Summary
De geïnhaleerd worden beschreven kunnen genereren, monster voor karakterisatie en uniform een geneesmiddel aërosol in de longen van knaagdieren deponeren. Hierdoor kan de preklinische bepaling van de effectiviteit en veiligheid van geneesmiddeldoseringen afgezet in de longen; belangrijke gegevens op grond waarvan de klinische geïnhaleerde ontwikkeling van geneesmiddelen.
Abstract
Respiratoire aandoeningen zoals astma en chronische obstructieve longziekte (COPD) worden momenteel behandeld met geïnhaleerde anti-inflammatoire en bronchusverwijdende middelen. Ondanks de beschikbaarheid van meerdere behandelingen, zijn beide ziekten groeiende zorg voor de volksgezondheid. De meeste astmapatiënten zijn goed gereguleerd huidige inhalatietherapieën maar een aanzienlijk aantal patiënten met ernstige astma niet. Astma treft naar schatting 300 miljoen mensen wereldwijd en ongeveer 20 procent een ernstige vorm van de ziekte. In tegenstelling tot astma, zijn er weinig effectieve therapieën voor COPD. Naar schatting 10% van de bevolking heeft COPD en de trend van het sterftecijfer neemt toe voor COPD terwijl het verminderen van andere ernstige ziekten. Hoewel de ontwikkeling van medicijnen voor inhalatie levering uitdaging, de neus alleen inhaleereenheid maakt directe afgifte van nieuwe geneesmiddelen voor de longen van knaagdieren voor pre-klinische effectiviteit en veiligheid / toxicologische studies. Geïnhaleerde toediening van geneesmiddelenheeft meerdere voordelen ademhalingsziekten, waarbij hoge concentraties in de longen verbetert werkzaamheid en minimale systemische bijwerkingen. Inhalatiecorticosteroïden en luchtwegverwijders profiteren van deze voordelen en ingeademd levering kan ook mogelijkheden voor toekomstige biologische therapieën te houden. De geïnhaleerd worden beschreven kunnen genereren, monster voor karakterisatie en uniform een geneesmiddel aërosol in de longen van knaagdieren deponeren. Hierdoor kan de pre-klinische bepaling van de effectiviteit en veiligheid van drug doses afgezet in de longen van knaagdieren, de belangrijkste gegevens die nodig zijn voor het starten van klinische ontwikkeling.
Introduction
Er zijn veel voordelen aan het geïnhaleerde toediening van geneesmiddelen voor de behandeling van respiratoire aandoeningen. Geïnhaleerde levering geldt het therapeutische middel rechtstreeks naar de site van de actie, de longen. Een hoge lokale concentratie van het geneesmiddel in de longen heeft een groot voordeel dat dosis en systemische blootstelling minimaliseren, en maximaliseert werkzaamheid. Dit is een belangrijk voordeel, dat sterk de therapeutische index kan verhogen (TI, verhouding van de dosis geneesmiddel die een neveneffect op de dosis geneesmiddel die effectiviteit verschaft veroorzaakt) van een geneesmiddel. Inhalatie β 2-adrenerge agonisten, corticosteroïden en anti-cholinerge geneesmiddelen zijn effectief in het verbeteren van de longfunctie bij astma en COPD bewezen tegen zo laag mogelijke systemische bijwerkingen (tachycardie, immunosuppressie en constipatie) waargenomen wanneer deze geneesmiddelen oraal worden ingenomen. Nieuwe drug klassen (bijvoorbeeld PDE4 remmers 1 en BTK remmers 2) hebben onlangsbewezen effectief te verbeteren longfunctie bij preklinische dierziektemodellen maar vergelijkbaar met 2 agonisten, corticosteroïden en anti-cholinerge geneesmiddelen P lijden aan systemische bijwerkingen die kunnen worden geminimaliseerd door geïnhaleerde afgifte. Als gevolg van de extra kosten van de ontwikkeling van geïnhaleerd versus orale geneesmiddelen, moet een inhalatie formulering alleen in aanmerking voor respiratoire indicaties na een succesvolle orale / systemische toediening onthult dosis-limiterende mechanisme gebaseerde systemische bijwerkingen.
Preklinisch worden ingeademd verbindingen geoptimaliseerd om de TI, hetwelk in vivo werkzaamheid en bijwerkingen nemen toe. Aanvankelijk waren deze metingen kunnen worden uitgevoerd in afzonderlijke assays, gewoonlijk een topisch afgeleverd effectiviteit meten en systemisch afgeleverd neveneffect meten, maar echt vergelijken stoffen dient werkzaamheid en bijwerkingen worden gemeten op dezelfde dieren na toediening door inhalatie. Dit vereist dosis / respons studies die achieve genoeg verbinding toegediend aan de longen van een meetbare neveneffect te induceren. De enige manier nog gelijkmatig verdelen grote doses geneesmiddel in de longen van meerdere kleine dieren tegelijk is de neus slechts inhalatie 3, 4, 5. De sterke en zwakke punten van de verschillende inhalatieblootstelling technieken zijn recent beoordeeld 6, 7, 8. Gespecialiseerde apparatuur en een grote hoeveelheid testverbinding (een gram) vereist voor de neus alleen geïnhaleerde afgifte van geneesmiddelen, maar proof-of-concept studies mogelijk zijn met andere middelen.
Wanneer de hoeveelheid geneesmiddel is beperkt (mg hoeveelheden), directe toedieningsmethoden zijn optioneel maar lijdt aan niet-homogene afzetting, meer geneesmiddel geconcentreerd langs de centrale luchtwegen en minder goed vertegenwoordigd in de parenchymale / alveolairegebieden 3, 4, 5. De effectieve dosis door directe instillatie geleverd is altijd hoger en kan nooit rechtstreeks worden vergeleken met geïnhaleerde doses 4. Directe instillatie werkwijzen waaronder intranasale 9, intratracheale vloeistof 10, 11 en nevel instillatie 12, of droog poeder insufflatie 13, 14 kan worden gebruikt als een screeningsgereedschap bij benadering dosisbereik voor latere neus alleen inhalatieonderzoek bepalen of het bepalen Classificatie van effectiviteit / toxiciteit in een reeks structureel vergelijkbare middelen 15. Door de centrale luchtwegen depositiepatroon kan directe toediening werkwijzen nuttiger zijn om de effecten van verbindingen die werken op het centrale luchtwegen (bronchodilatatoren of mestcel remmers) dan i bepalenn de perifere long (ontstekingsremmers).
