Summary
여기, 우리는 침략 행위를 조사하고 각각 인간의 유방암 세포의 intravasation 및 혈관 외 유출 가능성을 평가하기 위해, 두 개의 서로 다른 주사 부위, 즉, 난황 주위 공간과 퀴비에의 덕트를 사용하여 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 설명합니다.
Abstract
대부분의 경우, 암 환자는 오히려 때문에 전이, 차 종양으로 사망하지 않습니다. 수많은 설치류 모델은 생체 내에서 암 전이를 공부 할 수 있지만, 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 변경 또는 약리 화합물의 잠재적 인 효과에 액세스하는 데 필요합니다. 따라서, 우리는 설명하고이 목표를 지원하기 위해 제브라 피쉬 배아에 주입 인간의 유방암 세포를 이용한 이종 이식 모델의 타당성을 설명합니다. 현미경, 형광 단백질 또는 화학적 표지 된 인간 유방암 세포를 형질 전환 지브라 피쉬 수정란에 이식되고, Tg는 (FLI : EGFP), 48 시간 수정 후의 난황 주위 공간 또는 퀴비에 (독)의 덕트로. 그 직후, 살아있는 물고기의 몸에 암 세포 침공, 보급 및 전이의 시간적 공간적 과정은 형광 현미경으로 시각화됩니다. 즉, 서로 다른 주사 부위를 사용하여 모델, 당ivitelline 공간 또는 문서는 초기 (intravasation 공정) 및 후기 이벤트 전이성 다단계 캐스케이드 (넘쳐 공정)을 반영하여 서로 상호 보완 적이다. 또한 peritumoral 및 종양 혈관 신생 난황 주위 공간으로 주입하여 관찰 할 수있다. 전체 실험 기간은 더 이상 팔일 이상 없습니다. 이 두 모델은 유전 및 약리 조작에 대한 응답으로 암 전이의 신속한 평가를 가능하게 셀 라벨, 마이크로 이식, 형광 이미징 기술을 결합한다.
Introduction
병원에서 명백한 암 전이는 "전이성 폭포"로 알려진 복잡하고 여러 단계의 일련의 사건을 포함한다. 캐스케이드는 광범위하게 검토하고 연속적인 단계로 해부 할 수 있습니다 : 지역 침공, intravasation, 보급, 체포, 넘쳐, 그리고 식민 1, 2. 암 전이의 기전 및 생체 내에서 잠재적 인 치료 전략의 개발의 더 나은 이해는 암 세포 확산의 강력한 호스트 모델을 필요로한다. 설치류 모델은 잘 확립되어 널리 전이 3을 평가하는 데 사용되지만, 이러한 접근 방식은 낮은 효율성과 윤리적 한계를 가지고 특정 조작이 전이성 표현형에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위해 최전선 모델로 비용이 많이 든다. 다른 효율, 신뢰성, 저가의 모델은 신속하게 (에피) 유전 적 변화 나 pharmacolog의 잠재적 영향에 액세스하는 데 필요한iCal의 화합물. 때문에 높은 유전 적 인간 상동과 배아의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))의 투명성에 중요한 척추 모델로 등장하고 점점 발달 과정, 미생물 - 호스트 상호 작용, 인간의 질병, 약물 검사 등의 연구에 적용되고 . 사. 제브라 피쉬 년에 설립 된 암 전이 모델은 설치류 모델 5, 6의 단점에 대한 답변을 제공 할 수 있습니다.
자연 종양이 거의 야생 제브라 피쉬 7에서 본 적이 있지만, 제브라 피쉬에서 원하는 암을 유발하는 여러 가지의 오랜 기술이있다. 발암 성 물질에 의한 유전자 돌연변이 또는 신호 전달 경로의 활성화는 조직 학적 및 분자 모델 발암, 제브라 피쉬 7, 8, 9, 인간의 질병을 모방 할 수 있습니다. 탁으로암 유전자 또는 종양 억제 유전자 조작을 앞으로 다양한 활용을 보내고 및 역방향 (유전자 변형) 제브라 피쉬는 암의 형성과 유지 보수 (6), (10)의 잠재적 인 연구를 활성화. 제브라 피쉬 유도 암 모델 소화, 생식, 혈액, 신경계, 6 상피 세포를 포함하는 광범위한 스펙트럼을 커버한다.
