Introduction
Туберкулез (ТБ) остается серьезной угрозой глобального здравоохранения , несмотря на наличие противотуберкулезных режимов химиотерапии в течение более 40 лет 1. Это связано отчасти с требованием в течение длительного периода лечения в течение 6 месяцев с использованием нескольких комбинаций лекарственных препаратов, что приводит к пациенту несоблюдения 2. Возникновение лекарственно-устойчивого туберкулеза в последние годы еще более усугубляются проблемы в области , где успешное развитие клинически одобренных препаратов практически не существует 3. Действительно, несмотря на исчерпывающий разработки лекарственных средств против туберкулеза, только один препарат был одобрен FDA для клинического использования в течение последних 40 лет 4. Таким образом, крайне необходимы новые поколения противотуберкулезных препаратов для решения этой проблемы.
Ключевой проблемой в обнаружении наркотиков ТБ является отсутствие успешной передачи из соединений с активностью в пробирке эффективности в клинических условиях= "Xref"> 5, 6, 7. Первоначально целевые подходы , основанные были использованы для скрининга лекарственных средств анти- MTB 5, которые не удалось перевести в целые бактериальные клетки. Даже при использовании MTB клетки, она часто выполняется с использованием бульона выращенных культур, которые не точно предсказать эффективность лекарственного средства в естественных условиях 8, 9. Эти проблемы были признаны и скрининга лекарственных препаратов анализы против макрофагов , содержащих MTB или латентную MTB были успешно установлены 8, 10, 11, 12. Тем не менее, даже эти более продвинутые анализы не дают достаточного внимания к проникновению барьеров, что наркотики столкнуться в не васкуляризированных легочных поражений, а в некротических очагов на месте инфекции. В самом деле, Даже для первой линии ТБ рифампицином наркотиков, неоптимальной дозирование была поставлена под сомнение в связи с недостаточным в естественных условиях ткани и спинномозговой жидкости (CSF) проникновение 13, 14, 15, а также снижение эффективности против внутриклеточной Mtb 8, 9. Как таковые, новых моделей и анализов, которые учитывали бы эти параметры в ходе процесса разработки свинца начале будет, несомненно, улучшит ТБ усилия обнаружения наркотиков.
Чтобы удовлетворить эту потребность, мы недавно установили недорогой, быстрый, и BSL-2 совместимый альтернативную модель заражения для Mtb наркотиков тестирования 16 эффективности. Эта инфекция модель производится плотно упакованной MTB в крупных макрофагами агрегированных структур, что физиологически соответствующие воспроизводятся барьеры проникновения сотовой связи и порожденных макрофаг-пассировать
Здесь мы опишем подробно поколение MTB / макрофагами агрегированных структур для производства макрофаг-пассировать Mtb подходит для тестирования чувствительности к лекарственным препаратам с использованием Рема. В частности, мы покажем, как эта система инфекция может быть адаптирована к формату 96-луночного для совместимости с скрининга кандидатов противотуберкулезных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: В туберкулезной MC 2 6206 является авирулентный штамм 17, 18, все работы в этом протоколе могут быть выполнены в 2 уровня биологической безопасности объекта (BSL-2).
1. Условия культивирования для зеленого флуоресцентного белка Выражая туберкулезной MC 2 6206 (MTB -GFP)
Примечание: туберкулез M. H37Rv полученный ауксотроф штамма MC 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) , трансформированные с GFP экспрессии плазмиды pMN437 используется в этом протоколе 16. Можно заменить штамм Mtb -GFP с не- GFP экспрессии штамма дикого типа с целью упрощения доступности штамма для исследователей. Однако экспрессия GFP желательно включить визуальное подтверждение фагоцитоза и образования агрегатов / макрофагов MTB. Для долготуг Срок хранения, Mtb -GFP замораживают при температуре -80 ° С в полных 7H9 средах (описанных в пункте 1.1) , дополненной 20% глицерина.
