Summary
Den innåndingsenhet som er beskrevet her kan generere, prøve for karakterisering, og jevnt å avsette et medikament aerosol i lungene hos gnagere. Dette gjør det mulig for pre-klinisk bestemmelse av effektiviteten og sikkerheten av legemiddeldoser avsatt i lungene; nøkkeldata slik at klinisk inhalert legemiddelutvikling.
Abstract
Obstruktive luftveissykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) blir for tiden behandlet ved inhalasjon anti-inflammatorisk og bronkodilaterende medikamenter. Til tross for tilgjengeligheten av flere behandlinger, er begge sykdommene økende folkehelse bekymringer. Flertallet av astma pasienter er godt kontrollert på aktuelle inhalerte behandlinger, men et betydelig antall pasienter med alvorlig astma er det ikke. Astma påvirker anslagsvis 300 millioner mennesker over hele verden, og ca 20 prosent har en alvorlig form av sykdommen. I motsetning til astma, er det få effektive behandlingsformer for KOLS. Anslagsvis 10% av befolkningen har COPD og trenden i dødsrater er økende for KOLS samtidig redusere til andre alvorlige sykdommer. Selv om utvikling av legemidler for levering til inhalasjon er utfordrende, gjør det mulig for nese-inhalering eneste enhet direkte levering av nye medikamenter til lungene av gnagere for effekt og sikkerhet / Toksikologistudier prekliniske. Inhalert legemiddelavleveringhar flere fordeler for luftveissykdommer, hvor høy konsentrasjon i lungene bedrer effektiviteten og minimaliserer systemiske bivirkninger. Inhalasjonssteroider og bronchodilators dra nytte av disse fordelene og inhalert levering kan også holde potensialet for fremtidige biologisk behandling. Den innåndingsenhet som er beskrevet her kan generere, prøve for karakterisering, og jevnt å avsette et medikament aerosol i lungene hos gnagere. Dette gjør det mulig for pre-klinisk bestemmelse av effektiviteten og sikkerheten av legemiddeldoser avsatt i lungene til gnagere, nøkkeldata nødvendig før igangsetting klinisk utvikling.
Introduction
Det er mange fordeler med inhalert administrering av legemidler for behandling av luftveissykdom. Inhalert levering gjelder det terapeutiske middel direkte til virkningsstedet, lungene. En høy lokal konsentrasjon av medikamentet i lungene gir en betydelig fordel som minimerer dose og systemisk eksponering, og maksimerer effekten. Dette er en viktig fordel som i stor grad kan øke den terapeutiske indeksen (TI, forholdet mellom dosen av legemiddel som forårsaker en side-effekt over den dose av stoffet som gir effekt) av et medikament. Inhalerte β 2-adrenerge agonister, kortikosteroider og anti-cholinergiske medikamenter har vist seg effektive ved forbedring av lungefunksjonen hos pasienter med astma og KOLS, samtidig minimere de systemiske bivirkninger (takykardi, immunsuppresjon, og forstoppelse) observert når disse stoffene blir tatt oralt. Nye legemiddelgrupper (for eksempel PDE4-inhibitorer 1 og BTK hemmere 2) har nyligvist seg effektiv ved forbedring av lungefunksjonen i pre-kliniske dyresykdomsmodeller, men i likhet med P2-agonister, kortikosteroider og anti-kolinerge midler, lider av systemiske bivirkninger som kan minimaliseres ved inhalasjon levering. På grunn av den økte kostnaden for utvikling av inhalerte vs. orale medikamenter, bør en inhalert formulering kun anses for respiratoriske indikasjoner etter vellykket oral / systemisk administrering viser dosebegrensende mekanisme-baserte systemiske bivirkninger.
Pre-klinisk, inhaleres forbindelser optimalisert for å øke den TI, som krever in vivo-effektivitet og side-effektmålinger. Opprinnelige disse målinger kan gjøres i separate analyser, vanligvis en topisk leverte effekt til måling og en systemisk levert bivirkning måling, men for å sammenligne virkelig forbindelser, bør effekt og bivirkninger måles i de samme dyr etter inhalasjon. Dette krever dose / responsstudier at achieve nok til forbindelsen som blir administrert til lungene for å indusere en målbar bivirkning. Den eneste måten for tiden for jevnt å fordele store doser av medikament i lungene til flere små dyr samtidig er nese-inhalering bare 3, 4, 5. Styrker og svakheter ved ulike innånding eksponeringsteknikker har nylig blitt anmeldt 6, 7, 8. Spesialisert utstyr og en stor mengde av testforbindelse (gram mengder) er nødvendig for nese-bare inhalert legemiddelavlevering, men proof-of-concept studier kan være mulig på annen måte.
Når mengden av medikament som er begrenset (mg mengder), direkte administreringsmetodene er et alternativ, men alle lider av ikke-homogen avsetning, med mer medikament konsentrert langs den sentrale luftveier og mindre godt representert i parenchymal / alveolarområder 3, 4, 5. Den effektive dose som ble avlevert ved direkte drypping er alltid høyere, og kan ikke sammenlignes direkte med inhalerte doser 4. Direkte instillasjon metoder inkludert intranasal 9, intratrakeal væske 10, 11 og sprøyte instillasjon 12, eller tørr-pulver insufflasjon 13, kan 14 benyttes som et screening-verktøy for å bestemme den omtrentlige doseområde for senere nese-bare inhalasjonsundersøkelser, eller for å bestemme vurdering av effekt / toksisitet for en rekke strukturelt lignende stoffer 15. På grunn av den sentrale luftveiene avsetningsmønsteret kan direkte administreringsmetodene være mer nyttig å bestemme effektene av forbindelser som virker på de sentrale luftveier (bronkodilatorer eller mastcelle-inhibitorer) enn in den perifere lunge (antiinflammatoriske midler).