암 연구에 제브라 피쉬의 사용으로 인해이 유기체 인간 종양 세포의 이종 이식 모델의 설립에 최근에 확장했다. 이 작업은 처음 성공적으로 2005 (11)의 포배 단계에서 제브라 피쉬 배아에 접목 된 인간의 전이성 흑색 종 세포로보고되었다. 여러 독립적 인 실험실은 다양한 사이트 및 발달 단계에서 제브라 피쉬으로 포유 동물의 암 세포 라인의 다양한 범위를 도입하여이 선구적인 작업의 타당성을 검증 한 5 </ SUP>. 예를 들어, 상기 blastodisc 포배 단계의 배반포 근처 주사; 5 일 된 배아 난황낭, 난황 주위 공간 퀴비에 (독)의 덕트, 6-H-의 후방 기수 정맥 주사; 30 일된 면역 애벌레의 복강에 주사 12 5 수행되었다. 또한, 동종 종양 이식은 제브라 피쉬 (12), (13)에보고되었다. 이종 이식을 사용의 가장 큰 장점 중 하나는 접목 암 세포가 쉽게 형광 표지와 정상 세포를 구별 할 수 있다는 것입니다. 따라서, 14 microtumor 형성 세포 침윤 및 전이 15, 16, 17, 종양 - 유도 된 혈관 형성 (15), (1)의 동적 거동에 조사8, 암 세포와 호스트 사이의 상호 작용은 형질 전환 제브라 피쉬 라인 5를 적용 특히, 17 분명히 활어 몸으로 시각화 할 수 있습니다 요인.
문서 주사 (16)을 통해 제브라 피쉬 배아 : 전이를 평가하기 위해 제브라 피쉬 이종 이식 모델의 높은 잠재력에 의해 영감을, 우리의 Tg (EGFP FLI)의 tailfin 영역에 다른 유방암 세포 라인의 transvascular 혈관 외 유출 특성을 보여 주었다. 성장 인자 β (TGF-β) (16)과 뼈 형태 형성 단백질 변형의 역할은 (BMP)을 / 프로 안티 - 유방암 세포 침윤과 전이 19 신호 전달 경로도이 모델에서 조사 하였다. 또한, 우리는 또한 난황 주위 공간 주사와 이종 이식 제브라 피쉬 모델을 사용하여 혈액 순환에 다양한 유방암 세포주의 intravasation 능력을 효과적으로 요약.
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Protocol
유전자 변형 형광 제브라 피쉬의 Tg (FLI : EGFP)를 사용하여 모든 연구 녹색 형광 단백질을 강화했다 변형을, (EGFP)의 국제 지침에 따라 수행하고, 주택 및 실험을 포함하여, 혈관 (20) - 표지 및 지역 기관위원회에 의해 승인되었다 라이덴 대학 의료 센터의 동물 복지 (Dier Ethische Commissie (DEC)합니다.
주 : 배아 컬렉션 (도 1A), 미세 주입 (도 1b), 선별 (도 1C), 및 분석 (도 1D)도 1에 요약 된 바와 같이, 프로토콜은 크게 다음 4 단계로 세분화된다.
1. 주사 바늘을 준비
- 붕규산 유리 마이크로 캐 필러 리와 주사 바늘을 준비한다. 다음 설정을 마이크로 피펫 풀러 장치에 마이크로 모세관 입력 : 기압, 500; 열 (650); 100 당겨; 속도, 200; 시각,그들이 주입에 사용 될 때까지 40 바늘 홀더 플레이트에 주사 바늘을 유지합니다.
2. 주입을위한 형광, 유전자 레이블이 유방암 세포를 준비
- L 글루타민, 10 % 소 태아 혈청 및 1을 포함하는 DMEM - 고 글루코스 배지에서 37 ° C에서 배양 인간 유방암 MDA-MB-231 세포 100 페니실린 스트렙토 마이신 (펜 연쇄상 구균).
