Introduction
Tüberküloz (TB) 40 yılı aşkın 1 TBC kemoterapi rejimlerinin varlığına rağmen ciddi bir küresel sağlık tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu uyumsuzluğu 2 hastaya neden çoklu ilaç kombinasyonları kullanılarak 6 aydan uzun tedavi dönemleri için gereksinimi, kısmen kaynaklanmaktadır. Klinik onaylı ilaçların başarılı gelişimi 3 neredeyse varolmayan olduğu son yıllarda ilaca dirençli TB çıkması ayrıca bir alanda sorunları bileşik etti. Nitekim, ayrıntılı bir anti-TB ilaç geliştirme rağmen, sadece tek bir ilaç FDA son 40 yılda 4 klinik kullanım için onaylanmıştır olmuştur. Bu nedenle, anti-TB ilaçların yeni nesil acilen bu sorunu çözmek için ihtiyaç vardır.
TB ilaç keşfinde önemli bir sorun klinik ortamda etkinliğine in vitro aktiviteye sahip bileşikler başarılı transfer olmaması= "xref"> 5, 6, 7. Başlangıçta, hedef bazlı yaklaşımlar tam bakteriyel hücrelere çevirmek için başarısız anti-Mtb Drugs 5, taranması için kullanıldı. Mtb hücreleri kullanılır bile, genellikle doğru vivo 8, 9 ilaç etkinliğini öngörmek olmayan suyu üreyen kültürler, kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sorunlar, tanınmış ve MTB veya gizli Mtb içeren makrofajlar karşı ilaç tarama deneyleri başarıyla 8, 10, 11, 12 tespit edilmiştir. Ancak, hatta bu daha gelişmiş analizler ilaçlar non-vaskülarize akciğer lezyonları karşılaştıkları penetrasyon engelleri yeterli önem vermesi ve yok enfeksiyon yerinde nekrotik odaklar. AslındaHatta ilk basamak TB ilaç rifampisin için, sub-optimal doz nedeniyle in vivo doku ve beyin omurilik sıvısı (BOS) 'de vasat sorgulanmıştır hücre içi Mtb 8, 9 karşı etkinin azalmasına yanı sıra 13, 14, 15 nüfuz. şüphesiz TB ilaç keşif çabalarını artıracak erken kurşun geliştirme sürecinde dikkate bu parametreleri alacak gibi, yeni modeller ve tahlilleri gibi.
Bu ihtiyacı karşılamak için, biz son zamanlarda Mtb ilaç etkinlik testleri 16 için, ucuz, hızlı ve BSL-2 uyumlu alternatif enfeksiyon modeli kurdu. Fizyolojik ilgili hücresel penetrasyon engelleri değinmeyecek ve makrofaj pasajlandı oluşturulan yoğun üretilen büyük makrofaj agrega yapılar içinde Mtb paketlenmiş Bu enfeksiyon modeli,
Burada ayrıntılı olarak rema kullanılarak ilaç duyarlılık testi için makrofaj geçirilmiş Mtb uygun üretmek Mtb / makrofaj agrega yapıların üretilmesini tarif eder. Özel olarak, bu enfeksiyonun sistemi aday anti-TBC ilaçların verimli tarama ile uyumlu bir 96-gözlü formata adapte olabilir şeklini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: 2 6206 bir avirulent suşu 17, 18 M. tuberculosis mc gibi, bu protokoldeki tüm çalışma Biyogüvenlik Seviye 2 tesis (BSL-2) yapılabilir.
M. tuberculosis mc 2 ifade Yeşil Floresan Protein 1. Kültür koşulları 6206 (Mtb GFP)
NOT: M. tuberculosis H37Rv auxotroph suşu 6206 mc 2 türetilmiş (Δ panCD, Δ leuCD) plazmid pMN437 ifade GFP bu protokol 16 boyunca kullanılır ile dönüştürdü. Olmayan GFP araştırmacılar için gerginlik daha kolay erişilebilirliği sağlamak için yabani tip gerginlik ifade ile Mtb GFP gerginlik yerine mümkündür. Bununla birlikte, GFP tanımı fagositozu ve Mtb / makrofaj agregaların oluşumunun görsel onay sağlamak için arzu edilir. long süreli depolama, Mtb GFP% 20 gliserol ile desteklenmiş (adım 1.1 tarif edilmiştir) eksiksiz 7H9 ortamında -80 ° C'de dondurulmuştur.