I motsetning til mennesker, som kan inhalere en betydelig dose av konsentrert aerosol fra en inhalator i en enkelt dypt åndedrag, kontinuerlig generering av en respirerbar (0,5-5 um massemedianaerodynamisk diameter, MMAD) aerosol, i opp til en time, kreves for å avsette en virksom medikamentdose inn i et spontant pustende gnagere lunger i en nese-inhalering bare systemet 16. Aerosol-generatorer (jetforstøver eller Wright Dust Feed-17) som kontinuerlig kan produsere den nødvendige aerosolen partikkelstørrelse og konsentrasjon for nese-bare inhalasjonsundersøkelser ikke er svært effektiv til å generere høy kvalitet (respirerbare) aerosoler. Den medikamenttilførselshastigheter for disse aerosolgeneratorer for kraftig (IC50 pM til nM i funksjonelle cellebaserte analyser) forbindelser er vanligvis i området 1 til 10 mg / min område og vanligvis mindre enn 1% av det legemiddelaero gjør det til pustesonen av dyrene(Figur 1). Mange av partiklene som genereres er for store (> 5 um) for å gå inn i lungene og blir fjernet ved hjelp av en aerosol-deler (en pre-separator eller med en syklon 5 um snitt punkt) for å unngå en stor dose av medikament i nesen. Å legge til ineffektiviteten av nese-bare inhalasjonssystemer er den lille partikkelstørrelsesområde (0,5 til 5 um MMAD) av respirerbare partikler. Mange av aerosolpartiklene mindre enn 0,5 um utåndet (som sigarettrøyk) og ikke avsettes i lungene 18. Også mange av de "større" aerosol partikler (~ 5 mikrometer) innskudd i nesen blir absorbert eller transporteres ved mukociliær klaring mot baksiden av halsen hvor de er svelget ned i magen 19. Ved bruk av nese-bare inhalasjon er dosen avsatt i nesen er alltid større enn dosen som er avsatt i lungene og nese dosen kan bidra til systemisk eksponering og bivirkninger 20. Naturlig, innånding Drug doser er liten (i mikrogram-området) minimaliserer systemisk bivirkning potensialet av medikament som absorberes av nasal, lunge-, gastrointestinal eller vev. Selv når partikkelstørrelsen i den aerosol som leveres til dyrene er i det respirerbare området, et gjennomsnitt på bare 4% av aerosolpartiklene som gjør det til pustesonen til det dyr som avsettes i lungene. Mer effektive aerosolgeneratorer er tilgjengelige, men de jetforstøver og Wright Dust Feed-er enestående for deres evne til å produsere kontinuerlige aerosoler fra forskjellige flytende og tørre pulverformuleringer, henholdsvis.
Respirerbar aerosol fra det pre-separatoren føres inn i nesen-eneste eksponering innåndingsenhet 21 som er basert på en strømnings forbi nesen utformingen 22. Den innåndingsenhet har 3 lagene (bare to lag er vist på figur 1), og hvert lag består av 10 eksponerings porter for dyr og aerosol prøvetaking. Portene er plassert periferisk rundt central aerosol plenum. Bevisste mus blir plassert i glassholderne (6 inches lange med 1,2 tommer i diameter) og puste aeros innholdet i innåndingsenhet. Musene ikke akklimatisert til holdeinnretninger 23. Tidligere erfaring har vist at mus tåler rør beherskelse av mindre enn en time varighet på lignende måte, med eller uten tilpasning 2.
Den innåndingsenhet er konstruert for å levere medikament aerosoler direkte til lungene av dyrene samtidig unngå eksponering til operatørene. Styrken / toksisitet av disse stoffene er vanligvis ukjente og flere ingeniørsikkerhetskontrollene er brukt for å unngå eksponering for operatørene. Operatørene må alltid bruke personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakker, respiratorer, og vernebriller). Den ytre plenum av innåndingsenhet er under negativt trykk til enhver tid under drift, slik at for fjerning av enkelt eller grupper av dyr uten huUT stenge av aerosolgeneratoren. Den innåndingsenhet er også inneholdt i en sekundær kabinett som holdes ved et negativt trykk ved hjelp av en utløpsåpning i taket for å forhindre utslipp av aerosol inn i rommet i tilfelle av funksjonssvikt. All utstrømning av luft fra inhaleringssystem blir filtrert av et HEPA-filter før utslipp til omgivelsene. Nesen kun eksponering systemet som brukes i dette manuskriptet ble kjøpt fra en enkelt leverandør (se supplerende Table of Materials).
Protocol
Musene som brukes i disse studiene var ivaretatt i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, åttende utgave 24. Mus var gruppe plassert på en forening for Vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) internasjonal-akkreditert anlegget i sterile ventilert mikroisolatorbur boliger på mais cob senger. Ved måling av bronkokonstriksjon ble musene bedøvet med 100 mg / kg ip pentobarbital og anestesidybden ble målt ved mangel på tå klype refleks og opprettholdes ved ip bedøvelse som nødvendig. På slutten av forsøkene ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon etter barbiturat overdose. Verifisering av eutanasi ble bekreftet ved mangel på åndedrett. Det er ingen overlevelse operasjoner ble utført på musene. Alle forskningsprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Formulering og enhetsvalg for generasjon av Pharfarmasøytikaet Aerosoler
MERK: Formulering og innretning valg er avhengig av de fysikalsk-kjemiske egenskaper til den enkelte medikament som skal aerosoliseres, derfor generelt protokoller er gjengitt nedenfor, og leseren henvises til vurderinger av Zeng 25 og O'Riordan 26.
- Tørt pulver aerosoler
- Micronize medikament tørt pulver i en kulemølle, jetmølle eller lignende anordning 27, og sikre den mikroniserte partikkelstørrelsesfordelingen (PSD) inneholder partikler som kan innåndes (0,5-5 um massemedianaerodynamisk diameter, MMAD) partikkelstørrelse. Bland potente testforbindelser som krever fortynning med mikronisert laktose.
