Summary
Den inhalationsenhed beskrevet heri, kan generere, prøve til karakterisering og ensartet deponere en medikament aerosol i lungerne hos gnavere. Dette muliggør den prækliniske bestemmelse af effektiviteten og sikkerheden af lægemiddeldoser deponeret i lungerne; nøgledata muliggør klinisk inhaleret lægemiddeludvikling.
Abstract
Obstruktive luftvejssygdomme såsom astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) for øjeblikket behandles ved inhalerede antiinflammatoriske og bronchodilatorlægemidler. På trods af tilgængeligheden af flere behandlinger, er begge sygdomme voksende bekymringer for folkesundheden. Størstedelen af astmapatienter er velkontrolleret på aktuelle inhalerede behandlinger men et betydeligt antal patienter med svær astma er ikke. Astma påvirker en anslået 300 millioner mennesker verden over, og cirka 20 procent har en alvorlig form af sygdommen. I modsætning til astma, er der kun få effektive behandlinger for KOL. Det anslås, at 10% af befolkningen har KOL og udviklingen i dødelighed er stigende for KOL mens faldende til andre alvorlige sygdomme. Selv om udformningen af lægemidler til inhaleret afgivelse er udfordrende, næse-kun inhalationsenhed muliggør direkte levering af nye lægemidler til lungen af gnavere til prækliniske effekt og sikkerhed / toksikologiske undersøgelser. Inhaleret lægemiddeladministrationhar flere fordele for luftvejssygdomme, hvor høj koncentration i lungen forbedrer virkningsfuldhed og minimerer systemiske bivirkninger. Inhalerede kortikosteroider og bronkodilatatorer drage fordel af disse fordele og inhaleret levering kan også holde potentialet for fremtidige biologiske behandlinger. Den inhalationsenhed beskrevet heri, kan generere, prøve til karakterisering og ensartet deponere en medikament aerosol i lungerne hos gnavere. Dette muliggør den prækliniske bestemmelse af effektiviteten og sikkerheden af lægemiddeldoser deponeret i lungerne hos gnavere, kræves nøgledata før initiering klinisk udvikling.
Introduction
Der er mange fordele ved at inhaleret administration af lægemidler til behandling af luftvejssygdomme. Inhaleret levering gælder det terapeutiske middel direkte til stedet for handling, lungerne. En høj lokal koncentration af lægemidlet i lungerne giver en betydelig fordel, der minimerer dosis og systemisk eksponering, og maksimerer effektiviteten. Dette er en vigtig fordel, at i høj grad kan forøge det terapeutiske indeks (TI, forhold mellem dosis lægemiddel, der forårsager en bivirkning over dosis lægemiddel, der giver virkningsfuldhed) af et lægemiddel. Inhalerede β 2-adrenerge agonister, corticosteroider og anticholinerge lægemidler har vist sig effektiv til at forbedre lungefunktionen hos patienter med astma og KOL, samtidig minimere de systemiske bivirkninger (takykardi, immunosuppression og forstoppelse) observeret, når disse stoffer indtages oralt. Nye lægemiddelklasser (f.eks PDE4-inhibitorer 1 og BTK inhibitorer 2) har for nyligvist sig effektiv til forbedring af lungefunktionen i prækliniske dyremodeller men, svarende til p 2 -agonister, corticosteroider og anticholinerge lægemidler, lider systemiske bivirkninger, der kan minimeres ved inhaleret afgivelse. På grund af de ekstra omkostninger til udvikling af inhalerede vs. orale lægemidler, bør en inhaleret formulering kun overvejes for respiratoriske indikationer efter vellykket oral / systemisk indgivelse afslører dosisbegrænsende mekanisme-baserede systemisk bivirkninger.
Præ-klinisk, er inhalerede forbindelser optimeret for at øge TI, som kræver in vivo effektivitet og bivirkningsprofil målinger. Oprindelig blev disse målinger kan foretages i separate assays, sædvanligvis en topisk leveret effekt måling og en systemisk leveret bivirkning måling, men lige sammenlign forbindelser, bør effektivitet og bivirkninger måles i de samme dyr efter inhaleret administration. Dette kræver dosis / respons-undersøgelser, at achieve nok forbindelse indgivet til lungerne for at inducere en målbar bivirkning. Den eneste måde i øjeblikket til ensartet at fordele store doser af medikament i lungerne af multiple små dyr samtidigt er kun næsen inhalation 3, 4, 5. Styrker og svagheder ved forskellige eksponeringsniveauer inhalation teknikker er for nylig blevet revideret 6, 7, 8. Specialudstyr og en stor mængde af testforbindelse (gram-mængder) er påkrævet for kun næsen inhaleret lægemiddeladministration, men proof-of-concept undersøgelser kan være muligt på anden måde.
Når mængden af lægemiddel er begrænset (mg mængder), direkte administration metoder er en mulighed, men alle lider ikke-ensartet aflejring, med mere lægemiddel koncentreret langs de centrale luftveje og mindre godt repræsenteret i parenchymale / alveolæreregioner 3, 4, 5. Den effektive dosis leveres ved direkte instillation altid er højere og kan aldrig direkte sammenlignet med inhalerede doser 4. Direkte instillationsperioder metoder, herunder intranasal 9, intratrakeal væske 10, 11 og spray instillation 12, eller tør-pulver insufflation 13, kan 14 anvendes som et screeningsværktøj at bestemme den omtrentlige dosisområde for senere næse- kun inhalationsstudier, eller til at bestemme Vurderet af effekt / toksicitet for en række strukturelt tilsvarende lægemidler 15. På grund af den centrale luftveje deposition mønster, kan direkte administration metoder være mere nyttigt at bestemme virkningerne af forbindelser, der virker på de centrale luftveje (bronchodilatorer eller mastcelle inhibitorer) end in den perifere lunge (anti-inflammatoriske).
