Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En ansiktsbehandling av museblodfartøy

Published: May 19, 2017 doi: 10.3791/55460

Summary

En fremgangsmåte for fremstilling av ansiktspreparater av muskelkarotidarterien og aorta er beskrevet. Slike preparater, når immunofluorescensfarget med spesifikke antistoffer, gjør det mulig for oss å studere lokalisering av proteiner og identifikasjon av celletyper i hele vaskulærveggen ved konfokal mikroskopi.

Abstract

Seksjoner av parafininkonstruert vev blir rutinemessig brukt til å studere vevshistologi og histopatologi. Det er imidlertid vanskelig å avgjøre hva den tredimensjonale vevsmorfologien er fra slike seksjoner. I tillegg kan de undersøkte delene av vev ikke inneholde regionen i vevet som er nødvendig for den pågående studien. Denne sistnevnte begrensningen hindrer histopatologiske studier av blodkar siden vaskulære lesjoner utvikles på en fokalisert måte. Dette krever en metode som gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarveggen, fra overflaten til dypere områder. En helmontering og ansiktspreparasjon av blodkar oppfyller dette kravet. I denne artikkelen vil vi demonstrere hvordan man gjør ansiktspreparasjoner av musa aorta og karotisarterie og å immunofluorescently flekke dem for konfokal mikroskopi og andre typer fluorescensbasert bildebehandling.

Introduction

For histopatologiske studier ved lysmikroskopi behandles tredimensjonale biter av biologiske vev rutinemessig for paraffininduksjon etterfulgt av snitting og farging. En vevsprøve som har blitt paraffin-innebygd, kan være flere millimeter i alle tre dimensjoner. For lysmikroskopi må det imidlertid først snittes slik at lyset kan passere gjennom og deretter farget slik at den tynne delen gir nok kontrast til bildebehandling. Fordi snittprøver vanligvis er 5-10 μm tykkelse, ser man bare en liten del av hele prøven i to dimensjoner av gangen. Det er mulig å samle sekvensielle seksjoner og, etter å ha avbildet hvert enkelt avsnitt, utfører datamaskinassistert rekonstruksjon av 3D-bildene, men dette er en kjedelig jobb. Histopatologi av blodkar, spesielt for å studere patogenesen av aterosklerose, presenterer unike problemer. Aterosklerose er en fokalisert sykdom som utvikler segLokalt i områder hvor forstyrret blodstrøm forekommer. Dessuten initieres sykdommen i intima, et tynt vev bestående av et monolag av endotelceller og ekstracellulær matrise, av store arterier. Av disse årsakene er det en utfordring å lokalisere og studere tidlige lesjoner ved hjelp av seksjonerte blodårer, fordi man lett kan savne snittet av lesjonen. Selv om en seksjon inkluderer et sykt område, vil man kun se en 5-10 μm porsjon som inneholder endotelceller og andre vaskulære veggceller i media og adventitia.

Preparasjoner for hele fjellet og ansiktet (uttalte än fäs) gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarets overflate som hele aorta fra aorta rotten helt ned til de vanlige iliac arteriene. Ved å bruke et slikt preparat som er farget med spesifikke antistoffer og andre spesifikke prober, kan man finne plasseringen av lesjoner og også hvor forskjellige molekylære hendelser forekommer i endotelceller i forbindelse medAtherogenesen som forandringer i ekspresjon, lokalisering og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner. I tillegg til å studere atherogenese blir endotelcelleformen observert i en ansiktspreparat brukt som en indikator på det regionale tidsmessige blodstrømningsmønster. Slike data er viktige for å studere mekanosignalering av endotelceller in situ. For dette formål er rutinemessige histologiske tverrsnittede blodkar ikke nyttige. For vaskulær medisin og biologi er det derfor spesielt viktig å skaffe seg en teknikk for å lage ansiktspreparater av blodkar som gjør det mulig å observere et bredt område av fartøyets overflate samt dypere undergrunnsflater av fartøyet.

