Summary
Ett förfarande för framställning av ansiktspreparat av muskelkarotidartären och aorta beskrivs. Sådana preparat, när immunofluorescens färgas med specifika antikroppar, möjliggör oss att studera lokalisering av proteiner och identifiering av celltyper inom hela vaskväggen genom konfokal mikroskopi.
Abstract
Sektioner av paraffininbäddade vävnader används rutinmässigt för att studera vävnadshistologi och histopatologi. Det är emellertid svårt att bestämma vad den tredimensionella vävnadsmorfologin är från sådana sektioner. Dessutom kan de undersökta vävnaderna inte innehålla regionen inom vävnaden som är nödvändig för den pågående studien. Denna senare begränsning hindrar histopatologiska studier av blodkärl eftersom kärlskador utvecklas på ett fokaliserat sätt. Detta kräver en metod som gör det möjligt för oss att undersöka ett brett område av blodkärlets vägg, från dess yta till djupare områden. En fullständig montering av ansiktsbehandling av blodkärl uppfyller detta krav. I denna artikel kommer vi att visa hur man gör ansiktspreparationer av musa aorta och halspulsådern och att immunofluorescensa dem för konfokal mikroskopi och andra typer av fluorescensbaserad bildbehandling.
Introduction
För histopatologiska studier genom ljusmikroskopi bearbetas tredimensionella bitar biologiska vävnader rutinmässigt för paraffininkonstruktion följt av snittning och färgning. Ett vävnadsprov som har blivit paraffinerat kan vara flera millimeter i alla tre dimensionerna. För ljusmikroskopiens syfte måste det emellertid först snittas så att ljuset kan passera och färgas så att den tunna sektionen ger tillräckligt med kontrast för bildbehandling. Eftersom snittprover normalt är 5-10 μm i tjocklek ser man endast en mycket liten del av hela provet i två dimensioner åt gången. Det är möjligt att samla sekventiella sektioner och, efter bildbehandling av varje sektion individuellt, utföra datorstödd rekonstruktion av 3D-bilderna, men detta är ett tråkigt jobb faktiskt. Histopatologi av blodkärl, speciellt för att studera patogenes av ateroskleros, presenterar unika problem. Ateroskleros är en fokaliserad sjukdom som utvecklasLokalt i områden där stört blodflöde uppstår. Vidare initieras sjukdomen inom intima, en tunn vävnad bestående av ett monoskikt av endotelceller och extracellulär matris, av stora artärer. Av dessa skäl är det en utmaning att lokalisera och studera tidiga lesioner med hjälp av sektionerade blodkärl, eftersom man lätt kan missa att skära av lesionen. Även om en sektion inkluderar ett sjukt område kommer man endast att se en 5-10 pm del innehållande endotelceller och andra vaskulära väggceller i media och adventitier.
Förberedelser för fullständigt monterad ansikte (uttalad än fäs) gör det möjligt för oss att undersöka ett stort område av blodkärlsytan, såsom hela aortan från aorta-roten hela vägen ner till de gemensamma iliacartärerna. Genom att använda ett sådant prov färgat med specifika antikroppar och andra specifika sonder kan man bestämma läget av lesioner och även där olika molekylära händelser förekommer i endotelceller i samband med wiAtherogenesen, såsom förändringar i uttrycket, lokalisering och posttranslationella modifieringar av proteiner. Förutom att studera atherogenes användes endotelcellsformen observerad i en ansiktsberedningar som en indikator på det regionala medeltalet blodflödesmönster. Sådan data är viktiga för att studera mekanosignalering av endotelceller in situ. För detta ändamål är rutinhistologiska tvärsnittsblodkärl inte användbara. Således är det för kärlsmedicin och biologi särskilt viktigt att förvärva en teknik för framställning av ansiktspreparat av blodkärl som gör att man kan observera ett brett område av kärlytan såväl som de djupare underytorna hos kärlet.
