C e agitar com vortex durante 10 s.
- Infecção
Nota: Consulte a Figura 1 para modelo.- Prepara-se uma placa de 96 cavidades por adição de 200 uL de água estéril em filas A e H e as colunas 1 e 12 para um aro de água para evitar a evaporação do meio de cultura.
- Adicionar 200 uL de RPMI-C para a coluna 2 (B2 para G2) para o controlo de fundo (em branco).
- Para infectar, adicione suspensão Mtb -GFP (passo 3.2) para suspensão de células THP-1 (passo 3.1) e misture bem por pipetagem. A densidade de células THP-1 final é de 5 x 10 5 por ml e a multiplicidade correspondente de infecção é de 40.
- Verter a suspensão de células THP-1 / Mtb -GFP em um reservatório de 25 ml.
- Adicionar 200 mL de THP-1 / suspensão Mtb -GFP a todos os 96 poços restantes (B3 através G11) usinga pipeta multi-canal.
NOTA: Se múltiplos que trabalha com placas de 96 poços, ressuspender regularmente a restante suspensão de células THP-1 / Mtb no reservatório para assegurar uma mistura uniforme é adicionado a cada poço. - Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 7-10 dias.
- Mudar meios a cada 2 dias, removendo-se lentamente 100 ul meios gasto a partir do topo de cada poço e suavemente adicionando 100 ul de RPMI pré-aquecido-C utilizando uma pipeta multi-canal. Não ressuspender poços e perturbar os agregados de Mtb / macrófagos no fundo dos poços.
- Examine visualmente os poços por microscopia de fluorescência (objetiva 4-10x) diariamente, tomando nota do tamanho do Mtb agregados / macrófagos. Por dia 10/07, Mtb agregados / macrófagos deve ser suficientemente grande (consulte a Figura 2 para referência) para prosseguir para testes de eficácia da droga (Seção 4).
- Se desejado, capturar imagens dos 96 poços utilizando um sistema de imagem de células automatizado equipadocom o campo luminoso e filtro GFP define para documentar a formação de agregados Mtb / macrófagos.
NOTA: Se os usuários não têm acesso a um sistema de imagem automatizado, imagens de poços representativos podem ser tomadas utilizando qualquer microscópio apropriado com capacidades de GFP e de campo brilhante.
4. Crescimento Ensaio de Inibição de Avaliação de Drogas eficácia contra Mtb Derivado do Mtb / macrófagos Agregados
- Preparação de drogas (em triplicado condições para duas drogas)
NOTA: Ver Figura 1A para o modelo.- Numa placa de 96 poços separada, adicionar 125 uL de meios de 7H9-C para B2 através de G10.
- Preparar dois fármacos com o dobro da maior concentração final desejada em 1 ml de 7H9-C para dar conta da diluição no passo 4.2.4.
- Adicionar 250 uL de cada fármaco aos poços B11-C11-D11 e E11-F11-G11, respectivamente, para tratamentos em triplicado.
- Usando uma pipeta multi-canal, em série dilute os fármacos de teste de duas vezes por movendo 125 mL de B11-G11-G10 em B10. Misturar por pipetagem de 5 vezes em cada passo.
- Continuar a mover-se 125 uL da coluna a coluna (direita para a esquerda) do outro lado da placa, e depois de parar a coluna 4.
- Depois de se misturar coluna 4, descartar 125 mL num recipiente de desperdícios. As colunas 2 e 3 não deve conter quaisquer drogas para permitir o uso como um fundo (em branco) e controlo de crescimento positivo.
NOTA: Como alternativa, siga modelo na Figura 1B para bibliotecas de teste de drogas. Cada placa de 96 poços pode acomodar 58 drogas numa concentração única. Preparar esta placa de drogas utilizando o dobro da concentração final desejada, uma vez que será diluída pela metade na etapa 4.2.4.
- O tratamento medicamentoso:
- Recuperar a placa de 96 poços contendo o Mtb infectados macrófagos (agregados de Mtb / macrófagos).
- Cuidadosamente decantar todos os poços relevantes (B2 através G11) com uma pipeta de multi-canal.Executar esta de um modo em dois passos: primeiro remover 150 mL sem inclinação da placa, e em seguida, retirar o suporte restantes (~ 50 ul) através da inclinação da placa e inserindo a ponta da pipeta para o bordo inferior do poço. Como Mtb / macrófagos agregados são aderentes ao fundo do poço, nenhum material deve ser perdida.