MERK: Hvis det ikke er nok mikronisert pulver for å bestemme PSD med en kaskadestøter kan PSD av en liten (sub-milligram) av det mikroniserte pulver måles ved lysspredning for å bekrefte at den inneholder små / respirerbare partikler. - Generer det tørre pulveret aerosol ved bruk av et Wright Dust Feed-pulver aerosolgenerator. Pakk den mikroniserte legemiddel / laktose-pulver inn i den sylindriske reservoaret ved hjelp av en manuell hydraulisk presse ved ca. 1000 pounds per kvadrattomme (psi) for å fremstille sammenpressede kaker av pulver som brukes som input av Wright Dust Feed-aerosolgenerator 17.
- Skru sylindrisk reservoar over til Wright Dust Feed-rykk tanken til skrapebladet er i kontakt med medikament kake.
- Å forbinde utløpet av den Wright Dust Feed-til en syklon og innløpet til en trykkluftkilde satt til 15 L / min luftstrømningsraten (maksimalt trykk 90 psi).
- Sett matehastigheten kontrollen til 0,7 omdreininger pr minutt (rpm) og slå på Wright Dust Feed-aerosolgenerator.
MERK: 0,7 rpm tilsvarer en testartikkel kake tilførselsmengde på 1 g / time ved hjelp av den lille Wright Dust Feed-sylindrisk reservoar. Wright Dust Feed-skraper et tynt lag av kompaktert powder av testartikkelen kake ved å rotere beholderen. Luft bærer støvet ut av Wright Dust Feed-, gjennom en sonisk dyse for deagglomerering, og inn i en syklon for å fjerne ikke-respirerbare partikler og agglomerater. - Å forbinde utløpet av syklonen til den sentrale aerosol plenum av innåndingsenhet (figur 1).
MERK: Forbindelser kan komprimeres 300-1500 psi i reservoaret av Wright Dust Feed-. Hensikten er å komprimere partiklene nok slik at de vil bli holdt tilbake i reservoaret når invertert, men ikke så mye at den Wright Dust Feed-ikke kan skrape av et tynt sjikt for re-forstøvning. Man må huske at måleren på den manuelle hydrauliske trykk viser i pounds og stempelet på den lille støvforingsreservoaret har et overflateareal på ca. 0,25 kvadrat-tommer. Derfor, 250 pounds av kompresjonskraft på 0,25 kvadrattomme er ekvivalent med 1000 psi.
- Micronize medikament tørt pulver i en kulemølle, jetmølle eller lignende anordning 27, og sikre den mikroniserte partikkelstørrelsesfordelingen (PSD) inneholder partikler som kan innåndes (0,5-5 um massemedianaerodynamisk diameter, MMAD) partikkelstørrelse. Bland potente testforbindelser som krever fortynning med mikronisert laktose.
- Forstøvede flytende aerosoler
- Oppløse medikamentet i 100 ml vann eller fysiologisk saltløsning.
- Laster en 100 ml sprøyte med legemiddeloppløsningen og plassere sprøyten inn i en sprøytepumpe med en strømningsrate på 1 ml / min.
- Koble sprøytepumpe til stråleforstøver, og spyle ut luften fra mateledningen som fører til forstøver.
- Koble trykkluft kilde til jetforstøver og setter luftstrømningsmåler til 10 L / min.
- Sett jetforstøver til den pre-separatoren. Den pre-separatoren forbinder forstøveren til den sentrale aerosol plenum av innåndingsenhet (figur 1).
Merk Mange legemiddelforbindelsene har begrenset løselighet i vann, og er bedre formuleres som tørt pulver aerosoler. Dersom en stabil suspensjon kan fremstilles fra mikronisert (MMAD <5 pM) forbindelse, kan den benyttes sammen med den jetforstøver. Forsiktighet bør brukes som suspensjonen kan tilstoppe forstøveren. Forstøvermate konsentrasjoner fra 1 mg / ml for potente forbindelser (som bronkodilatorenipratropium) til 40 mg / ml suspensjoner (for mindre potente forbindelser som salbutamolsulfat) har blitt benyttet. Sprøytepumpen Tilførselshastigheten er satt til 1 ml / min for en praktisk grunn; for å tillate aerosolkonsentrasjonen ekvilibreringsperioden og 45-min-lang eksponering kan gjennomføres uten at man behøver å fylle sprøyten.
2. Aerosol Eksponering Experiment Setup
- Måle medikamentkonsentrasjonen (ved å samle aerosol på et absolutt filter) og partikkelstørrelsesfordeling (ved å samle aerosol ved hjelp av en kaskadestøter) på den aerosol som kommer inn i innåndingsenhet Post Pre-separator / syklon. Bruk disse parametrene sammen med dyrets minutt ventilasjon, kroppsvekt, og eksponeringstid for å beregne dosen av medikament avsatt i lungene.
- Vei den absolutte filter og ta filteret vekt. Plasser filteret inn i filterholderen og montere filterholderen. Koble innløpet av den absolutte filterholderentil en sentral aerosol plenum prøvetakingsporten og utløp til en vakuumkilde satt til prøve aerosolen ved en strømningshastighet på 1 l / min for varigheten av eksperimentet.