- 배양 5 % 말 혈청, 20 ng / ml의 상피 세포 성장 인자, 10 ㎎ / ㎖와 L- 글루타민을 함유하는 DMEM / F12 배지에서 37 ° C에서 유방 상피 세포주 MCF10A (M1) 및 MCF10A-RAS (M2), 인슐린 100 NG / ㎖ 콜레라 독소, 0.5 ㎎ / ㎖의 하이드로 코르티손, 1 : 100 펜 연쇄상.
- 공동 형질 HEK293T 세포로 PLV-mCherry,을 pCMV-VSVG 21 pMDLg-RRE (개그 / 폴) (22), 및 REV pRSV-22 플라스미드로 mCherry의 렌티 바이러스를 생산한다. 수확 된 세포 상등액 -80 ° C에서 형질 저장 후 48 시간.
- 나는5 NG / ㎖의 폴리 브렌의 존재하에 정상 배지로 1 : nfect 렌티 바이러스 상등액 24 시간 동안 30 % 합류에 MDA-MB-231, M1, M2 및 셀 (1) 희석 하였다.
- mCherry 안정 발현 세포주를 취득 할 때까지 격리 세포 클론의 생장을 허용하는 96 웰 플레이트에 세포를 희석하여 단일 세포 클론을 선택한다.
- 주입을위한 세포 배양 한 T75 플라스크. 0.5 % 트립신 EDTA 처리와 80 % 합류에 세포를 수확. 1X PBS 2-3 시간으로 세포를 씻으십시오.
- PBS의 약 200 μL의 세포를 다시 일시 중지합니다. 분사 이전보다 5 시간 동안 그들 4 ° C에서 보관.
3. 주입을위한 Zebrafish의 배아를 준비
- 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정하고 로젠 등으로 이전 조브 기사에서와 같이 배아를 수집합니다. (23).
- 미 수정 및 비정상적인 배아를 제거하여 0-4 HPF에있는 배아를 선택합니다. 페트리 창피에서 배아를 유지계란 물 (60 ㎍ / mL의 바다 염 ~ 60 개 배아 / 접시)의 전체 시간 및 28 ° C에서 품어.
- 48 HPF에서 미세 핀셋으로 배아를 Dechorionate.
- 40 ㎍ / ㎖의에 tricaine (3- 아미노 벤조산) 약 2 분간 주입하기 전에, 그러나 더 이상 주입 2 시간 전에보다 달걀 물을 함유로 전송하여 배아 마취.
참고 Tricaine 원액 (4 ㎎ / ㎖, 100X) 7.4 pH를 가진 이중 증류수 97.9 ㎖의 1 M 트리스 -베이스 (PH 9) 2.1 mL에 tricaine 분말 400mg을 같이 제조된다. -20 ° C 냉장고에 보관.
난황 주위 공간에 4를 주입 인간 유방암 세포
- 주사 바늘로 세포 현탁액 15 μL로드. 미세 조작기에 니들 마운트 5-10 ㎛의 선단 개구 직경을 얻기 위해 미세 핀셋 바늘 끝을 끊는.
- 마이크로 인젝션을 수행하기 위해 공기 picopump과 조작을 사용합니다. Adju세인트는 picopump 400 셀마다 주사한다. 주입 전에, 1 % 아가로 오스를 함유하는 페트리 접시 위에 세포를 주입하여 직접 세포 수를 계산.
- 10 개 배아마다 주위 라인업 마취 배아 평평하고 1 % 아가로 분사 플레이트 (2-3 일 후 수정 (DPF)).
- 바늘 (즉, 대각선 방향) 삽입하기위한 바람직한 위치에서 배아를 배치 주사 중에 손으로 분사 판의 방향.
- 주사 부위에 바늘 끝 포인트 부드럽게 난황 및 지브라 피쉬 배아 (도 2a)의 주피 사이 난황 주위 공간에 바늘 끝을 삽입한다.
- 약 400 mCherry 표지 종양 세포를 주입한다. 난황은 난황에 주입을 방지하기 위해 파열되지 않았는지 확인합니다.
5. 문서로 인간 유방암 세포를 주입
- 난 바와 같이 주사 바늘 및 지브라 피쉬 배아 준비 해당 프로토콜은 1, 2, 3 단계.
- 다큐먼트는 배아의 등쪽에서 접근 할 수 있도록 45 ° 각도로 바늘을 사용한다.
- 다큐먼트 (도 3A)를 기점으로 바늘 단지 덕트 난황 위에 확대 개시 위치로 지느러미, 약 400 세포를 주입 삽입; 덕트 내의 볼륨 펄스 난황 직후 팽창하면 주사가 정확하다.
참고 : 여러 연속 주사는 바늘을 추출하지 않고 수행 할 수 있습니다. - 계란 물에 주입 된 제브라 피쉬 배아를 전송합니다.
참고로 상당한 차이 개별 피쉬 배아간에 존재하고, 주입 후 배아 발생의 죽음으로 (약 100) 지브라 피쉬의 수정란 비교적 다수의 암 세포를 주사한다. - 어류 및 포유류 세포에 대한 최적의 온도 조건을 수용하기 위해 33 ° C에서 피쉬 배아를 유지한다.
- 난황 주위 공간에 주입 2 시간 후 분사 (HPI) (도 2)에서, 형광 실체 현미경을 이용하여 각 물고기 화면 또는 문서 주입 (도 2)에 대한 2-24 HPI에서 배아 모두가 주입되도록 종양 세포의 유사 수. 이러한 파열 (도 2b) 또는 난황 주사 (도 3b)과 같은 주입의 오차와 배아를 제거하고, 주입 된 다음 셀 (도 2C 및도 3b), 또는 상기 (도 2D 및 3B)와 임계 값 배아를 골라. 문화에 약 400 셀 만 배아를 유지합니다.
- 세포가 이미 순환 세포와 배아를 제거하여 주입 과정에서 순환에 직접 도입 가능성을 배제. 또한, 문서에 대한 질량 가까운 셀 (도 2D 어떠한 배아를 제거
7. 이미지와 전이성 프로세스 분석
- 다양한 팁 파스퇴르 피펫으로 여러 마취 배아를 수집하고 폴리스티렌 접시의 유리 바닥에 전송할 수 있습니다.
- 여분의 물을 제거하고 계란 물을 제한된 양을 유지합니다. 모발 루프 도구 위치로 배를 조작하고, 유리의 위에 커버를 배치했다.
- 물에 침수 또는 장거리 건조 목표와 함께 거꾸로 공 초점 현미경을 사용합니다. 관심 영역은 가능한 한 목표에 가깝게되도록 배아를 놓습니다.
- 때문에 액체 증발로 죽음의 위험을 줄이기 위해 마취 후 즉시 이미징을 수행합니다.
- 배아의 동일 위치 EGFP 표지 혈관계 및 mCherry 표지 된 종양 세포에서 캡처 신호 공동 레지스터 개의 영상 채널을 병합하여 혈관과 세포를 주사한다.
- 각 지브라 피쉬 배아를 들어, 이미지의 두 개의 다른 세트를 수집머리 부분과 꼬리 지역.
- 전파 세포의 수를 정량화.
- 난황 주위 공간 주사제, 머리와 꼬리 영역 (4), (15) 내의 어류 배아 체를 향해 균체로부터 전파 한 각 물고기 세포의 수를 계산; 영역은 부레의 등쪽의 위에, 정면 중심 공동의 경계를 넘어, 그리고 비뇨 방구 미부.
- 다큐먼트 충전 용 개별 순환 (MDA-MB-231)에서 tailfin의 콜라겐 섬유가 침입 한 세포 또는 꼬리 조혈 조직 (CHT)의 셀 집합 적 (M2)에 의해 형성된 클러스터의 개수 수를 카운트 각 19 제브라 피쉬.
- 공 초점 현미경을 사용하여 더 자세히 침략과 전이를 공부 (추천).
- 이미지 전체에 낮은 배율 (4X 목표)를 사용하여본체는 종양 세포의 확산 패턴의 개요를 얻고.
참고 : 높은 배율 (20 배와 40 개 배 목표는) 수술 중 사망시에 종양 혈관 신생 및 배아 본문에 전파 세포의 정확한 현지화를 공부하기에 적합하다. - 빨간색 형광 표시 이식 종양 세포를 스캔 제브라 피쉬 배아 혈관과 543 nm의 레이저를 스캔하기 위해 488 nm의 레이저를 사용합니다. 8-10 단계에서 각 배아를 스캔하여 높은 품질의 이미지를 얻습니다. 스캔 및 각 단계를 여섯 번 평균.