Som gjennomgått av Jelev og Surchev 1 , har vaskulære biologer utviklet ulike metoder for å observere foringen av blodårene i ansiktet. Noen geniale metoder ble utviklet i 1940- og 1950-tallet. Ved hjelp av disse metodene var de Kunne studere den grunnleggende organisasjonen av endotelceller som linje den indre overflaten av blodårene. Imidlertid var det ikke alltid mulig å oppnå uforstyrret morfologisk grunnlag på grunn av måten disse preparatene fremstilles på (den såkalte Hautchen-metoden 2 , 3 , 4 eller avskalling av fartøyets overflate 5 ) og måten prøven ble farget på. Informasjon fra fartøyets overflate til de dypere områdene av blodkarveggen. Hele montering av ansiktsbeholderpreparat kombinert med immunfluorescensfarging tillot oss ikke bare å studere endotelcellemorfologi og proteinuttrykk og lokalisering i disse cellene, men også for å utvide slike studier til den subendoteliale regionen av karvegveggen. Tidlige studier ved bruk av blodkar og ansiktspreparater ble farget immunoflurescently begynte å dukke opp i 1980-tallet 6 ,F "> 7. Med fremkomsten av laserskanning av konfokal mikroskopi og nyere mikrofonmikroskopi, kan man nå skaffe klare in-fokusbilder av blodkarets veggstruktur i immunfluorescently-stained en ansiktsbeholderprøver samt det vaskulære nettverket i levende dyr 8 , 9 , 10 , 11. Disse datamaskinbaserte billedteknikkene skaper optiske snittbilder i fokus og ved å stable slike bilder kan man få rekonstruert 3D-bilder av fartøyets vegg og det vaskulære nettverket i vev. I tillegg er en Kan generere bilder av en seksjon laget langs Z-aksen til det rekonstruerte bildet 12 , 13 .

I denne artikkelen vil vi illustrere en metode for å forberede en ansiktspreparat av musaorta og halspulsåren for immunfluorescerende farging. En ansikts forberedelserKan gjøres selv etter at disse fartøyene har blitt manipulert eksperimentelt. For eksempel kan en halspulsårer være delvis ligert og deretter et ansiktspreparat fremstilt etter en slik operasjon. Av denne grunn vil vi også beskrive i denne artikkelen hvordan vi gjør en delvis ligering på halspulsåren. Sammenlignet med å lage lignende preparater fra større dyr som rotter, kaniner og mennesker, er musekar små i størrelse og mer skjøre, hvilket krever ekstra omsorg for håndtering under kirurgisk isolering av kar og forbereder dem for antistofffarging og mikroskopi. Fordi den mest brukte dyremodellen for genetisk modifikasjon er musen, blir det kritisk for mange etterforskere å håndtere muskasser uten å skade dem. I dette manuskriptet vil vi beskrive hvordan du skal håndtere museblodkar når du lager ansiktspreparater av musa aorta og karotisarterie. For demonstrasjonsformål vil vi bruke wild type C57 / b6 mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollene for mus-partiell carotidarterie-ligering og isolering av musaorta og karotisarterien for immunfarging i ansiktet er godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk (IBT 2014-9231).