- Suavemente adicionar 100 de meio 7H9-C a todos os poços relevantes (B2 através G11) da placa contendo os agregados / macrófagos de M. tuberculosis.
- Usando uma pipeta de multi-canal, transferir 100 ul do fármaco que contém placa de 96 poços (passo 4.1) aos poços correspondentes da placa de infecção.
- Lugar em saco selado e incubar durante 3 dias a 37 ° C.
5. A quantificação da droga Eficácia Utilizando o Ensaio de Microtitulação Resazurina
- Prepare resazurina solução mãe a uma concentração final de 0,8 mg / ml em H 2 O. Filtra-se através de 0,22 um de tamanho dos poros da membrana de PVDF para a esterilização.
- Preparar solução de trabalho de resazurina por mistura de solução de resazurina, H2O e Tween-80 (solução a 20% em H2O) em uma proporção de 2: 1: 1. As concentrações finais são de 0,4 mg / mL de resazurina e 5% de Tween-80.
- Utilizando um leitor de placa, a instalação de um programa para ler a fluorescência a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão a cada 30 min durante 24 h a 37 ° C. leitor de placas pré-quente a 37 ° C.
- Adiciona-se 20 uL de solução de trabalho de resazurina a todos os poços relevantes (B2 a G11) da placa de drogas tratada (passo 4.11) usando uma pipeta de multi-canal.
- Coloque placa no leitor de placa e iniciar o programa criado no passo 5.3.
NOTA: Para facilitar o processamento de grandes volumes de placas de ensaio, que é suficiente para desenvolver o ensaio em uma incubadora a 37 ° C e realizar único fluorescência lê a cada 24 h. Isto também se aplica a usuários que não têm acesso a um leitor de placas com capacidades cinéticas e incubação.
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Representative Results
Para confirmar a robustez de adaptar este modelo de infecção de 96 poços formato de placa, que aqui examinada a susceptibilidade fármaco de M. tuberculosis, derivado da 96-bem adaptado modelo de infecção à rifampicina (RIF) e moxifloxacina (moxi) de acordo com o modelo dado na figura 1A. Nós demonstramos que a geração do M. tuberculosis / macrófagos estruturas agregadas chave para este ensaio podem ser produzidos de forma fiável num formato de placa de 96 poços (Figura 2), permitindo assim a compatibilidade de transferência (Figura 1B). Macrófagos passadas Mtb produzido deste modo pode ser utilizada directamente nos ensaios de eficácia de drogas usando o ensaio de microtitulação de resazurina bem caracterizado (Figura 3).
Como o ensaio depende de resazurina as espécies oxidativas produzidas pela Mtb metabolicamente activa para converter a resazurina azul para o Fluorescent resorufina rosa, a mudança de cor e de fluorescência pode ser utilizado como um marcador substituto para determinar a quantidade de crescimento bacteriano. Na Figura 3A, que mostra que não há sensibilidade suficiente dentro do ensaio de resazurina para detectar com fiabilidade as bactérias M. tuberculosis viáveis capazes de se replicar na ausência de drogas após apenas 3 dias de incubação. Embora a confirmação visual da mudança de cor do ponto final é apenas uma avaliação aproximada de crescimento, que pode com precisão quantificar este cineticamente por medição da conversão de resazurina no seu metabolito fluorescente resorufina utilizando um leitor de placas (Figura 3B). Usando estes dados, para normalizar o controlo de crescimento positivo (ausência de drogas) permite o cálculo das curvas de aniquilação de susceptibilidade para visualizar a eficácia da droga contra a M. tuberculosis passadas-macrófago (Figura 4).
Aqui, os resultados representativos nas Figuras 3 4 mostram que a concentração inibitória mínima (CIM), definida como a menor concentração do antibiótico em que é observada inibição do crescimento de 90%, é maior do que 2 mg / mL tanto para a rifampicina e moxifloxacina contra M. tuberculosis derivado do nosso modelo de infecção. Isto demonstra que o nosso modelo de infecção predizer a eficácia de fármacos anti-Mtb que estão mais em linha com os valores de MIC contra determinados intracelular Mtb 8, e, portanto, reflecte as propriedades de barreira de difusão que são negligenciadas na maior parte dos ensaios de susceptibilidade aos fármacos de M. tuberculosis usando células bacterianas cultivadas em caldo.