- % 10 Middlebrook OADC,% 0.02 tiloksapol 24 ug / mL D-pantotenik asit, 50 ug / ml L-lösin ve 50 ug / ml Higromisin B ile 7H9 ortamında ilave tamamlandığını Mtb GFP ortamı (7H9-C) hazırlanması
- Mtb GFP bir şişe çözülme ve 30 ml kare alt PETG şişede 7H9-C 10 mL ekle.
- Döner bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 37 ° C'de inkübe edin. Optik yoğunluk ölçümleri (OD 600) birkaç günde OD 600 1.0 (yaklaşık 5-8 gün) ulaşıncaya kadar atın.
- Bir OD 0.2-1.0 arasında 600 korumak için gerektiği gibi sulandırmak ve geçit kültürü.
- Enfeksiyon için, logaritmik büyüme fazı (OD 0.6-1 600) içinde Mtb GFP kurulmuş bir kültür kullanın. Clumpy kültürleri önlemek için, bir su banyosu içinde Mtb kültür şişesi sonikasyon (130 W; 3 x 5 s darbe) ONCE veya haftada iki kez
2. Kültür Koşulları THP-1 hücreleri
- % 10 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES ile RPMI 1640 ortamı ilave etmek suretiyle tamamlandı, THP-1 hücre ortamı (RPMI-C) hazırlayın.
- % 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C'de bir T-75 balonuna hücreleri inkübe edin.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın veya gün aşırı akış sitometrisi ve 0.1 mL başına milyon 0.6 arasında bir yoğunlukta THP-1 hücreleri korumak.
3. Enfeksiyon Protokol Mtb / Makrofaj Agrega Yapıları oluşturmak için
- THP-1 hücre preparasyonu (96 oyuklu plaka başına)
- 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin 7 x 10 6 THP-1 hücreleri. 7 ml RPMI-C süspanse.
- Mtb GFP hazırlık
- Santrifüj 2.8 x 10 8 Mtb GFP sallanan kovası santrifüj 3200 xg 5 dakika süreyle uOD 600, 1.0 = 3 x 10 8 bakteri / ml arasında bir dönüşüm şarkı.
- Adım 3.2.1 olarak RPMI-C ve santrifüj ile bir kez yıkayın.
- 10 s 7 ml RPMI-C süspanse ve vorteks.
- enfeksiyon
NOT: Şablon için Şekil 1'e bakınız.- kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için bir su ağız için satırlar A ve H ve sütun 1 ve 12, steril su, 200 uL eklenmesiyle 96 oyuklu bir plaka hazırlanması.
- Arka plan kontrolü (Boş) sütununda 2 (G2 B2) 200 ul RPMI-C ekleyin.
- Bulaştırmak için, THP-1 hücre süspansiyonu (adım 3.1) Mtb GFP süspansiyon (adım 3.2) ekleyin ve pipetleme iyice karıştırın. Nihai THP-1 hücre yoğunluğu mL başına 5 x 10 5 ve enfeksiyonun gelen çokluğu 40.
- 25 ml rezervuar içine THP-1 / Mtb GFP süspansiyon dökün.
- (G11 yoluyla B3), THP-1 kalan 96 oyuklara / MTB GFP süspansiyonu 200 uL usin eklemega çok kanallı pipet.
Not: birden çok 96 oyuklu plakalar çalışma durumunda, düzenli daha kanşım her bir göze ilave edilir sağlamak için rezervuar içinde kalan, THP-1 / MTB süspansiyon tekrar süspansiyon. - 7-10 gün süreyle% 5 CO2 37 ° C'de inkübe edin.
- yavaş yavaş 100 çıkararak her 2 günde bir ortam değiştirme uL 100 uL, çok kanallı bir pipet kullanılarak, RPMI-C önceden ısıtılmış eklenmesi de yavaşça her birinin en ortam geçirdi. Kuyu tekrar süspansiyon ve kuyu dibinde Mtb / makrofaj agrega rahatsız etmeyin.
- Görme Mtb / makrofaj agrega büyüklüğü dikkate alınarak, günlük floresan mikroskobu (4-10X objektif) tarafından kuyuları incelemek. Günün 7-10 tarafından, Mtb / makrofaj agrega yeterince büyük olmalıdır ilaç etkinlik testleri (Bölüm 4) için devam etmek (referans için Şekil 2'ye bakınız).
- İstenirse, bir otomatik hücre görüntüleme sistemi kullanılarak 96-kuyuların yakalama görüntüleri monteparlak bir alan ve GFP filtresi ile Mtb / makrofaj agrega oluşumu belgelemek için ayarlar.
