Summary
Une procédure pour fabriquer des préparations en face de l'artère carotide et de l'aorte de la souris est décrite. De telles préparations, lorsqu'elles sont colorées par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques, nous permettent d'étudier la localisation des protéines et l'identification des types de cellules dans toute la paroi vasculaire par microscopie confocale.
Abstract
Les sections de tissus intégrés à la paraffine sont habituellement utilisées pour étudier l'histologie tissulaire et l'histopathologie. Cependant, il est difficile de déterminer quelles sont les morphologies tissulaires tridimensionnelles issues de ces sections. En outre, les sections de tissus examinés peuvent ne pas contenir la région dans le tissu qui est nécessaire aux fins de l'étude en cours. Cette dernière limitation entrave les études histopathologiques des vaisseaux sanguins, car les lésions vasculaires se développent de manière focalisée. Cela nécessite une méthode qui nous permet d'examiner une large zone de la paroi des vaisseaux sanguins, de sa surface à des régions plus profondes. Une préparation complète des vaisseaux sanguins répond à cette exigence. Dans cet article, nous allons démontrer comment faire des préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide et les tacher immunofluorescents pour la microscopie confocale et d'autres types d'imagerie à base de fluorescence.
Introduction
Pour les études histopathologiques par microscopie optique, des morceaux tridimensionnels de tissus biologiques sont systématiquement traités pour l'emboîtement de la paraffine, suivis d'une coupe et d'une coloration. Un échantillon de tissu qui a été encastré en paraffine peut être plusieurs millimètres dans les trois dimensions. Cependant, dans le but de la microscopie optique, il faut d'abord sectionner afin que la lumière puisse passer et ensuite tachée afin que la section mince donne suffisamment de contraste pour l'imagerie. Parce que les spécimens sectionnés ont généralement une épaisseur de 5 à 10 μm, on ne voit qu'une très petite fraction de l'échantillon entier en deux dimensions à la fois. Il est possible de collecter des sections séquentielles et, après l'imagerie de chaque section individuellement, effectuer une reconstruction assistée par ordinateur des images 3D, mais il s'agit d'un travail fastidieux en effet. L'histopathologie des vaisseaux sanguins, en particulier pour l'étude de la pathogenèse de l'athérosclérose, présente des problèmes uniques. L'athérosclérose est une maladie focalisée qui se développeLocalement dans les zones où survient le flux sanguin perturbé. En outre, la maladie est initiée dans l'intima, un tissu mince consistant en une monocouche de cellules endothéliales et une matrice extracellulaire, de grandes artères. Pour ces raisons, il est difficile de localiser et d'étudier les lésions précoces en utilisant des vaisseaux sanguins sectionnés car on peut facilement manquer de sectionner la lésion. Même si une section comprend une zone malade, on ne verra qu'une portion de 5 à 10 μm contenant des cellules endothéliales et d'autres cellules de la paroi vasculaire dans les médias et l'adventice.
Les préparations en montage intégral (prononcé än fäs) nous permettent d'examiner une vaste zone de la surface des vaisseaux sanguins, telle que l'aorte entière de la racine aortique jusqu'à l'artère iliaque commune. En utilisant un tel échantillon coloré avec des anticorps spécifiques et d'autres sondes spécifiques, on peut cerner l'emplacement des lésions et aussi où divers événements moléculaires se produisent dans les cellules endothéliales en conjonction avecThétéogenèse telle que les changements dans l'expression, la localisation et les modifications postraductionnelles des protéines. En plus d'étudier l'athérogenèse, la forme de la cellule endothéliale observée dans les préparations en visage est utilisée comme indicateur du taux de flux sanguin dans la moyenne régionale. De telles données sont importantes pour l'étude de la mechanosignaling des cellules endothéliales in situ. À cette fin, les vaisseaux sanguins histologiques systématiques ne sont pas utiles. Ainsi, pour la médecine vasculaire et la biologie, il est particulièrement important d'acquérir une technique pour fabriquer des préparations en face des vaisseaux sanguins qui permet d'observer une grande surface de la surface du vaisseau ainsi que les zones souterraines profondes du vaisseau.