Mais importante, os dados obtidos usando o ensaio descrito no formato de 96 pos apresentou resultados muito comparáveis aos que tinham previamente determinado para rifampicina e moxifloxacina contra passadas-macrófagos 16 Mtb.
Figura 1: layout da placa de Drogas. (A) modelo de Exemplo da placa de desafio fármaco utilizado no passo 4. Isto permite o teste em paralelo de duas drogas em poços em triplicado em 8 concentrações definidas. Como um experimento representativo, foi utilizado rifampicina (RIF) e moxifloxacina (moxi) a partir de 2 uM e 2,5 uM, respectivamente. (B) um modelo alternativo para throughput screening é também fornecida para mostrar a possibilidade de teste de 58 compostos numa concentração única. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de Mtb / estruturas agregadas de macrófagos em placas de 96 poçosformato. (A) de campo claro Representante e GFP fundiu imagens de Mtb agregados -macrophage no dia 9 de infecção pós. As imagens foram capturadas com um objetivo 4X usando um programa de imagens de células automatizado que documenta todo o bem costurando uma montagem de 3 por 3 imagens capturadas individualmente. (B) uma imagem individual não costuradas do campo visual mostrado em (A). (C) Um representante fundiu imagem Campo e GFP brilhante de um / estrutura agregada macrófagos Mtb capturado com uma objetiva de 10X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Usando o ensaio de microtitulação resazurina para medir a viabilidade Mtb. (A) A presença de viablcélulas de M. tuberculosis e pode ser simplesmente determinado pela conversão do corante azul de resazurina a sua cor de rosa, forma reduzida. Os resultados representativos são mostrados aqui usando rifampicina (RIF) e moxifloxacina (moxi) de acordo com o modelo na Figura 1A. (B) para medir quantitativamente a conversão de resazurina, fluorescência de poços individuais (correspondente à figura 3A) foi monitorizada cineticamente durante 24 h tal como descrito no passo 5. representativos mini-gráficos mostram unidades de fluorescência relativa (eixo y) versus tempo (x -eixo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Determinação de sensibilidade às drogas matando curvas a partir de dados REMA. unidades de fluorescência relativa no momento de máxima resazurin sinal em (A) e (B rifampicina) moxifloxacina (a partir de poços tratados Figura 3B) foram normalizados para o controlo sem droga (Mtb crescimento máxima) como 100% de sobrevivência. controle de fundo sinais (em branco) foram subtraídos a cada poço de amostra. A percentagem de sobrevivência foi representada graficamente para cada concentração de cada droga de tratamento para gerar uma curva de morte. Os dados apresentados nesta figura representam as médias ± DP de três experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo de infecção por Mtb alternativa adequada para testes de eficácia da droga. Este modelo leva em conta dois fatores-chave que devem ser dadas mais consideração durante o processo de início de desenvolvimento TB: a presença de barreiras fisiologicamente relevantes para a penetração da droga e as alterações metabólicas de Mtb durante a infecção. Embora tenhamos mostrado previamente os benefícios do nosso modelo de infecção e propôs a possibilidade de expansão da infecção para compatibilidade com o rendimento de 16, aqui nós demonstramos que este é realmente viável, adaptando o sistema diretamente em formato de placa de 96 poços. A capacidade de gerar Mtb / macrófagos agregados directamente em placas de 96 poços é vantajoso uma vez que remove a necessidade de pipeta e distribuir os agregados a partir de um frasco de cultura de grande em poços individuais, o que é inerentemente difícil como os tamanhos dos agregados podem atingir tamanhos> 500 uM. O grande tamanho dos agregados de macrófagos infectados impediria a utilização de P200 pipetas multicanal, que são necessárias para os ensaios de rendimento, uma vez que seria ou entupir as pontas ou pipetagem extensa iria quebrar os agregados. A modificação deste sistema de infecção para placas de 96 poços reduz a quantidade de passos de manipulação necessárias e gera poços uniformes com quantidades semelhantes de Mtb agregados / macrófagos. Como tal, este sistema de ensaio é particularmente valiosa não só no processo de desenvolvimento precoce para prever a eficácia dos compostos candidatos da ligação in vivo, mas no rastreio de bibliotecas de drogas.