In tegenstelling tot mensen, die een aanzienlijke dosis geconcentreerd aerosol kan inhaleren uit een inhaleerinrichting in één adem continue productie van een inadembaar (0,5-5 urn massamediane aerodynamische diameter MMAD) aerosol, gedurende maximaal een uur nodig te deponeren een werkzame dosis geneesmiddel in de longen van spontaan ademende knaagdier in een neus alleen inhaleersysteem 16. Aërosols (jet vernevelaar of Wright stof toevoer 17) continu de vereiste grootte aerosol deeltjesgrootte en concentratie neus alleen inhalatiestudies kan produceren niet erg efficiënt in het genereren van hoge kwaliteit (inadembaar) aerosolen. Het geneesmiddel toevoersnelheden deze aerosolgenerators voor potent (IC50 pM tot nM in functionele testen op celbasis) verbindingen zijn algemeen bekend in het 1-10 mg / minuut en gewoonlijk minder dan 1% van dat farmaceutische aerosol maakt de ademzone van de dieren(Figuur 1). Veel van de deeltjes gegenereerd zijn te groot (> 5 pm) waardoor de longen binnendringen en worden verwijderd door een aërosol classifier (a pre-afscheider of cycloon met een 5 urn snijpunt) een grote dosis geneesmiddel in de neus te voorkomen. Het toevoegen aan de inefficiëntie van de neus slechts inhalatiesystemen is de kleine deeltjesgrootte (0,5-5 pm MMAD) voor inadembare deeltjes. Veel van de aërosoldeeltjes kleiner dan 0,5 urn uitgeademd (sigarettenrook) en niet in de longen 18 afgezet. Ook veel van de "grotere" aërosoldeeltjes (~ 5 pm) storting in de neus worden opgevangen of mucociliaire klaring getransporteerd naar de achterkant van de keel wanneer ze worden ingeslikt in de maag 19. Bij gebruik neus alleen inhalatie, de neergeslagen in de neus dosis is altijd groter dan de afgezette dosis in de longen en nasale dosering kan bijdragen aan systemische blootstelling en neveneffecten 20. Inherent, ingeademd drug doses klein zijn (in het bereik microgram) het minimaliseren van systemische bijwerking potentieel geneesmiddel geabsorbeerd door de nasale, long-, maag- of weefsels. Zelfs wanneer de deeltjesgrootte van de dieren geleverde aerosol in het ingeademd, gemiddeld slechts 4% van de aerosol deeltjes die het naar de ademzone van het depot dieren in de longen. Efficiëntere aërosols verkrijgbaar, maar de jet vernevelaar en Wright stof diervoeder ongeëvenaard voor hun vermogen om continu aërosolen uit diverse vloeibare en droge poederformuleringen resp.
Inhaleerbare aerosol uit de pre-separator overgaat in de neus alleen inhalatieblootstelling eenheid 21 die is gebaseerd op een stroming langs de neus 22 ontwerp. De inhaleereenheid over 3 lagen (twee lagen worden getoond in Figuur 1) en bevat elke etage 10 blootstelling poorten voor dieren en aerosol bemonstering. De poorten zijn omtrek rondom het central aerosol plenum. Bewuste muizen worden in glazen tegenhoudende houders (6 inch lang en 1,2 inch diameter) en adem de aerosol inhoud van de geïnhaleerd worden. De muizen zijn niet gewend aan de beveiligingssystemen 23. Uit ervaring is gebleken dat muizen verdragen buis beperking van minder dan een duur die gelijk uur, met of zonder aanpassing 2.
De inhalatie apparaat is ontworpen om geneesmiddel aerosols rechtstreeks aan de longen van de dieren, terwijl voorkomen doordat de operators. De potentie / toxiciteit van deze drugs is meestal onbekend en meerdere safety engineering controles worden gebruikt om de blootstelling aan de exploitanten te voorkomen. De exploitanten moeten altijd dragen persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratorium jassen, maskers, en een veiligheidsbril). De externe kamer van de inhaleereenheid onder negatieve druk te allen tijde tijdens bedrijf waardoor de veilige verwijdering van enkele of groepen dieren without afsluiten van de aërosolgenerator. De inhaleereenheid is ook opgenomen in een secundaire ruimte een onderdruk gehandhaafd door een uitlaatpoort in het plafond om het ontsnappen van aerosol in de kamer bij storingen te voorkomen. Alle effluent lucht uit het inhaleren wordt gefilterd door een HEPA-filter voordat ze in het milieu. De neus-only exposure systeem dat wordt gebruikt in dit manuscript werd gekocht van een enkele leverancier (zie aanvullende Table of Materials).
Protocol
De muizen die in deze studies werden in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren, achtste editie 24 verzorgd. De muizen werden gehuisvest in groep in een Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care (AAALAC) internationale geaccrediteerde faciliteit in steriele geventileerde microisolator woningen op maïskolf beddengoed. Bij het meten van bronchoconstrictie, werden muizen verdoofd met 100 mg / kg ip pentobarbital en diepte van de anesthesie werd gevolgd door gebrek aan teen knijpen reflex en onderhouden door ip anesthesie nodig. Aan het eind van de experimenten werden de muizen gedood door cervicale dislocatie na overdosis barbituraten. Verificatie van euthanasie werd bevestigd door het ontbreken van de ademhaling. Geen survival operaties werden uitgevoerd op de muizen. Al het onderzoek protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Formulering en Device Selectie voor het genereren van Phartische Aerosols
OPMERKING: Formulering en selectieorgaan afhankelijk van de fysisch-chemische eigenschappen van de individuele geneesmiddelen te aërosol bijgevolg algemene protocollen worden hieronder weergegeven en de lezer wordt verwezen naar de beoordelingen door Zeng 25 en 26 O'Riordan.