Comme l'ont décrit Jelev et Surchev 1 , les biologistes vasculaires ont développé diverses méthodes pour observer le revêtement des vaisseaux sanguins en face. Des méthodes ingénieuses ont été développées dans les années 1940 et 1950. En utilisant ces méthodes, ils étaient Capable d'étudier l'organisation fondamentale des cellules endothéliales qui bordent la surface interne des vaisseaux sanguins. Cependant, en raison de la façon dont ces préparations en face sont préparées (la soi-disant méthode Hautchen 2 , 3 , 4 ou décollage de la surface du vaisseau 5 ) et la façon dont l'échantillon a été coloré, il n'a pas toujours été possible d'obtenir une morphologie ininterrompue Des informations provenant de la surface du vaisseau dans les zones plus profondes de la paroi des vaisseaux sanguins. La préparation complète des vaisseaux de montage en face combinée à la coloration par immunofluorescence nous a permis non seulement d'étudier la morphologie des cellules endothéliales et l'expression et la localisation des protéines dans ces cellules, mais aussi d'étendre ces études à la région sous-endothéliale de la paroi vasculaire. Les premières études utilisant des préparations de vaisseaux sanguins en visage, des immunodilures colorés ont commencé à apparaître dans les années 1980 6 ,F "> 7. Avec l'avènement de la microscopie confocale à balayage laser et plus récemment la microscopie multiphotonique, on peut maintenant obtenir des images claires et claires de la structure de la paroi des vaisseaux sanguins dans des échantillons de vaisseaux endurcis à l'immunofluorescence ainsi que dans le réseau vasculaire des animaux vivants 8 , 9 , 10 , 11. Ces techniques d'imagerie par ordinateur créent des images en coupe optique focalisées et, en empilant ces images, on peut obtenir des images 3D reconstruites de la paroi du vaisseau et du réseau vasculaire dans les tissus. Peut générer des images d'une section réalisée le long de l'axe Z de l'image reconstruite 12 , 13 .
Dans cet article, nous allons illustrer un procédé pour préparer des préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide pour la coloration immunofluorescente. Préparations de visagePeuvent être réalisés même après que ces navires aient été expérimentalement manipulés. Par exemple, une artère carotide peut être partiellement ligaturée, puis une préparation en face faite après une telle intervention chirurgicale. Pour cette raison, nous décrirons également dans cet article comment on fait une ligature partielle sur l'artère carotide. Par rapport à la fabrication de préparations similaires à partir d'animaux plus grands tels que les rats, les lapins et les humains, les vaisseaux de souris sont de petite taille et plus fragiles, ce qui nécessite des soins supplémentaires pour la manipulation lors de l'isolement chirurgical des vaisseaux et leur préparation pour la coloration et la microscopie des anticorps. Étant donné que le modèle animal le plus couramment utilisé pour la modification génétique est la souris, il devient essentiel pour de nombreux chercheurs de manipuler les vaisseaux de souris sans les endommager. Dans ce manuscrit, nous décrirons comment traiter les vaisseaux sanguins de souris lors de préparations en face de l'aorte de la souris et de l'artère carotide. Aux fins de la démonstration, nous utiliserons des souris de type sauvage C57 / b6.
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Protocol
Les protocoles pour la ligature de la carotide partielle de la souris et l'isolement de l'aorte de la souris et de l'artère carotide pour l'immunocoloration sur le visage sont approuvés par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux (IBT 2014-9231).
1. Ligature de l'artère carotide partielle gauche
- Préparez l'espace chirurgical en plaçant un coussin chauffant de 12 pouces x 14 pouces sur la table et couvrez le coussinet et le dessus de table avec un grand drap chirurgical propre. Réglez le bras du support de la poutre de sorte que le champ de vision du stéréomicroscope se trouve dans la zone centrale du coussin chauffant.
- Allumez le coussin chauffant sur la table et réglez la molette de réglage 3 réglages sur le niveau de chaleur moyen. À ce réglage de la température, la surface du panneau chirurgical (voir 1.6.1) sera de 38 à 40 ° C.