NOT: Kullanıcıların otomatik görüntüleme sistemine erişimi yoksa, temsilci kuyuların görüntüleri GFP ve parlak bir alan yetenekleri ile herhangi bir uygun mikroskop kullanılarak alınabilir.
4. Büyüme İnhibisyon Tahlili Mtb / Makrofaj Agrega türetilen Uyuşturucu Etkinlik Karşı MTB Değerlendirmek için
- İlaç hazırlama (iki ilaç için üçlü koşullar)
NOT: Şablon için Şekil 1A bakınız.- Ayrı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, G10 üzerine B2'ye 7H9-Cı ortamın 125 uL ekleyin.
- Aşama 4.2.4 seyreltmeden dolayı 7H9-C 1 mL çift en arzu edilen nihai konsantrasyonda iki ilaç hazırlanması.
- üçlü tedaviler için sırasıyla kuyulara B11-C11-D11 ve E11-F11-G11 her ilacın 250 mcL ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanılarak, seri Dilute testi ilaçlar B10-G10 içine B11-G11 125 uL hareket ettirerek iki kat. Her adımda 5 kez pipetleme karıştırın.
- plaka üzerinde (sağdan sola) sütun sütun 125 uL taşımak ve sütun 4 sonra durdurmak için devam edin.
- sütunu 4 karıştırıldıktan sonra, bir atık kabı içine 125 uL atın. Sütunlar 2, 3 arka plan (boş) ve pozitif bir büyüme kontrol olarak kullanmak için izin vermek için herhangi bir ilaç içermemelidir.
Alternatif test ilaç kütüphaneleri için Şekil 1B şablonu izleyin: Not. Her 96 oyuklu plaka tek bir konsantrasyonda 58 ilaçları verebilir. bu adımda 4.2.4 yarı yarıya seyreltilmiş olacağından çift arzu edilen nihai konsantrasyonu kullanılarak bu ilaç tabak hazırlayın.
- İlaç tedavisi:
- MTB ihtiva eden 96 oyuklu plaka makrofajlar (MTB / makrofaj agregalar) ile enfekte al.
- Dikkatle çok kanallı pipet ile ilgili tüm kuyular (G11 yoluyla B2) süzün.iki adımlı bir şekilde bu gerçekleştirin: ilk plaka eğmeden 150 uL kaldırın ve ardından plakayı devirme ve iyi alt kenarına pipet takarak kalan medya (~ 50 uL) çıkarın. Makrofaj Mtb / agrega, çukurun tabanına yapışık olarak, önemli bir yok olması gerekmektedir.
- Yavaşça Mtb / makrofaj toplulukları ihtiva plakanın ilgili tüm kuyular (G11 ile B2) 7H9-C medya 100 mcL ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanılarak, enfeksiyon levhanın tekabül eden gözleri 96 oyuklu plaka (aşama 4.1) ihtiva eden bir ilaç kupasında 100 uL aktarın.
- kapalı torbada yer ve 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe edilir.
Resazurin microtiter Test kullanma Niceleme İlaç Etkinliğinin 5.
- 0.8 mg nihai konsantrasyonda stok solüsyonu resazurin Hazırlama / ml H 2 O. sterilizasyon için 0.22 um gözenek boyutlu PVDF zarından filtre.
- 1: 1 oranında bir 2 resazurin stok solüsyonu, H2O ve Tween-80 (H 2 O içinde% 20 çözelti) karıştırılarak çalışma çözeltisi resazurin hazırlayın. Nihai konsantrasyon 0.4 mg / mL resazurin ve% 5 Tween-80 bulunmaktadır.
- Bir plaka okuyucusu, kurulum 530 nm'de uyarma ve 590 nm'de emisyonla 37 ° C'de 24 saat süre ile, her 30 dk floresan okumak için bir programı kullanarak. 37 ° C'ye kadar ön-sıcak plaka okuyucu.
- Çok kanallı bir pipet kullanılarak ilaç tedavi plaka (aşama 4.11) ilgili tüm oyuklara (G11 ile B2) resazurin çalışma çözeltisinin 20 uL ekleyin.
- plaka okuyucu üzerinde plakası yerleştirin ve adım 5.3 kurmak programını başlatın.