- Droogpoeder aerosolen
- Microniseren drug droge poeders in een kogelmolen, straalmolen of dergelijke inrichting 27 en zorgen voor de gemicroniseerde deeltjesgrootteverdeling (PSD) bevat deeltjes van inadembare (0,5-5 urn massamediane aerodynamische diameter MMAD) deeltjesgrootte. Blend potente testverbindingen die verdunning met gemicroniseerd lactose vereisen.
OPMERKING: Indien er onvoldoende gemicroniseerd poeder aan de PSD een cascade impactor te bepalen, kan de PSD van een kleine (sub-milligram) monster van het gemicroniseerde poeder wordt gemeten door lichtverstrooiing te bevestigen bevat kleine / inadembare deeltjes. - Genereren het droge poeder aërosol onder gebruikmaking van een Wright stof toevoer droog poeder aërosolgenerator. Verpak de gemicroniseerde geneesmiddel / lactosepoeder in het cilindrische reservoir via een manuele hydraulische pers bij ongeveer 1000 pounds per square inch (psi) tot verdichte koeken poeder gebruikt als invoer door de Wright stof toevoer aërosolgenerator 17 te produceren.
- Draai het cilindrische reservoir op de Wright stof toevoer voortbewegen van het reservoir tot het schraapblad in contact met het geneesmiddel cake.
- Sluit de uitlaat van de toevoer Wright stof een cycloon en de inlaat van een persluchtbron ingesteld op 15 l / min luchtstroomsnelheid (maximale druk 90 psi).
- Stel de toevoersnelheid besturing 0,7 omwenteling per minuut (opm) en zet de Wright stof toevoer aërosolgenerator.
OPMERKING: 0,7 opm komt overeen met een testvoorwerp cake toevoersnelheid van 1 g / h bij gebruik van kleine Wright stof toevoer cilindrische reservoir. De Wright stof toevoer schraapt een dunne laag verdicht powder van de testartikel koek door draaien het reservoir. Lucht draagt de stof uit de Wright stof toevoer via een sonisch mondstuk voor de-agglomeratie, en in een cycloon niet-inadembare deeltjes en agglomeraten te verwijderen. - Sluit de uitlaat van de cycloon naar het centrale aerosol plenum van de geïnhaleerd worden (figuur 1).
OPMERKING: Verbindingen kunnen worden gecomprimeerd 300-1500 psi in het reservoir van de stof Wright voeding. Het doel is om de deeltjes voldoende samen te drukken zodat ze in het reservoir blijft behouden wanneer omgekeerd, maar niet zoveel dat de Wright stof toevoer niet schrapen een dunne laag voor het opnieuw aërosolvorming. Men moet niet vergeten dat de meter de handmatige hydraulische pers leest ponden en de zuiger op een stofje laadhouder heeft een oppervlak van ongeveer 0,25 vierkante inch. Daarom 250 pond drukkracht op 0,25 vierkante inch is gelijk aan 1.000 psi.
- Microniseren drug droge poeders in een kogelmolen, straalmolen of dergelijke inrichting 27 en zorgen voor de gemicroniseerde deeltjesgrootteverdeling (PSD) bevat deeltjes van inadembare (0,5-5 urn massamediane aerodynamische diameter MMAD) deeltjesgrootte. Blend potente testverbindingen die verdunning met gemicroniseerd lactose vereisen.
- Vernevelde vloeistofdeeltjes
- Los het geneesmiddel in 100 ml water of fysiologische zoutoplossing.
- Laad een 100 ml spuit met de geneesmiddeloplossing en plaats de spuit in de injectiespuitpomp met een stroomsnelheid bedraagt 1 ml / minuut.
- Sluit de injectiespuitpomp de jet vernevelaar en zuiveren van de lucht uit de toevoer die naar de vernevelaar.
- Sluit de persluchtbron de jet vernevelaar en zet de luchtstroommeter 10 l / min.
- Plaats de jet vernevelaar in de pre-separator. De pre-separator verbindt de vernevelaar om de centrale aerosol plenum van de geïnhaleerd worden (figuur 1).
Opmerking: veel drug verbindingen zijn oplosbaarheid in water beperkt en worden beter geformuleerd als droog poeder aerosolen. Als een stabiele suspensie kan worden gemaakt van gemicroniseerd (MMAD <5 uM) verbinding kan worden gebruikt bij de jet vernevelaar. Voorzichtigheid moet worden gebruikt als suspensie kan de vernevelaar verstoppen. Verstuiver voer concentraties van 1 mg / ml voor potente verbindingen (zoals bronchodilatoripratropium) 40 mg / ml suspensies (minder potente verbindingen zoals salbutamolsulfaat) gebruikt. De spuitpomp toevoersnelheid ligt bij 1 ml / min gedurende een praktische redenen; zodat de aerosol concentratie equilibratieperiode en 45-minuten durende blootstelling te vullen zonder de noodzaak om de spuit opnieuw te laden.
2. Aerosol Exposure Experiment Setup
- Meet de geneesmiddelconcentratie (door het verzamelen van aerosol op een absoluut filter) en de deeltjesgrootteverdeling (door het verzamelen aerosol via een cascade impactor) van de aerosol die de inhaleereenheid na pre-separator / cycloon binnentreedt. Gebruik deze parameters samen met het dier minuut ventilatie, lichaamsgewicht, en de blootstelling tijd om de dosis van het geneesmiddel afgezet in de longen te schatten.