- Placez une cage propre sur un autre coussin chauffant. Tournez le coussin chauffant comme indiqué ci-dessus. Cette cage sera utilisée pour le rétablissement après la chirurgie (voir 1.16) ainsi que le logement.
- Peser une souris. Le poids corporel est nécessaire pour déterminer la quantité appropriée d'analgésie, qui sera administrée immédiatement avant la chirurgie.
- Placez une souris dans la chambre d'induction.
- Allumez le réservoir d'oxygène et le vaporisateur anesthésique afin d'anesthésier la souris dans la chambre d'induction. Maintenir le niveau d'isoflurane à 2%. Il faut 3-5 minutes avant que la souris ne bouge.
- Alors que la souris est anesthée, Placez un petit morceau de drap chirurgical stérile (24 pouces x 24 pouces) sous le stéréomicroscope pour créer une surface chirurgicale. Ensuite, placez un panneau chirurgical acrylique (qui a été nettoyé avec 70% d'alcool) sur la surface drapée. Le panneau chirurgical devrait donc être sur le coussin chauffant mais séparé par deux couches de draps chirurgicaux.
- Lorsque la souris cesse de se déplacer dans la chambre d'induction, transférez la souris dans une zone de préparation pré-chirurgicale et placez son nez dans le cône du nez connecté au vaporisateur (2% d'isoflurane). Retirez les cheveux autour de la zone cervicale à l'aide d'un coupe-coupe électrique ou d'une lotion démaquillante. Nous recommandons la lotion anti-cheveux, car cette méthode ne produira pas de morceaux de cheveux lâches, ce qui est difficile à éliminer complètement de la zone chirurgicale.
- Avec le cône du nez en place, déplacez la souris vers le panneau chirurgical.
- Tapez les pattes avant droite et gauche sur le panneau chirurgical. Tapez les deux pattes arrièreSur le côté droit de la souris. Cela provoque une légère rotation du corps de la souris de sorte que le côté gauche de la zone du cou de la souris devienne mieux positionné pour une opération chirurgicale.
- Désinfectez la zone d'incision avec 70% d'alcool, le frottis chirurgical à la chlorhexidine et à nouveau avec 70% d'alcool. Couvrez la souris avec un drap chirurgical stérilisé, sauf pour la zone d'incision cervicale.
- Confirmez par pincement que la souris est complètement anesthésiée et donne une analgésie (Caprofen 3-5 mg / kg) par injection intraperitoneale ou sous-cutanée.
- Sous le microscope de dissection, faites une incision de la ligne médiane ventrale autour de la zone cervicale en utilisant un scalpel ou des ciseaux d'iris.
REMARQUE: Nous utilisons des ciseaux car la distance de travail du stéréomicroscope est limitée, ce qui rend difficile l'utilisation d'un scalpel. - Exposer l'artère carotide commune gauche (LCCA) en repoussant et en repositionnant les glandes salivaires qui couvrent les vaisseaux sanguins vers le côté gauche de la aNimal.
- Identifiez tous les vaisseaux sanguins dans le champ chirurgical ( figure 1 ). La LCCA se bifurque dans l'artère carotide interne gauche (ICA) et l'artère carotide externe gauche (ECA). L'artère thyroïdienne superficielle (STA) provient de la CEA du côté médian. L'artère occipitale (OA) provient habituellement de la CEA, mais chez certaines souris, elle provient de l'ICA.
- Relier toutes les branches de l'artère à l'exception de l'OA en utilisant une suture de soie stérilisée 6-0. Pour ce faire, effectuez les deux ligatures suivantes.
- Retirez doucement le tissu conjonctif autour et en dessous de l'artère carotide interne gauche (ICA). Prenez un morceau de suture de soie précueuse 6-0 (~ 2,5 cm) avec une pince et passez sous l'artère. En utilisant une autre pince, tirez la suture environ 1/3 de sa longueur et ligotez l'artère.
- Retirez le tissu conjonctif autour de l'artère carotide externe gauche (ECA) de la même manière décrit ci-dessus et faites une ligature proximale à la thyroïde supérieure gaucheD artère (STA) ( Figure 1 ). Veillez à ne pas endommager les fibres nerveuses qui se déroulent dans le champ chirurgical.