I modsætning til mennesker, som kan indånde en betydelig dosis af koncentreret aerosol fra en inhalator i en enkelt dyb indånding, kontinuerlig frembringelse af en respirabel (0,5-5 um aerodynamisk massemediandiameter, MMAD) aerosol, i op til en time, er forpligtet til at deponere en virkningsfuld lægemiddeldosis i en spontant vejrtrækning gnaver lunger i et kun næsen inhalationssystem 16. Aerosolgeneratorer (jet nebulizer eller Wright støv foder 17), der kontinuerligt kan producere den ønskede aerosol partikelstørrelse og koncentration til næse-kun inhalationsstudier er ikke meget effektive til frembringelse af høj kvalitet (respirable) aerosoler. Lægemiddelforrådshulrummet fødehastigheder af disse spraydåser til potent (IC50 pM til nM i funktionelle cellebaserede assays) forbindelser er almindeligvis i 1 til 10 mg / min rækkevidde og sædvanligvis mindre end 1% af dette lægemiddel aerosol gør det til åndedrætszonen af dyrene(Figur 1). Mange af partiklerne genererede er for store (> 5 um) for at komme ind i lungerne og fjernes ved en aerosol sigten (en præ-separator eller cyklon med en 5 um skærepunktet) for at undgå en stor dosis af lægemiddel i næsen. Tilføjelse til ineffektiviteten af næse- kun inhalationssystemer er den lille partikelstørrelsesområde (0,5 til 5 um MMAD) til respirable partikler. Mange af aerosolpartiklerne mindre end 0,5 um udåndes (ligesom cigaret røg) og ikke aflejret i lungerne 18. Også mange af de "større" aerosolpartikler (~ 5 um) deponering i næsen absorberes eller transporteres af mucociliær clearance mod bagsiden af halsen, når de synkes ind i maven 19. Når der anvendes kun næsen inhalation dosis deponeres i næsen er altid større end den dosis afgives i lungerne og den nasale dosis kan bidrage til systemisk eksponering og bivirkninger 20. Inherent, inhaleret drug doser er små (i mikrogram området) minimering enhver systemisk bivirkning potentiale af lægemiddel absorberes af nasale, lunge eller gastrointestinale væv. Selv når partikelstørrelsen af aerosolen leveres til dyrene er i det respirable område, et gennemsnit på kun 4% af aerosolpartiklerne, der gør det til åndedrætszonen af dyr deponering i lungerne. Mere effektive aerosolgeneratorer er til rådighed, men den jetforstøveren og Wright støv foder er uovertruffen for deres evne til at producere kontinuerlige aerosoler fra forskellige flydende og tørpulverformuleringer hhv.
Respirable aerosol fra præseparator passerer ind i kun næsen indånding enhed 21, som er baseret på en strøm-forbi næsen design 22. Inhalationen enhed har 3 metodetrin (kun to lag er vist i figur 1) og hvert lag indeholder 10 eksponering porte til dyr og aerosol prøveudtagning. Portene er placeret perifert omkring central aerosol plenum. Bevidste musene anbringes i glas fastholdende holdere (6 inches lang med 1,2 inch diameter) og indånde aerosolpartiklerne indholdet af inhalationsenhed. Musene er ikke akklimatiseret til fastholdelsesanordninger 23. Tidligere erfaringer har vist, at mus tolerere rør tilbageholdenhed på mindre end en time varighed på lignende med eller uden tilpasning 2.
Inhalationen enhed er designet til at levere lægemidler aerosoler direkte til lungerne af dyr samtidig undgå udsættelse for operatørerne. Styrken / toksicitet af disse stoffer er normalt ukendte og flere engineering sikkerhedskontrollen er vant til at undgå udsættelse for operatørerne. Operatørerne skal altid bære personlige værnemidler (handsker, kitler, åndedrætsværn, og sikkerhedsbriller). Den udvendige plenum af inhalationsenhed er under negativt tryk på alle tidspunkter under drift, hvilket muliggør sikker fjernelse af enkelt eller grupper af dyr without afspærring aerosolgeneratoren. Inhalationen enhed er også indeholdt i en sekundær indelukke holdes ved et negativt tryk ved en udstødningsport i loftet for at forhindre enhver udslip af aerosol ind i rummet i tilfælde af fejl. Alle udstrømmende luft fra Inhalationssystemet filtreres af et HEPA filter før udledning i miljøet. Næse-kun eksponering, der anvendes i dette manuskript blev indkøbt fra en enkelt leverandør (se supplerende tabel of Materials).
Protocol
Musene anvendt i disse undersøgelser blev passet i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, ottende udgave 24. Mus var gruppe huse på en forening for Evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) internationalt akkrediteret facilitet i steril ventileret microisolator boliger på majskolber sengetøj. Ved måling bronkokonstriktion blev mus bedøvet med 100 mg / kg ip pentobarbital og dybden af bedøvelse blev overvåget ved manglende tå knivspids refleks og opretholdt ved ip anæstesi efter behov. Ved slutningen af eksperimenterne blev mus aflivet ved cervikal dislokation efter overdosis barbiturat. Verifikation af eutanasi blev bekræftet ved manglende åndedræt. Ingen overlevelse operationer blev udført på musene. Alle forskningsaktiviteter protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Formulering og Device Valg for Generation of Pharmaceutical Aerosoler
BEMÆRK: Formulering og enheden udvælgelse afhænger af de fysisk-kemiske egenskaber for den enkelte lægemiddel, der skal aerosoliseres derfor generelle protokoller er anført nedenfor, og læseren henvises til bedømmelserne af Zeng 25 og O'Riordan 26.