- Weeg de absolute filter en noteer het gewicht filter. Plaats het filter in de filterhouder en monteer de filterhouder. Sluit de inlaat van de absolute filterhoudereen centrale aerosol plenum bemonsteringspoort en de uitlaat met een vacuümbron ingesteld op de aerosol monster met een stroomsnelheid van 1 l / min gedurende de duur van het experiment.
OPMERKING: De massa van geneesmiddel op het filter na bemonstering gedurende 45 min kan in de sub-range microgram en / of gemengd worden met lactose, zout NaCl of ander voertuig. Een microbalans die leest tot 0,1 microgram nodig. Om een nauwkeurige gewicht van het geneesmiddel afgezet op het filter te krijgen, moet het filter worden in evenwicht gebracht en afgewogen in een luchtvochtigheid gecontroleerde omgeving. Het gewicht van geneesmiddel op de filters kan alleen worden gebruikt bij het berekenen dosering als er geen voertuig in de formulering of het voertuig water. Bij een voertuig behalve water formulering, het gewicht van de stof op het filter geeft slechts een schatting uitgangspunt voor verdere analyse van geneesmiddelgehalte door hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC). - Te wegen en het gewicht van de 7 cascadeslaginrichting fase filters en een laatste "staartstuk" opnemen; filter. Plaats een filter op elk van de zeven trappen van de Cascade impactor en monteer de Mercer cascade impactor 28. Sluit de inlaat van de cascade impactor een centrale aerosol plenum bemonsteringspoort en de uitlaat met een vacuümbron ingesteld op de aerosol een stroomsnelheid de cascade impactor wordt geijkt (gewoonlijk 0,5 of 1 l / min) monster voor de duur van de experiment.
- Bewaken van de aerosol inhoud van de geïnhaleerd worden met de real-time aërosol monitor (zie tabel van Materialen en reagentia) te bevestigen aërosols functioneel en een stabiele aerosol gedurende het experiment. Sluit de inlaat van de real-time aërosol monitor op een centrale aerosol plenum bemonsteringspoort en de uitlaat met een vacuümbron ingesteld op de aerosol monster met een stroomsnelheid van 1 l / min gedurende de duur van het experiment.
Opmerking: Het signaal van de werkelijke tijd aerosol beeldscherm wordt in ug / L, maar is gekalibreerd voor weg- stof en opnieuw worden gekalibreerdvoor elk individueel geneesmiddel aerosol juiste aerosol concentratiewaarden verkregen. Kalibratie is niet nodig om de monitor te gebruiken om de aanwezigheid of afwezigheid en temporele stabiele aerosol concentratie bevestigen. - Stel het procesbesturingssysteem parameters (luchtdebiet, vacuüm, druk aerosolgenerator vermogen) om de vereiste dat afhankelijk van het aantal dieren dat met het inhaleereenheid waarden. De inhaleereenheid en aërosols worden voortdurend gecontroleerd / bewaakt door een geautomatiseerd proces control / data-acquisitiesysteem (DACO) van de fabrikant (zie tabel van Materialen en reagentia). Luchtstroomsnelheid in de inhaleereenheid moet minimaal ongeveer 2 maal de totale minuutventilatie percentage van alle dieren in de inhaleereenheid zijn om een ophoping van CO2 te vermijden.
- Weeg de absolute filter en noteer het gewicht filter. Plaats het filter in de filterhouder en monteer de filterhouder. Sluit de inlaat van de absolute filterhoudereen centrale aerosol plenum bemonsteringspoort en de uitlaat met een vacuümbron ingesteld op de aerosol monster met een stroomsnelheid van 1 l / min gedurende de duur van het experiment.
- Load muizen in de neus alleen dempers voor blootstelling aan aërosol in de neus alleen geïnhaleerd worden. Ook laden onderdrukte stress controledieren inom restrainers naar kamer lucht in te ademen.
OPMERKING: een dosis / respons-experiment bestaat uit meerdere groepen muizen blootgesteld aan aërosol voor verschillende hoeveelheden tijd. Belichtingstijd wordt gebruikt om de dosis elke groep krijgt bij een dosis / respons-experiment besturen.- Hoek de tegenhoudende buis naar het plafond bij een poging de dieren geladen, omdat ze de neiging om naar boven draaien proberen te ontsnappen. Het richten van de buizen naar beneden aub stimuleert terugwinnen en ontsnapt uit de achterkant van de buis. Zorgen neus van de muis is georiënteerd tot de punt van de buis en zet de variabele positie plunjer in het achtereinde van de tegenhouder.
OPMERKING: De plunjer is gevormd om de staart van de muis uitsteekt uit de houder, waardoor de muis om de lichaamstemperatuur te reguleren terwijl in de vasthouder. - Pas de zuiger om de muizen te draaien, maar niet aan kop tot staart; te zorgen voor de aerosol wordt ingeademd.
- Continu demuizen terwijl de tegenhoudende buizen. Na het positioneren van de zuiger, kleine muizen (<20 g) proberen vaak hoofd te draaien tot staart in de buizen en neemt een U-positie waar ze moeite met ademhalen. Deze draaien gedrag is het meest voor in de eerste 5 minuten van terughoudendheid, na dat de muizen zelden proberen om hoofd te draaien tot staart.
- Hoek de tegenhoudende buis naar het plafond bij een poging de dieren geladen, omdat ze de neiging om naar boven draaien proberen te ontsnappen. Het richten van de buizen naar beneden aub stimuleert terugwinnen en ontsnapt uit de achterkant van de buis. Zorgen neus van de muis is georiënteerd tot de punt van de buis en zet de variabele positie plunjer in het achtereinde van de tegenhouder.
3. Aerosol Delivery
- Plaats stoppers aan de afgiftepoorten van de inhaleereenheid plug en activeert de aërosolgenerator, perslucht stromingsregelaar en inhaleereenheid vacuümpomp vanuit het procesbesturingssoftware.
- Zodra de aanwijzing van de onvertraagde aerosol scherm tonen de aerosol concentratie evenwicht komen (~ 30 min, figuur 2), beginnen met het verwijderen stoppen en aanbrengen enige neus-beteugeling buizen met muizen in de geïnhaleerd worden. Herhalen totdat alle muizen worden blootgesteld aan geneesmiddel worden verbonden met de geïnhaleerd worden.