Som granskat av Jelev och Surchev 1 har vaskulära biologer utvecklat olika metoder för att observera framkallningen av blodkärl. Några geniala metoder utvecklades på 1940-talet och 1950-talet. Med hjälp av dessa metoder var de Kunna studera den grundläggande organisationen av endotelceller som leder blodkärlens inre yta. På grund av det sätt på vilket dessa ansiktsberedningar förbereds (den så kallade Hautchen-metoden 2 , 3 , 4 eller avskalning av kärlytan 5 ) och hur provet färgades var det inte alltid möjligt att erhålla oavbruten morfologisk Information från kärlytan till de djupare områdena av blodkärlets vägg. Helmontering och ansiktsbehållarberedning kombinerat med immunofluorescensfärgning tillät oss att inte bara studera endotelcellmorfologi och proteinuttryck och lokalisering i dessa celler utan också att utvidga sådana studier till kärlväggens subendoteliala region. Tidiga studier med blodkärl och ansiktsberedningar började färgas immunoflurescently i 1980-talet 6 ,F "> 7. Med framkomsten av laserskanning av konfokal mikroskopi och mer nyligen multiphotonmikroskopi kan man nu få tydliga in-fokusbilder av blodkärlets väggstruktur i immunofluorescensfärgade prov i ansiktsbehållare såväl som det vaskulära nätverket i levande djur 8 , 9 , 10 , 11. Dessa datorbaserade bildtekniker skapar optiska sektionsbilder i fokus och genom att stapla upp sådana bilder kan man få rekonstruerade 3D-bilder av kärlväggen och det vaskulära nätverket i vävnader. Dessutom är en Kan generera bilder av en sektion gjord längs Z-axeln hos den rekonstruerade bilden 12 , 13 .
I denna artikel kommer vi att illustrera en metod för att förbereda ansiktsberedningar av musaorta och halspulsådern för immunofluorescerande färgning. En ansiktsberedningarKan göras även efter att dessa kärl har manipulerats experimentellt. Till exempel kan en carotidartär ligeras delvis och därefter en ansiktsberedning gjord efter en sådan operation. Av denna anledning kommer vi också att beskriva i denna artikel hur vi gör en partiell ligation på halspulsådern. Jämfört med att göra liknande preparat från större djur, såsom råttor, kaniner och människor, är muskärl små i storlek och mer bräckliga, vilket kräver ytterligare omsorg för hantering under kirurgisk isolering av kärl och förberedande för antikroppsfärgning och mikroskopi. Eftersom den vanligaste djurmodellen för genetisk modifiering är musen, blir det viktigt för många utredare att hantera muskärl utan att skada dem. I det här manuskriptet kommer vi att beskriva hur man hanterar muskärl när man gör ansiktspreparat av musa aorta och halspulsådern. I demonstrationens syfte kommer vi att använda vildtyp C57 / b6-möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen för muspartiell carotidartärligering och isolering av musaorta och karotidartären för immunförsvagning i ansiktet godkänns av Institutional Animal Care and Use Committee (IBT 2014-9231).
1. Vänster Partiell Carotid Arteriligering
- Förbered det kirurgiska utrymmet genom att placera en 12 tum x 14 tums värmepanna på bordet och täcka dynan och bordsskivan med en stor ren kirurgisk draperi. Ställ in armens arm så att stereomikroskopets synfält befinner sig i värmepannaens mittområde.
- Sätt på värmeskyddet på bordet och sätt 3-inställningsreglaget till medeltemperaturvärme. Vid denna temperaturinställning kommer den kirurgiska styrytan (se 1.6.1) att vara 38-40 ° C.
- Placera en ren bur på en annan värmepanna. Vänd upp värmeplattan som ovan. Denna bur kommer att användas för återhämtning efter operationen (se 1.16) samt bostäder.
- Väg en mus. Kroppsvikten är nödvändig för att bestämma lämplig mängd analgesi, som kommer att administreras omedelbart före operationen.
- Placera en mus i induktionskammaren.
- Slå på syrgasbehållaren och bedövningsförångaren för att bedöva musen i induktionskammaren. Behåll isofluranhalten vid 2%. Det tar 3-5 minuter innan musen slutar röra sig.
- Medan musen är anesthePlacera en mindre bit steril kirurgisk draperi (24 tum x 24 tum) under stereomikroskopet för att skapa en kirurgisk yta. Lägg sedan en akryl kirurgisk bräda (som har rengjorts med 70% alkohol) på den draperade ytan. Den kirurgiska styrelsen bör därför vara på värmepuden men separeras av två lager av kirurgiska draperier.