- Tørpulveraerosoler
- Mikronisere lægemiddel tørre pulvere i en kuglemølle, jetmølle eller lignende indretning 27 og sikre det mikroniserede partikelstørrelsesfordeling (PSD) indeholder partikler af respirabel (0,5-5 um aerodynamisk massemediandiameter, MMAD) partikelstørrelse. Blend potente testforbindelser, der kræver fortynding med mikroniseret lactose.
BEMÆRK: Hvis der ikke er nok mikroniseret pulver til at bestemme PSD med en kaskadeimpaktor kan PSD af en lille (sub-milligram) prøve af det mikroniserede pulver måles ved lysspredning for at bekræfte den indeholder små / respirable partikler. - Generere tørpulveraerosol anvendelse af et Wright støv foder tørpulveraerosol generator. Pack det mikroniserede lægemiddel / lactosepulver ind i det cylindriske reservoir under anvendelse af en manuel hydraulisk presse ved ca. 1000 pounds per square inch (psi) for at fremstille komprimerede kager af pulver, der anvendes som input ved Wright støv foder aerosolgeneratoren 17.
- Skru cylindriske reservoiret til Wright støv foder fremføring af reservoiret indtil skrabebladet er i kontakt med lægemidlet kage.
- Forbinde udløbet fra Wright støv foder til en cyklon og indløbet til en trykluftkilde indstillet til 15 l / min luftstrømningshastighed (maksimalt tryk 90 psi).
- Indstil tilspænding kontrol til 0,7 omdrejning pr minut (rpm) og tænd Wright støv foder aerosolgeneratoren.
BEMÆRK: 0,7 rpm svarer til en testartikel kage fødehastighed på 1 g / h ved brug af lille Wright støv foder cylindrisk reservoir. Wright støv foder skraber et tyndt lag af komprimeret poWder off testartiklen kage ved drejning reservoiret. Luft bærer støv ud af Wright støv foder gennem en sonisk dyse til de-agglomerering, og ind i en cyklon til fjernelse af ikke-respirerbare partikler og agglomerater. - Forbinde udløbet fra cyklonen til den centrale aerosol plenum af inhalationsenheden (figur 1).
BEMÆRK: Forbindelser kan komprimeres 300-1500 psi i reservoiret i Wright støv feed. Formålet er at komprimere partiklerne nok så de vil blive tilbageholdt i reservoiret, når inverteret, men ikke så meget, at Wright støv foder ikke kan skrabe et tyndt lag for re-aerosolisering. Det bemærkes, at skalaen på den manuelle hydraulisk presse læser i pounds og stemplet på den lille støv foderreservoirets har et overfladeareal på ca. 0,25 kvadrat-inch. Derfor, 250 pounds af kompression på 0,25 kvadrattomme er lig med 1000 psi.
- Mikronisere lægemiddel tørre pulvere i en kuglemølle, jetmølle eller lignende indretning 27 og sikre det mikroniserede partikelstørrelsesfordeling (PSD) indeholder partikler af respirabel (0,5-5 um aerodynamisk massemediandiameter, MMAD) partikelstørrelse. Blend potente testforbindelser, der kræver fortynding med mikroniseret lactose.
- Forstøvede flydende aerosoler
- Opløse lægemidlet i 100 ml vand eller fysiologisk saltvand.
- Indlæse en 100 ml sprøjte med lægemiddelopløsningen og placere sprøjten i sprøjtepumpen med en strømningshastighed sat til 1 ml / min.
- Forbinde sprøjtepumpen til jetforstøveren og rense luften fra tilførselsledningen fører til forstøveren.
- Forbinde luftkilden tryksat til jetforstøveren og indstil luftmængdemåler til 10 l / min.
- Indsæt jetforstøveren i pre-separator. Pre-separator forbinder forstøveren til den centrale aerosol plenum af inhalationsenheden (figur 1).
BEMÆRK: Mange lægemiddelforbindelser har begrænset vandopløselighed og er bedre formuleret som tørpulver aerosoler. Hvis en stabil suspension kan fremstilles af mikroniseret (MMAD <5 pM) forbindelse, kan den anvendes med jetforstøveren. Forsigtighed bør anvendes som suspensionen kan tilstoppe forstøveren. Nebulizer koncentrationer foder fra 1 mg / ml for potente forbindelser (ligesom bronchodilatoripratropium) til 40 mg / ml suspensioner (for mindre potente forbindelser som salbutamolsulfat) er blevet anvendt. Sprøjtepumpen tilspænding sættes til 1 ml / min i en praktisk årsag; at tillade aerosolkoncentrationen ækvilibreringsperiode og 45-min-lang eksponering udfyldes uden behov for at genindlæse sprøjten.
2. Aerosol Eksponering Opsætning af forsøg
- Måle koncentrationen lægemiddel (ved at indsamle aerosol på en absolut filter) og partikelstørrelsesfordeling (ved at indsamle aerosol anvendelse af en kaskadeimpaktor) af aerosolen der kommer ind i inhalationsenhed stolpe pre-separator / cyklon. Bruge disse parametre sammen med dyrets minut ventilation, legemsvægt og eksponeringstid til at estimere lægemiddeldosen afgives i lungerne.
- Vej den absolutte filter og optage filtret vægt. Placer filteret i filterholderen og samle filterholderen. Forbinde indløbet af filterholderen den absoluttetil en central aerosol plenum prøveporten og udløbet til en vakuumkilde indstillet til at opsamle aerosolen ved en strømningshastighed på 1 l / min under hele forsøget.