- 이미지 전체에 낮은 배율 (4X 목표)를 사용하여본체는 종양 세포의 확산 패턴의 개요를 얻고.
- 이 추가 실험에 필요한 경우 조심스럽게 달걀 물에 다시 배아를 놓습니다.
8. 사후 분석으로 이어 분산 (ANOVA)의 분석을 사용하여 통계 분석을 수행
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Representative Results
난황 주위 공간 분사 배아 제브라 이종 이식 모델에서, 물고기 체내 표지 암세포의 혈행 보급 활성 이동으로 간주된다. 이 과정은 상기 검출 방법에서 설명한 바와 같이 형광 현미경으로 정량화 할 수있다. 이러한 이종 이식 모델을 설명하기 위해 전위 (없거나) 공지의 침입 / 전이가 HRAS 변태 암성 관내 및 양성 정상적인 유방 상피 M1 세포를 비롯한 생체 내 마우스 연구에있어서 서로 다른 유방암 세포주의 보급 과정을 따라 M2 세포 높은 전이성 MDA-MB-231 세포, 이후 일일 포스트 분사 수 (dpi). 고해상도 촛점 현미경 이미지는 MDA-MB-231 세포 (적색) 난황 주위 공간에서의 불규칙한 경계와 공격적인 표현형을 나타내는 것으로 나타났다. Pseudopodia 형 돌기 침습적 정면도 많이 존재 (도 4A, 좌측). 몇몇 세포 (오른쪽,도 4a) 빠르면 1 dpi의 혈액 순환 내로 전파. 2 dpi로 명확 보급 (오른쪽,도 4a) 물고기의 말단 부분에서 관찰되었다. 전파 셀의 개수는 3 dpi의 (도 4a 및도 4d)에 더욱 증가 하였다. M2는 제브라 피쉬 세포에 감염시켰다 때 달리, 이들은 2 dpi의 (도 4B) 후 물고기 본체 적당한 확산을 나타냈다. 시간은 (그림 4 층) 통과 후 그들은 또한 증가 보급을 보여 주었다. 도 4c 및도 4G에 도시 된 바와 같이, M1 세포는 제브라 피쉬 자주 순환에 파종하고, 난황 주위 공간 내의 활성 지역에도 마이그레이션 관찰 기간 동안 빈번했다. 의 M1 세포 질량은 거의 원래의 주사 부위에 구금되었다. 물고기의 몸에> 5 개 세포와 같은 양의 보급이나 전이를 정의하는 경우SS = "외부 참조"> (4), MDA-MB-231 세포 전이 M2 3 dpi로 (도 4G)에서 각각 92 % 및 어류의 57 %에서 관찰되었다. 대조적으로, 어떤 양의 보급은 M1 세포에 의해 관찰되지 않았다. 따라서, 인간의 암 세포의 진행이 제브라 피쉬 모델은 정확하게 마우스에서 다른 세포의 전이 가능성의 상대적 수준을 반영한다. 배아 지브라 피쉬의 subintestinal 신경총에서 발아 및 MDA-MB-231 또는 M2 균체 또한 배양 (도 4a 및도 4b 3 일 뒤에 종양 세포의 난황 주위 공간 주입 후 존재 관통 혈관 신생 (녹색), 왼쪽 ). 보급에 장애 일관 약간만 신생 혈관은 M1 세포 주입 (도 4C)에 따라 검출 하였다.