- När musen slutar röra sig i induktionskammaren, överför musen till ett förkirurgiskt förberedelsesområde och placera näsan i näskonan ansluten till förångaren (2% isofluran). Ta bort håret runt livmoderhalsområdet med en elektrisk trimmer eller hårborttagare. Vi rekommenderar hårborttagande lotion eftersom den här metoden inte kommer att producera lösa hårbitar, som är svåra att helt ta bort från operationsområdet.
- Med näskonan på plats, flytta musen till kirurgisk bräda.
- Tape ner höger och vänster frampoten till kirurgiska brädan. Tape ner båda bakbenens takDär på höger sida av musen. Detta orsakar en liten rotation av muskroppen så att vänster sida av muskets nackområde blir bättre positionerad för operation.
- Desinficera snittområdet med 70% alkohol, kirurgisk skrubbhexidin och igen med 70% alkohol. Täck musen med en steriliserad kirurgisk draperi förutom den livmoderhalsiga snittet.
- Bekräfta med tån nypa att musen är fullständigt bedövad och ge analgesi (Caprofen 3-5 mg / kg) via intraperitoneal eller subkutan injektion.
- Under dissekeringsmikroskopet, gör en ventral mittlinje snitt runt livmoderhalsområdet med antingen en skalpell eller iris sax.
OBS! Vi använder sax eftersom stereomikroskopets arbetsavstånd är begränsat vilket gör det svårt att använda en skalpell. - Exponera den vänstra gemensamma halshinnan (LCCA) genom att trycka åt sidan och omplacera spyttkörtlarna som täcker blodkärlen till vänster om aNimal.
- Identifiera alla blodkärl i det kirurgiska fältet ( Figur 1 ). LCCA bifurcates i vänster inre halspulsådern (ICA) och vänster yttre halspulsådern (ECA). Den ytliga sköldkörtelkärlen (STA) uppstår från ECA på den mediala sidan. Den occipitala artären (OA) uppstår vanligtvis från ECA, men hos vissa möss uppstår det från ICA.
- Ligera alla artärgrenar utom OA med användning av steriliserad 6-0 silkesutur. För att uppnå detta, gör följande två ligeringar.
- Ta försiktigt bort bindväven runt och under vänster inre halspulsåren (ICA). Ta en bit av precut 6-0 silkesuture (~ 2,5 cm) med tång och passera den under artären. Använd ett annat par tångar, dra suturen ungefär 1/3 av dess längd och ligera artären.
- Ta bort bindväv runt den vänstra externa halspulsådern (ECA) på samma sätt som beskrivits ovan och gör en ligering proximal till vänster överlägsen thyroiD artär (STA) ( Figur 1 ). Var försiktig så att du inte skadar nervfibrer som löper inom det kirurgiska området.
- När dessa ligeringar har gjorts, returnera spyttkörtlarna till ursprunglig position och hydratisera det kirurgiska fältet genom att placera 2-3 droppar steril saltlösning. Stäng huden med 6-0-belagda vicryl suturer.
- Efter operationen placerar du musen i föruppvärmd bur (se 1.2.1). Musen ska vakna inom 5 min och börja gå runt. När du väl har bekräftat att musen beter sig normalt, ta med buret till djurhuset.
- Observera musen dagligen för de första tre dagarna av återhämtning. Musen kan hållas så länge som experimentet kräver under de olika förhållanden som det experimentella protokollet kräver. En ansiktsberedning kan göras när som helst efter operationen.
2. En Face Immunostaining
- Euthanisera en mus med CO 2 genom inandning överdosering.
- Tape musen i en bakre (magen sida upp) position på ett dissekta bord.
- Exponera bukhålan genom att göra ett mittlinje snitt med iris sax.
- Utsätt thoraxhålan genom att klippa ribborna i sidled mot bröstbenet.
- Smeka i vena cava eller skär en av femorala artärer för att tömma blod.
- Sätt i en 26 G-nål som är fäst vid en gravitationsprimeringsinstallation (120 cm vattentryck) i vänster ventrikelns topp och perfusera cirkulationssystemet med saltlösning innehållande heparin (40 U / mL). Fortsätt perfusionen tills saltlösningen som strömmar ut från klippet blir klar.
- Byt perfusionssystemet från saltlösning till fixeringslösningen innehållande 4% paraformaldehyd i PBS (fosfatbuffrad saltlösning) och fortsätt perfusera i ytterligare 5 minuter.
- Skär aorta och både vänster och höger halspulsåder med hjälp av trubbiga ändar och pincett och placera i ett 50 ml koniskt rör innehållande fixativet på is.