LET OP: Inhet voorbeeldexperiment de via de aërosolgenerator en verdunningslucht om aanzuiging meegeleverde totale luchtstroom ingesteld op 0,5 l / min debiet leveren aan elk dier blootstelling gebruikte poorten. Bijvoorbeeld 15 l / min totale luchtstroom is voldoende om alle 30 poorten in de inhaleereenheid leveren. Dit is veel luchtstroom door de minuutventilatie van de muizen dan vereist, maar een grotere luchtstroom nodig om de energie (drukval over de aërosolgenerator) leveren om (vernevelen / de-agglomeraat) de aerosol. - Zodra alle dieren in de belichtingseenheid worden geladen, zet het vacuüm bemonstering pompen die verbonden zijn met de absolute filter en Cascade Impactor volgens de werkwijze besturingssoftware.
- Wanneer alle posities zijn voltooid, zet de aërosolgenerator en verwijderen van alle resterende muizen uit geïnhaleerd worden.
LET OP: Animals zal in een verandering station kap of door personeel dat het dragen van een gezichtsmasker worden behandeld. Na afloop van aerosol afgifte, de muizen removed van de buizen en de buizen worden ontsmet na gebruik.
4. Berekening van het gedeponeerde Dose
- Het gedeponeerde dosis 29 berekenen ug / kg (Vergelijking 1) te vermenigvuldigen de concentratie van het geneesmiddel in de spuitbus (ug / L) x minuutventilatie (l / min) x blootstellingsduur (min) x inhaleerbare fractie x pulmonaire depositie fractie en delen door het lichaamsgewicht (kg).
- Bereken de aerosol concentratie (ug / l) door de massa van geneesmiddel te verdelen over de absolute filter (ug) door de luchtstroom door het filter (L / min) vermenigvuldigd met de bemonsteringstijd (min). Schat minuutventilatie van de muis door een allometrische vergelijking op basis van het lichaamsgewicht 30. De inhaleerbare fractie 1 als aerosol werd door een pre-separator niet-inadembare deeltjes te verwijderen en de pulmonaire depositie fractie wordt bepaald uit het geneesmiddel aerosol MMAD (figuur 3) metexperimentele ijkkrommen van monodisperse aerosolen (figuur 4) 31.
Representative Results
De bronchodilator ipratropium bromide werd opgelost in 0,9% normale zoutoplossing bij een concentratie van 1 mg / ml. Een 100 ml spuit werd gevuld met de ipratropium formuleringsoplossing en de injectiespuit werd in een injectiespuitpomp ingesteld op de jet vernevelaar voeden (figuur 1) met een stroomsnelheid van 1 ml / min ingebracht. Activeren van het regelsysteem voor de inhalatie initieert een 10 l / min luchtstroom naar de jet vernevelaar, 5 L / min verdunningsluchtstroom de verdunningskamer en 15,5 l / min vacuüm luchtstroom naar de geneesmiddel aerosol trekken uit de inhaleereenheid na het passeren van de neus van de muizen. De spuitpomp en onmiddellijke aerosol beeldscherm bemonsteringspomp werden geactiveerd. Vierentwintig muizen werden in de inhaleereenheid na de realtime aerosol beeldscherm bevestigt de aerosol-concentratie in de inhaleereenheid moest evenwicht (15-30 min, figuur 2) komt. Het monster pompen voor de absolute filter (1 l / min) en cascadeimpactor (0,5 l / min) waren ingeschakeld zodra alle muizen met het inhaleereenheid. De eerste groep van 8 muizen werd verwijderd uit de inhaleereenheid na 5 minuten, de tweede groep na 15 minuten, en de derde groep na 45 minuten. Bronchoconstrictie 32 werd gemeten als de toename van de luchtwegen weerstand (Rrs) een enkelvoudige dosis vernevelde methacholine (30 mg / ml) geleverd 2 uur na dosering ipratropium via het knaagdier respirator 33. Het percentage toename van Rrs voor elk dier berekend als de maximale Rrs via 3-minuten interval na vernevelde methacholine (Rmax) minus de Rrs waarde van de nulmeting voor methacholine (Rbase) gedeeld door Rbase (% toename Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), werd gebruikt voor het kwantificeren bronchoconstrictie.
De aerosol afgezet op de cascade impactor filters en absoluutfilter gedurende 45 min aërosol blootstelling werd opgelost in50% acetonitril en massa ipratropium gekwantificeerd met HPLC (tabel 1). De MMAD x / GSD van de ipratropium aerosol werd berekend als 1,7 x / 1,5 urn (figuur 3) en een afzetting fractie (DF) van 0,037 voor muizen werd gebruikt voor een aerosol een MMAD van 1,7 um (zie figuur 4). De inhaleerbare fractie (IF) werd 1 als aerosol werd door een pre-separator niet-inadembare deeltjes te verwijderen. De gemiddelde concentratie van ipratropium in de spuitbus (0,5 ug / l) werd berekend uit de massa van ipratropium op de absolute filter (22 ug) gedeeld door de stroomsnelheid van lucht die door het filter (1 l / min) vermenigvuldigd met de bemonsteringstijd (45 min). Het gemiddelde lichaamsgewicht van de muizen was 0,019 kg en hun voorspelde minuutventilatie werd berekend als 0,021 L / min. Onder gebruikmaking van vergelijking 1, de neergeslagen pads voor 5, 15 en 45 min blootstellingsgroepen waren 0,1, 0,3 en 0,9 ug / kg; respectievelijk.
= "1"> Ipratropium geremd vernevelde methacholine bronchoconstrictie in 8 weken oude C57BL / 6 muizen. Methacholine verhoogd Rrs binnen seconden verstoven toediening (figuur 5, bovenste paneel). De Rrs van de controlegroep (blootgesteld aan kamerlucht plaats van ipratropium aerosol) steeg van een basislijnwaarde van 0,62 ± 0,03 cmH 2 O * s / ml tot een maximale waarde van 1,66 ± 0,12 cmH 2 O * s / ml, hetgeen een 168 ± 9% toename Rrs, 70 s na methacholine aerosol toediening. Het percentage toename van de ademhalingswegen resistentie werd op een dosisafhankelijke wijze geremd door geïnhaleerde doses ipratropium. Het percentage toename Rrs werd geremd met 51 ± 9%, 79 ± 14% en 89 ± 2% (figuur 5, onderste paneel) en geïnhaleerde doses ipratropium gedeponeerd 0,1, 0,3 en 0,9 ug / kg.
g"/>
Figuur 1: inhaleereenheid met droog poeder aerosol generator bevestigd. De vernevelaar gebruikt om aerosol uit vloeibare samenstellingen te genereren is rechts weergegeven. 1) Wright stof toevoer, 2) cycloon, 3) spuitpomp 4) jet vernevelaar ingebracht in pre-separator, 5) verdunningslucht mixer. Bij het aanleveren vernevelde aerosolen, stof toevoer en cycloon worden vervangen door de injectiepomp, jet vernevelaar / pre-separator en verdunningslucht mixer. Het vergrote aanzicht (gemodificeerd van Oldham 21) toont de aerosol stroompad in de ademzone rond de neus dier dat wordt gecreëerd door het inbrengen van de beperkende buis in de geïnhaleerd worden. De aerosol vult de centrale aerosol (grijs) plenum van geïnhaleerd worden, stroomt naar de neus van het dier wanneer deze wordt getrokken door een lichte onderdruk in de buitenste (wit) plenum en in de afvalinzameling filters (niet getoond). plverlichten klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Real time aerosol monitormetingen bevestigen aerosol-concentratie in de inhaleereenheid evenwicht bereikt ~ 30 minuten na het inschakelen van de aërosolgenerator. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Ipratropium massa verzameld in elk stadium van de cascade impactor (blauwe balk) bedekt met curve fit (zwarte kromme) gebruikt om de MMAD en GSD van de aerosol deeltjesgrootteverdeling berekenen. alsjeblieftklik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Deposition fractie voor muizenlongen in afhankelijkheid van MMAD voor aerosols door de neus alleen inhalatie geleverd (gewijzigd van Hsieh 31). Voor deeltjesgrootte kleiner dan 0,5 urn meeste aerosol uitgeademd en niet deponeren in de longen (zoals sigarettenrook). Voor deeltjesgrootten groter dan 5 urn, de meeste van de aerosol wordt gefilterd door de neus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: De snelle toename van de luchtwegen weerstand geïnduceerd door vernevelde methacholine administerood aan muizen wordt geblokkeerd door ipratropium door neus-inhalatie uitsluitend geleverd aan muizen (n = 8 per groep, bovenste paneel). Ipratropium remde de methacholine veroorzaakte toename luchtwegen weerstand met een ED50 van 0,1 ug / kg dosis afgezet (* p <0,05 versus controle, onderste paneel). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Cascadeslaginrichting data gebruikt om MMAD en GSD berekenen | ||
| Stage Filter | Ipratropium op filter HPLC (mg) | Stage Cut Diameter (mm) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0.19 | 4.5 |
| 3 | 1.43 | 2.5 |
| 4 | 2.55 | 1.5 |
| 5 | 2.95 | 1.2 |
| 6 | 1.03 | 0.7 |
| 7 | 0.37 | 0.5 |
Tabel 1: Cascade impactor gebruikte gegevens MMAD en GSD berekenen
Discussion
Een neus alleen inhalatie installatie en de werking op farmaceutische aërosolen leveren aan de longen van knaagdieren is beschreven. Fixeren van dieren in de neus alleen houders is een gewoonlijk gebruikte methode voor dieren blootgesteld aan lucht materiaal. Een experiment werd uitgevoerd waaruit de anticholinergische bronchodilatator ipratropiumbromide 34 kan potente reverse methacholine bronchoconstrictie bij door neus- alleen inhalatie geleverd aan muizen met een ED50 van 0,1 ug / kg dosis afgezet. Een meer dan 10-voudige toename van de effectieve dosis van ipratropium nodig was voor bronchodilatatie na intratracheale afgifte (ED50 intratracheale = 1,3 ug / kg, gegevens niet getoond) leveren. Dit is te wijten aan de niet-homogene depositiepatroon geneesmiddel in de longen door intratracheale dosering 3, 5, 10. 10 maal en meer effectieve dosisverschillen tussen inhalatie en intratracheale dosering technieken voor andere geneesmiddelen zijn eerder waargenomen door anderen 4.
De niet-homogene depositiepatroon geneesmiddel in de longen door intratracheale toediening vertraagt ook geneesmiddel absorptie door de longen 35, verlagen van de snelheid waarmee het geneesmiddel komt in de systemische circulatie en het verminderen van de kans om er systemische bijwerkingen. Daarom de veiligheid / werkzaamheid (therapeutische index) van 36 nieuwe geïnhaleerde geneesmiddelen te optimaliseren, dient de neus slechts inhalatieaflevering gebruikt. Intratracheale depositie een onnauwkeurige schatting van de TI geven door het genereren abusievelijk hoge effectieve doses in de long en lage doses aan de systemische circulatie.