1. Venstre Partiell Carotid Artery Ligation

  1. Klargjør kirurgisk plass ved å plassere en 12 tommer x 14 tommers varmepute på bordet og dekke pute og bordplaten med en stor, ren kirurgisk drap. Juster armen på bommestativet slik at stereomikroskopets synsfelt ligger i midten av varmeputen.
  2. Slå på varmeputen på bordet og sett 3-innstillingsbryteren på mediumvarmen. Ved denne temperaturinnstillingen vil kirurgisk brettoverflate (se 1.6.1) være 38-40 ° C.
    1. Plasser et rent bur på en annen varmepute. Slå varmeputen på som ovenfor. Dette buret vil bli brukt til gjenvinning etter kirurgi (se 1.16) samt bolig.
    På kirurgisk bord plasser du en autoklavert steriliseringspose med iris saks (1 par), vevpinne (1 par), supergrepspistoler (2 par), vårsaks (1 par), stump retraktor (1 par, 2,5 mm bred) , Rundhåndtert nålholder (1), sterilisert silikon sutur 6-0, bomullstopp applikatorer, applikasjoner med mini bomullstopp, kirurgiske gardiner og 2 "x 2" gaze svamper. Legg også en klemflaske inneholdende 70% etanol og en annen inneholdende klorhexidin kirurgisk skrubbe kirurgisk bord.
  3. Vei en mus Kroppsvekten er nødvendig for å bestemme riktig mengde analgesi, som vil bli gitt umiddelbart før kirurgi.
  4. Plasser en mus inn i induksjonskammeret.
  5. Slå på oksygenbeholderen og bedøvelsesvaporisatoren for å bedøve musen i induksjonskammeret. Opprettholde isofluran nivået ved 2%. Det tar 3-5 minutter før musen stopper å bevege seg.
    1. Mens musen er anestetLegg et mindre stykke sterilt kirurgisk draperi (24 tommer x 24 tommer) under stereomikroskopet for å skape en kirurgisk overflate. Legg deretter et akryl kirurgisk brett (som er rengjort med 70% alkohol) på den draperte overflaten. Kirurgisk brettet bør derfor være på varmeputen, men adskilt av to lag med kirurgiske gardiner.
  6. Når musen slutter å bevege seg i induksjonskammeret, overfør musen til et pre-kirurgisk preparatområde og plasser nesen i nesekegelen forbundet med fordamperen (2% isofluran). Fjern håret rundt livmorhalsområdet ved hjelp av en elektrisk trimmer eller hårfjernings lotion. Vi anbefaler hårfjerning av lotion fordi denne metoden ikke vil produsere løse hårbiter, noe som er vanskelig å fjerne helt fra kirurgisk området.
  7. Med nesekeglen på plass, flytt musen til kirurgisk brettet.
    1. Tape ned høyre og venstre forpote til kirurgisk bord. Tape ned begge bakbeneneDer på høyre side av musen. Dette forårsaker en liten rotasjon av musekroppen slik at venstre side av nakkeområdet på musen blir bedre posisjonert for kirurgi.
  8. Desinfiser snittområdet med 70% alkohol, klorhexidin kirurgisk skrubbe og igjen med 70% alkohol. Dekk musen med en sterilisert kirurgisk drape bortsett fra det cervicale snittområdet.
  9. Bekreft ved tå klemme at musen er fullbedøvet og gi analgetika (Caprofen 3-5 mg / kg) via intraperitoneal eller subkutan injeksjon.
  10. Under disseksjonsmikroskopet, lage en ventral midtlinje snitt rundt livmorhalsområdet med enten en skalpell eller iris saks.
    MERK: Vi bruker saks fordi arbeidsavstanden til stereomikroskopet er begrenset, noe som gjør det vanskelig å bruke en skalpell.
  11. Utsett venstre felles halspulsår (LCCA) ved å skyve til side og reposisjonere spyttkjertlene som dekker blodkarene til venstre på aNimal.
  12. Identifiser alle blodkarene i det kirurgiske feltet ( Figur 1 ). LCCA bifurcates inn i den venstre indre halspulsåren (ICA) og den venstre eksterne halspulsåren (ECA). Den overfladiske skjoldbruskkjertelarterien (STA) oppstår fra ECA på medial side. Den occipital arterien (OA) oppstår vanligvis fra ECA, men i noen mus oppstår det fra ICA.
  13. Ligate alle arterie grener unntatt OA ved hjelp av sterilisert 6-0 silke sutur. For å oppnå dette, gjør følgende to ligeringer.
    1. Fjern forsiktig bindevevet rundt og under den venstre indre halspulsåren (ICA). Ta et stykke forgjenget 6-0 silkesutur (~ 2,5 cm) med tang og pass det under arterien. Bruk et annet par tanger, trekk suturen omtrent 1/3 av lengden og ligat arterien.
    2. Fjern bindevevet rundt den venstre ytre halspulsåren (ECA) på samme måte som beskrevet ovenfor, og gjør en ligering proksimal til venstre overlegen thyroiD arterie (STA) ( figur 1 ). Vær forsiktig så du ikke skader nervefibre som går innenfor det kirurgiske feltet.
  14. Når disse ligasjonene er blitt gjort, returner spyttkjertlene til den opprinnelige posisjonen og hydrater det kirurgiske feltet ved å plassere 2-3 dråper steril saltvann. Lukk huden med 6-0 belagte vicryl suturer.
  15. Etter operasjonen, plasser musen i forvarmet bur (se 1.2.1). Musen skal våkne opp innen 5 minutter og begynner å gå rundt. Når du har bekreftet at musen oppfører seg normalt, ta buret til dyrets boligerom.
  16. Følg musen daglig for de første tre dagene av gjenoppretting. Musen kan holdes så lenge eksperimentet krever under de forskjellige forholdene som den eksperimentelle protokollen krever. En ansiktspreparat kan gjøres når som helst etter operasjonen.