Uma das principais vantagens do modelo de infecção descrito é a utilização de um BSL-2 compatível estirpe Mtb. A capacidade de trabalhar sob condições BSL-2 é altamente rentável, acelera a manipulação do protocolo, e mais importante ainda permite aos laboratórios que não têm acesso a uma instalação BSL-3 para executar aSE avançada ensaios de rastreio de drogas. O utilizada auxotr�ica mc Mtb 2 6206 estirpe é um derivado de H37Rv 17, 18 que retém todos, mas 4 genes, PANCD e leuCD, que não afectam a resistência aos medicamentos ou tolerância 16. Em comparação com outros substitutos de Mtb comumente utilizados, tais como M. bovis BCG e M. smegmatis, Mtb mc 2 6206 está mais estreitamente relacionado com virulento M. tuberculosis H37Rv, a estirpe de referência para estudos de patogénese. É importante notar que mantém o locus RD-1, que está ausente de BCG e desempenha um papel importante na virulência do Mtb e formação de granulomas 19. Comparativamente, Mtb mc 2 6206 também é mais relevante para os ensaios de desenvolvimento de TB-drogas do que M. smegmatis, que é uma espécie de crescimento rápido que é genomically diferente de Mtb e tem diferentes perfis de resistência a antibióticos.
O ensaio aqui descrito é também valioso devido ao seu elevado grau de flexibilidade. As placas de 96-poços contendo os agregados de M. tuberculosis / macrófagos podem ser utilizados não só para a titulação de tratamentos com drogas em triplicado, como mostramos (Figura 3), mas também para o rastreio de bibliotecas de drogas inteiras (Figura 1B). Numa concentração única, cada placa de 96 poços pode tela 58 compostos. Este número aumentaria drasticamente a> 300 compostos se o sistema de infecção é adaptado para uma placa de 384 poços, o qual é completamente possível com base em que o facto de que obter sinais fortes de resazurina depois de apenas permitir que as bactérias para replicar durante 3 dias. Na verdade, seria relativamente simples de adaptar este sistema para o formato de placa de 384 poços, como excepção para baixo-escalando os volumes proporcionalmente de acordo com o formato bem menor, a maior parte do protocolo permaneceriam inalterados. Para permitir sinal adequada para o ensaio de resazurina, pode sernecessária para estender a incubação no passo 4.2.5 a 7 dias para permitir a replicação bacteriana suficiente.
Enquanto o acoplamento deste modelo de infecção com o ensaio de resazurina como um read-out para a viabilidade Mtb tem muitos benefícios, ou seja, a sua relação custo-eficácia e protocolo de ensaio rápido, enquanto a obtenção de resultados comparáveis a outros sistemas padrão ouro como BACTEC 460 20, que, no entanto, tem algumas limitações . O ensaio resazurina não pode discriminar entre as drogas bacteriostáticas e bactericidas uma vez que só mede a atividade metabólica. Esta é uma restrição importante a ter em mente, como a atividade metabólica é inerentemente baixa em Mtb latente. No entanto, o componente-chave do presente ensaio é o modelo de infecção, que pode ser compatível com leituras de M. tuberculosis para a susceptibilidade da droga que não seja o ensaio de resazurina. Por exemplo, após o tratamento com droga, os poços podem ser directamente plaqueadas para formação de colónias unidade (CFU) de contagem, o ouro Standard para testar a actividade bactericida de compostos (embora isto não é compatível com throughput screening). Em alternativa, este sistema pode ser acoplado a luciferase expressa M. tuberculosis, que tem sido demonstrado que se correlacionam de perto a contagem de CFU 21. Para utilizar um sistema de luciferase para medir a sensibilidade às drogas, apenas duas alterações ao protocolo seria necessário: i) substituição de Mtb -GFP com Mtb -luciferase e ii) a utilização de Glo-Bright reagente luciferina no lugar de resazurina na etapa 5. o uso de luciferase expressa Mtb iria encurtar o desenvolvimento do ensaio de 30 min enquanto aumenta consideravelmente a sensibilidade do ensaio para níveis que seriam facilmente compatível com o formato de placa de 384 poços.
Em resumo, temos a transição com sucesso este modelo de infecção em um formato de placa de 96 poços que tem relativamente poucos passos de manipulação, de alta reprodutibilidade, e a capacidade de produzir quantidades infinitas de partidamaterial, todos os fatores-chave para a compatibilidade de transferência. Este ensaio também é facilmente adaptável a muitos formatos diferentes e read-outs, tornando-se um recurso valioso para o processo de descoberta de drogas no início Mtb.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
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