- Подготовьте полный Mtb -GFP носитель (7H9-C), дополнив 7H9 среду с добавлением 10% Миддлбрука OADC, 0,02% тилоксапола, 24 мкг / мл D-пантотеновой кислоты, 50 мкг / мл L-лейцина и 50 мкг / мл гигромицину В.
- Оттепель один флакон Mtb -GFP и добавляют к 10 мл 7H9-C в квадратной нижней PETG колбу 30 мл.
- Инкубируют при 37 ° С на роторной качалке (50 оборотов в минуту). Проводите измерения оптической плотности (OD 600) каждые несколько дней , пока OD 600 не достигнет 1,0 (приблизительно 5-8 дней).
- Развести и прохождение культуры по мере необходимости для поддержания OD 600 между 0,2-1,0.
- Для заражения, использовать установленную культуру Mtb -GFP в логарифмической фазе роста (OD 600 0,6-1). Чтобы избежать глыбовыми культур, разрушать ультразвуком культуры колбу MTB на водяной бане (130 Вт; 3 х 5 сек импульсов) ОНКе или два раза в неделю
2. Условия культивирования для ТНР-1 клеток
- Подготовьте полный ТНР-1 клеточную среду (среда RPMI-C), дополняя RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES.
- Инкубируйте клеток в Т-75 колбу при 37 ° C в увлажненной атмосфере , содержащей 5% CO 2.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра или проточной цитометрии через день и поддерживать клетки ТНР-1 при плотности от 0,1 до 0,6 млн на мл.
3. Протокол Заражение для генерации MTB / макрофагами агрегатных структурах
- ТНР-1 препарат клеток (на 96-луночный планшет)
- Центрифуга клетки 7 × 10 6 ТНР-1 при 250 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют в 7 мл RPMI-C.
- Препарат Mtb -GFP
- Центрифуга 2,8 х 10 8 Mtb -GFP при 3200 мкг в течение 5 мин в бакет-центрифуге Uпеть преобразование OD 600 1,0 = 3 × 10 8 бактерий / мл.
- Промывают один раз RPMI-C и центрифуга, как на этапе 3.2.1.
- Ресуспендируют в 7 мл RPMI-C и вихревое в течение 10 с.
- Инфекционное заболевание
Примечание: На рисунке 1 шаблона.- Подготовка 96-луночный планшет с добавлением 200 мкл стерильной воды в строках А и Н и столбцах 1 и 12 для воды ободком для предотвращения испарения культуральной среды.
- Добавить 200 мкл RPMI-C к колонке 2 (B2 на G2) для фонового контроля (пробел).
- Для заражения, добавьте Mtb -GFP суспензию (шаг 3.2) к ТНР-1 клеточной суспензии (этап 3.1) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Окончательный ТНР-1 плотность клеток 5 х 10 5 на мл и соответствующей кратностью инфекции 40.
- Налейте ТНР-1 / Mtb -GFP суспензии в резервуар 25 мл.
- Добавить 200 мкл THP-1 / Mtb -GFP подвески для всех остальных 96- ти лунок (B3 через G11) USINга многоканальная пипетка.
Примечание: Если работы с несколькими 96-луночные планшеты, регулярно ресуспендирования оставшегося ТНР-1 / MTB суспензии в резервуаре , чтобы обеспечить даже смесь добавляют в каждую лунку. - Инкубировать при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 7-10 дней.
- Изменение среды каждые 2 дня, медленно удаляя 100 мкл истощенные среды из каждой лунки и осторожно добавлением 100 мкл предварительно нагретую RPMI-C, используя пипетку многоканальный. Не ресуспендируют скважин и нарушить агрегаты MTB / макрофаги на дне лунок.
