Summary
마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.
Abstract
파라핀 내장 조직 섹션은 조직 조직학 및 조직 병리학을 연구하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 3 차원 조직 형태가 그런 절에서 무엇인지 결정하는 것은 어렵습니다. 또한 검사 된 조직의 섹션에는 진행중인 연구의 목적에 필요한 조직 내의 영역이 포함되지 않을 수 있습니다. 이러한 후자의 제한은 혈관 병변이 집중된 방식으로 발달하기 때문에 혈관의 조직 병리학 적 연구를 방해한다. 이것은 우리가 혈관 벽의 넓은 영역을 표면에서 더 깊은 영역까지 조사 할 수있게하는 방법을 필요로합니다. 혈관의 전면적 인 준비가이 요구 사항을 충족시킵니다. 이 기사에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 안면 조영 및 공 촛점 현미경 및 형광 기반 이미징의 다른 유형을 면역 형광으로 조제하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
광학 현미경에 의한 조직 병리학 적 연구를 위해, 파라핀 매입 (paraffin embedment) 및 절편 화 및 염색을 위해 생물학적 조직의 3 차원 조각을 통상적으로 처리한다. 파라핀이 묻혀있는 조직 샘플은 3 차원 모두 수 밀리미터가 될 수 있습니다. 그러나, 광학 현미경 검사의 목적을 위해, 빛이 통과 할 수 있도록 먼저 절단되어야하며, 따라서 얇은 부분이 이미징을 위해 충분한 대비를 생성하도록 염색되어야합니다. 절편 된 시편은 일반적으로 두께가 5-10 μm이기 때문에 한 번에 2 차원으로 전체 시편의 매우 작은 부분 만 볼 수 있습니다. 순차적 섹션을 수집하고 각 섹션을 개별적으로 이미징 한 후에 3D 이미지의 컴퓨터를 이용한 재구성을 수행 할 수는 있지만 실제로 지루한 작업입니다. 혈관의 조직 병리학, 특히 죽상 동맥 경화증의 병인 생리를 연구하는 데는 독특한 문제가 있습니다. 죽상 동맥 경화증은 발병하는 집중 질환입니다.혈류가 방해받는 곳에서 국부적으로 또한, 질병은 내막, 큰 동맥의 내피 세포와 세포 외 매트릭스의 단일 층으로 구성된 얇은 조직 내에서 시작됩니다. 이러한 이유 때문에 절개 된 혈관을 사용하여 초기 병변을 찾고 연구하는 것이 쉽지 않기 때문에 병변을 절개하지 못할 수 있습니다. 절에 병이있는 부분이 포함되어 있어도 배지 및 외막에 내피 세포와 기타 혈관벽 세포가 포함 된 5-10 μm 부분 만 보입니다.
전체 마운트 엉 얼굴 (발음 än fäs) 준비는 대동맥 뿌리부터 일반적인 장골 동맥까지 전체 대동맥과 같은 혈관 표면의 넓은 영역을 조사 할 수있게 해줍니다. 특정 항체 및 기타 특정 프로브로 염색 된 그러한 표본을 사용하여, 병변의 위치를 정확하게 지적 할 수 있으며, 또한 다양한 분자 이벤트가 내피 세포에서 발생하는 경우단백질의 발현, 국소화 및 번역 후 변형의 변화와 같은 아테롬 발생 (atherogenesis). atherogenesis를 연구하는 것 외에도 en face preparation에서 관찰 된 내피 세포 모양은 지역 시간 평균 혈류 패턴의 지표로 사용됩니다. 이러한 데이터는 원위치에서 내피 세포의 기계 신호를 연구하는 데 중요합니다. 이러한 목적으로, 일상적인 조직 학적 단면 혈관은 유용하지 않습니다. 따라서 혈관 약과 생물학에있어서 혈관의 표면을 넓게 관찰 할 수있는 혈관 조영 기술을 습득하는 것이 중요합니다.