BEMÆRK: Massen af lægemiddel på filteret efter prøveudtagning i 45 minutter kan være i sub-mikrogram rækkevidde og / eller blandes med lactose, NaCl salt eller andet køretøj. En mikrovægt, der læser til 0,1 mikrogram er nødvendig. At få en præcis vægt af lægemiddel deponeret på filteret, skal filteret ækvilibreres og vejet i en fugtighed kontrolleret miljø. Vægten af lægemiddel på filtrene kan kun bruges i beregningen dosis, hvis der ikke er noget køretøj i formuleringen eller køretøjet er vand. Når der er et køretøj i den anden end vand-formulering, vægten af stof på filteret giver kun en anslået udgangspunkt for yderligere analyse af lægemiddelindhold ved højtydende væskekromatografi (HPLC). - Afvej og registrer vægten af de 7 kaskadeimpaktor stage filtre og en endelig "hale stykke"; filter. Placer et filter på hver af de syv stadier af kaskadeimpaktoren og saml Mercer kaskadeimpaktoren 28. Forbinde indløbet af kaskadeimpaktoren til en central aerosol plenum prøveporten og udløbet til en vakuumkilde indstillet til at opsamle aerosolen ved en strømningshastighed kaskadeimpaktoren er kalibreret på (sædvanligvis 0,5 eller 1 l / min) for varigheden af den eksperiment.
- Overvåg aerosol indholdet af inhalation enhed med den tidstro aerosol monitor (se tabel af Materialer og reagenser) for at bekræfte spraydåser er funktionelle og fremstilling af en stabil aerosol under forsøget. Forbinde indløbet til tidstro aerosol skærm til en central aerosol plenum prøveporten og udløbet til en vakuumkilde indstillet til at opsamle aerosolen ved en strømningshastighed på 1 l / min under hele forsøget.
BEMÆRK: Signalet fra den tidstro aerosol skærm er rapporteret i ug / l, men er kalibreret til vej støv og skal rekalibreresfor hver enkelt lægemiddel aerosol til opnåelse korrekte aerosol koncentrationsværdier. Kalibrering er ikke nødvendigt at bruge skærmen for at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet og tidsmæssig stabilitet af aerosol koncentration. - Indstil proces styreparametre (luftmængder, vakuum-, tryk-, aerosolgenerator magt) til de krævede værdier, der afhænger af antallet af dyr, der skal forbindes til inhalation enhed. inhalation unit og spraydåser de løbende styres / overvåges af et computerstyret kontrol / datafangst processystemet (DACO) leveret af fabrikanten (se tabel af Materialer og reagenser). Luftstrømningshastighed ind i inhalationsenhed bør være minimalt ca. 2 gange den totale minut ventilation på alle dyr i inhalationsenhed for at undgå en ophobning af CO2.
- Vej den absolutte filter og optage filtret vægt. Placer filteret i filterholderen og samle filterholderen. Forbinde indløbet af filterholderen den absoluttetil en central aerosol plenum prøveporten og udløbet til en vakuumkilde indstillet til at opsamle aerosolen ved en strømningshastighed på 1 l / min under hele forsøget.
- Belastning mus i næse-kun restrainers før udsættelse for aerosol i kun næsen inhalationsenhed. Også belastningsbeskyttelsessystemer stress kontroldyr itil restrainers at indånde luften i rummet.
BEMÆRK: En dosis / respons eksperiment består af flere grupper af mus udsat for aerosol til forskellige mængder af tid. Eksponeringstid anvendes til at styre den dosis, hver gruppe modtager under en dosis / respons eksperiment.- Vinkel den fastholdende rør op mod loftet, mens du prøver at indlæse dyrene, da de har tendens til at køre opad forsøger at flygte. Peger rørene ned under lastning vil tilskynde dreje rundt og flygter ud på bagsiden af røret. Sikre musens næse er orienteret i den spidse ende af røret og fiksere variabelposition stemplet ind i bagenden af harpiksstopperen.
BEMÆRK: Stemplet er udformet til at tillade halen af musen til at rage ud fra holderen, som giver musen til at regulere sin kropstemperatur, mens i harpiksstopperen. - Juster stemplet for at tillade musene til at rotere, men ikke dreje hoved til hale; at sikre aerosolen inhaleres.
- Løbende overvågemus mens i fastholdende rør. Efter positionering af stemplet, lille mus (<20 g) forsøger ofte at dreje hoved til hale i rørene og vedtage en U-position, hvor de har problemer med at trække vejret. Denne drejning adfærd er mest udbredt i de første 5 minutter af tilbageholdenhed, efter at musene sjældent forsøge at dreje hoved til hale.
- Vinkel den fastholdende rør op mod loftet, mens du prøver at indlæse dyrene, da de har tendens til at køre opad forsøger at flygte. Peger rørene ned under lastning vil tilskynde dreje rundt og flygter ud på bagsiden af røret. Sikre musens næse er orienteret i den spidse ende af røret og fiksere variabelposition stemplet ind i bagenden af harpiksstopperen.
3. Aerosol Delivery
- Indsætte stoppere at lukke afgivelsesåbninger af inhalering og aktiver aerosolgeneratoren, trykluft strømningsregulatoren, og inhalationsenhed vakuumpumpe fra i processen kontrol software.
- Når aflæsninger fra den tidstro aerosol monitor demonstrere aerosolkoncentrationen har til at komme til ligevægt (~ 30 min, figur 2), begynder at fjerne propper og indsætte kun næsen fastholdende rør indeholdende mus i inhalationsenhed. Gentag, indtil alle mus for at blive udsat for lægemiddel er forbundet til inhalation enhed.