mCherry 표지 MDA-MB-231 세포와 배아 제브라 이종 이식 모델 및 문서 주입, 실험실제브라 피쉬의 tailfin에 eled 암 세포 활성 혈관 외 유출을 대표하는 것으로 간주됩니다. mCherry 표지 MDA-MB-231 세포는 DPF (2)에 주입 하였다. 3 dpi로, 세포를 콜라겐 농축 된 tailfin에 용기로부터 이전하기 시작했다. 단일 MDA-MB-231 세포는 먼 tailfin (도 5a)에 독립적 용기로부터 하나씩 이주. 6 dpi로 침공은 tailfin 조직으로 이전 셀의 수를 계수함으로써 정량화 될 수있다. mCherry 표지 M2 세포 독 주입 모델에서, 주입은 DPF (2)에서 수행 하였다. 그러나 클러스터 된 표현형은 활성 혈관 외 유출 과정에서 관찰되었다. 1 dpi로, M2 세포는 제브라 피쉬의 CHT로 용기로부터 이전하기 시작했다. 2 dpi로, 이주 M2 세포는 CHT (도 5b)에서 선박 사이의 클러스터를 형성하기 시작했다. CHT 영역의 침습 M2 셀 클러스터 번호의 정량화에서 수행 될 수있다6 dpi로.
그림 1 : 배아 제브라 피쉬의 유방암 세포의 침략 행위를 조사하는 주요 단계. 밤새 부모 지브라 피쉬를 지나면 (A)는, Tg는 (fli1 : EGFP) 지브라 피쉬 배아 다음날 아침을 수집하고, 28 ℃로 유지 하였다. (B)이 배아 실체 48 시간 후 수정 (HPF) 하에서 미세 핀셋 dechorionated 하였다. 표지 된 유방암 세포를 수집하고 PBS의 소량 다시는-중단. 잘 준비 후, 부유 세포는 하나 개의 바늘에로드. 약 400 세포를 실체 현미경 난황 주위 공간 퀴비에 (독)의 관에 주입 하였다. 주입 된 수정란은 33 ℃로 유지 하였다. (C)을 2 시간 포스트 분사 (HPI), 배아는 CA을 실시형광 실체 현미경 검사 reful. 배아 3, 6 일 동안 33 ℃로 유지 하였다. 간격 동안, 배아는 설계 처리했다. 닥 주사에 의한 난황 주위 공간 또는 주입에 의한 침입 (D) 암세포 보급 검출 계산 한 공 초점 현미경 3 6일 포스트 분사 (dpi)로하여 영상화 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 난황 주위 공간에 주입 사이트 및 일반적인 오류. (A) 약 400 mCherry 표지 된 세포 (MDA-MB-231) 난황 주위 공간에 주입 하였다. 분사의 시야 (최상층), 그린 혈관계 (중상) 및 적혈구 질량 (아래쪽 중간)에드 제브라 피쉬 배아는 공 초점 현미경으로 촬영되었다. 세 채널의 합성 화상 (최하층)은 배아의 균체의 스테레오 위치를 나타낸다. (B) 세포는 적절하게 난황 주위 공간을 대상으로하지 않았다. 난황이 파열되었다. (C) 임계 (더 적은 400) 아래에 주입 된 세포를 포함한다. (D) 상기 전지 주조 임계 (더 이상의 400). 균체는 다양한 혈류를 가지고 퀴비에의 덕트에 너무 가깝게했다. 스케일 바는 50 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 퀴비에 (문서) 주입 덕트의 개요. 이후 수정 이일에서 문서 주입 (A) 도식 (d제브라 피쉬 배아에서 유방암 세포와 PF). 화살표는 문서를 나타냅니다. (B) 약 400 유방암 세포의 정 주사의 예; 난황 misinjection 포함한 음극 주사; 세포의 수가 잘못 4 HPI 주입. 화살표와 동그라미가 주입 된 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 다양한 유방암 세포주 중 보급 능력의 비교. 약 400 mCherry 표지 MDA-MB-231, MCF10Aras (M2), 또는 MCF10A (M1) 세포는 제브라 피쉬 배아 48 HPF 난황 주위의 공간에 주입 하였다. 주입 된 배아 3 일 동안 관찰 하였다. (A, B, 및 C) 하이 RESOMDA-MB-231 (A), M2 (B)의 대표 이동 보급 처리를 도시 기술인 것 현미경 및 개별 배아 체 (1, 2)에서의 M1 (C) 세포, 및 포스트 분사 (dpi)로 3일. 왼쪽, 난황 주위 공간 (적색)과 peritumoral 및 종양 내 혈관 (녹색)의 세포 이동. 