- Överför varje kärl separat till en brunn i en brunn med 12 brunnar innehållande 0,5 ml av en permeabiliserande lösning (0,1% Triton X-100 i PBS) per brunn. Permeabilisera blodkärl i 10 minuter med gungning vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta kort med PBS.
- För att blockera icke-specifika antikroppsbindningsställ, inkubera blodkärl i 10% normalt serum från djurarterna i vilka de sekundära antikropparna har gjorts, i TTBS (Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 2,5% Tween 20) under 30 min med Rockar vid RT.
- Inkubera kärl med de primära antikropparna på lämpligt sätt utspädd i TTBS med 10% normalt serum (som beskrivet ovan) över natten med rockning vid 4 ° C. NivånAv utspädningen måste bestämmas för varje antikropp.
- Utför följande kontrollfärgning.
- Inkubera kärl med TTBS istället för en primär antikropp följt av inkubation med en sekundär antikropp.
- Inkubera kärl med TTBS innehållande icke-immun (eller före immun) serum eller Ig av samma djur (art), i vilka primära antikroppar har gjorts, följt av inkubering med en sekundär antikropp.
- Ta bort inkubationen med en sekundär antikropp. Dessa kontrollprover måste hanteras på samma sätt och samtidigt som färgning med specifika antikroppar utförs.
- Tvätta blodkärl 3 gånger med TTBS i 10 minuter vardera med rockning vid RT.
- Inkubera med fluorescensmärkta sekundära antikroppar utspädda på lämpligt sätt i TTBS med 10% normalt serum (som beskrivet ovan) under 1 timme med rockning vid RT. Kärnfärgning med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) kan samtidigt utföras enT detta steg genom att tillsätta 1/5 000 volymprocent av en DAPI stamlösning som innehåller 5 mg / ml DAPI i H2O .
- Tvätta 3 gånger med TTBS i 10 min vardera med rockning vid RT.
- Skölj kort i PBS.
- Placera en droppe av anti-blekreagenset på ett täckglas (22 mm x 50 mm) och placera ett blodkärl på lockglaset med endotelet vänd nedåt.
- Placera ett glidglas (22 mm x 75 mm) på blodkärlet medan du undviker fångstbubblor.
- Placera bilden på en ren laboratorieavtorkning ( t.ex. Kimwipe) och täck glidret med två bitar av laboratorieavtorkning. Placera försiktigt 3,5 kg av vikt ( t.ex. använd en flaska vatten på en tjock bok.) På glidbanan i högst 5 min för att plana provet i ansiktet av blodkärlet.
- Ta bort vikten och torka av överflödig lösning från runt täckglaset.
- Applicera nagellack på de fyra hörnen av täckglaset, placera glidskydden i en glidlåda, täck omslagsidan uppåt och håll i mörkret vid RT(Eller 4 ° C) över natten. Denna process plattar vävnaden ytterligare och gör det lättare att göra mikroskopi vid höga förstoringar.
- Täta täckglaset helt med nagellack.
- Utför mikroskopi så snart nagellacket är torrt.
- Vid behov lagra glidbanorna vid -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk ansiktsimmunofluorescensbild av endotelet visas i figur 3 . Denna bild visar en enda optisk del av en musaorta i närheten av öppningen av en interostalartär (det stora mörka äggformade området). Aortan var dubbelfärgad med anti-VE-cadherin (grön) och anti-VCAM-1 (vaskulär celladhesionsmolekyl-1) (röd). Varje endotelcell skisseras med en grön linjär färgning vid adherensförbindelsen. På grund av mindre ojämnheter i provet är några adherens-korsningar utanför denna optiska sektion. Anti-VCAM-1-färgning är starkare vid öppningen av den interkostala artären där stört blodflöde är känt att inträffa. Figur 4 visar ansiktsfärgning av carotidartärer med anti-VE-kadherin (grön), anti-VCAM-1 (röd) och DAPI (lila). Den vänstra halspulsartären (LCA) ligerades partiellt medan den högra halshinnan (RCA) var orörd. Fartygsproverna gjordes 1 dag efter Kirurgi och färgad. Observera ökad anti-VCAM-1-färgning i det ligerade kärlet. Prov som färgas immunofluorescens med olika antikroppar kan användas för att undersöka expressionsnivån av proteiner av intresse, graden av posttranslationella modifieringar av målproteiner och naturligtvis mönstret för lokalisering av olika proteiner inuti endotelceller såväl som i andra celler inom Blodkärlvägg 10 , 11 .