MERK: Massen av stoff på filteret etter prøvetaking i 45 min kan være i sub-mikrogram området og / eller bli blandet med laktose, NaCl-salt, eller et annet kjøretøy. En mikro som leser til 0,1 mikrogram er nødvendig. For å få en nøyaktig vekt av medikament som er avsatt på filteret, må filteret ekvilibrert og veies i en fuktighetskontrollert miljø. Vekten av medikamentet på filtrene kan bare brukes i beregning av dose hvis det ikke er kjøretøy i formuleringen eller kjøretøyet er vann. Når det er et kjøretøy i det annet enn vann formulering, vekten av stoffet på filteret bare gir en anslått utgangspunkt for videre analyse av medikamentinnhold ved høyytelse-væskekromatografi (HPLC). - Vei og registrere vekten av de 7 kaskadestøter trinns filter og en avsluttende "hale stykke"; filter. Plasser et filter på hver av de syv stadier av kaskadestøter og montere Mercer kaskadestøter 28. Koble innløpet av kaskadestøter til en sentral aerosol plenum prøvetakingsporten og utløp til en vakuumkilde satt til prøve aerosolen ved en strømningshastighet på kaskadestøter er kalibrert på (vanligvis 0,5 eller 1 l / min) for varigheten av eksperiment.
- Overvåk aerosol innholdet av innåndingsenhet med den virkelige tid aerosol monitor (se tabell over Materialer og reagenser) for å bekrefte aerosolgeneratorer er funksjonell og som produserer en stabil aerosol gjennom hele forsøket. Koble innløpet av den virkelige tid aerosol monitor til en sentral aerosol plenum prøvetakingsporten og utløp til en vakuumkilde satt til prøve aerosolen ved en strømningshastighet på 1 l / min for varigheten av eksperimentet.
MERK: Signalet fra reell-tids aerosol monitor er angitt i ug / l, men er kalibrert for veistøv, og må rekalibreresfor hvert enkelt medikament aerosol under dannelse av korrekte aerosol konsentrasjonsverdier. Kalibrering er ikke nødvendig å bruke skjermen for å bekrefte tilstedeværelse eller fravær og tidsstabiliteten av aerosol konsentrasjon. - Sett prosess-styreparametere (luftstrøm, vakuum, trykk, aerosolgeneratoren kraft) til de verdier som kreves som avhenger av antallet av dyr som skal kobles til innåndingsenhet. Inhalasjonsenheten og aerosolgeneratorer blir kontinuerlig kontrollert / overvåket ved hjelp av en datastyrt prosesskontroll / datainnsamlingssystem (DACO) levert av fabrikanten (se tabell over Materialer og reagenser). Luftstrømningshastighet inn i innåndingsenhet bør være minimalt ca. 2 ganger den totale minutt ventilasjonshastigheten av alle dyrene i innåndingsenhet for å unngå en oppbygging av CO2.
- Vei den absolutte filter og ta filteret vekt. Plasser filteret inn i filterholderen og montere filterholderen. Koble innløpet av den absolutte filterholderentil en sentral aerosol plenum prøvetakingsporten og utløp til en vakuumkilde satt til prøve aerosolen ved en strømningshastighet på 1 l / min for varigheten av eksperimentet.
- Belastnings mus i nese-bare fastholdingsrammer før det utsettes for aerosolbeholdere i nese-inhalering eneste enhet. Laster også holdespenningskontroll dyrtil fastholdingsrammer å puste luften i rommet.
MERK: En dose / responsforsøk består av flere grupper av mus eksponert for aerosolbeholdere for ulike mengder tid. Eksponeringstid blir brukt til å styre doseringen hver gruppe mottar under en dose / responsforsøk.- Vinkle begrensende rør opp mot taket mens du prøver å laste dyrene, som de pleier å kjøre oppover prøver å flykte. Peker rørene ned under lasting vil oppmuntre til å dreie seg rundt og rømmer ut på baksiden av røret. Kontroller at musen nese er orientert inn i den spisse ende av røret og feste den variable-stilling stempelet inn i den bakre ende av rainer.
MERK: Stempelet er utformet for å tillate halen av musen til å stikke frem fra holderen, noe som gjør at musen til å regulere kroppstemperaturen mens i rainer. - Juster stemplet, slik at musene til å rotere, men ikke slår hode til hale; for å sikre at aerosolen blir inhalert.
- Kontinuerlig overvåkemus mens i begrensende rør. Etter posisjonering av stempelet, liten mus (<20 g) ofte forsøker å svinge hode til hale i rørene og innta en U-stilling hvor de har problemer med å puste. Dette snu oppførsel er mest utbredt i de første 5 minuttene av tilbakeholdenhet, etter at musene sjelden forsøke å snu hode til hale.
- Vinkle begrensende rør opp mot taket mens du prøver å laste dyrene, som de pleier å kjøre oppover prøver å flykte. Peker rørene ned under lasting vil oppmuntre til å dreie seg rundt og rømmer ut på baksiden av røret. Kontroller at musen nese er orientert inn i den spisse ende av røret og feste den variable-stilling stempelet inn i den bakre ende av rainer.
3. Aerosol Levering
- Sett stoppere for å plugge avleveringsåpninger i innåndingsenheten og aktivere aerosolgeneratoren, komprimert luft strømningsregulator, og innåndingsenhet vakuumpumpen fra inne i prosesskontrollprogramvare.
- Så snart avlesningen til den reelle tid aerosol monitor demonstrere aerosolkonsentrasjonen har til å komme til likevekt (~ 30 min, figur 2), begynne å fjerne propper og innsetting av nese-bare begrensende rør som inneholdt mus inn i innåndingsenhet. Gjenta til alle mus for å bli utsatt for legemiddel er forbundet med innåndingsenhet.
MERK: Ieksperimenteksempelet er den totale luftstrømmen som tilføres til innåndingsenhet via aerosolgeneratoren og fortynning luft satt til å levere en 0,5 l / min strømningshastighet for hver av dyreeksponerings havner i bruk. For eksempel, er en 15 L / min totale luftstrøm nok til å forsyne hvert av de 30 portene i innåndingsenhet. Dette er mye mer enn luftstrømmen som kreves av den minutt ventilasjon av musene, men et større luftstrømmen er nødvendig for å tilføre den energi (trykkfallet over aerosolgeneratoren) for å fremstille (forstøve / de-agglomerat) aerosolen. - Når alle dyr blir lastet inn i eksponeringsenhet, slå på vakuumprøvepumpene som er forbundet med den absolutte filter og kaskadestøter anvendelse av fremgangsmåten kontrollprogramvare.