경고 신호는 미세 혈관 세포의 오버랩을 나타낸다. 중동, 배아의 전체 이미지. 배아의 후방에서 전파 세포의 오른쪽, 시각화. 노란 화살촉 단일 파종 세포를 나타냅니다. 스케일 바는 50 μm의 =. (D, E 및 F) 1, 2, 3의 각 dpi의 배아 체에서 파종 세포 수의 정량. 결과는 SEM ± 평균으로 표현된다. 포스트 혹 분석 하였다 변동 (ANOVA)의 일방 분석 결과를 나타낸다. P <0.05 (통계적으로 의미로 받아 들여졌다 * 0.01 <P <0.05; ** 0.001 <P <0.01; *** P <0.001. (G) 1, 2, 3 dpi 해상도에서 배아 체에서 MDA-MB-231, M2, 및 M1 전지용 intravasation의 빈도의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : 퀴비에 주입 덕트 제브라에서 MDA-MB-231 세포 M2 전이 다른 동작. (A) 제브라 피쉬의 대표적인 공 촛점 이미지는 제브라 피쉬에서 MDA-MB-231 세포의 단일 세포 이동 동작을 표시 3, 4, 5 dpi로 하였다. 화살표는 tailfins로 용기로부터 이전 침습 MDA-MB-231 세포를 나타낸다. 스케일 바 좌항 = 200 μm의 오른쪽 열에서 50㎛의. (B) 주제제브라 피쉬의 촛점 이미지는 제브라 피쉬 M2 셀의 셀 클러스터 마이그레이션 동작을 표시하는 1, 2, 3 dpi로 하였다. 화살표 꼬리 조혈 조직 (CHT)로 용기로부터 이전과 선박 사이의 클러스터 형성 침습 M2 셀을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
난황 주위 공간과 문서와 주사 피쉬 배아 : 여기서는의 Tg (EGFP fli1) 유방암 세포의 침입 문제를 조사하기 위해 두 가지 방법을 설명했다. 형질 전환 지브라 피쉬 배아에 화학 염료 또는 형광 단백질 표지 암세포를 주입하여, 침윤 및 전이의 동적 및 공간 특성이 명확하게 형광 현미경 하에서 단일 셀 또는 클러스터 레벨에서 실시간으로 추적 될 수있다. 대부분의 경우, 제브라 피쉬의 전이의 급속한 진행은 분석이 이식 후 일주 내에서 수행 할 수 있도록합니다. 또한, 강력한 통계는 물고기의 많은 동료를 얻을 수있다.
전이성 캐스케이드의 초기와 후기 이벤트는 시뮬레이션 각각 난황 주위 공간 또는 문서로 암 세포를 주입하여 효과적으로 요약 할 수있다. 난황 주위 공간은여보세요 물고기의 주피 및 난황 사이의 제한된 공간입니다WS 하나는 생체에서 주 사이트에서 단일 종양 세포의 보급을 모니터링 할 수 있습니다. 이식 후 암 세포는 난황 주위 공간 내에서 지역의 마이그레이션 및 침략 (간주 차 사이트)를 거쳐 다음 그들은 혈관에 intravasate 및 순환과 함께 배포. 머리와 tailfin (고려 먼 대상 사이트)에서, 암 세포는 좁은 모세 혈관 침대와 extravasate에 축적. 따라서, 물고기의 몸에서 먼 부위에서 발견되는 세포의 수는 전이성 능력의 측정이다. 또한, 더 extravasated 세포는 또한 문서 주입 분석법 사실 나중 포인트에서 관찰 할 수있다.
닥은 광범위한 혈류 24 확대 공통 기수 정맥이다. 주사 부위가 순환 시스템으로 암세포를 소개로 직접 문서를 대상으로. 실제로, 유방암 세포를 통해 배아 몸 전체에 확산문서 주입 후 즉시 혈류. 세포는 꼬리 정맥 등의 대동맥에서 체포. 혈관 외 유출, 침략, 및 미세 전이 형성 6 일 이내에 연속적으로 관찰 할 수있다. 이전에보고 된 바와 같이 16, 전이성 MDA-MB-231 세포 및 암성 세포 유방 M2 다른 침습성 표현형을 나타낸다. MDA-MB-231 세포는 콜라겐 매트릭스 풍부한 tailfin 단일 세포 침윤을 겪는다. 따라서, MDA-MB-231 세포의 침윤 전위 extravasated 및 tailfin 조직 침입 한 세포의 수를 카운트함으로써 측정 될 수있다. 반면, M2 셀은 다양한 크기의 클러스터를 형성하고, 공동 CHT의 침입을 겪는다. 이 프로토콜에서 클러스터의 수를 계수함으로써 M2 세포의 침윤 잠재 성을 정량화하기 어렵다 바람직 공 초점 현미경을 사용하여 3 차원 화상을 만드는 클러스터링 된 종양 세포의 양을 결정함으로써 수행된다.