Als nieuwe geneesmiddelen per inhalatie geleverd worden ontwikkeld, is het essentieel om adequaat te vertalen van de werkzame dosis geneesmiddel uit preklinische studies naar de werkzaamheid van een ef voorspellenficacious humane dosis voor klinische proeven. De beruchte dood van Tusko de olifant 37 wordt vaak aangehaald in de literatuur om ons te herinneren aan allometrische scaling gebruiken om interspecies drug doses voorspellen en dat interspecies drug doses niet lineair worden geëxtrapoleerd op basis van een eenvoudige vergelijking van het lichaam massa. Het is gebruikelijk om een allometrische aanpak gebruiken met een allometrische exponent b van 0,67 voor de menselijke drug doses voorspellen van preklinische studies naar de werkzaamheid 38. Met de muis geïnhaleerde ED90 van 0,9 ug / kg voor ipratropium, een allometrische exponent van 0,67, een muislichaam gewicht van 0,03 kg en een menselijk lichaamsgewicht van 60 kg; schatting menselijke ED90 van 0,07 ug / kg ((0,9 * (0.03 / 60) (1-0,67) = 0,07) kan worden berekend als de voorspelde menselijke afgezette dosis Aanbevolen muisdata. De voorspelde waarde is vergelijkbaar met de werkelijke menselijke werkzame afgezette dosis van 0,26 ug / kg, die kan worden berekend uit de geleverdese van 40 ug 39 gedeeld door het menselijk lichaamsgewicht van 60 kg vermenigvuldigd met een humane orale inhalatie pulmonaire depositie fractie 16 van 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Een schatting van de effectieve menselijke geïnhaleerde gedeponeerd dosis helpt ook om de geleverde doses gebruikt in inhalatie toxicologische studies die nodig zijn voor klinische proeven 40 plannen.
Gespecialiseerde materialen grote hoeveelheid testverbinding (een gram) nodig voor de neus met alleen inhalatie geneesmiddelafgifte kunnen aanzienlijke beperkingen zijn bij de ontwikkeling van de neus alleen inhalatietechniek. Een ijkprocedure zonder aanwezige dieren is nodig als een speciale dosis is nodig om een (meestal toxicologie en geen werkzaamheid dosis / respons) studie en deze ijkprocedure meer geneesmiddel nodig beschikbaar zijn. Deze kalibratie run is noodzakelijk omdat de fysisch-chemische eigenschappen van elk geneesmiddel / formulering hebben een grote invloed op de afgezette dosis kan variërenvan het geneesmiddel in de longen. Optimalisatie van de lucht en drugs voedingssnelheden naar de aërosolgenerator gedurende de ijkprocedure nodig is om een aerosol deeltjesgrootte en de concentratie van het specifieke vereiste dosis te bereiken. Terwijl de aërosolgenerator lucht en drugs toevoersnelheden bij de werkwijzen voorgesteld een redelijk uitgangspunt, is er potentieel dat voor een bepaalde geneesmiddelformulering een niet-inadembare (deeltjesgrootte> 5 mm) aerosol gegenereerd. Op de preklinische fase, is er vaak niet genoeg drug beschikbaar voor een kalibratie-run te doen en het is onmogelijk om a priori wat doses (indien aanwezig) krijgen in de longen te leren kennen. Ook wordt statische elektriciteit tijdens het generatieproces aerosol en kan de tijd die het aerosol-concentratie in evenwicht beïnvloeden. Het is belangrijk om een goede aarding van de apparatuur om statische lading te minimaliseren. Een andere mogelijkheid om statische elektriciteit te minimaliseren is het vocht toe te voegen aan de aan de inhalatie unit toegevoerde lucht, om de geleidbaarheid te verhogen enverdrijven elektrostatische ladingen op deeltjes 25. Bevochtiging van de naar de aërosolgenerator toegevoerde lucht niet vereist voor dierlijke comfort tijdens korte (<1 uur) doseringssessies maar moet worden beschouwd als langere behandelingsperiode keer worden gebruikt.
Geneesmiddelen kunnen worden afgegeven aan de longen van dieren door passieve neus alleen inhalatie of rechtstreekse intratracheale toediening methoden nasofaryngeale depositie omzeilen. Neus alleen inhalatieaflevering wordt algemeen gebruikt op het gebied van inhalatie toxicologie 41 maar spaarzaam vroeg in het ontdekkingsproces van geneesmiddelen gebruikt. Een multidisciplinair onderzoeksteam is nodig voor het uitvoeren van de neus-only inhalatie studies te wijten aan de: behoefte aan grote hoeveelheden drugs, gespecialiseerde kennis die nodig is om te formuleren, het genereren en karakteriseren van aërosolen; werken complexe apparatuur, en meet drug werkzaamheid in diermodellen van luchtwegaandoeningen. De levering hierin beschreven technieken worden gebruikt om de ontwikkeling small molecule geïnhaleerde geneesmiddelen maar in de toekomst kunnen worden toegepast op geïnhaleerde biologische 42 ontwikkelen 43. Hopelijk zal de procedures en tips die in dit manuscript zal nieuwe pre-klinische drug discovery en toxicologie onderzoekers om de vaardigheden die nodig zijn om drugs te leveren aan knaagdieren door aerosolinhalatie verwerven vergemakkelijken.
Disclosures
Alle auteurs werkzaam bij Amgen. Publicatie vergoedingen voor deze video-artikel worden betaald door Amgen.
Acknowledgments
Wij erkennen: Dr. Thomas Budiman op TSE Systems GmbH voor zijn technische expertise en apparatuur aanpassen. John Fry (Battelle Inc.) en Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) voor hun behulpzaam discussies. Tian Wu, Sam Mboggo april Miller, en Sean Davis (Amgen) voor hulp bij de experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
References
- Chapman, R. W., et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE4 for inhaled administration. Eur J Pharmacol. 643 (2-3), 274-281 (2010).
- Phillips, J. E., et al. Btk inhibitor RN983 delivered by dry powder nose-only aerosol inhalation inhibits bronchoconstriction and pulmonary inflammation in the ovalbumin allergic mouse model of asthma. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 29 (3), 233-241 (2016).
- Zecchi, R., et al. Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach. Eur J Mass Spectrom. 19 (6), 475-482 (2013).
- Cooper, A. E., Ferguson, D., Grime, K. Optimisation of DMPK by the inhaled route: challenges and approaches. Curr Drug Metab. 13 (4), 457-473 (2012).