Figur 1 : Detaljerad fartygsanatomi i muscervikalområdet. Det vaskulära nätverket före och efter dissektion visas till vänster. Alla artärer identifieras i diagrammet som visas till höger. Svarta linjer indikerar ligeringar. Skala: 1 division = 1 mm._blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Diagram som visar hur paraplyarterier och aorta görs i ansiktsberedningar. Stipade linjer längs kärlväggen indikerar skär som ska göras för att öppna kärlen. De färgade mikrograferna visar faktiska ansiktsberedningar. Skala: 1 division = 1 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: En En- ansiktsbild av endotelet färgat med anti-VE-kadherin (grönt) och anti-VCAM-1 (rött). En konfokal singel optisk sektion av endotelceller nära en intercostalöppning ärvisad. Observera att VCAM-1-uttrycket ökas i endotelceller som ligger vid kärlgrenens punkt där blodflödet är icke-laminärt. Bilden spelades in med användning av en objektivslins 60X (NA 1.4, olja). Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: En ansiktsbilder av vänster och höger karotidarterier färgad med anti-VE-kadherin (grön), anti-VCAM-1 (röd) och DAPI (lila). Den vänstra halspulsartären ligerades delvis och den högra karoten var kvar intakt. Dessa ansiktsberedningar gjordes 24 h efter operationen. Ökat uttryck av VCAM-1 på den ligerade sidan jämfört med det intakta kärlet är uppenbart. Dessa bilder togs i närheten av bifurcation av vanliga karotidartärer avMed hjälp av ett laserskanningskonokalmikroskop med en objektivlins 60X (NA 1.4, olja). Skalstänger = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid hantering av muskärl är det viktigt att komma ihåg att endotelet är ömtåligt och att alltför kraftig mekanisk kraft kommer att skada endotelceller. Till exempel bryts eller sönder endotelceller från kärlväggen om kärlet perfusioneras för kraftigt, vilket lätt kan hända när kärlet perfuseras med en handdriven spruta.
För att erhålla konstant perfusionstryck använder vi ett gravitetsperspirationssystem med ett tryck på 120 cm vattenkolonn. Det har rapporterats att det genomsnittliga artärtrycket hos en mus, som skiljer sig från stammen, ligger mellan 130 och 170 cm H2O14. Det perfusionstryck vi använder är således något mindre än det uppmätta arteriella trycket. När vi perfusion-fixad råttorort användes 90 cm H2O kolonntryck 6 .
In situ är endotelceller också skadade om kärlet sträcker sig under skörd, Rengöring, längsgående splittring, immunostaining och montering. Faktum är att mekanisk skada är en av de vanligaste orsakerna till att man förlorar endotelceller i ansiktsberedningar. Fartygets sträckning kan inträffa vid vilket som helst steg under proceduren, men oftast sker det vid skörden av fartyget. Det är också lätt att sträcka kärlet när du tar bort adipitvävnaden fäst vid adventitia.
En ansiktsberedningar tillverkas genom att ett kärl skärs längs längs hela sin längd. Detta görs vanligen med hjälp av skarpa ögonhåriga saxar. Dock kan saksens spets vara för stor om målkärlets inre diameter är liten. I sådant fall kan man använda ett sprickat tunt engångs rakblad för att göra en snitt. Vi har använt denna teknik för att göra ansiktspreparat av chick mesenteric artery 15 .
Efter fixering permeabiliseras ansiktspreparat. Vanligtvis används PBS innehållande Triton X-100 förDetta ändamål, men det är möjligt att använda andra permeabiliseringsreagenser, såsom Tween-20, Nonidet P-40, saponin, digitonin och Leucomerm. Helst bör permeabiliseringsförhållandet optimeras i varje labb. För musa aorta och halspulsåder behandlar vi dem med PBS innehållande 0,1% Triton X-100 i 10 minuter vid RT, och denna behandling är tillräcklig för att permeabilisera alla cellerna i kärlväggen. Permeabiliserade prover behandlas sedan sekventiellt först med en primär antikropp och därefter en sekundär antikropp som är fluorescensmärkt. För färgning av muskärl är det kritiskt att den primära antikroppen inte tillverkas i mus eftersom muskelvävnaden kommer att innehålla mus-IgG som kommer att märkas av det fluorescensmärkta sekundära anti-mus-IgG, vilket orsakar hög bakgrundsfärgning. För mikroskopi bör provet vara så platt som möjligt. Vi trycker på bilder i 5 minuter med 3,5 kg vikt. Denna specifika vikt bestämdes empiriskt.
WHöna och ansiktsberedningar märks immunofluorescens, de kan studeras genom att använda ett vanligt epifluorescensmikroskop, ett laserskanningskonokalmikroskop och ett multiphotonmikroskop. Konfokalmikroskopi är bäst att erhålla bilder av endotelet och subendoteliala regionen upp till 50 μm eller så från kärlytan, medan djup penetrering av excitationsljuset som uppnås genom multiphoton-belysningsförmågan möjliggör att man får in-fokusbilder från djupet av Upp till 2 mm från kärlväggen. Dessutom kan multiphotonmikroskopi användas för andra harmoniska avbildning, mest typiskt för att studera kollagenfiberorganisering i kärlväggen. En ansiktspreparat är stor, vilket gör det möjligt för oss att undersöka ett stort kärlområde såsom hela längden av aortan. Dessa är några av fördelarna med att använda immunofluorescensfärgade preparat för ansiktsblodkärl. Det finns emellertid vissa nackdelar med denna teknik. För det första är metoden begränsad tillTillgänglighet av specifika antikroppar och andra fluorescensmärkta reagens, såsom fluorescerande falloidin, DAPI och DiI-Ac-LDL (acetylerad låg densitet lipoprotein märkt med 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametyl-indokarbocyanin perklorat). Eftersom bildbehandling är baserad på fluorescens, kan icke-fluorescerande delar av prover inte avbildas. Hela bergproverna uppvisar generellt autofluorescens och elastinfibrer som finns i stora blodkärl fluorescerar i grönt. Denna fluorescens är särskilt problematisk vid användning av ett epifluorescensmikroskop; Därför rekommenderas avbildning av ett konfokalmikroskop. Inblandning av denna gröna autofluorescens kan emellertid minskas signifikant med användning av sekundära antikroppar märkta med ett rött fluorescerande färgämne. Slutligen, eftersom en ansiktsprov är tjock, är bildbehandling genom överförd belysning inte möjlig.
Kommersiella konfokala och multiphotonmikroskop kommer med bildanalysprogram inklusiveEn för kvantitativ analys av fluorescerande intensitet av bilder. Kvantifierad data är mer tillförlitliga om jämförelser görs inom samma bild. Detta beror på att alla villkor för immunostaining är desamma för provet. Om färgningsintensiteter måste jämföras mellan olika diabilder (till exempel normala vs sjuka kärl) är det enda sättet att validera data att öka provtal så att både tekniska och biologiska variationer kan beräknas i genomsnitt. I allmänhet är intensitetsmätningar på konfokala bilder som erhållits nära kärlets yta mer tillförlitliga. Fluorescerande intensiteter av bilder erhållna från djupare områden av vävnad tenderar att vara mer variabla på grund av olika grader av spridning och absorption av både excitations och emitterat fluorescerande ljus. I allmänhet måste man vara försiktig med att tolka subtila intensitetsskillnader som detekteras i de djupa områdena av prover. För att förbättra avbildningsförmågan från djupare områden av vävnad görs försök att göra tFrågor genomskinliga och några imponerande bilder har erhållits (se till exempel en nyartikel av Neckel et al. 16 och dokument som citerats av dessa författare). Även om det är möjligt att de behandlingar som används för att göra vävnader genomskinliga kan extrahera vissa antigener och / eller denaturera vissa epitoper, kan denna metod användas för att få mer reproducerbara fluorescerande signaler från djupare områden av vävnad.
Användningen av ansiktspreparat är inte begränsad till avbildning genom fluorescensmikroskopi. Med hjälp av ett stereomikroskop kan en ansiktsbehållarberedning användas för att studera omfattningen av aterosklerotisk plackbildning efter färgning av dem med oljerapp O. En ansiktsbehållarberedningar kan framställas aseptiskt. Sådana preparat kan bibehållas i odling och kan användas som ett ex vivo- system för att studera leukocyt-endotelcellsinteraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Författarnas forskningsaktiviteter stöds av bidrag från National Institute of Health till Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