2. En ansikt Immunostaining

  1. Euthaner en mus med CO 2 ved innånding av overdosering.
  2. Tape musen i en liggende (mageside opp) posisjon på et dissekasjonsbord.
  3. Utsett bukhulen ved å lage en midtlinje snitt ved hjelp av iris saks.
  4. Utsett thoracic hule ved å kutte ribber i sidelengs til brystbenet.
  5. Gjør et kjeft i vena cava eller kutt en av femorale arteriene for drenering av blod.
  6. Sett inn en 26 G nål festet til en gravitasjons perfusjonsoppsett (120 cm vanntrykk) inn i toppunktet i venstre ventrikel og perfusjon sirkulasjonssystemet med saltoppløsning inneholdende heparin (40 U / mL). Fortsett perfusjonen til saltvannet som strømmer ut fra kuttet blir klart.
  7. Bytt perfusjonssystemet fra saltvann til fikseringsoppløsningen som inneholder 4% paraformaldehyd i PBS (fosfatbuffet saltvann) og fortsett perfusjon i 5 minutter.
  8. Høst aorta og både venstre og høyre halspulsårer ved hjelp av stumpe saks og tanger, og sett i et 50 ml konisk rør som inneholder fikseringsmiddelet på is.
  9. Figur 2 ).
  10. Overfør hvert fartøy separat til en brønn i en brønn med 12 brønner som inneholder 0,5 ml av en permeabiliserende oppløsning (0,1% Triton X-100 i PBS) per brønn. Permeabiliser blodkar i 10 minutter med rocking ved romtemperatur (RT).
  11. Vask kort med PBS.
  12. For å blokkere ikke-spesifikke antistoffbindingssteder, inkuber blodkar i 10% normalt serum fra dyreartene der de sekundære antistoffene er blitt gjort, i TTBS (Tris-bufret saltvann (TBS) med 2,5% Tween 20) i 30 minutter med Rocking på RT.
  13. Inkubér beholdere med de primære antistoffene hensiktsmessig fortynnet i TTBS med 10% normalt serum (som beskrevet ovenfor) over natten med rocking ved 4 ° C. NivåetAv fortynning må bestemmes for hvert antistoff.
  14. Utfør følgende kontrollfarging.
    1. Inkubere kar med TTBS i stedet for et primært antistoff etterfulgt av inkubering med et sekundært antistoff.
    2. Inkubere kar med TTBS som inneholder ikke-immun (eller forimmun) serum eller Ig av samme dyr (arter) der primære antistoffer er blitt gjort, etterfulgt av inkubering med et sekundært antistoff.
    3. Fjern inkuberingen med et sekundært antistoff. Disse kontrollprøver må håndteres på samme måte og samtidig når farging med spesifikke antistoffer utføres.
  15. Vask blodårene 3 ganger med TTBS i 10 minutter hver med rocking ved RT.
  16. Inkuber med fluorescensmerkede sekundære antistoffer som er fortynnet hensiktsmessig i TTBS med 10% normalt serum (som beskrevet ovenfor) i 1 time med rocking ved RT. Kjernefarging med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) kan samtidig utføres enT dette trinnet ved å tilsette 1/5000 volum av en DAPI stamløsning som inneholder 5 mg / ml DAPI i H20.
  17. Vask 3 ganger med TTBS i 10 minutter hver med rocking ved RT.
  18. Skyll kort i PBS.
  19. Plasser en dråpe av anti-fade reagens på et dekselglass (22 mm x 50 mm) og plasser et blodkar på dekselglasset med endotelet vendt nedover.
  20. Plasser et glideglass (22 mm x 75 mm) på blodkaret mens du unngår fange bobler.
  21. Plasser lysbildet på et rent laboratorietørkemiddel ( f.eks. Kimwipe) og dekk glidebryteren med to stykker laboratorietørk. Legg forsiktig 3,5 kg med vekt ( f.eks. Bruk en flaske vann på en tykk bok.) På lysbildet i maksimalt 5 minutter for å flate blodprosjektet med en ansikt.
  22. Fjern vekten og tørk av overflødig løsning fra rundt dekselet.
  23. Påfør neglelakk ved de 4 hjørnene på dekselet, plasser lysbildene i en lysbilde, deksel på siden og hold deg i mørket ved RT(Eller 4 ° C) over natten. Denne prosessen flater vevet videre og gjør det lettere å gjøre mikroskopi ved høye forstørrelser.
  24. Tett forseglingslokken helt med neglelakk.
  25. Utfør mikroskopi så snart neglelaket er tørt.
  26. Hvis det er nødvendig, lagre lysbildene ved -20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et typisk en-ansikt immunofluorescensbilde av endotelet er vist i figur 3 . Dette bildet viser en enkelt optisk del av en musaorta tatt nær åpningen av en intercostal arterie (det store mørke eggformede området). Aorta ble dobbeltfarget med anti-VE-kadherin (grønt) og anti-VCAM-1 (vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1) (rødt). Hver endotelcelle er skissert med en grønn lineær farging ved adherensforbindelsen. På grunn av mindre ujevnhet i prøven, er noen adherensforbindelser utenfor denne optiske delen. Anti-VCAM-1-farging er sterkere ved åpningen av intercostalarterien hvor det er kjent at forstyrret blodstrøm forekommer. Figur 4 viser ansiktsfarging av karoten arterier med anti-VE-kadherin (grønn), anti-VCAM-1 (rød) og DAPI (lilla). Den venstre karoten arterien (LCA) ble delvis ligert mens den høyre karoten arterien (RCA) var uberørt. Beholderprøver ble laget 1 dag etter Kirurgi og flekker. Merk økt anti-VCAM-1-farging i det ligerte karet. Prøver fargede immunofluorescens med forskjellige antistoffer kan brukes til å undersøke ekspressionsnivået av proteiner av interesse, omfanget av posttranslasjonelle modifikasjoner av målproteiner og selvfølgelig mønsteret for lokalisering av forskjellige proteiner i endotelcellene så vel som i andre celler i Blodkarveggen 10 , 11 .