Not: deney plakası, yüksek hacimli işlenmesini kolaylaştırmak için, 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir analiz geliştirmek, tek flüoresan 24 saatte bir okuma yapmak için yeterlidir. Bu aynı zamanda kinetik ve inkübasyon özelliklerine sahip bir plaka okuyucu erişimi olmayan kullanıcılar için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
96 gözlü plaka formatında bu enfeksiyon modeli uyarlamak sağlamlığını teyit etmek için, burada Şekil verilen şablona göre bir ilaç eden 96 oyuklu türetilen Mtb duyarlılığını enfeksiyonu rifampisin modeli (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) adapte incelenmiştir 1 A. Bu deneyde anahtarı Mtb / makrofaj agrega yapıların üretimi güvenilir bir şekilde ve böylece verim uyumluluğu (Şekil 1B) sağlayarak, bir 96 gözlü plaka formatında (Şekil 2) üretilebilir olduğunu göstermektedir. Makrofaj Mtb doğrudan iyi karakterize resazurin mikrotitre deneyi (Şekil 3) kullanılarak ilaç etkinliği test etmek için kullanılabilir, bu şekilde üretilen pasajlanmağa devam edildi.
Resazurin tahlil flor mavi resazurin dönüştürmek için metabolik olarak aktif Mtb tarafından üretilen oksidatif türlerinin dayanır olarakPembe rezorfuinin escent, renk ve parlaklıkta meydana gelen değişiklikler bakteri miktarını belirlemek için bir belirteç olarak da kullanılabilir. Şekil 3A'da olarak, güvenilir bir inkübasyon yalnızca 3 gün sonra ilaçlar yok iken replike edebilen canlı Mtb bakterilerin saptanmasıyla ilgili resazurin deneyi içinde yeterli hassasiyeti olduğunu göstermektedir. Son nokta renk değişimi görsel onay büyümesinin yalnızca yaklaşık bir değerlendirme olmakla birlikte, biz doğru kinetik bir plaka okuyucu (Şekil 3B) kullanılarak Resorufm onun floresan metaboliti için resazurin dönüşüm ölçerek bu ölçmek olabilir. Pozitif büyüme kontrolü (ilaçların yokluğu) ile normalize, bu verileri kullanarak makrofaj-pasajını Mtb karşı ilaç etkinliğini görselleştirmek için duyarlılık öldürme eğrileri hesaplanması (Şekil 4) için izin verir.
Burada, Şekil temsilcisi sonuçları 3 4% 90 büyüme inhibisyonu gözlendiği en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak tarif edilen en az önleyici konsantrasyon (MIC), bizim enfeksiyon modelinden türetilen Mtb karşı hem rifampisin ve moksifloksasin için daha fazla 2 mg / ml olduğunu gösterir. Bu bizim enfeksiyon modeli hücre içi Mtb 8 karşı belirlenen MİK değerleri ile daha uyumlu olan anti Mtb ilaçların etkinliğini tahmin olduğunu gösteriyor ve bu nedenle suyu yetiştirilen bakteri hücreleri kullanarak en Mtb ilaç duyarlılık deneylerinde ihmal edilen difüzyon bariyer özelliklerini yansıtır.
Önemli olarak, 96 gözlü bir formatta tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilen veriler, daha önce makrofaj geçirilmiş Mtb 16'ya karşı rifampisin ve moksifloksasin için belirlenen olan kişilerce da benzer sonuçlar elde edilmiştir.
Şekil 1: İlaç plaka düzeni. Adım 4'te kullanılan ilaç testi levhası (A) Örnek şablonu Bu 8 tanımlanan konsantrasyonlarda üçlü kuyucuklara iki ilacın paralel test sağlar. temsili bir deney olarak, sırasıyla, 2 uM ve 2.5 uM başlayan rifampisin (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) kullanılır. (B) veri akışı tarama için alternatif bir şablon ayrıca, tek bir konsantrasyonda 58 bileşiklerinin test edilmesi olanağını göstermektedirler sağlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Mtb üretilmesi / makrofaj agrega yapılar 96 oyuklu plaka içerisindebiçim. (A) Temsilcisi parlak bir alan ve GFP Gün 9 sonrası enfeksiyon Mtb -macrophage agrega görüntüleri birleşti. Görüntüler 3 ayrı çekilen görüntülerin tarafından 3 bir montaj dikiş ile tüm kuyu belgeleyen bir otomatik hücre görüntüleme programı kullanarak 4X amacı ile ele geçirildi. (B), (A) 'da gösterilen görme alanından bir birey olmayan dikişli görüntü. (C) bir temsilci 10X amacı ile yakalanan bir Mtb / makrofaj agrega yapısının parlak bir alan ve GFP görüntü birleşti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Mtb canlılığı ölçmek için resazurin mikrotiter testi kullanılarak. (A) viabl varlığıe Mtb hücreleri sadece kendi pembe, indirgenmiş biçimine mavi resazurin boya dönüştürülmesiyle belirlenebilir. Temsilcisi sonuçları Şekil 1A şablona göre rifampisin (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) kullanarak burada gösterilmektedir. Aşamasında tarif edildiği gibi (B) elde edildi, tek tek oyuklara floresans (Şekil 3A'ya tekabül eder), resazurin dönüşümünü ölçmek için 5. Örnek mini grafikler zaman karşısındaki bağıl floresan birimlerinin (y-ekseni) gösteren 24 st için kinetik gözlenmiş (X ekseni). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: REMA verilerinden eğrileri öldürme ilaç duyarlılık belirlenmesi. maksimal resaz zamanında bağıl floresans birimleri(A) rifampisin ve (Şekil 3B den) (B) moksifloksasin tedavi kuyularda idrar sinyali% 100 sağkalım olarak herhangi bir ilaç kontrolü (maksimal Mtb büyüme) normalize edildi. Arka plan kontrolü (Boş) sinyalleri de her numuneden çıkarıldı. Yüzde hayatta kalma bir ölüm eğrisi oluşturmak için ilaç tedavisi, her bir konsantrasyonu için işaretlenmiştir. Bu şekilde Veriler, üç bağımsız deneyin ortalama ± SD temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, ayrıntılı olarak ilaç etkinlik testleri için uygun bir alternatif Mtb enfeksiyonu modeli tarif var. Bu model hesabına erken TB ilaç geliştirme sürecinde daha fazla dikkate alınmalıdır iki önemli faktör dikkate alır: ilaç penetrasyonu ve enfeksiyon sırasında Mtb metabolik değişikliklere fizyolojik ilgili engellerin varlığı. Daha önce bizim enfeksiyon modelinin yararları gösterilmiştir ve verimlilik uyumluluğu 16 enfeksiyon ölçekleme olasılığını önerdi ederken, biz burada bu 96-plaka biçiminde doğrudan sisteme adapte ederek aslında ulaşılabilir olduğunu göstermektedir. Bu pipet gereksinimi ortadan kaldırır ve agrega boyutları boyutları ulaşabilir olarak doğal zor bireysel çukurlar halinde büyük bir kültür şişesi, agrega dağıtma olarak Mtb / makrofaj oluşturma yeteneği, 96 oyuklu plakalar içinde doğrudan agregatlar avantajlıdır> 500 mikron. enfekte makrofaj agrega büyüklüğü bu ipuçlarını yapışmasına neden olur ya da geniş bir pipetleme agrega parçalanmak gibi verimli deneyler için gerekli olan P200 çok kanallı pipet kullanımını engellemek olacaktır. 96 oyuklu plakalara Bu enfeksiyonun sistemin modifikasyonu gerekli manipülasyon adımları miktarını azaltır ve Mtb / makrofaj agrega içindeki miktarları ile homojen kuyu oluşturur. Bu nedenle, bu deney sistemi, sadece, in vivo olarak talebi Aday bileşiklerin etkinliğini öngörmek için erken geliştirme sürecinde özellikle değerli olan, ancak ilaç kütüphanelerinin akışı taramada.
Açıklanan enfeksiyon modelinde önemli bir avantajı, bir BSL-2 uyumlu Mtb gerginlik kullanılmasıdır. BSL-2 koşullarda çalışma yeteneği, yüksek maliyetli olan protokol manipülasyon hızlandırır, ve en önemlisi gerçekleştirmek için bir BSL-3 tesise erişimi olmayan laboratuarlar sağlarse ilaç tarama deneyleri gelişmiş. Kullanılan oksotropik Mtb MC 2 6206 suşu, ilaç direnci ya da toleransı 16 etkilemez 4 genleri panCD ve leuCD, ancak tüm muhafaza H37Rv 17, 18 bir türevidir. Bu M.bovis BCG ve M. smegmatis, 6206 en yakın Mtb H37Rv, patojenik incelemelerinde referans suşu virulent ilgilidir Mtb mc 2 gibi diğer yaygın olarak kullanılan Mtb vekillere karşılaştırılmıştır. Önemli olarak, BCG'nin eksik ve Mtb hastalık oluşturma ve granülom oluşumunun 19 önemli bir rol oynar RD-1 lokusundan korur. Nispeten, Mtb mc 2 6206 da Mtb gelen genomik farklı bir hızlı büyüyen bir türdür ve farklı antibiyotik direnç profilleri vardır M. smegmatis, daha TB-ilaç geliştirme deneyleri için daha uygun olduğunu.