- Lorsque ces ligatures ont été faites, renvoyer les glandes salivaires à la position initiale et hydrater le champ chirurgical en plaçant 2-3 gouttes de solution saline stérile. Fermez la peau en utilisant des sutures vicryl revêtues de 6-0.
- Après la chirurgie, placez la souris dans la cage préchauffée (voir 1.2.1). La souris devrait se réveiller dans les 5 minutes et commencer à se promener. Une fois confirmé que la souris se comporte normalement, amener la cage dans la salle de logement des animaux.
- Observez la souris tous les jours pendant les 3 premiers jours de récupération. La souris peut être maintenue aussi longtemps que l'expérience l'exige dans les différentes conditions requises par le protocole expérimental. Les préparations en face peuvent être préparées à tout moment après la chirurgie.
2. In Face Immunostaining
- Éuthaniser une souris avec du CO 2 par surdosage par inhalation.
- Tapez la souris dans une position en position couchée (côté ventre latéral) sur une plaque de dissection.
- Exposer la cavité abdominale en effectuant une incision en ligne médiane à l'aide de ciseaux à l'iris.
- Exposez la cavité thoracique en coupant les côtes latéralement sur le sternum.
- Faire un sillon dans la veine cave ou couper une des artères fémorales pour drainer le sang.
- Insérez une aiguille 26 G attachée à une configuration de perfusion gravitaire (pression d'eau de 120 cm) dans le sommet du ventricule gauche et perfusez le système circulatoire avec une solution saline contenant de l'héparine (40 U / mL). Continuer la perfusion jusqu'à ce que la solution saline qui s'écoule de la coupe devienne claire.
- Mettre le système de perfusion de solution saline dans la solution de fixation contenant 4% de paraformaldéhyde dans du PBS (solution salée tamponnée au phosphate) et continuer à perfuser pendant 5 minutes de plus.
- Récoltez l'aorte et les artères carotides gauche et droite en utilisant des ciseaux et des pinces à extrémités franches et placez-les dans un tube conique de 50 ml contenant le fixateur sur de la glace.
- Transférer chaque récipient séparément dans un puits d'une plaque à 12 puits contenant 0,5 ml d'une solution de perméabilisation (0,1% de Triton X-100 dans du PBS) par puits. Perméabiliser les vaisseaux sanguins pendant 10 minutes avec un basculement à température ambiante (RT).
- Se laver brièvement avec PBS.
- Pour bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques, incuber les vaisseaux sanguins dans 10% de sérum normal à partir des espèces animales dans lesquelles les anticorps secondaires ont été fabriqués, dans TTBS (Tris-buffered saline (TBS) avec 2,5% Tween 20) pendant 30 minutes avec Basculer à la RT.
- Incuber les vaisseaux avec les anticorps primaires dilués de manière appropriée dans TTBS avec 10% de sérum normal (comme décrit ci-dessus) pendant une nuit avec un basculement à 4 ° C. Le niveauDe dilution doit être déterminée pour chaque anticorps.
- Effectuez la coloration de contrôle suivante.
- Incuber les vaisseaux avec TTBS au lieu d'un anticorps primaire suivi d'une incubation avec un anticorps secondaire.
- Incuber les vaisseaux avec TTBS contenant du sérum non immunisé (ou pré-immédiat) ou Ig du même animal (espèce) dans lequel des anticorps primaires ont été réalisés, suivis d'une incubation avec un anticorps secondaire.
- Omettre l'incubation avec un anticorps secondaire. Ces échantillons de contrôle doivent être manipulés de la même manière et en même temps que des colorations avec des anticorps spécifiques sont effectuées.
- Laver les vaisseaux sanguins 3 fois avec TTBS pendant 10 min chacun avec un basculement à la RT.
- Incuber avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence dilués de manière appropriée dans TTBS avec 10% de sérum normal (comme décrit ci-dessus) pendant 1 h avec un basculement à la RT. La coloration nucléaire avec DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) peut être effectuée simultanémentT cette étape en ajoutant 1 / 5.000 en volume d'une solution mère DAPI qui contient 5 mg / mL de DAPI dans H 2 O.
- Laver 3 fois avec TTBS pendant 10 min chacun avec un basculement à la température ambiante.
- Rincer brièvement dans PBS.
- Placez une goutte du réactif anti-décoloration sur un verre de couverture (22 mm x 50 mm) et placez un vaisseau sanguin sur le verre de couverture avec l'endothélium vers le bas.
- Placez un verre coulissant (22 mm x 75 mm) sur le vaisseau sanguin tout en évitant le piégeage des bulles.
- Placez la glissière sur un essoufflement propre au laboratoire ( p. Ex. Kimwipe) et recouvrez la glissière avec deux lingots de laboratoire. Collez doucement 3,5 kg de poids ( p. Ex., Utilisez une bouteille d'eau sur un livre épais) sur la glissière pendant 5 minutes maximum pour aplatir l'échantillon de vaisseaux sanguins en face.
- Retirez le poids et essuyez l'excès de solution autour de la lamelle.
- Appliquer un vernis à ongles aux 4 coins de la lamelle, placer les diapositives dans une boîte à glissière, coulisser vers le haut et garder dans l'obscurité à la RT(Ou 4 ° C) pendant la nuit. Ce processus aplatit davantage le tissu et facilite la microscopie à des grossissements élevés.
- Sceller le couvre-lit complètement à l'aide de vernis à ongles.
- Effectuez une microscopie dès que le vernis à ongles est sec.
- Si nécessaire, rangez les diapositives à -20 ° C.
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Representative Results
Une image d'immunofluorescence typique en face de l'endothélium est illustrée à la figure 3 . Cette image montre une seule section optique d'une aorte de souris prise près de l'ouverture d'une artère intercostale (la grande zone osseuse en forme d'oeuf). L'aorte a été doublement colorée avec une protéine anti-VE-cadhérine (verte) et anti-VCAM-1 (molécule d'adhésion de cellules vasculaires 1) (rouge). Chaque cellule endothéliale est décrite avec une coloration linéaire verte à la jonction adhérente. En raison d'une inégalité mineure de l'échantillon, certaines jonctions adhérentes sont en dehors de cette section optique. La coloration anti-VCAM-1 est plus forte à l'ouverture de l'artère intercostale où le flux sanguin perturbé est connu pour se produire. La figure 4 montre la coloration en face des artères carotides avec anti-VE-cadhérine (vert), anti-VCAM-1 (rouge) et DAPI (violet). L'artère carotide gauche (LCA) a été partiellement ligaturée alors que l'artère carotide droite (RCA) était intacte. Les spécimens des navires ont été fabriqués 1 jour après la Chirurgie et taché. Notez l'augmentation de la coloration anti-VCAM-1 dans le vaisseau ligaturé. Les échantillons colorés immunofluorescents avec différents anticorps peuvent être utilisés pour étudier le niveau d'expression des protéines d'intérêt, l'étendue des modifications post-traductionnelles des protéines cibles et, bien sûr, le mode de localisation de diverses protéines dans les cellules endothéliales ainsi que dans d'autres cellules de la Paroi des vaisseaux sanguins 10 , 11 .
Figure 1 : Anatomie détaillée du navire dans la zone cervicale de la souris. Le réseau vasculaire avant et après la dissection est montré sur la gauche. Toutes les artères sont identifiées dans le schéma affiché à droite. Les lignes noires indiquent les ligatures. Échelle: 1 division = 1 mm._blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Diagramme montrant comment les artères carotides et l'aorte sont fabriquées dans les préparations faciales. Les lignes pointillées le long de la paroi du vaisseau indiquent des coupures pour ouvrir les navires. Les micrographies colorées présentent des préparations réelles. Échelle: 1 division = 1 mm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Une image en face de l'endothélium coloré avec anti-VE-cadhérine (vert) et anti-VCAM-1 (rouge). Une section optique unique confocal de cellules endotheliales près d'une ouverture intercostale estMontré. Notez que l'expression de VCAM-1 est augmentée dans les cellules endothéliales situées au point de ramification du vaisseau où le flux sanguin n'est pas laminaire. L'image a été enregistrée à l'aide d'un objectif 60X (NA 1.4, huile). Barre d'échelle = 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Images en face des artères carotides gauche et droite tachées avec anti-VE-cadhérine (Vert), Anti-VCAM-1 (Rouge) et DAPI (Violet). L'artère carotide gauche a été partiellement ligaturée et la carotide droite a été laissée intacte. Ces préparations en face ont été faites 24 h après la chirurgie. L'expression accrue de VCAM-1 sur le côté ligaturé par rapport au vaisseau intact est évidente. Ces images ont été prises près de la bifurcation des artères carotides communes parEn utilisant un microscope confocal à balayage laser avec un objectif 60X (NA 1.4, huile). Barres d'échelle = 20 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Lors de la manipulation des vaisseaux sanguins de la souris, il est important de se rappeler que l'endothélium est fragile et que toute force mécanique excessive endommage les cellules endothéliales. Par exemple, les cellules endothéliales se cassent ou se détachent de la paroi du vaisseau si le vaisseau est perfusé avec trop de force, ce qui peut se produire facilement lorsque la vascularisation est perfusée à l'aide d'une seringue à main.
Pour obtenir une pression de perfusion constante, nous utilisons un système de perfusion par gravité avec une pression de colonne d'eau de 120 cm. Il a été rapporté que la pression artérielle moyenne d'une souris, qui diffère selon la souche, varie entre 130 et 170 cm H 2 O 14 . Ainsi, la pression de perfusion que nous utilisons est légèrement inférieure à la pression artérielle mesurée. Lorsque nous avons porté une aorte de rat à perfusion, on a utilisé une pression de colonne de 90 cm H 2 O 6 .
Les cellules endothéliales in situ sont également endommagées si le vaisseau est étiré pendant la récolte, Nettoyage, séparation longitudinale, immunocoloration et montage. En fait, les dommages mécaniques sont l'une des causes fréquentes de perte de cellules endothéliales dans les préparations de visage. L'étirement du navire peut se produire à n'importe quelle étape pendant la procédure, mais le plus souvent, il se produit au moment de la récolte du vaisseau. Il est également facile d'étirer le vaisseau lorsque vous retirez le tissu adipeux attaché à l'adventice.
Les préparations en face sont réalisées en coupant un navire longitudinalement sur toute sa longueur. Cela se fait habituellement à l'aide de ciseaux ophtalmiques tranchants. Cependant, la pointe des ciseaux peut être trop importante si le diamètre intérieur du vaisseau cible est petit. Dans un tel cas, on peut utiliser une lame de rasage mince fracturée pour faire une coupe. Nous avons utilisé cette technique pour faire des préparations en face de l'artère mésentérique de la poule 15 .
Après la fixation, les préparations de visage sont perméabilisées. Habituellement, le PBS contenant Triton X-100 est utilisé pourCe but, mais il est possible d'utiliser d'autres réactifs de perméabilisation tels que Tween-20, Nonidet P-40, saponine, digitonine et Leucomerm. Idéalement, la condition de perméabilisation devrait être optimisée dans chaque laboratoire. Pour l'aorte de la souris et les artères carotides, nous les traitons avec du PBS contenant 0,1% de Triton X-100 pendant 10 min à la RT, et ce traitement est suffisant pour perméabiliser toutes les cellules dans la paroi vasculaire. Les échantillons perméabilisés sont ensuite traités séquentiellement d'abord avec un anticorps primaire et ensuite un anticorps secondaire qui est marqué par fluorescence. Pour la coloration des vaisseaux de souris, il est essentiel que l'anticorps primaire ne soit pas fabriqué dans la souris parce que le tissu vasculaire de souris contiendra de l'IgG de souris qui sera marquée par l'IgG anti-souris secondaire marquée par fluorescence, ce qui provoquera une coloration de fond élevée. Pour la microscopie, l'échantillon doit être aussi plat que possible. Nous appuyons sur les diapositives pendant 5 min avec 3,5 kg de poids. Ce poids spécifique a été déterminé empiriquement.
WLes préparations de poule et de poule sont marquées immunofluorescents, elles peuvent être étudiées en utilisant un microscope à épifluorescence ordinaire, un microscope confocal à balayage laser et un microscope multiphotonique. La microscopie confocale est la meilleure pour obtenir des images de l'endothélium et de la région sous-endothéliale jusqu'à 50 μm ou plus de la surface du vaisseau alors que la pénétration profonde de la lumière d'excitation obtenue par le mode d'éclairage multiphotonique permet d'obtenir des images en foyer à partir de la profondeur de Jusqu'à 2 mm de la surface de la paroi du vaisseau. En outre, la microscopie multiphotonique peut être utilisée pour une image de seconde harmonique, généralement pour étudier l'organisation de la fibre de collagène dans la paroi du vaisseau. Les préparations en face sont grandes, ce qui nous permet de dépister une vaste zone vasculaire telle que toute la longueur de l'aorte. Voici quelques avantages de l'utilisation de préparations de vaisseaux sanguins résistant à l'immunofluorescence. Il existe toutefois des inconvénients de cette technique. Tout d'abord, la méthode est limitée àLa disponibilité d'anticorps spécifiques et d'autres réactifs marqués par fluorescence tels que la phalloidine fluorescente, DAPI et DiI-Ac-LDL (Lipoprotéine à faible densité acétylée marquée avec 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-tétraméthyl-indocarbocyanine Perchlorate). Puisque l'imagerie est basée sur la fluorescence, les parties non fluorescentes des spécimens ne peuvent pas être imagées. Les spécimens de monture en général présentent une autofluorescence et des fibres d'élastine trouvées dans de grands vaisseaux sanguins fluorescents en vert. Cette fluorescence est particulièrement problématique lors de l'utilisation d'un microscope à épifluorescence; Ainsi, l'imagerie par un microscope confocal est fortement recommandée. Cependant, l'interférence de cette autofluorescence verte peut être considérablement réduite en utilisant des anticorps secondaires marqués avec un colorant fluorescent rouge. Enfin, comme les spécimens en face sont épais, l'imagerie par l'illumination transmise n'est pas possible.
Les microscopes commerciaux confocaux et multiphotones sont livrés avec un logiciel d'analyse d'image comprenantUn pour analyser quantitativement l'intensité fluorescente des images. Les données quantifiées sont plus fiables si les comparaisons sont effectuées dans la même diapositive. C'est parce que toutes les conditions d'immunocoloration sont les mêmes pour le spécimen. Si les intensités de coloration doivent être comparées entre différentes diapositives (par exemple, les vaisseaux normaux vs malades), la seule façon de valider les données est d'augmenter les nombres d'échantillons afin que les variations techniques et biologiques puissent être calculées en moyenne. En général, les mesures d'intensité sur les images confocales obtenues près de la surface des vaisseaux sont plus fiables. Les intensités fluorescentes des images obtenues à partir de régions plus profondes du tissu ont tendance à être plus variables en raison de différents degrés de diffusion et d'absorption de l'excitation et de la lumière fluorescente émise. En général, il faut faire attention à interpréter les différences d'intensité subtiles détectées dans les zones profondes des spécimens. Pour améliorer la capacité d'imagerie à partir de régions profondes de tissu, des tentatives sont faites pour rendre tDes problèmes translucides et des images impressionnantes ont été obtenues (par exemple, voir un article récent de Neckel et al., 16 et les articles cités par ces auteurs). Bien qu'il soit possible que les traitements utilisés pour fabriquer des tissus translucides puissent extraire certains antigènes et / ou dénaturer certains épitopes, cette méthode peut être utilisée pour obtenir des signaux fluorescents plus reproductibles provenant de régions plus profondes de tissu.
L'utilisation de préparations en face n'est pas limitée à l'imagerie par microscopie à fluorescence. En utilisant un microscope stéréo, les préparations de vaisseaux peuvent être utilisées pour étudier l'étendue de la formation de plaque athérosclérotique après coloration avec Oil Red O. En face, les préparations des récipients peuvent être préparées de manière aseptique. De telles préparations peuvent être conservées en culture et peuvent être utilisées comme système ex vivo pour étudier l'interaction entre leucocyte et les cellules endothéliales.
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Disclosures
Aucun
Acknowledgments
Les activités de recherche des auteurs sont soutenues par des subventions de l'Institut national de la santé au Dr Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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