Jelev와 Surchev 1 에 의해 검토 된 바와 같이 혈관 생물 학자들은 혈관의 안면을 관찰하기위한 다양한 방법을 개발했다. 일부 독창적 인 방법은 1940 년대와 1950 년대에 개발되었습니다. 이 방법을 사용하여 혈관의 내부 표면을 줄 지어주는 내피 세포의 기본 구성을 연구 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 표면 준비가 준비되는 방법 (Hautchen 방법 2 , 3 , 4 또는 용기 표면 5 의 벗겨짐)과 표본이 염색되는 방식 때문에, 방해받지 않는 형태학을 얻는 것이 항상 가능하지는 않습니다 혈관 벽의 더 깊은 영역으로 혈관 표면의 정보. immunofluorescence 얼룩이 결합 된 전체 마운트 엉 얼굴 선박 준비는 우리뿐만 아니라 혈관 벽의 subendotial 지역에 이러한 연구를 확장 이러한 세포의 내피 세포 형태와 단백질 발현 및 지방화를 연구 할 수있었습니다. immunoflucently 스테인드 혈관 얼굴 준비를 사용하여 초기 연구 1980 년 6 월 에 나타나기 시작 ,f "> 7. 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 검사와 최근 다 광자 현미경 검사의 출현으로 면역 형광 염색 된 안면 혈관 샘플 및 살아있는 동물의 혈관 네트워크에서 혈관 벽 구조의 명확한 초점을 맞출 수 있습니다 이러한 컴퓨터 기반 영상 기법은 인 - 포커스 광학 단면 영상을 생성하고, 이러한 영상을 적층함으로써 조직 내에서 혈관 벽 및 혈관 네트워크의 재구성 된 3D 영상을 얻을 수있다. 또한, 재구성 된 이미지 (12 , 13) 의 Z- 축을 따라 만들어진 섹션의 이미지를 생성 할 수 있습니다.
이 기사에서는 면역 형광 염색을위한 마우스 대동맥과 경동맥의 대면 준비를위한 방법을 설명 할 것입니다. 얼굴 준비이 용기를 실험적으로 조작 한 후에도 만들 수 있습니다. 예를 들어, 경동맥을 부분적으로 결찰 한 다음 수술을 한 후 얼굴을 준비 할 수 있습니다. 이런 이유로 우리는이 기사에서 우리가 경동맥에 부분 연결을 어떻게하는지 설명 할 것입니다. 쥐, 토끼 및 인간과 같은 더 큰 동물에게서 유사한 준비를 만들기와 비교해, 쥐 배는 크기가 작아서 더 부서지기 쉽고, 따라서 혈관의 외과 단절 동안 핸들링과 항체 염색법과 현미경 검사를 위해 그들을 준비 할 필요가있다. 유전자 변형을 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델은 마우스이기 때문에 많은 연구자가 마우스 혈관을 손상시키지 않으면 서이를 처리하는 것이 중요합니다. 이 원고에서는 마우스 대동맥과 경동맥의 얼굴을 만들 때 마우스 혈관을 다루는 방법을 설명 할 것입니다. 데모 목적으로 야생형 C57 / b6 마우스를 사용합니다.
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Protocol
안면 면역 염색을위한 마우스 부분 경동맥 결찰 및 마우스 대동맥 및 경동맥의 분리에 대한 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IBT 2014-9231)의 승인을 받았습니다.
1. 좌 경부 동맥 결찰술
- 테이블에 12 인치 x 14 인치의 가열 패드를 놓고 외과 공간을 준비하고 패드와 테이블 위에 큰 깨끗한 수술 용 드레이프를 덮으십시오. 실체 현미경의 시야가 가열 패드의 가운데 부분에 오도록 붐 스탠드의 암을 조정하십시오.
- 테이블의 히팅 패드를 켜고 3 단계 조절 다이얼을 중간 열 수준으로 설정합니다. 이 온도 설정에서 수술 보드 표면 (1.6.1 참조)은 38-40 ° C가됩니다.
- 다른 가열 패드 위에 깨끗한 케이지를 놓습니다. 위와 같이 가열 패드를 켜십시오. 이 케이지는 수술 후 회복 (1.16 참조)과 주거에 사용됩니다.
- 마우스의 무게를 잰다. 체중은 수술 직전에 투여 될 진통제의 적절한 양을 결정하는 데 필요합니다.