BEMÆRK: Ieksemplet eksperiment den totale luftstrøm tilføres til inhalation enheden via aerosolgeneratoren og fortyndingsluft indstillet til at levere en 0,5 l / min strømningshastighed til hver af portene dyr eksponering i brug. For eksempel en 15 l / min totale luftstrøm er nok til at forsyne hver af de 30 havne i inhalationsenhed. Dette er meget mere luftstrømmen end krævet i minut ventilation af musene, men en større luftstrøm er nødvendigt at levere energi (trykfald over aerosolgeneratoren) til frembringelse af (forstøve / de-agglomerat) aerosolen. - Når alle dyr indlæses i eksponeringen enhed, tænde vakuum prøveudtagning pumper, der er forbundet med absolut filter og kaskadeimpaktor anvendelse af fremgangsmåden kontrol software.
- Når alle engagementer er afsluttet, slukkes aerosolgeneratoren og fjerne resterende mus fra inhalationsenhed.
BEMÆRK: Dyr vil blive håndteret i en ændring station hætte eller af personale iført en ansigtsmaske. Efter afslutning af aerosolafgivelse musene er removed fra rørene, og rørene desinficeres efter hver brug.
4. Beregning af de deponerede Dose
- At beregne den deponerede dosis 29 i ug / kg (ligning 1) multiplicere koncentrationen af lægemidlet i aerosolen (ug / L) x minut ventilation (L / min) x varigheden af udsættelse (min) x inhalerbare fraktion x pulmonal aflejring fraktion og dividere med legemsvægt (kg).
- Beregn aerosolkoncentrationen (ug / L) ved at dividere massen af lægemiddel på absolut filter (ug) af luftstrømmen gennem filteret (L / min) multipliceret med prøvetagningstidspunkt (min). Estimere musens minutters ventilation ved en allometrisk ligning baseret på kropsvægt 30. Den inhalerbare fraktion er 1 som aerosolen blev passeret gennem en for-separator til fjernelse af ikke-respirerbare partikler, og det pulmonale aflejring fraktion bestemmes ud fra lægemidlet aerosol MMAD (figur 3) ved anvendelse afeksperimentelle kalibreringskurver fra monodisperse aerosoler (figur 4) 31.
Representative Results
Bronkodilatoren ipratropiumbromid blev opløst i 0,9% normal saltopløsning i en koncentration på 1 mg / ml. En 100 ml sprøjte blev fyldt med ipratropium formulering opløsning, og sprøjten blev indsat i en sprøjtepumpe sat til foder jetforstøveren (figur 1) ved en strømningshastighed på 1 ml / min. Aktivering af styresystemet til inhalation enhed initierer en 10 l / min luftstrømmen til jetforstøveren, 5 l / min fortyndingsluft flow til fortyndingskammeret, og 15,5 l / min af vakuum luftstrøm til at trække lægemidlet aerosol ud af inhalationsenhed når den passerer næsen på musene. Sprøjtepumpen og tidstro aerosol monitor prøvepumpen blev aktiveret. Fireogtyve mus blev indsat i inhalationsenhed efter den tidstro aerosol monitor bekræfter koncentration aerosolen i inhalationsenhed var kommet til ligevægt (15-30 min, figur 2). Prøven pumper til absolut filter (1 l / min) og kaskadeslaglegemet (0,5 L / min) blev tændt, når alle mus blev forbundet til inhalation enhed. Den første gruppe af 8 mus blev fjernet fra inhalationsenhed efter 5 minutter, den anden gruppe efter 15 minutter, og den tredje gruppe efter 45 min. Bronchokonstriktion 32 blev målt som stigningen i åndedrætsorganerne resistens (Rrs) til en enkelt forstøvet dosis af methacholin (30 mg / ml) afgav 2 timer efter dosering ipratropium hjælp af gnaver respirator 33. Den procentvise forøgelse i Rrs for hvert dyr, beregnet som den maksimale Rrs på 3-min interval efter forstøvet methacholin (Rmax) minus Rrs værdi basisopgørelse før methacholin (Rbase) divideret med Rbase (% stigning i Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), blev anvendt til at kvantificere bronchokonstriktion.
Aerosolen aflejret på kaskadeimpaktoren filtre og absolut filter i 45 min af aerosoleksponering blev opløst i50% acetonitril og massen af ipratropium kvantificeret ved HPLC (tabel 1). MMAD x / GSD af ipratropium aerosol blev beregnet til at være 1,7 x / 1,5 um (figur 3) og en deposition fraktion (DF) på 0,037 for mus blev anvendt til en aerosol med en MMAD på 1,7 um (figur 4). Den inhalerbare fraktion (IF) var 1 som aerosolen blev passeret gennem en for-separator til fjernelse af ikke-respirerbare partikler. Den gennemsnitlige koncentration af ipratropium i aerosolen (0,5 ug / l) blev beregnet ud fra massen af ipratropium på absolut filter (22 ug) divideret med strømningshastigheden af luft trukket gennem filteret (1 l / min) multipliceret med prøvetagningstidspunkt (45 min). Den gennemsnitlige legemsvægt af musene var 0,019 kg og deres forudsagte minut ventilation blev beregnet som 0,021 l / min. Anvendelse af ligning 1, de deponerede doser til 5, 15 og 45 minutters udsættelse grupper var 0,1, 0,3 og 0,9 ug / kg; henholdsvis.
= "1"> Ipratropium inhiberede forstøvet methacholin inducerede bronchokonstriktion 8 uger gamle C57BI / 6-mus. Methacholin øget Rrs inden for sekunder for forstøvet indgivelse (figur 5, øverste panel). RRS i kontrolgruppen (udsatte til værelse luft i stedet for ipratropium aerosol) steg fra en basislinieværdi på 0,62 ± 0,03 CMH 2 O * s / ml til en maksimal værdi på 1,66 ± 0,12 CMH 2 O * s / ml, altså en 168 ± 9% stigning i Rrs, 70 s efter methacholin aerosol administration. Den procentvise forøgelse i åndedrætsorganerne modstand blev inhiberet på en dosisafhængig måde ved inhalerede doser af ipratropium. Den procentvise forøgelse i Rrs blev inhiberet med 51 ± 9%, 79 ± 14%, og 89 ± 2% (figur 5, nederste panel) ved inhalerede deponerede doser af ipratropium på 0,1, 0,3 og 0,9 ug / kg.
g"/>
Figur 1: Indånding enhed med tørt pulver aerosolgeneratoren tilknyttet. Forstøveren bruges til at generere aerosol fra flydende formuleringer er vist til højre. 1) Wright støv foder, 2) cyklon, 3) sprøjtepumpe, 4) jetforstøver indsat i præseparator, 5) fortyndingsluft mixer. Ved levering af forstøvede aerosoler, er støvet foder og cyklon erstattet af sprøjtepumpen, jetforstøver / pre-separator, og fortyndingsluft mixer. Den forstørrede afbildning (modificeret fra Oldham 21) viser aerosol strømningsvej ved vejrtrækning zone omkring dyrets næse, der er skabt ved at indsætte fastholdende røret i inhalationsenhed. Aerosolen fylder den centrale aerosol (grå) plenum af inhalationsenhed, strømmer ud til dyrets næse, hvor den trækkes tilbage af et let undertryk i den ydre (hvid) plenum og ind affaldsindsamling filtrene for (ikke vist). pllethed klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Real time aerosol monitor målinger bekræfter koncentration aerosolen i inhalationsenhed når ligevægt ~ 30 min efter at aktivere aerosolgeneratoren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ipratropium udskilt på hvert trin i kaskadeimpaktor (blå søjlediagram) overlejret med kurvetilpasning (sort kurve) anvendes til at beregne MMAD og GSD af aerosolen partikelstørrelsesfordeling. Vær venligklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Aflejring fraktion til muselunger som en funktion af MMAD for aerosoler leveret af kun næsen inhalation (ændres fra Hsieh 31). For partikelstørrelser mindre end 0,5 um meste af aerosol udåndes og ikke aflejres i lungerne (ligesom cigaretrøg). Til partikelstørrelser større end 5 um, er det meste af aerosol bortfiltreret af næsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Den hurtige stigning i åndedrætsorganerne resistens induceret af forstøvet methacholin administerød til mus er blokeret af ipratropium leveret af kun næsen inhalation til mus (n = 8 pr gruppe, øverste panel). Ipratropium inhiberede methacholin inducerede stigning i åndedrætsorganerne modstand med en ED50 på 0,1 ug / kg deponerede dosis (* p <0,05 over for kontrol, nederste felt). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kaskadeimpaktorresultater data, der anvendes til at beregne MMAD og GSD | ||
| Stage Filter | Ipratropium på filter ved HPLC (mg) | Stage Cut Diameter (mm) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4,5 |
| 3 | 1,43 | 2.5 |
| 4 | 2,55 | 1.5 |
| 5 | 2,95 | 1.2 |
| 6 | 1,03 | 0,7 |
| 7 | 0,37 | 0,5 |
Tabel 1: kaskadeimpaktor data anvendes til at beregne MMAD og GSD
Discussion
En kun næsen inhalation systemet og dets drift til at levere farmaceutiske aerosoler til lungerne hos gnavere er blevet beskrevet. Fastholde dyr i nose-only holdere er en almindeligt anvendt metode til eksponering dyr for luftbåret materiale. Et eksperiment blev udført demonstrerer det anticholinerge bronkodilatator ipratropiumbromid 34 kan kraftigt omvendt methacholin inducerede bronchokonstriktion ved levering af kun næsen inhalation til mus med en ED50 på 0,1 ug / kg deponerede dosis. En større end 10 gange stigning i effektiv dosis af ipratropium var påkrævet for bronkodilation efter intratrakeal levering (ED50 intratracheal = 1,3 ug / kg, data ikke vist) levering. Dette skyldes den ikke-ensartet aflejring mønster af lægemiddel i lungerne fremstillet ved intratracheal dosering 3, 5, 10. 10 gange og større effektiv dosisforskellene mellem inhalerede og intratracheale dosering teknikker til andre lægemidler er tidligere blevet observeret af andre 4.
Den ikke-ensartet aflejring mønster af lægemiddel i lungerne fremstillet ved intratracheal dosering også forsinker lægemiddelabsorption af lungen 35, begrænse den hastighed, hvormed lægemidlet kommer ind i den systemiske cirkulation og reducere chancerne for at se systemiske bivirkninger. Derfor, for at optimere sikkerhed / effekt (terapeutisk indeks) 36 af hidtil ukendte inhalerede lægemidler, bør anvendes kun næsen inhalation levering. Intratracheal aflejring vil give en unøjagtig estimat af TI ved at generere fejlagtigt høje effektive doser i lunge og lave doser til den systemiske cirkulation.
Som nye lægemidler leveret ved inhalering er udviklet, er det vigtigt at passende oversætte den effektive medicin dosis fra prækliniske undersøgelser af effekten til at forudsige en efficacious humane dosis for kliniske forsøg. Den berygtede død Tusko elefanten 37 er almindeligt citeret i litteraturen for at minde os om at bruge allometrisk skalering til at forudsige interspecies narkotika doser, og at mellem arter narkotika doser ikke bør lineært ekstrapoleret på grundlag af en simpel sammenligning af kroppens masserne. Det er almindeligt at anvende en allometrisk tilgang med en allometrisk eksponent b på 0,67 til at forudsige humane lægemiddeldoser fra præklinisk virkningsundersøgelser 38. Ved hjælp af musen inhaleret ED90 på 0,9 ug / kg til ipratropium, en allometrisk eksponent på 0,67, en mus kropsvægt på 0,03 kg og en human kropsvægt på 60 kg; en anslået humant ED 90 på 0,07 ug / kg ((0,9 * (0,03 / 60 ) (1-0.67) = 0,07) kan beregnes som den forudsagte humane deponerede dosis fra vores muse data. Dette forudsagte værdi kan sammenlignes med den faktiske menneske virkningsfuld deponerede dosis på 0,26 ug / kg, som kan beregnes ud fra den leverede dose af 40 ug 39 divideret med det menneskelige legeme masse på 60 kg ganget med en human oral inhalation pulmonal aflejring fraktion 16 på 0,4 ((40/60) * 0.4 = 0,26). Et skøn over den effektive humane inhaleret deponerede dosis hjælper også til at planlægge de leverede anvendte doser i inhalation toksikologiske undersøgelser er nødvendige for kliniske forsøg 40.
Det specialiserede udstyr og stor mængde af testforbindelse (gram-mængder), der kræves for kun næsen inhaleret lægemiddeltilførsel kan være betydelige begrænsninger ved udviklingen af kun næsen inhalation teknik. En kalibreringskørsel uden tilstedeværende dyr er nødvendigt, hvis en specifik dosis er nødvendig for en (sædvanligvis toksikologi og ikke en effektivitet dosis / respons) studie, og denne kalibrering sigt vil kræve mere lægemiddel til rådighed. Denne kalibreringskørsel er nødvendigt, fordi de fysisk-kemiske egenskaber af hvert lægemiddel / formulering kan variere nok til i høj grad påvirke den deponerede dosisaf lægemiddel i lungerne. Optimering af luft og lægemiddel fødehastigheder til aerosolgeneratoren under kalibreringen kræves for at opnå en aerosol partikelstørrelse og koncentration til den specifikke dosis, der kræves. Mens aerosolgeneratoren luft og medikament fødehastigheder foreslået i fremgangsmåderne er et fornuftigt udgangspunkt, der er potentiale, at for et specifikt lægemiddel formulering vil blive genereret en ikke-respirerbar (partikelstørrelse> 5 mm) aerosol. På den prækliniske fase, er der ofte ikke nok stof til rådighed til at gøre en kalibrering køre, og det er umuligt at vide på forhånd, hvad doser (hvis nogen) får ned i lungerne. Også, statisk elektricitet frembragt under aerosoldannelse proces og kan påvirke den nødvendige tid for aerosolkoncentrationen at ækvilibrere. Det er vigtigt, at en god jordforbindelse udstyr til at minimere statisk elektricitet. En anden mulighed for at minimere statisk elektricitet er at tilføje fugt til luften tilføres til inhalation enhed, for at forøge ledningsevnen ogsprede elektrostatiske ladninger på partiklerne 25. Luftbefugtning tilføres til aerosolgeneratoren er ikke påkrævet til dyr komfort under korte (<1 h) dosering sessioner, men bør overvejes, hvis der anvendes længere dosering gange.
Lægemidler kan leveres til lungerne hos dyr ved passiv kun næsen inhalation eller direkte intratracheale administration metoder, der omgår nasopharyngeal aflejring. Kun næsen levering inhalation er almindeligt anvendt inden for inhalation toksikologi 41, men er sparsomt anvendes tidligt i lægemiddelopdagelsesprocessen. er behov for en tværfaglig forskergruppe for udførelse af næse-kun inhalationsstudier grund af: behovet for store mængder af narkotika, specialiseret viden, der kræves for at formulere, generere, og karakterisere aerosoler; betjene komplekse udstyr, og måle lægemiddelvirkningsfuldhed i dyremodeller på luftvejssygdom. Leveringen teknikker beskrevet heri anvendes til at udvikle small molekyle inhaleret lægemidler, men i fremtiden kan anvendes til at udvikle inhalerede Biologics 42, 43. Forhåbentlig procedurerne og tips dokumenteret i dette manuskript vil lette nye prækliniske lægemiddelforskning og toksikologi forskere til at erhverve de nødvendige for at levere medicin til gnavere ved aerosol indånding færdigheder.
Disclosures
Alle forfattere ansat af Amgen. Offentliggørelse gebyrer for denne denne video-artikel er betalt af Amgen.
Acknowledgments
Vi anerkender: Dr. Thomas Budiman på TSE Systems GmbH for sin tekniske ekspertise og udstyr tilpasning. John Fry (Battelle Inc.) og Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) for deres nyttige diskussioner. Tian Wu, Sam Mboggo, April Miller, og Sean Davis (Amgen) som hjælp til forsøgene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
References
- Chapman, R. W., et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE4 for inhaled administration. Eur J Pharmacol. 643 (2-3), 274-281 (2010).
- Phillips, J. E., et al. Btk inhibitor RN983 delivered by dry powder nose-only aerosol inhalation inhibits bronchoconstriction and pulmonary inflammation in the ovalbumin allergic mouse model of asthma. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 29 (3), 233-241 (2016).
- Zecchi, R., et al. Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach. Eur J Mass Spectrom. 19 (6), 475-482 (2013).
- Cooper, A. E., Ferguson, D., Grime, K. Optimisation of DMPK by the inhaled route: challenges and approaches. Curr Drug Metab. 13 (4), 457-473 (2012).
- Leong, B. K., Coombs, J. K., Sabaitis, C. P., Rop, D. A., Aaron, C. S. Quantitative morphometric analysis of pulmonary deposition of aerosol particles inhaled via intratracheal nebulization, intratracheal instillation or nose-only inhalation in rats. J Appl Toxicol. 18 (2), 149-160 (1998).
- Pauluhn, J. Overview of inhalation exposure techniques: strengths and weaknesses. Exp Toxicol Pathol. 57 Suppl 1, 111-128 (2005).
- Wong, B. A. Inhalation exposure systems: design, methods and operation. Toxicol Pathol. 35 (1), 3-14 (2007).
- Phalen, R. F. Inhalation Studies Foundations and Techniques. , 2nd, Informa Healthcare. (2009).
- Siddiqui, S., et al. Pulmonary eosinophilia correlates with allergen deposition to the lower respiratory tract in a mouse model of asthma. Clin Exp Allergy. 38 (8), 1381-1390 (2008).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur J Pharm Biopharm. 61 (3), 214-218 (2005).
- Morello, M., et al. Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies. Tuberculosis (Edinb). 89 (5), 371-377 (2009).
- Guillon, A., et al. Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model. Int J Pharm. 434 (1-2), 481-487 (2012).
- Pauluhn, J., Mohr, U. Inhalation studies in laboratory animals--current concepts and alternatives. Toxicol Pathol. 28 (5), 734-753 (2000).
- Snipes, M. B., McClellan, R. O., Mauderly, J. L., Wolff, R. K. Retention patterns for inhaled particles in the lung: Comparisons between laboratory animals and humans for chronic exposures. Health Phys. 57 (Sup 1), 69-78 (1989).
- Wright, B. M. A new dust-feed mechanism. J Sci Inst. 27, 12-15 (1950).
- Scheuch, G., Siekmeier, R. Novel approaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides. J Physiol Pharmacol. 58 Suppl 5 (Pt 2), 615-625 (2007).
- Phillips, J. E., Ji, L., Rivelli, M. A., Chapman, R. W., Corboz, M. R. Three-dimensional analysis of rodent paranasal sinus cavities from X-ray computed tomography (CT) scans. Can J Vet Res. 73 (3), 205-211 (2009).
- Wolff, R. K. Toxicology studies for inhaled and nasal delivery. Mol Pharm. , (2015).
- Oldham, M. J., Phalen, R. F., Budiman, T. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/c mice in a new nose-only exposure system. Aerosol Sci Technol. 43 (10), 970-977 (2009).
- Cannon, W. C., Blanton, E. F., McDonald, K. E. The flow-past chamber: an improved nose-only exposure system for rodents. Am Ind Hyg Assoc J. 44 (12), 923-928 (1983).
- Narciso, S. P., Nadziejko, E., Chen, L. C., Gordon, T., Nadziejko, C. Adaptation to stress induced by restraining rats and mice in nose-only inhalation holders. Inhal Toxicol. 15 (11), 1133-1143 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Zeng, X., Martin, G., Marriott, C. Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation. , Taylor & Francis. (2001).
- O'Riordan, T. G. Formulations and nebulizer performance. Respir Care. 47 (11), 1305-1313 (2002).
- Pilcer, G., Amighi, K. Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int J Pharm. 392 (1-2), 1-19 (2010).
- Mercer, T. T., Tillery, M. I., Newton, G. J. A multi-stage, low flow rate cascade impactor. J. Aerosol Sci. 1 (1), 9-15 (1970).
- Forbes, B., et al. Challenges in inhaled product development and opportunities for open innovation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (1-2), 69-87 (2011).
- Alexander, D. J., et al. Association of inhalation toxicologists (AIT) working party recommendation for standard delivered dose calculation and expression in non-clinical aerosol inhalation toxicology studies with pharmaceuticals. Inhal Toxicol. 20 (13), 1179-1189 (2008).
- Hsieh, T. H., Yu, C. P., Oberdorster, G. Deposition and clearance models of Ni compounds in the mouse lung and comparisons with the rat models. Aerosol Sci Technol. 31 (5), 358-372 (1999).
- Phillips, J. E., et al. House dust mite models: will they translate clinically as a superior model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 132 (1), 242-244 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. JoVE. (75), e50172 (2013).
- Storms, W. W., DoPico, G. A., Reed, C. E. Aerosol Sch 1000. An anticholinergic bronchodilator. Am Rev Respir Dis. 111 (4), 419-422 (1975).
- Schanker, L. S., Mitchell, E. W., Brown, R. A. Jr Species comparison of drug absorption from the lung after aerosol inhalation or intratracheal injection. Drug Metab Dispos. 14 (1), 79-88 (1986).
- Biju, P., et al. Steroidal C-21 mercapto derivatives as dissociated steroids: discovery of an inhaled dissociated steroid. Bioorg Med Chem Lett. 21 (21), 6343-6347 (2011).
- West, L. J., Pierce, C. M., Thomas, W. D. Lysergic acid diethylamide: Its effects on a male asiatic elephant. Science. 138 (3545), 1100-1103 (1962).
- Boxenbaum, H., DiLea, C. First-time-in-human dose selection: allometric thoughts and perspectives. J Clin Pharmacol. 35 (10), 957-966 (1995).
- Spina, D. Current and novel bronchodilators in respiratory disease. Curr Opin Pulm Med. 20 (1), 73-86 (2014).
- Degeorge, J. J., et al. Considerations for toxicology studies of respiratory drug products. Regul.Toxicol.Pharmacol. 25 (2), 189-193 (1997).
- McClellan, R. O., Henderson, R. F. Concepts in Inhalation Toxicology. , Taylor & Francis Group. (1989).
- Patton, J. S., et al. The particle has landed--characterizing the fate of inhaled pharmaceuticals. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 23 Suppl 2, S71-S87 (2010).
- Depreter, F., Pilcer, G., Amighi, K. Inhaled proteins: Challenges and perspectives. Int J Pharm. 447 (1-2), 251-280 (2013).