Figur 1
Figur 1 : Detaljert fartøyanatomi i musens livmorhalsområde. Det vaskulære nettverket før og etter disseksjon er vist til venstre. Alle arteriene er identifisert i diagrammet vist til høyre. Svarte linjer indikerer ligasjoner. Skala: 1 divisjon = 1 mm._blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Diagram som viser hvordan carotidarterier og aorta blir gjort til ansiktspreparasjoner. Stiplede linjer langs fartøyets vegg indikerer kutt som skal gjøres for å åpne opp fartøyene. De fargede mikrografene viser faktiske en ansikts forberedelser. Skala: 1 divisjon = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: En En- ansiktsbilde av endotelet farget med anti-VE-kadherin (grønt) og anti-VCAM-1 (rødt). En konfokal enkel optisk del av endotelceller i nærheten av en intercostal åpning ervist. Legg merke til at VCAM-1-ekspresjonen økes i endotelceller som befinner seg ved fartøyets grenpunkt hvor blodstrømmen ikke er laminær. Bildet ble registrert ved hjelp av en objektiv objektiv på 60 x (NA 1,4, olje). Skalbjelke = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: En ansiktsbilder av venstre og høyre karotidarterier som er farget med anti-VE-kadherin (grønn), anti-VCAM-1 (rød) og DAPI (lilla). Den venstre karoten arterien ble delvis ligert og den rette karoten ble etterlatt intakt. Disse ansiktspreparatene ble gjort 24 timer etter operasjonen. Økt ekspression av VCAM-1 på den ligerte siden sammenlignet med det intakte karet er tydelig. Disse bildene ble tatt i nærheten av bifurcation av vanlige karotisarterier avVed hjelp av et laserskannende konfokalmikroskop med en objektivlinse på 60 x (NA 1,4, olje). Skalestenger = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når du håndterer museblodkar, er det viktig å huske at endotelet er skjøre, og at enhver overdreven mekanisk kraft vil skade endotelceller. Endotelcellene bryter for eksempel av eller løsner fra karveggen hvis karet blir perfusert for kraftig, noe som lett kan skje når karet blir perfusjonert ved hjelp av en hånddrevet sprøyte.