- 유도 챔버에 마우스를 놓으십시오.
- 유도 챔버에서 마우스를 마취하기 위해 산소 탱크와 마취 기화기를 켜십시오. 이소 플루 란 수준을 2 %로 유지하십시오. 마우스가 움직이기 전에 3-5 분이 걸린다.
- 마우스가 마취되고있는 동안입체 현미경 아래에 멸균 수술 용 드레이프 (24 인치 x 24 인치)의 작은 조각을 놓고 수술 표면을 만듭니다. 그런 다음 드레이프 된 표면에 아크릴 외과 용 보드 (70 % 알콜로 세척 됨)를 놓습니다. 따라서 외과 용 보드는 가열 패드 위에 있어야하지만 외과 용 드레이프의 두 층으로 분리되어야합니다.
- 마우스가 유도 챔버에서 움직이는 것을 멈 추면 마우스를 수술 전 준비 구역으로 옮기고 기화기 (2 % isoflurane)에 연결된 코 콘에 코를 놓습니다. 전기 트리머 또는 헤어 제거제 로션을 사용하여 자궁 경부 주위의 모발을 제거하십시오. 이 방법으로는 수술 부위에서 완전히 제거하기 어려운 털 조각이 생기지 않으므로 로션을 제거하는 것이 좋습니다.
- 코 콘을 제 위치에 놓고 마우스를 수술 용 보드로 옮깁니다.
- 오른쪽 및 왼쪽 앞다리를 외과 용 보드에 테이프로 감아 넣으십시오. 양쪽 뒷다리를 아래로 테이프로 감아 서ther 마우스 오른쪽에. 이것은 마우스의 목 부위의 좌측이 수술을 위해보다 양호하게 배치되도록 마우스 몸체의 약간의 회전을 야기한다.
- 절개 부위를 70 % 알코올, 클로르헥시딘 외과 수술 용 스크럽 및 다시 70 % 알코올로 소독합니다. 자궁 절개 부위를 제외하고 멸균 된 수술 용 드레이프로 마우스를가립니다.
- 마우스를 완전히 마취하고 intraperitoneal 또는 피하 주사 를 통해 진통 (카로 펜 3-5 mg / kg) 을 주는 발가락 핀치로 확인하십시오.
- 해부 현미경으로, 메스 또는 홍채 가위를 사용하여 자궁 경부 주위에 복부 중간 선 절개를하십시오.
참고 : 입체 현미경의 작동 거리가 제한되어 있기 때문에 가위를 사용하기 때문에 메스를 사용하기가 어렵습니다. - 왼쪽 총 경동맥 (LCCA)을 옆으로 밀고 혈관을 덮고있는 타액선의 위치를 왼쪽으로 옮깁니다.nimal.
- 수술 분야의 모든 혈관을 확인하십시오 ( 그림 1 ). LCCA는 왼쪽 내 경동맥 (ICA)과 왼쪽 외 경동맥 (ECA)으로 분기됩니다. 표재성 갑상선 동맥 (STA)은 내측의 ECA에서 발생합니다. 후두 동맥 (OA)은 일반적으로 ECA에서 발생하지만 일부 마우스에서는 ICA에서 발생합니다.
- 멸균 된 6-0 실크 봉합사를 사용하여 OA 기기를 제외한 모든 동맥 가지를 라이 게이션하십시오. 이를 위해 다음 두 가지 연결을 만드십시오.
- 부드럽게 왼쪽 내 경동맥 (ICA) 주위와 아래에 결합 조직을 제거합니다. 포 셉터로 precut 6-0 실크 봉합 (~ 2.5cm)의 조각을 잡고 동맥 아래에 전달하십시오. 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 봉합사를 길이의 1/3 정도로 잡아 당겨 동맥을 결찰하십시오.
- 위에 설명 된 것과 같은 방식으로 왼쪽 외부 경동맥 (ECA) 주위의 결합 조직을 제거하고 왼쪽 상 티로이 근위에 결찰을하십시오d 동맥 (STA) ( 그림 1 ). 수술 분야에서 움직이는 신경 섬유를 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 이러한 결찰이 이루어지면 타액선을 원래의 위치로 돌려 놓고 멸균 된 생리 식염수 2 ~ 3 방울을 넣어 수술 부위를 수분을 공급하십시오. 6-0 코팅 된 vicryl 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.