- Leong, B. K., Coombs, J. K., Sabaitis, C. P., Rop, D. A., Aaron, C. S. Quantitative morphometric analysis of pulmonary deposition of aerosol particles inhaled via intratracheal nebulization, intratracheal instillation or nose-only inhalation in rats. J Appl Toxicol. 18 (2), 149-160 (1998).
- Pauluhn, J. Overview of inhalation exposure techniques: strengths and weaknesses. Exp Toxicol Pathol. 57 Suppl 1, 111-128 (2005).
- Wong, B. A. Inhalation exposure systems: design, methods and operation. Toxicol Pathol. 35 (1), 3-14 (2007).
- Phalen, R. F. Inhalation Studies Foundations and Techniques. , 2nd, Informa Healthcare. (2009).
- Siddiqui, S., et al. Pulmonary eosinophilia correlates with allergen deposition to the lower respiratory tract in a mouse model of asthma. Clin Exp Allergy. 38 (8), 1381-1390 (2008).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur J Pharm Biopharm. 61 (3), 214-218 (2005).
- Morello, M., et al. Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies. Tuberculosis (Edinb). 89 (5), 371-377 (2009).
- Guillon, A., et al. Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model. Int J Pharm. 434 (1-2), 481-487 (2012).
- Pauluhn, J., Mohr, U. Inhalation studies in laboratory animals--current concepts and alternatives. Toxicol Pathol. 28 (5), 734-753 (2000).
- Snipes, M. B., McClellan, R. O., Mauderly, J. L., Wolff, R. K. Retention patterns for inhaled particles in the lung: Comparisons between laboratory animals and humans for chronic exposures. Health Phys. 57 (Sup 1), 69-78 (1989).
- Wright, B. M. A new dust-feed mechanism. J Sci Inst. 27, 12-15 (1950).
- Scheuch, G., Siekmeier, R. Novel approaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides. J Physiol Pharmacol. 58 Suppl 5 (Pt 2), 615-625 (2007).
- Phillips, J. E., Ji, L., Rivelli, M. A., Chapman, R. W., Corboz, M. R. Three-dimensional analysis of rodent paranasal sinus cavities from X-ray computed tomography (CT) scans. Can J Vet Res. 73 (3), 205-211 (2009).
- Wolff, R. K. Toxicology studies for inhaled and nasal delivery. Mol Pharm. , (2015).
- Oldham, M. J., Phalen, R. F., Budiman, T. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/c mice in a new nose-only exposure system. Aerosol Sci Technol. 43 (10), 970-977 (2009).
- Cannon, W. C., Blanton, E. F., McDonald, K. E. The flow-past chamber: an improved nose-only exposure system for rodents. Am Ind Hyg Assoc J. 44 (12), 923-928 (1983).
- Narciso, S. P., Nadziejko, E., Chen, L. C., Gordon, T., Nadziejko, C. Adaptation to stress induced by restraining rats and mice in nose-only inhalation holders. Inhal Toxicol. 15 (11), 1133-1143 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Zeng, X., Martin, G., Marriott, C. Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation. , Taylor & Francis. (2001).
- O'Riordan, T. G. Formulations and nebulizer performance. Respir Care. 47 (11), 1305-1313 (2002).
- Pilcer, G., Amighi, K. Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int J Pharm. 392 (1-2), 1-19 (2010).
- Mercer, T. T., Tillery, M. I., Newton, G. J. A multi-stage, low flow rate cascade impactor. J. Aerosol Sci. 1 (1), 9-15 (1970).
- Forbes, B., et al. Challenges in inhaled product development and opportunities for open innovation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (1-2), 69-87 (2011).
- Alexander, D. J., et al. Association of inhalation toxicologists (AIT) working party recommendation for standard delivered dose calculation and expression in non-clinical aerosol inhalation toxicology studies with pharmaceuticals. Inhal Toxicol. 20 (13), 1179-1189 (2008).
- Hsieh, T. H., Yu, C. P., Oberdorster, G. Deposition and clearance models of Ni compounds in the mouse lung and comparisons with the rat models. Aerosol Sci Technol. 31 (5), 358-372 (1999).
- Phillips, J. E., et al. House dust mite models: will they translate clinically as a superior model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 132 (1), 242-244 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. JoVE. (75), e50172 (2013).
- Storms, W. W., DoPico, G. A., Reed, C. E. Aerosol Sch 1000. An anticholinergic bronchodilator. Am Rev Respir Dis. 111 (4), 419-422 (1975).
- Schanker, L. S., Mitchell, E. W., Brown, R. A. Jr Species comparison of drug absorption from the lung after aerosol inhalation or intratracheal injection. Drug Metab Dispos. 14 (1), 79-88 (1986).
- Biju, P., et al. Steroidal C-21 mercapto derivatives as dissociated steroids: discovery of an inhaled dissociated steroid. Bioorg Med Chem Lett. 21 (21), 6343-6347 (2011).
- West, L. J., Pierce, C. M., Thomas, W. D. Lysergic acid diethylamide: Its effects on a male asiatic elephant. Science. 138 (3545), 1100-1103 (1962).
- Boxenbaum, H., DiLea, C. First-time-in-human dose selection: allometric thoughts and perspectives. J Clin Pharmacol. 35 (10), 957-966 (1995).
- Spina, D. Current and novel bronchodilators in respiratory disease. Curr Opin Pulm Med. 20 (1), 73-86 (2014).
- Degeorge, J. J., et al. Considerations for toxicology studies of respiratory drug products. Regul.Toxicol.Pharmacol. 25 (2), 189-193 (1997).
- McClellan, R. O., Henderson, R. F. Concepts in Inhalation Toxicology. , Taylor & Francis Group. (1989).
- Patton, J. S., et al. The particle has landed--characterizing the fate of inhaled pharmaceuticals. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 23 Suppl 2, S71-S87 (2010).
- Depreter, F., Pilcer, G., Amighi, K. Inhaled proteins: Challenges and perspectives. Int J Pharm. 447 (1-2), 251-280 (2013).