암 세포 마이크로의 기술 과제주입 성공적으로 난황 주위 공간 또는 문서를 목표로하고있다. 배아 다수의 미세 주입법은 숙련 작업자 환자를 요구하는 번거로운 절차이다. , 주입 주입 세포 수에서의 차이, 및 난황 세포로의 누설 때 개별 물고기 결과의 변화에 기여하는 인자는 배아의 발달 단계를 포함한다. 드문 있지만, 조작 실수로 혈관에 침투 수 있으며, 특히 난황 주위 공간에 주입에서 직접 순환 시스템에 세포를 소개합니다. 다른 변형을 줄이기 위해 및 분석의 신뢰성을 보장하기 위해, 현미경 검사 프로세스 전반에 걸쳐 시점에 자격이 물고기를 제외하는 것이 필요하다. 또한, 설정에 대한 지식없이 전문가가 분석 눈을 멀게하는 강한 편견 정량화를 달성하는 것이 좋습니다.
요약하면, 우리는 여기에 소개 된이 개 모델은 빛을 흘리다침습성 절차없이 생체 내 세포의 침윤과 전이의 과정을 시각화. 우리는 전이성 잠재력에 대한 두 가지 모델에서 유방암 세포를 연구하지만, 그들은 다른 암으로 추정 할 수있다. 또한, 상기 모델은 메커니즘 (EPI) 유전자 조작을 이용하여 암세포의 전이를 제어하는 새로운 분자 표적을 결정하는 폭 넓은 애플리케이션을 가질 수있다. 인해 급전 또는 설치류 (25)의 주입에 비해 작은 분자 화합물에 의한 피쉬 배아의 높은 투과성을 두 제시된 모델은 새로운 잠재적 항 - 침윤 / 전이 약물의 높은 처리량 스크리닝의 측면에서 장점이있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
TGF-β 가족 구성원에 대한 연구는 암 유전체학 센터 네덜란드에서 지원됩니다. 시지아 리우와 장 르네는 라이덴 대학에서 공부 4 년 동안 중국 장학위원회에 의해 지원됩니다. 우리는 MCF10A 세포 라인 박사 프레드 밀러 (바바라 앤 Karmanos 암 연구소, 디트로이트, MI, USA)을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MP Biomedicals | AGAF0500 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 300038 | |
| Cholera enterotoxin | Calbiochem | 227035 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 STED | |
| DMEM-high glucose media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMEM/F-12 media containing L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 21041025 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11252-20 | |
| Epidermal growth factor | Merck Millipore | 01-107 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16140071 | |
| Fluorescent stereo microscope | Leica | M165 FC | |
| HEK293T cell line | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Hydrocortisone | SigmaAldrich | 227035 | |
| Horse serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Insulin | SigmaAldrich | I-6634 | |
| MCF10A (M1) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MCF10Aras (M2) cell line | Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) | ||
| MDA-MB-231 cell line | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) | Eppendorf | F276456I | |
| pCMV-VSVG plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PLV-mCherry plasmid | Addgene | 36084 | |
| pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Pneumatic picoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Polybrene | SigmaAldrich | 107689 | |
| Prism 4 software | GraphPad Software | ||
| pRSV-REV plasmid | Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) | ||
| Stereo microscope | Leica | MZ16FA | |
| Tg (fli:EGFP) zebrafish strain | Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands) | ||
| Tris-base | SigmaAldrich | 11814273001 | |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid) | SigmaAldrich | A-5040 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher Scientific | 15400054 | |
| Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) | SigmaAldrich | P5481-500EA | |
| Polystyrene dish with glass bottom | WillCo | GWST-5040 |
References
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