- 수술 후 예열 된 케이지 (1.2.1 참조)에 마우스를 놓습니다. 마우스는 5 분 안에 일어나야하며 주변을 걷기 시작해야합니다. 마우스가 정상적으로 작동하는지 확인한 후 새장을 동물 방에 가져 오십시오.
- 회복 첫 3 일 동안 매일 마우스를 관찰하십시오. 마우스는 실험 프로토콜이 요구하는 다양한 조건 하에서 실험이 요구하는 한 오래 유지 될 수 있습니다. 얼굴 수술 준비는 수술 후 언제든지 가능합니다.
2. 엉덩이 면역 면역
- 흡입 과다에 의해 CO 2 로 마우스를 안락사하십시오.
- 해부 보드에 누름 (배꼽이 위를 향한) 위치에 마우스를 테이프.
- 홍채 가위를 사용하여 정중선 절개를하여 복강을 노출시킵니다.
- 갈비를 옆으로 흉골로 절단하여 흉강을 노출시킵니다.
- 대정맥에서 딱지를 만들거나 혈액을 배출하기 위해 대퇴 동맥 중 하나를 자릅니다.
- 중력 관류 설정 (120cm 수압)에 첨부 된 26G 바늘을 왼쪽 심실의 꼭대기에 삽입하고 순환계를 헤파린 (40U / mL)이 들어있는 생리 식염수로 관류하십시오. 상처에서 흐르는 식염수가 명확해질 때까지 재관류를 계속하십시오.
- 관류 시스템을 식염수에서 PBS (인산염 완충 식염수)에 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 고정 솔루션으로 전환하고 5 분 동안 계속해서 관류합니다.
- 무딘 엔드 가위 및 집게를 사용하여 대동맥과 좌우 경동맥을 수확하고 얼음에 정착액이 들어있는 50 ML 원추형 튜브에 넣으십시오.
- 우물 당 permeabilizing 솔루션 (PBS에 0.1 % 트리톤 X - 100) 0.5 ML을 포함하는 12 잘 접시의 우물로 별도로 각 그릇을 전송합니다. 실온 (RT)에서 흔들어 10 분간 혈관을 침투.
- PBS로 간단히 씻으십시오.
- 비특이적 항체 결합 부위를 차단하기 위해 TTBS (2.5 % Tween 20를 함유 한 Tris-buffered saline (TBS))에서 30 분 동안 2 차 항체가 만들어진 동물 종에서 혈청을 10 % 정상 배양한다. RT에서 락.
- 4 ° C에서 흔들어 밤새 정상적인 10 % 혈청 (위에서 설명한)으로 TTBS에 적절히 희석 한 기본 항체와 혈관을 품어. 레벨각 항체에 대해 희석 정도를 결정해야합니다.
- 다음의 컨트롤 얼룩을 수행하십시오.
- 일차 항체 대신에 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 후 이차 항체와 함께 항온 처리한다.
- 일차 항체가 만들어진 동일한 동물 (종)의 비 면역 (또는 면역 전) 혈청 또는 Ig를 함유하는 TTBS로 혈관을 인큐 베이트 한 다음, 2 차 항체와 함께 항온 처리한다.
- 이차 항체와 함께 배양을 생략하십시오. 이러한 대조 검체는 특정 항체로 염색 할 때 동일한 방식으로 동시에 취급해야합니다.
- TTBS로 혈관을 3 번 씻고 10 분간 RT에서 흔들어 준다.
- TTBS에서 10 % 정상 혈청 (위에서 기술 한)으로 적절하게 희석 된 형광 표지 된 2 차 항체와 함께 항온 처리하고 RT에서 흔들어 주면서 1 시간 동안 항온 처리한다. DAPI (4 ', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌)로 핵 염색을 동시에 수행 할 수있다.H 2 O에 5mg / mL의 DAPI를 함유하는 DAPI 스톡 용액의 1 / 5,000 부피를 첨가함으로써이 단계를 수행 하였다.
- RT에서 흔들어 10 분 동안 TTBS로 3 번 씻으십시오.