- Визуально проверьте лунки с помощью флуоресцентной микроскопии (4-10X объективной) ежедневно, принимая во внимание размер агрегатов / макрофагами MTB. Днем 7-10, MTB / макрофаги агрегаты должны быть достаточно большим (см рисунок 2 для справки) , чтобы приступить к тестированию эффективности лекарственного средства (раздел 4).
- При желании, захвата изображения 96-лунок с использованием системы автоматизированной обработки изображений клеток установленыс ярким полем и GFP наборов фильтров к документу MTB / макрофагами образования агрегатов.
Примечание: Если пользователи не имеют доступа к автоматизированной системе формирования изображения, изображения представительных скважин могут быть выполнены при помощи любого подходящего микроскопа с GFP и светлого поля возможностями.
4. Рост Анализ ингибирования для оценки эффективности против наркотиков MTB Производный от MTB / макрофагальной Совокупностей
- Лекарственный препарат (тройные условия для двух препаратов)
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1A для шаблона.- В отдельном 96-луночного планшета, добавляют 125 мкл 7H9-C Среда для В2 до G10.
- Готовят два препарата в двойном высшей желаемой конечной концентрации в 1 мл 7H9-C для учета разбавления на этапе 4.2.4.
- Добавить 250 мкл каждого препарата в лунки B11-C11-D11 и E11-F11-G11, соответственно, для трех параллельных обработок.
- Используя пипетку многоканальный, последовательно разбавленнымЮт тестируемые препараты в два раза путем перемещения 125 мкл из B11-G11 в B10-G10. Смешайте с помощью пипетки 5 раз на каждом шаге.
- Продолжайте двигаться 125 мкл из колонки в колонку (справа налево) через пластину, и остановится после колонки 4.
- После смешивания колонку 4, выбросьте 125 мкл в контейнер для отходов. Колонки 2 и 3 не должны содержать каких-либо лекарств, чтобы использовать в качестве фона (пробел) и положительного контроля роста.
Примечание: В качестве альтернативы, следуйте шаблон на рисунке 1В для библиотек тестирования на наркотики. Каждый 96-луночный планшет может вместить 58 препаратов в одной концентрации. Подготовить этот препарат пластины с использованием двойной желаемой конечной концентрации, так как он будет разбавлен пополам на шаге 4.2.4.
- Медикаментозное лечение:
- Получение 96-луночный планшет , содержащий MTB -infected макрофаги (MTB / макрофаги агрегаты).
- Тщательно сцедить все соответствующие лунки (В2 через G11) с многоканальным пипеткой с.Выполнить это в двухступенчатом образом: сначала удалить 150 мкл без наклона пластины, а затем удалить остатки бумаги (~ 50 мкл) за счет наклона пластины и вставки наконечника пипетки к нижнему краю колодца. Как MTB / макрофаг агрегаты прилипает к нижней части скважины, материал не должен быть потерян.
- Осторожно добавьте 100 мкл 7H9-C СМИ ко всем соответствующим колодцах (В2 через G11) пластины , содержащей агрегаты / макрофаги MTB.
- Используя пипетку многоканальный, передача 100 мкл из препарата, содержащего 96-луночный планшет (этап 4.1) в соответствующие лунки инфекции пластины.
- Место в закрытом пакете и инкубировать в течение 3-х дней при 37 ° С.
5. Количественное Drug Эффективность с использованием анализа ресазурин микротитрами
- Подготовка резазурин маточного раствора в конечной концентрации 0,8 мг / мл в H 2 O. Смесь фильтруют через 0,22 мкм фильтр с размером пор PVDF мембраны для стерилизации.
- Подготовка ресазурин рабочего раствора путем смешивания резазурин исходного раствора, H 2 O и твин-80 (20% раствор в H 2 O) в соотношении 2: 1: 1. Конечные концентрации 0,4 мг / мл ресазурина и 5% твин-80.
- С помощью планшет-ридера, установки программу для чтения флуоресценции при 530 нм возбуждение и 590 нм эмиссии каждые 30 мин в течение 24 ч при 37 ° С. Предварительно теплая пластина для чтения до 37 ° С.