Burada tarif edilen deney, bağlı esneklik, yüksek düzeyde de değerlidir. (Şekil 3), aynı zamanda, tüm madde kütüphaneleri (Şekil 1B) taranması için gösterildiği gibi Mtb / makrofaj toplulukları ihtiva 96 oyuklu plakalar sadece üç kez ilaç tedavilerinin titrasyonu için kullanılabilir. tek bir konsantrasyonda, her 96 oyuklu plaka 58 bileşikleri tarayabilir. Enfeksiyon sistemi göre tam olarak mümkün olan bir 384-oyuklu bir plaka, için uyarlanmış, bu sayısı önemli ölçüde 300> terkipleri artacaktır sadece bakteriler 3 gün boyunca çoğaltmak için izin verildikten sonra, güçlü bir resazurin sinyallerini almak bu gerçeği. Aslında, aşağı ölçekleme küçük de biçimine göre orantılı birimleri için diğer gibi protokol çoğunluğu değişmeden kalacak daha 384 oyuklu plaka formatı için bu sistemi adapte nispeten basit olacaktır. resazurin tahlil için yeterli sinyali etkinleştirmek için, bu olabilirYeterince bakteri çoğaltma için izin vermek için 4.2.5 ila 7 gün adımda inkübasyon uzatmak için gerekli.
Mtb canlılığı için bir okuma olarak resazurin tahlil için bu enfeksiyon modeli birleştirilmesi birçok faydası, yani maliyet etkinliği ve hızlı tahlil protokolü gibi BACTEC 460 20 gibi diğer altın standart sistemlerine karşılaştırılabilir sonuçlar elde ederken sahipken, yine de bazı sınırlamalar var . sadece metabolik aktivitesini ölçer beri resazurin tahlil bakteriyostatik ve bakterisidal ilaçlar arasında ayrım olamaz. Bu metabolik aktivite gizli Mtb içinde doğal olarak düşük olduğu, akılda tutulması gereken önemli bir sınırlamadır. Ancak, bu testin temel bileşeni resazurin tahlili dışında Mtb ilaç duyarlılık için okuma-çıkışları ile uyumlu olabilir enfeksiyon modelidir. Örneğin, ilaç tedavisinden sonra, kuyular GOLD stan koloni birimi formasyonu (CFU) sayımı için plakalanır olabilir(Bu verimli tarama ile uyumlu olmasa da) dart bileşimlerinin bakterisit aktivitesi test etmek. Seçenek olarak ise, bu sistem CFU 21 sayım yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir ifade MTB, lusiferaz için bağlanabilir. İlaç duyarlılık ölçmek için bir lusiferaz sistemini kullanmak için, protokol sadece iki değişiklik gerekli olacaktır: Mtb -lusiferazdır ve 5. adımda resazurin yerine Parlak-Glo luciferin reaktif ii) kullanımı ile Mtb GFP i) yerine. önemli ölçüde 384 oyuklu plaka formatı ile kolayca uyum olacaktır seviyelere deney hassasiyetini arttırırken Mtb 30 dakika tahlilin gelişimini kısaltılacak ifade lusiferaz kullanımı.
Özet olarak, başarılı bir şekilde çok az sayıda işlem adımını yüksek yeniden üretilebilirliğe sahip bir 96 oyuklu plaka formatı içine Bu enfeksiyon modeli, ve başlangıçtan sonsuz miktarda üretme yeteneğini geçiş yapanMalzeme, verim uyumluluk tüm önemli faktörler. Bu tahlil erken Mtb ilaç keşfi süreci için değerli bir varlık haline de pek çok farklı biçimlerde ve okuma-çıkışları için de uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7H9 | BD Difco | 271310 | Follow manufacturer's recommendations |
| Middlebrook OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma | P5710 | Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O |
| Nalgene Square PETG media bottle | Thermo Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 media | Hyclone | SH30027.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| L-glutamine | Corning | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 plate reader | Biotek | Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope | |
| Gen5 Software | Biotek | Recording and analysis of rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize |
References
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
- Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
- Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
- Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
- Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
- Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).
- Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114 (2014).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
- Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
- Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117 (2015).
- van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
- Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
- Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
- Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
- Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
- Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
- Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
- Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).