- Når alle eksponeringer er ferdig, dreies fra aerosol-generatoren, og fjerne gjenværende mus fra innåndingsenhet.
MERK: Dyr vil bli håndtert på en endring stasjon hette eller av personell iført en ansiktsmaske. Etter avslutningen av aerosoltilførselen mus er removed fra rørene, og rørene er desinfiseres etter bruk.
4. Beregning av den avsatte dose
- For å beregne den avsatte dose er 29 i ug / kg (ligning 1) multiplisere konsentrasjonen av medikamentet i den aerosol (ug / l) x minutt ventilasjon (l / min) x varighet av eksponering (min) x inhalerbar fraksjon x pulmonar avsetning fraksjon og dividere kroppsvekten (kg).
- Beregn aerosol konsentrasjon (ug / l) ved å dividere massen av stoffet på det absolutte filter (ug) ved den luftstrømningshastighet gjennom filteret (l / min) multiplisert med samplingstiden (min). Beregn musens minutters ventilasjon med en allometrisk ligning basert på kroppsvekt 30. Den inhalerbar del er en som aerosol ble ført gjennom en pre-separator for å fjerne ikke-respirerbare partikler, og den pulmonare avsetning fraksjon bestemmes fra den legemiddelaero MMAD (figur 3) ved hjelpeksperimentelle kalibreringskurvene fra monodisperse aerosoler (figur 4) 31.
Representative Results
Bronkodilatoren ipratropium bromid ble oppløst i 0,9% normal saltoppløsning ved en konsentrasjon på 1 mg / ml. En 100 ml sprøyte ble fylt med den ipratropium formuleringen løsning, og sprøyten ble satt inn i en sprøytepumpe innstilt for å mate stråleforstøver (figur 1) ved en strømningshastighet på 1 ml / min. Aktivering av styresystemet for innåndingsenhet setter i gang en 10 l / min luftstrømmen til jetforstøver, 5 l / min fortynning luftstrømmen til fortynningskammeret, og 15,5 l / min av vakuum luftstrøm for å trekke stoffet aerosol ut av innåndingsenhet når den passerer nesen av musene. Sprøytepumpen og sanntids aerosol overvåke prøvepumpen ble aktivert. Tjue-fire mus ble satt inn i innåndingsenhet etter at den virkelige tid aerosol monitor bekrefter aerosolkonsentrasjonen i innåndingsenhet var kommet til likevekt (15-30 min, figur 2). Prøven pumper for den absolutte filter (1 l / min) og kaskadeAnslags (0,5 l / min) ble skrudd på en gang alle musene var koblet til innåndingsenhet. Den første gruppe på 8 mus ble fjernet fra innåndingsenhet etter 5 min, den andre gruppen etter 15 min, og den tredje gruppen etter 45 min. Bronkokonstriksjon 32 ble målt som økningen i luftveiene motstand (RR) til en enkelt forstøvet dose av metakolin (30 mg / ml) levert 2 timer etter dosering ipratropium bruk av gnagerrespirator 33. Den prosentvise økning i Rrs for hvert dyr, beregnet som den maksimale Rrs over 3-minutters intervall etter forstøvet metakolin (Rmax) minus Rrs verdien av referansemålingen før metakolin (Rbase) dividert med Rbase (% økning i Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), ble anvendt for å kvantifisere den bronkokonstriksjon.
Den aerosol avsatt på kaskadestøter filtre og absoluttfilter i løpet av 45 minutter av aerosoleksponeringen ble oppløst i50% acetonitril og massen av ipratropium kvantifisert ved hjelp av HPLC (Tabell 1). MMAD-verdien x / GSD av ipratropium aerosol ble beregnet å være 1,7 x / 1,5 mikrometer (figur 3) og en avsetning fraksjon (DF) fra 0,037 til mus ble anvendt for en aerosolbeholder med en MMAD på 1,7 um (figur 4). Den inhalerbar del (IF) var 1 som aerosol ble ført gjennom en pre-separator for å fjerne ikke-respirerbare partikler. Gjennomsnittlig konsentrasjon av ipratropium i aerosolen (0,5 ug / l) ble beregnet fra masse av ipratropium av det absolutte filter (22 ug) dividert med strømningshastigheten for luften som trekkes gjennom filteret (1 l / min) multiplisert med samplingstiden (45 min). Den gjennomsnittlige kroppsvekten til musene var 0,019 kg og deres forutsagte minutters ventilering ble beregnet som 0,021 l / min. Ved å bruke ligning 1, de avsatte doser for den 5, 15 og 45 minutters eksponering gruppene var henholdsvis 0,1, 0,3 og 0,9 ug / kg; henholdsvis.
= "En"> ipratropium hemmet forstøvet metacholin-indusert bronkokonstriksjon i 8 uker gamle C57Bl / 6-mus. Metacholin økt Rrs løpet av sekunder etter forstøvet administrering (figur 5, øvre panel). RRS i kontrollgruppen (som er utsatt for romluften i stedet for ipratropium aerosol) økte fra en utgangsverdi på 0,62 ± 0,03 CMH 2 O * s / mL til en maksimalverdi på 1,66 ± 0,12 CMH 2 O * s / mL, som representerer en 168 ± 9% økning i Rrs, 70 s etter metakolin aerosoladministrering. Den prosentvise økningen i luftveiene resistens ble inhibert på en doseavhengig måte ved inhalert doser av ipratropium. Den prosentvise økning i Rrs ble inhibert med 51 ± 9%, 79 ± 14%, og 89 ± 2% (figur 5, nedre panel) ved inhalert avsatte doser på ipratropium på 0,1, 0,3 og 0,9 ug / kg, henholdsvis.
g"/>
Figur 1: Inhalering enhet med pulver aerosolgenerator festet. Den forstøver som brukes til å danne aerosol av væsketilberedninger er vist til høyre. 1) Wright Dust Feed-, 2) syklonen, 3) sprøytepumpe, 4) jetforstøver innsatt i forutskiller, 5) fortynning luftblander. Ved levering av forstøvede aerosoler, er det støv mate og syklonen erstattet av sprøytepumpen, jetforstøver / pre-separator, og fortynning luftblander. Den forstørret riss (modifisert fra Oldham 21) viser den aerosol-strømningsbanen ved pustesonen rundt dyrets nese som er skapt ved å sette den tilbakeholdende røret i innåndingsenhet. Aerosolen fyller den sentrale aerosol (grå) plenum av innåndingsenhet, strømmer ut til dyrets nese, hvor det er trukket tilbake av et svakt vakuum i den ytre (hvit) plenum og inn i avfallssamlingsfilter (ikke vist). Pllette klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sanntid aerosol monitor målinger bekrefter aerosolkonsentrasjonen i innåndingsenhet når likevekt ~ 30 minutter etter å ha slått på den aerosol-generatoren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ipratropium masse samles på hvert trinn i kaskadestøter (blå graf) overlappet med kurvetilpasning (svart kurve) som brukes til å beregne MMAD og GSD av aerosolen partikkelstørrelsesfordeling. Vær så snillKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Avsetning fraksjon for muselunger som en funksjon av MMAD-verdien for aerosoler levert av nese-inhalering bare (som modifisert fra Hsieh 31). For partikkelstørrelser mindre enn 0,5 um meste av aerosolen pustes ut og ikke avsetter seg i lungene (som sigarettrøyk). For partikkelstørrelser som er større enn 5 um, blir det meste av aerosolen filtrert ut av nesen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Den raske økningen i luftveiene motstand indusert av metakolin forstøvet administerød til mus er blokkert av ipratropium levert av nese-inhalering bare til mus (n = 8 per gruppe, øvre panel). Ipratropium hemmet metacholin-indusert økning i luftveiene motstand med en ED50 på 0,1 pg / kg avsatte dose (* p <0,05 vs. kontroll, nedre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kaskadestøter data til å beregne MMAD og GSD | ||
| Stage Filter | Ipratropium på filter ved hjelp av HPLC (mg) | Stage Cut Diameter (mm) |
| 1 | 0,002 | 6 |
| 2 | 0,19 | 4.5 |
| 3 | 1,43 | 2.5 |
| 4 | 2,55 | 1.5 |
| 5 | 2,95 | 1.2 |
| 6 | 1,03 | 0.7 |
| 7 | 0,37 | 0.5 |
Tabell 1: kaskadestøter data til å beregne MMAD og GSD
Discussion
En nese-inhalering bare anlegg og drift, for å levere farmasøytiske aerosoler til lungene hos gnagere er blitt beskrevet. Begrensende dyr i nese-bare holdere er en vanlig brukt metode for å utsette dyrene for luftbåret materiale. Et eksperiment ble utført for å demonstrere den antikolinerge bronkodilator ipratropiumbromid 34 kan potent reversere metacholin-indusert bronkokonstriksjon ved levering av nese-inhalering bare til mus med en ED50 på 0,1 pg / kg avsatte dose. En større enn 10 gangers økning i effektiv dose av ipratropium var nødvendig for bronkodilatasjon følgende intratrakeal levering (ED 50 intratrakeal = 1,3 ug / kg, data ikke vist) levering. Dette er på grunn av ikke-homogen avsetting mønster av medikament i lungene som produseres ved intratrakeal doserings 3, 5, 10. 10 ganger og mer effektiv doseforskjeller mellom inhalerte og intratrakeale doserings teknikker for andre narkotiske stoffer er blitt observert tidligere av andre 4.
Den ikke-homogene avsetningsmønsteret av medikament i lungene som produseres ved intratrakeal dosering bremser også absorpsjonen av lungen 35, redusere den hastighet ved hvilken medikamentet går inn i den systemiske sirkulasjon og redusere sjansene for å se systemiske bivirkninger. Derfor, for å optimalisere sikkerhet / effektivitet (terapeutisk indeks) 36 av nye inhalerte medikamenter, bør nese-inhalering bare levering benyttes. Intratracheal avsetning vil gi en unøyaktig estimat av TI ved å generere feilaktig høye effektive doser i lungen og lave doser til den systemiske sirkulasjon.
Som leveres av inhalasjon nye legemidler er utviklet, er det viktig å riktig sette effektive medikamentdosen fra prekliniske effektstudiene for å forutsi en efficacious human dose for kliniske studier. Den beryktede død Tusko elefanten 37 er ofte sitert i litteraturen for å minne oss å bruke allometrisk skalering å forutsi interlegemiddeldoser og at interlegemiddeldoser bør ikke lineært ekstrapolert på grunnlag av en enkel sammenligning av kroppens massene. Det er vanlig å bruke en allometriske tilnærming med en allometriske eksponent b fra 0,67 til å forutsi human medikamentdoser fra preklinisk effektivitetsstudier 38. Ved å bruke musen inhalert ED90 på 0,9 ug / kg for ipratropium, en allometriske eksponent på 0,67, en mus kroppsvekt på 0,03 kg, og en menneskekropp masse på 60 kg; anslagsvis humant ED 90 på 0,07 mikrogram / kg ((0,9 * (0,03 / 60) (1-0,67) = 0,07) kan bli beregnet som den antatte humane avsatte dose fra våre mus data. Denne forutsagte verdi er sammenlignbar med den faktiske humane virksom avsatte dose på 0,26 ug / kg, som kan beregnes fra den leverte gjørese av 40 ug 39 dividert med det menneskelige legeme masse på 60 kg multiplisert med en human oral inhalering lungeavsetning fraksjon 16 fra 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Et estimat av det effektive humane inhalert avsatte dose bidrar også til å planlegge de leverte doser som er brukt i inhalering toksisitetsstudier som er nødvendig for kliniske forsøk 40.
Den spesialutstyr og store mengder av testforbindelse (gram-mengder) som kreves for nese-bare inhalert legemiddelavlevering kan være betydelige begrensninger ved utviklingen av nese-inhalering eneste teknikk. En kalibrerings løpe uten dyr som er tilstede er nødvendig hvis en spesifikk dose er nødvendig for en (vanligvis toksikologi og ikke en effekt dose / respons) studien, og denne kalibrerings løp vil kreve ytterligere legemiddel for å være tilgjengelig. Denne kalibreringen løp er nødvendig fordi de fysikalsk-kjemiske egenskaper av hvert legemiddel / preparat kan variere nok til i stor grad påvirke den avsatte doseav medikament i lungene. Optimalisering av luft og medikament-tilførselshastigheter til aerosolgeneratoren under kalibrerings løp er nødvendig for å oppnå en aerosol partikkelstørrelse og konsentrasjon for den spesifikke dose som er nødvendig. Mens aerosolgeneratoren luft og medikament-tilførselshastigheter foreslått i fremgangsmåtene er et rimelig utgangspunkt, er det potensial som for en spesifikk medikamentformulering en ikke-respirerbar (partikkelstørrelse> 5 mm) aerosol vil bli generert. På preklinisk stadium, er det ofte ikke nok stoff tilgjengelig for å gjøre en kalibrering drevet, og det er umulig å vite a priori hvilke doser (hvis noen) får inn i lungene. Dessuten er statisk elektrisitet produsert i løpet av den aerosol-genereringsprosessen, og kan påvirke den tid som kreves for aerosolkonsentrasjonen å komme i likevekt. Det er viktig å riktig jorde utstyr for å minimere statisk elektrisitet. Et annet alternativ for å redusere statisk elektrisitet, er å legge til fuktighet til luften som tilføres innåndingsenhet, for å øke ledningsevnen ogavlede elektrostatiske ladninger på partiklene 25. Fukting av luften som leveres til aerosolgeneratoren er ikke nødvendig for dyr komfort under kort (<1 h) doseringssesjoner men bør overveies dersom lengre doseringstider anvendes.
Medikamenter kan tilføres til lungene av dyrene ved passiv nese-inhalering eller bare direkte intratrakeale administreringsmetodene som omgår nasofaryngealt deponering. Nese-inhalering bare levering er vanligvis brukes på området for innånding toksikologi 41, men er sparsomt anvendt tidlig i drug discovery prosessen. Et tverrfaglig forskerteam er nødvendig for å gjennomføre nese-bare inhalasjonsstudier på grunn av: behovet for store mengder av stoffet, spesialisert kunnskap som kreves for å formulere, generere og karakter aerosoler; operere komplisert utstyr, og måling av legemidlets effekt i dyremodeller av luftveissykdom. Leverings teknikker som er beskrevet her, blir brukt til å utvikle small molekyl inhalerte medikamenter, men i fremtiden kan anvendes for å utvikle inhalerte biologiske 42, 43. Forhåpentligvis de prosedyrer og tips dokumentert i dette manuskriptet vil lette nye pre-kliniske drug discovery og toksikologi forskere til å erverve den kompetansen som trengs for å levere narkotika til gnagere av aerosol innånding.
Disclosures
Alle forfattere ansatt av Amgen. Publiserings avgifter for denne video-artikkelen er betalt av Amgen.
Acknowledgments
Vi erkjenner: Dr. Thomas Budiman på TSE Systems GmbH for sin tekniske kompetanse og utstyr tilpasning. John Fry (Battelle Inc.) og Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) for sine nyttige diskusjoner. Tian Wu, Sam Mboggo april Miller, og Sean Davis (Amgen) for å få hjelp med forsøkene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
| DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
| MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
| Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
| Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
| Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
| Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
| Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
| Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
| Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
| flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |
References
- Chapman, R. W., et al. Pharmacology of a potent and selective inhibitor of PDE4 for inhaled administration. Eur J Pharmacol. 643 (2-3), 274-281 (2010).
- Phillips, J. E., et al. Btk inhibitor RN983 delivered by dry powder nose-only aerosol inhalation inhibits bronchoconstriction and pulmonary inflammation in the ovalbumin allergic mouse model of asthma. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 29 (3), 233-241 (2016).
- Zecchi, R., et al. Impact of drug administration route on drug delivery and distribution into the lung: an imaging mass spectrometry approach. Eur J Mass Spectrom. 19 (6), 475-482 (2013).
- Cooper, A. E., Ferguson, D., Grime, K. Optimisation of DMPK by the inhaled route: challenges and approaches. Curr Drug Metab. 13 (4), 457-473 (2012).
- Leong, B. K., Coombs, J. K., Sabaitis, C. P., Rop, D. A., Aaron, C. S. Quantitative morphometric analysis of pulmonary deposition of aerosol particles inhaled via intratracheal nebulization, intratracheal instillation or nose-only inhalation in rats. J Appl Toxicol. 18 (2), 149-160 (1998).
- Pauluhn, J. Overview of inhalation exposure techniques: strengths and weaknesses. Exp Toxicol Pathol. 57 Suppl 1, 111-128 (2005).
- Wong, B. A. Inhalation exposure systems: design, methods and operation. Toxicol Pathol. 35 (1), 3-14 (2007).
- Phalen, R. F. Inhalation Studies Foundations and Techniques. , 2nd, Informa Healthcare. (2009).
- Siddiqui, S., et al. Pulmonary eosinophilia correlates with allergen deposition to the lower respiratory tract in a mouse model of asthma. Clin Exp Allergy. 38 (8), 1381-1390 (2008).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route. Eur J Pharm Biopharm. 61 (3), 214-218 (2005).
- Morello, M., et al. Dry-powder pulmonary insufflation in the mouse for application to vaccine or drug studies. Tuberculosis (Edinb). 89 (5), 371-377 (2009).
- Guillon, A., et al. Pulmonary delivery of dry powders to rats: tolerability limits of an intra-tracheal administration model. Int J Pharm. 434 (1-2), 481-487 (2012).
- Pauluhn, J., Mohr, U. Inhalation studies in laboratory animals--current concepts and alternatives. Toxicol Pathol. 28 (5), 734-753 (2000).
- Snipes, M. B., McClellan, R. O., Mauderly, J. L., Wolff, R. K. Retention patterns for inhaled particles in the lung: Comparisons between laboratory animals and humans for chronic exposures. Health Phys. 57 (Sup 1), 69-78 (1989).
- Wright, B. M. A new dust-feed mechanism. J Sci Inst. 27, 12-15 (1950).
- Scheuch, G., Siekmeier, R. Novel approaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides. J Physiol Pharmacol. 58 Suppl 5 (Pt 2), 615-625 (2007).
- Phillips, J. E., Ji, L., Rivelli, M. A., Chapman, R. W., Corboz, M. R. Three-dimensional analysis of rodent paranasal sinus cavities from X-ray computed tomography (CT) scans. Can J Vet Res. 73 (3), 205-211 (2009).
- Wolff, R. K. Toxicology studies for inhaled and nasal delivery. Mol Pharm. , (2015).
- Oldham, M. J., Phalen, R. F., Budiman, T. Comparison of predicted and experimentally measured aerosol deposition efficiency in BALB/c mice in a new nose-only exposure system. Aerosol Sci Technol. 43 (10), 970-977 (2009).
- Cannon, W. C., Blanton, E. F., McDonald, K. E. The flow-past chamber: an improved nose-only exposure system for rodents. Am Ind Hyg Assoc J. 44 (12), 923-928 (1983).
- Narciso, S. P., Nadziejko, E., Chen, L. C., Gordon, T., Nadziejko, C. Adaptation to stress induced by restraining rats and mice in nose-only inhalation holders. Inhal Toxicol. 15 (11), 1133-1143 (2003).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Zeng, X., Martin, G., Marriott, C. Particulate Interactions in Dry Powder Formulations for Inhalation. , Taylor & Francis. (2001).
- O'Riordan, T. G. Formulations and nebulizer performance. Respir Care. 47 (11), 1305-1313 (2002).
- Pilcer, G., Amighi, K. Formulation strategy and use of excipients in pulmonary drug delivery. Int J Pharm. 392 (1-2), 1-19 (2010).
- Mercer, T. T., Tillery, M. I., Newton, G. J. A multi-stage, low flow rate cascade impactor. J. Aerosol Sci. 1 (1), 9-15 (1970).
- Forbes, B., et al. Challenges in inhaled product development and opportunities for open innovation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (1-2), 69-87 (2011).
- Alexander, D. J., et al. Association of inhalation toxicologists (AIT) working party recommendation for standard delivered dose calculation and expression in non-clinical aerosol inhalation toxicology studies with pharmaceuticals. Inhal Toxicol. 20 (13), 1179-1189 (2008).
- Hsieh, T. H., Yu, C. P., Oberdorster, G. Deposition and clearance models of Ni compounds in the mouse lung and comparisons with the rat models. Aerosol Sci Technol. 31 (5), 358-372 (1999).
- Phillips, J. E., et al. House dust mite models: will they translate clinically as a superior model of asthma. J Allergy Clin Immunol. 132 (1), 242-244 (2013).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. JoVE. (75), e50172 (2013).
- Storms, W. W., DoPico, G. A., Reed, C. E. Aerosol Sch 1000. An anticholinergic bronchodilator. Am Rev Respir Dis. 111 (4), 419-422 (1975).
- Schanker, L. S., Mitchell, E. W., Brown, R. A. Jr Species comparison of drug absorption from the lung after aerosol inhalation or intratracheal injection. Drug Metab Dispos. 14 (1), 79-88 (1986).
- Biju, P., et al. Steroidal C-21 mercapto derivatives as dissociated steroids: discovery of an inhaled dissociated steroid. Bioorg Med Chem Lett. 21 (21), 6343-6347 (2011).
- West, L. J., Pierce, C. M., Thomas, W. D. Lysergic acid diethylamide: Its effects on a male asiatic elephant. Science. 138 (3545), 1100-1103 (1962).
- Boxenbaum, H., DiLea, C. First-time-in-human dose selection: allometric thoughts and perspectives. J Clin Pharmacol. 35 (10), 957-966 (1995).
- Spina, D. Current and novel bronchodilators in respiratory disease. Curr Opin Pulm Med. 20 (1), 73-86 (2014).
- Degeorge, J. J., et al. Considerations for toxicology studies of respiratory drug products. Regul.Toxicol.Pharmacol. 25 (2), 189-193 (1997).
- McClellan, R. O., Henderson, R. F. Concepts in Inhalation Toxicology. , Taylor & Francis Group. (1989).
- Patton, J. S., et al. The particle has landed--characterizing the fate of inhaled pharmaceuticals. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 23 Suppl 2, S71-S87 (2010).
- Depreter, F., Pilcer, G., Amighi, K. Inhaled proteins: Challenges and perspectives. Int J Pharm. 447 (1-2), 251-280 (2013).