- PBS로 가볍게 헹굽니다.
- 커버 유리 (22mm x 50mm)에 항 - 퇴색 시약 1 방울을 놓고 내피가 아래를 향하게하여 커버 유리에 혈관을 놓습니다.
- 혈관에 슬라이드 유리 (22mm x 75mm)를 놓고 거품을 피하십시오.
- 깨끗한 실험실 닦음 ( 예 : Kimwipe)에 슬라이드를 놓고 두 개의 실험실 닦음으로 슬라이드를 덮으십시오. 슬라이드에 최대 3.5 분 동안 체중 3.5 kg ( 예 : 두꺼운 책에 물 한 병 사용)을 넣고 안면 혈관 표본을 평평하게합니다.
- 무게를 제거하고 coverslip 주위에서 과도한 솔루션을 닦아주십시오.
- coverslip의 네 모서리에 매니큐어를 적용 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓으십시오, coverslip면을 위로하고 RT에서 어둠에 보관(또는 4 ° C) 하룻밤. 이 과정은 조직을 더욱 평탄하게 만들고 고배율에서 현미경 검사를 더 쉽게합니다.
- 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 완전히 봉인하십시오.
- 매니큐어가 건조하자 마자 현미경 검사를 수행하십시오.
- 필요한 경우 -20 ° C에서 슬라이드를 보관하십시오.
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Representative Results
endothelium의 전형적인 얼굴 면역 형광 이미지가 그림 3 에 나와 있습니다. 이 이미지는 늑간 동맥 (큰 어두운 달걀 모양의 영역)의 개통 근처에서 찍은 마우스 대동맥의 단일 광학 섹션을 보여줍니다. 대동맥은 항 -VE- 카데 린 (녹색) 및 항 -VCAM-1 (혈관 세포 접착 분자 -1) (적색)으로 이중 염색되었다. 각 내피 세포는 adherens junction에서 녹색 선형 염색으로 윤곽이 그려져 있습니다. 시편의 미세한 불균일 때문에 일부 광학 접합점은이 광학 섹션 외부에 있습니다. 항문-VCAM-1 염색은 방해받는 혈류가 발생하는 것으로 알려진 늑간 동맥이 열릴 때 더 강합니다. 도 4는 항 -VE- 카데 린 (녹색), 항 -BCAM-1 (적색), 및 DAPI (보라색)를 갖는 경동맥의 엉성한 염색을 도시한다. 좌 경동맥 (LCA)은 부분적으로 결찰되었고 오른쪽 경동맥 (RCA)은 손상되지 않았습니다. 혈관 표본은 1 일 후 수술 및 스테인드. 결찰 혈관에서 항 -VCAM-1 염색이 증가됨을 주목하라. 다양한 항체로 면역 형광으로 염색 된 검체를 사용하여 대상 단백질의 발현 수준, 표적 단백질의 번역 후 변형 정도, 그리고 내피 세포 내뿐만 아니라 다른 세포 내 다양한 단백질의 국소화 패턴을 조사 할 수 있습니다 혈관 벽 ( 10 , 11) .
그림 1 : 마우스 경부의 상세 혈관 해부 해부 전후의 혈관 네트워크가 왼쪽에 표시됩니다. 모든 동맥은 오른쪽 그림에 나와 있습니다. 검은 선은 결찰을 나타냅니다. 눈금 : 1 눈금 = 1 mm._blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 경동맥 동맥 및 대동맥이 엉덩이 준비로 어떻게 만들어지는 지 보여주는 다이어그램. 혈관 벽의 점선은 혈관을 열 수있는 상처를 나타냅니다. 착색 된 현미경 사진은 실제 엉덩이 준비를 보여줍니다. 눈금 : 1 눈금 = 1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Anti-VE-cadherin (녹색) 및 Anti-VCAM-1 (적색)으로 염색 된 내피 세포의 En Face 이미지. 늑간 출입구 근처의 내피 세포의 공 초점 단일 광학 부분은표시됩니다. VCAM-1 발현은 혈류가 비 층류 인 혈관 지점에 위치한 내피 세포에서 증가한다는 것을 유의해야한다. 이미지는 60X (NA 1.4, 오일) 대물 렌즈를 사용하여 기록했습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Anti-VE-cadherin (녹색), Anti-VCAM-1 (적색) 및 DAPI (보라색)로 염색 된 왼쪽 및 오른쪽 경동맥의 경계면 이미지. 왼쪽 경동맥은 부분적으로 결찰되었고 오른쪽 경동맥은 손상되지 않았다. 이 수술은 24 시간 후에 이루어졌습니다. 혈관 손상이없는 혈관에 비해 결찰 측에서 VCAM-1의 발현이 증가한 것이 명백하다. 이 영상은 총 경동맥의 분기점 부근에서 촬영되었습니다.60X (NA 1.4, 오일) 대물 렌즈가있는 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경을 사용합니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스 혈관을 취급 할 때, 내피가 부서지기 쉽고 과도한 기계적 힘이 내피 세포를 손상 시킨다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 혈관이 수동으로 주사기를 사용하여 관류 될 때 쉽게 발생할 수있는 혈관이 너무 강하게 관류되는 경우 혈관벽에서 내피 세포가 깨지거나 분리됩니다.
일정한 관류 압력을 얻기 위해 우리는 120 cm의 수증기압을 갖는 중력 관류 시스템을 사용합니다. 변형에 따라 다른 마우스의 평균 동맥압은 130 ~ 170 cm H 2 O 14의 범위에 이르는 것으로보고되었습니다. 따라서 우리가 사용하는 관류 압력은 측정 된 동맥압보다 약간 낮습니다. 우리가 재관류 고정 쥐 대동맥, 90cm H 2 O 칼럼 압력이 사용되었습니다.
원위치 내피 세포는 수확 중에 배가 늘어나도 손상됩니다, 청소, 세로 분리, 면역 염색 및 장착. 사실, 기계적 손상은 엉덩이 준비에서 내피 세포를 잃는 일반적인 원인 중 하나입니다. 선박 스트레칭은 절차 중 어느 단계에서나 발생할 수 있지만 일반적으로 선박을 수확 할 때 발생합니다. 외막에 붙어있는 지방 조직을 제거 할 때 혈관을 잡아 당기는 것도 쉽습니다.
얼굴 전체 준비는 길이를 따라 길이 방향으로 용기를 절단하여 이루어집니다. 이것은 일반적으로 날카로운 안과 가위를 사용하여 수행됩니다. 그러나 가위의 팁은 대상 용기의 내부 직경이 작 으면 너무 커질 수 있습니다. 그러한 경우에는 절단 된 얇은 일회용 면도날을 사용하여 절단 할 수 있습니다. 우리는이 기술을 병아리 장간막 동맥의 얼굴 준비에 사용했습니다.
고정 후, 얼굴 준비가 permeabilized 있습니다. 일반적으로 Triton X-100을 함유 한 PBS가Tween-20, Nonidet P-40, saponin, digitonin, Leucomerm과 같은 다른 투과성 시약을 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 투과성 조건은 각 실험실에서 최적화되어야합니다. 마우스 대동맥과 경동맥의 경우, 0.1 % Triton X-100을 함유 한 PBS로 RT에서 10 분간 처리하고,이 처리는 혈관벽 내의 모든 세포를 투과성으로하는데 충분하다. 그 후, 투과성 샘플을 우선 일차 항체 및이어서 형광 표지 된 이차 항체로 처리한다. 마우스 혈관을 염색하기 위해서는 마우스 혈관 조직에 형광 표지 된 2 차 항 마우스 IgG에 의해 표지되는 마우스 IgG가 포함되어 높은 배경 염색을 일으키기 때문에 1 차 항체가 마우스에서 만들어지지 않는 것이 중요합니다. 현미경 검사의 경우 표본은 최대한 평평해야합니다. 우리는 3.5kg의 무게로 슬라이드를 5 분 동안 누릅니다. 이 비중은 경험적으로 결정되었습니다.
승암컷 얼굴 준비는 immunofluorescently 표시됩니다, 그들은 일반 epifluorescence 현미경, 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경, 그리고 다 광자 현미경을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 공 촛점 현미경 검사는 혈관 표면에서 최대 50 μm 정도의 내피와 내피 영역의 이미지를 얻는 것이 가장 좋습니다. 그러나 다 광자 모드의 조명으로 달성 된 여기 광의 깊은 침투로 인하여 깊이에서 인 - 포커스 이미지를 얻을 수 있습니다. 혈관 벽 표면으로부터 최대 2 mm. 또한, 다 광자 현미경 검사는 2 차 고조파 이미징에 사용될 수 있으며, 가장 일반적으로 혈관벽에서 콜라겐 섬유 조직을 연구합니다. 얼굴의 준비가 넉넉하여 대동맥의 전체 길이와 같은 큰 혈관 부위를 조사 할 수 있습니다. 이것들은 면역 형광으로 염색 된 안면 혈관 조제를 사용하는 것의 이점 중 일부입니다. 그러나이 기술의 몇 가지 단점이 있습니다. 우선,이 방법은DAPI, DiI-Ac-LDL (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanine으로 표지 된 Acetylated Low Density Lipoprotein)과 같은 특이 항체 및 기타 형광 표지 된 시약의 유용성 과염소산 염). 이미징은 형광을 기반으로하기 때문에 표본의 비 형광 부분을 이미징 할 수 없습니다. 전체 마운트 표본은 일반적으로 자기 형광을 나타내며 큰 혈관에서 발견되는 엘라스틴 섬유는 녹색으로 형광을.니다. 이 형광은 epifluorescence 현미경을 사용할 때 특히 문제가됩니다. 따라서, 공 촛점 현미경으로 이미징을 적극 권장합니다. 그러나,이 녹색 자기 형광의 간섭은 적색 형광 염료로 표지 된 2 차 항체를 사용함으로써 현저하게 감소 될 수있다. 마지막으로, 안면 표본이 두꺼우므로 투과 조명에 의한 이미징이 불가능합니다.
상업용 공 촛점 및 다 광자 현미경에는 이미지 분석 소프트웨어가 포함되어 있습니다.하나는 이미지의 형광 강도를 정량적으로 분석하는 것입니다. 동일한 슬라이드 내에서 비교를 수행하면 정량화 된 데이터가 더 안정적입니다. 이것은 면역 염색을위한 모든 조건이 표본과 동일하기 때문에 그렇습니다. 염색 강도를 다른 슬라이드 (예 : 정상 및 병균 혈관)간에 비교해야하는 경우 데이터를 검증하는 유일한 방법은 샘플 번호를 늘려 기술 및 생물학적 변이를 평균화하는 것입니다. 일반적으로 혈관 표면 근처에서 얻은 공 초점 영상의 강도 측정은 더욱 신뢰할 수 있습니다. 조직의 더 깊은 영역으로부터 얻어진 이미지의 형광 강도는 여기 및 방출 된 형광의 산란 및 흡수의 상이한 각도로 인해보다 가변적 인 경향이있다. 일반적으로 표본의 깊은 부분에서 감지 된 미묘한 강도 차이를 해석 할 때주의해야합니다. 깊은 조직 부위의 영상화 능력을 향상시키기 위해 t반투명하고, 인상적인 이미지를 얻었습니다 (예 : Neckel의 최근 기사 및이 저자들이 인용 한 논문 참조). 조직을 반투명하게 만드는 데 사용되는 트리트먼트가 특정 항원을 추출하거나 특정 항원 결정기를 변이시킬 수도 있지만,이 방법을 사용하면 조직의 깊은 부분에서 더 많은 재현성있는 형광 신호를 얻을 수 있습니다.
얼굴 준비의 사용은 형광 현미경에 의한 이미징에 국한되지 않습니다. 입체 현미경을 사용하여 en face vessel preparation을 사용하여 Oil Red O로 염색 한 후 아테롬성 동맥 경화 플라크 형성 정도를 연구 할 수 있습니다.면 혈관 조제는 무균 적으로 만들 수 있습니다. 그러한 제제는 배양 물에 보관 될 수 있으며 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 연구하기위한 생체 외 시스템으로 사용될 수있다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
저자의 연구 활동은 국립 보건원 (National Institute of Health)의 Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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