- Добавьте 20 мкл рабочего раствора резазурин все соответствующие лунки (В2 через G11) препарата обрабатывают пластины (этап 4.11), используя пипетку многоканальный.
- Поместите пластину на планшет-ридере и запустить программу установки на шаге 5.3.
Примечание: Для облегчения обработки больших объемов аналитических планшетов, достаточно для разработки анализа в C инкубаторе 37 ° и выполнения отдельной флуоресцентной читает каждые 24 часа. Это также относится к пользователям, которые не имеют доступа к ридере с кинетической и инкубационных возможностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для подтверждения надежности адаптации этой модели инфекции до 96-луночного пластины, мы здесь рассмотрели лекарственной чувствительности МТБ , полученного из нашего 96-луночного адаптированный инфекции модели к рифампицину (РИФ) и моксифлоксацин (Moxi) в соответствии с шаблоном , приведенной на рис 1A. Показано , что генерация MTB / макрофаг агрегированных структур ключевых в этом анализе может быть надежно произведено в 96-луночный формат пластины (рисунок 2), тем самым обеспечивая совместимость пропускная способность (Рисунок 1В). Макрофаги пассировать Mtb , полученный таким образом , может быть непосредственно использован для тестирования эффективности лекарственного средства с использованием хорошо охарактеризованных анализа ресазурин микротитрования (рисунок 3).
По мере того как анализ ресазурина опирается на окислительную видов производимых метаболически активных Mtb преобразовать синий резазурин в Fluorescent розовый резоруфином, изменение цвета и флуоресценции можно использовать для в качестве суррогатного маркера для определения количества бактериального роста. На рисунке 3А, мы покажем , что существует достаточно чувствительность в анализе резазурин надежно обнаружить жизнеспособные MTB бактерии , способные к репликации в отсутствие лекарств только после 3 дней инкубации. В то время как визуальное подтверждение изменения конечной точки цвета является лишь приблизительная оценка роста, мы можем точно количественно это путем измерения кинетически преобразование резазурин к его флуоресцентного метаболита резоруфином с использованием планшет - ридер (рис 3B). Используя эти данные, нормализующее к положительному контролю роста (отсутствие препаратов) позволяет для вычисления восприимчивости убивающих кривых визуализировать эффективность препарата против макрофаг-пассировать Mtb (рисунок 4).
Здесь, показательные результаты в цифрах 3 4 показывают , что минимальная ингибирующая концентрация (МИК), определяется как самая низкая концентрация антибиотика , при которой наблюдается ингибирование роста на 90%, больше , чем 2 мкг / мл для обоих рифампицина и моксифлоксацина против Mtb , полученного из нашей модели инфекции. Это свидетельствует о том, что наша модель предсказывает инфекции эффективность анти - препаратов MTB, которые более соответствуют значениям MIC , определенных в отношении внутриклеточных Mtb 8, и , таким образом , отражает свойства диффузионного барьера, которые пренебрегали в большинстве MTB чувствительности к лекарственным средствам анализа с использованием отвара выращенных бактериальных клеток.
Важно отметить, что данные , полученные с использованием описанного анализа в формате 96-луночного показали весьма сопоставимые результаты тем , которые мы ранее определяли для рифампицина и моксифлоксацина против макрофаг-пассировать Mtb 16.
Рисунок 1: Drug макет пластины. (А) Пример шаблона из провокационного лекарственного средства пластины , используемой на этапе 4. Это позволяет параллельное тестирование двух препаратов в трех лунках при 8 определенных концентрациях. В качестве показательного эксперимента мы использовали рифампицина (РИФ) и моксифлоксацин (Moxi), начиная с 2 мкМ и 2,5 мкМ, соответственно. (B) Альтернативный шаблон для скрининга также предоставляется , чтобы показать возможность тестирования 58 соединений в одной концентрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Генерация MTB / макрофаг агрегированные структуры в 96-луночный планшетформат. (А) представитель светлого поля и GFP объединены изображения MTB -macrophage агрегатов на 9 -й день после заражения. Изображения были захвачены с целью 4X с использованием автоматизированной программы обработки изображений клеток, что документы все хорошо прошиты нарезку из 3 × 3 по отдельности захваченных изображений. (В) физическому лицу, прошитый изображение из поля зрения , показанного на виде (А). (C) Представитель слился светлого поля и GFP образ MTB / макрофагами совокупной структуры захваченного с целью 10X. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Использование резазурин анализа микротитрования для измерения жизнеспособности MTB. (А) Наличие viablклетки е MTB может быть просто определено путем преобразования синего резазурин красителя к его розовой, восстановленной формы. Типичные результаты приведены здесь с использованием рифампицина (РИФ) и моксифлоксацин (Moxi) в соответствии с шаблоном на рисунке 1А. (B) Для количественного измерения конверсии резазурин, флуоресценция отдельных скважин ( в соответствии с рис 3А) контролировали кинетически в течение 24 ч , как описано в шаге 5. Представитель мини-графики показывают относительные единицы флуоресценции (ось у) в зависимости от времени (х -ось). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Определение лекарственной чувствительности убийство кривых из данных REMA. Относительные единицы флуоресценции в момент максимального resazУрин сигнал в (А) рифампицина и (В) моксифлоксацин обработанных скважин (из рис 3B) были нормированы на нет контроля над наркотиками (максимального роста МЗП) , как выживаемость 100%. Управление Фон (Пустые) сигналы вычитали из каждого образца хорошо. Выживание процентов наносили на график для каждой отдельной концентрации лекарственного лечения, чтобы сформировать кривую убийства. Данные в этой фигуре представляют собой средние значения ± SD трех независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы подробно описали альтернативную модель MTB инфекции подходит для тестирования эффективности лекарственного средства. Эта модель учитывает два ключевых фактора , которые следует уделять больше внимания в ходе процесса разработки ранней противотуберкулезных препаратов: наличие физиологически соответствующих барьеров на пути проникновения наркотиков и метаболические изменения МТБ во время инфекции. В то время как мы ранее показали преимущества нашей модели инфекции и предложила рассмотреть возможность расширения масштабов инфекции для совместимости с пропускной способностью 16, здесь мы покажем , что это действительно достижимо путем адаптации системы непосредственно в формате 96-луночного планшета. Способность генерировать MTB / макрофаг агрегатов непосредственно в 96-луночные планшеты , является предпочтительным , поскольку оно снимает требование к пипетке и распространять агрегаты с большой колбе для культивирования в отдельные лунки, которое по существу трудно , как размеры агрегатов могут достигать размеров> 500 мкм, Большой размер зараженных агрегатов макрофагами бы предотвратить использование P200 пипетки многоканальными, которые необходимы для пропускной способности анализов, как это будет либо забивают советы или обширные пипеткой бы распадаться агрегатов. Модификация этой инфекции системы к 96-луночные планшеты уменьшает количество шагов , необходимых манипуляций и формирует единые скважины с аналогичными количествами агрегатов / макрофагами MTB. Таким образом , эта система анализ особенно ценен не только в процессе раннего развития для прогнозирования эффективности свинцовых соединений - кандидатов , в естественных условиях, но в скрининга библиотек наркотиков.
Ключевым преимуществом описанной модели инфекции является использование в BSL-2 совместимого штамма Mtb. Способность работать в условиях BSL-2 условиях является весьма рентабельным, ускоряет обработку протокола, а главное позволяет лабораториям, которые не имеют доступа к BSL-3 объекта для выполненияSE расширенный скрининг лекарств анализы. Использованный ауксотрофная Mtb MC 2 6206 штамм является производным от H37Rv 17, 18 , которая сохраняет все , кроме 4 генов, panCD и leuCD, которые не влияют на устойчивость к лекарству или толерантности 16. По сравнению с другими широко используемыми MTB суррогатов , таких как М. Bovis БЦЖ и М. smegmatis, Mtb MC 2 6206 наиболее тесно связанной с вирулентных MTB H37Rv, эталонный штамм для исследования патогенеза. Важно то , что он поддерживает RD-1 локус, который отсутствует от БЦЖ и играет важную роль в Mtb вирулентности и образование гранулемы 19. Для сравнения, Mtb MC 2 6206 также более актуально для анализов развития ТБ наркотиков , чем M. smegmatis, который является быстро растущий вид , который genomically отличается от Mtb и имеет различные профили устойчивости к антибиотикам,
Анализ, описанный здесь, также ценно в связи с его высоким уровнем гибкости. 96-луночные планшеты , содержащие агрегаты MTB / макрофаги могут быть использованы не только для титрования лекарственной терапии в трехкратном повторе , как мы показали (рис 3), но и для скрининга целых библиотек наркотиков (рис 1В). При одной концентрации, каждый 96-луночный планшет может сито 58 соединений. Это число будет резко возрастет до> 300 соединений, если система инфекция адаптирована к 384-луночного планшета, что вполне осуществимо на основе, что тот факт, что мы получаем сильные сигналы резазурин после того, как только что позволяет бактерии повторить в течение 3-х дней. На самом деле, было бы относительно легко адаптировать эту систему к 384-луночного формата пластины, а кроме понижающего масштабирования объемов пропорционально, чтобы соответствовать меньшей -луночные, большинство протокола остается неизменным. Для того, чтобы можно было надлежащим образом сигнал для анализа резазурин, оно может бытьтребуется продлить инкубацию на этапе 4.2.5 до 7 дней, чтобы обеспечить достаточно бактериальной репликации.
В то время как соединения этой инфекции модель для анализа резазурин в качестве считывания для жизнеспособности Mtb имеет много преимуществ, а именно его экономическую эффективность и быстрый протокол анализа при получении сопоставимых результатов других золото стандартных систем , таких как BACTEC 460 20, тем не менее она имеет некоторые ограничения , Анализ ресазурин не может различать бактериостатические и бактерицидные препаратов, поскольку он измеряет только метаболическую активность. Это является важным сдерживающим фактором, чтобы иметь в виду, так как метаболическая активность по своей сути с низким содержанием скрытой Mtb. Тем не менее, ключевым компонентом этого анализа является модель инфекция, которая может быть совместим с чтения выходами для Mtb лекарственной чувствительности, кроме анализа резазурин. Например, после того, как медикаментозное лечение, скважины могут быть непосредственно высевали за образование единицы колонии (КОЕ) подсчета, золото Стандардскую для проверки бактерицидной активности соединений (хотя это не совместимо с скрининга). В качестве альтернативы, эта система может быть соединена с люциферазы , выражающую MTB, которое было показано , тесно коррелирует с КОЕ подсчета 21. Для того, чтобы использовать систему люциферазы для измерения чувствительности к лекарству, потребовалось бы только два изменения протокола: я) замена Mtb -GFP с Mtb -luciferase и II) использование Bright-Glo реагента люциферин вместо резазурин в шаге 5. использование люциферазы выражения Mtb бы сократить развитие анализа до 30 мин при одновременном значительном повышении чувствительности анализа до уровней , которые были бы легко совместим с 384-луночного формата пластины.
Таким образом, мы успешно переходили эту инфекцию модель в формате 96-луночного планшета, который имеет относительно небольшое число шагов манипуляции, высокой воспроизводимости и способность производить бесконечное количество пускаматериал, все ключевые факторы в пропускной совместимости. Этот анализ также легко адаптируется ко многим различных форматов и вывода, что делает его ценным активом для начала процесса обнаружения наркотиков Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