For å oppnå konstant perfusjonstrykk bruker vi et tyngdekraftsperfusjonssystem med 120 cm vannkolonne trykk. Det er blitt rapportert at det gjennomsnittlige arterielle trykket av en mus, som avviker fra stamme, varierer mellom 130 og 170 cm H2014. Således er perfusjonstrykket vi bruker litt mindre enn det målte arterielt trykk. Når vi perfusjons-fikserte rotte-aorta ble 90 cm H20-kolonne trykk brukt 6 .

In situ endotelceller er også skadet dersom fartøyet strekkes under høsting, Rengjøring, langsgående splitting, immunostaining og montering. Faktisk er mekanisk skade en av de vanligste årsakene til å miste endotelceller i ansiktspreparater. Fartøyets strekk kan forekomme på hvilket som helst trinn i løpet av prosedyren, men oftest forekommer det på tidspunktet for høsting av fartøyet. Det er også lett å strekke fartøyet når du fjerner fettvev festet til adventitia.

En ansiktspreparat fremstilles ved å kutte et fartøy langsgående langs hele lengden. Dette gjøres vanligvis ved hjelp av skarpe oftalmiske saks. Spissen av sakse kan imidlertid være for stor dersom målkarrets indre diameter er liten. I et slikt tilfelle kan man bruke et brukket tynt engangs barberblad for å lage et kutt. Vi har brukt denne teknikken til å lage ansiktspreparater av chick mesenteric artery 15 .

Etter fiksering permeabiliseres en ansiktspreparat. Vanligvis brukes PBS som inneholder Triton X-100Dette formål, men det er mulig å anvende andre permeabiliseringsreagenser som Tween-20, Nonidet P-40, saponin, digitonin og Leucomerm. Ideelt sett bør permeabiliseringsforholdet optimaliseres i hvert laboratorium. For mus aorta og karotisarterier behandler vi dem med PBS som inneholder 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved RT, og denne behandlingen er tilstrekkelig til å permeabilisere alle cellene i karvegveggen. Permeabiliserte prøver blir så sekvensielt behandlet først med et primært antistoff og deretter et sekundært antistoff som er fluorescensmerket. For farging av muskasser er det kritisk at det primære antistoffet ikke er laget i mus fordi musens vaskulære vev vil inneholde mus IgG som vil bli merket av det fluorescensmerkede sekundære anti-mus-IgG som forårsaker høy bakgrunnsfarvning. For mikroskopi bør prøven være så flat som mulig. Vi trykker lysbilder i 5 min med 3,5 kg vekt. Denne spesifikke vekten ble bestemt empirisk.

WHøne og ansiktspreparater er merket immunofluorescens, de kan studeres ved bruk av et vanlig epifluorescensmikroskop, et laserskanningskonokulært mikroskop, og et multiphotonmikroskop. Konfokal mikroskopi er best å skaffe bilder av endotelet og subendotelialområdet opptil 50 μm eller så fra fartøyets overflate, mens dyp penetrasjon av eksitasjonslyset oppnådd ved multiphoton-modusen for belysning gjør det mulig for en å oppnå in-fokusbilder fra dybden av Opptil 2 mm fra fartøyets veggoverflate. I tillegg kan multiphotonmikroskopi brukes til andre harmoniske avbildninger, mest typisk for å studere kollagenfiberorganisering i fartøyets vegg. En ansikts forberedelser er store, slik at vi kan undersøke et stort vaskulært område som hele lengden av aorta. Dette er noen av fordelene ved å bruke immunofluorescensfarget ansikt-blodkarpreparater. Det er imidlertid noen ulemper med denne teknikken. Først av alt er metoden begrenset tilTilgjengeligheten av spesifikke antistoffer og andre fluorescensmerkede reagenser som fluorescerende phalloidin, DAPI og DiI-Ac-LDL (acetylert lavt densitet lipoprotein merket med 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametyl-indokarbocyanin perklorat). Siden bildebehandling er basert på fluorescens, kan ikke-fluorescerende deler av prøver ikke avbildes. Hele fjellprovene viser generelt autofluorescens, og elastinfibre som finnes i store blodkar fluorescerer i grønt. Denne fluorescensen er spesielt problematisk ved bruk av et epifluorescensmikroskop; Derfor anbefales det å være avbildning av et konfokalmikroskop. Innblanding av denne grønne autofluorescensen kan imidlertid reduseres betydelig ved bruk av sekundære antistoffer merket med et rødt fluorescerende fargestoff. Til slutt, siden en ansiktsprøve er tykk, er det ikke mulig å forestille seg ved overført belysning.

Kommersielle konfokale og multiphoton mikroskoper leveres med bildeanalyses programvare inkludertEn for kvantitativt analyse av fluorescerende intensitet av bilder. Kvantifiserte data er mer pålitelige hvis sammenligninger gjøres innenfor samme lysbilde. Dette er fordi alle betingelsene for immunostaining er de samme for prøven. Hvis det må sammenlignes fargestyrke mellom ulike lysbilder (for eksempel normale vs syke fartøyer), er den eneste måten å validere dataene, å øke utvalgstallene, slik at både tekniske og biologiske variasjoner kan bli gjennomsnittet. Generelt er intensitetsmålinger på konfokale bilder oppnådd nær overflaten av fartøyer mer pålitelige. Fluorescerende intensiteter av bilder oppnådd fra dypere områder av vev har en tendens til å være mer variabel på grunn av forskjellige grader av spredning og absorpsjon av både eksitasjon og emittert fluorescerende lys. Generelt må man være forsiktig med å tolke subtile intensitetsforskjeller oppdaget i de dype områdene av prøvene. For å forbedre imaging evne fra dypere områder av vev, forsøkene blir gjort for å gjøre tProblemer gjennomskinnelig, og noen imponerende bilder har blitt oppnådd (for eksempel se en nylig artikkel av Neckel et al. 16 og papirer som er kalt av disse forfattere). Selv om det er mulig at behandlingene som brukes til å gjøre vev gjennomskinnelig, kan trekke visse antigener og / eller denaturere visse epitoper, kan denne metoden brukes til å få mer reproduserbare fluorescerende signaler fra dypere områder av vev.

Bruken av ansiktspreparater er ikke begrenset til avbildning ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Ved hjelp av et stereomikroskop kan en ansiktsbeholderpreparat brukes til å studere omfanget av aterosklerotisk plakkdannelse etter farging av dem med Olje Rød O. En ansiktsbeholderpreparat kan fremstilles aseptisk. Slike preparater kan holdes i kultur og kan brukes som et ex vivo system for å studere leukocyt-endotelcelleinteraksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Forfatterens forskningsaktiviteter støttes av stipend fra National Institute of Health til Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag Fisher Scientific NC9788429
12-well plates Fisher Scientific 12556005
6-0 coated vicryl suture Ethicon J833G
AF488 goat anti-rat IgG  Life Technologies A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG  Life Technologies A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad) BD Biosciences BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG Santa Cruze Biotechnology Sc-8304
Aoto Flow System Braintree Scientific EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch Cardinal Health 4024
Blunt retractors, 2.5 mm wide Fine Science Tools 18200-10
Caprofen (Rimadyl)  zoetis NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2% Med-Vet International RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2 x 2 Cardinal Health KC2146
Electric heating pad, 12 x 14 Fisher Scientific NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps Fine Science Tools 11152-10
Iris Scissors Fine Science Tools 14090-11
Micro cover glass 22 mm x 50 mm VWR 48393059
Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-18
normal goat serum Equitech-Bio GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS Santa Cruze Biotechnology SC-281692
Petri dishes 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI Life Technologies P-36935
Puritan cortton swabs VWR 10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators VWR 82004-050
Round handled Needle Holder Fine Science Tools 12076-12
Silk Suture 6/0 Fine Science Tools 18020-60
Spring scissors ROBOZ RS-5601
Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-09
Super Grip Forceps Fine Science Tools 00649-11
Transparent Dressing Cardinal Health TD-26C
Triton X-1000 Fisher Scientific AC327371000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
  2. Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
  3. Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
  4. Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
  5. Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
  6. White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
  7. Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
  8. Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
  9. Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
  10. Heo, K. -S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
  11. Le, N. -T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
  12. Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
  13. Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
  14. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
  15. Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
  16. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).

Tags

Grunnprotokoll utgave 123 aorta karotisarterie endotelceller en ansikt immunfluorescenspreparat
<em>En</em> ansiktsbehandling av museblodfartøy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ko, K. A., Fujiwara, K., Krishnan,More

Ko, K. A., Fujiwara, K., Krishnan, S., Abe, J. i. En Face Preparation of Mouse Blood Vessels. J. Vis. Exp. (123), e55460, doi:10.3791/55460 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter