Summary
Fare karotid arteri ve aortanın yüz öncesi hazırlıkları yapmak için bir prosedür anlatılmıştır. Bu preparatlar, immünofloresan olarak spesifik antikorlarla boyandığında, konfokal mikroskopi ile proteinlerin lokalizasyonu ve tüm vasküler duvar içindeki hücre tiplerinin tanımlanmasını sağlar.
Abstract
Parafin gömülü dokuların bölümleri doku histolojisini ve histopatolojiyi incelemek için rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu tür bölümlerden üç boyutlu doku morfolojisinin ne olduğunu belirlemek zordur. Buna ek olarak, incelenen dokuların kesitleri, devam eden çalışmanın amacı için gerekli doku içindeki bölgeyi içermeyebilir. Bu ikinci sınırlama, damar lezyonlarının fokalize bir şekilde gelişmesi nedeniyle kan damarlarının histopatolojik çalışmalarını engellemektedir. Bu, kan damarı duvarının geniş bir alanını, yüzeyinden derin bölgelerine kadar araştırmamızı sağlayan bir yöntem gerektirir. Kan dolaşımlarının tümüne monte edilmek üzere hazırlanması bu gereksinimi karşılar. Bu makalede, fare aortu ve karotis arterinin yüz hazırlıklarının nasıl yapılacağını ve konfokal mikroskopi ve diğer floresan bazlı görüntüleme türleri için immünofloresan olarak lekelenmelerini göstereceğiz.
Introduction
Işık mikroskopisi ile yapılan histopatolojik çalışmalar için biyolojik dokuların üç boyutlu parçaları düzenli olarak parafin yerleştirilmesi için işlenir ve bunu bölümleme ve boyama izler. Parafinle gömülmüş olan bir doku örneği üç boyutta da birkaç milimetre olabilir. Bununla birlikte, ışık mikroskopisi amacıyla, ışığın geçebileceği ve daha sonra ince bölümün görüntüleme için yeterli kontrast sağlayacak şekilde lekelenmesi için ilk kesit verilmelidir. Kesit örnekleri genelde kalınlığı 5-10 μm olduğundan, her seferinde iki boyutta tüm numunenin çok küçük bir fraksiyonu görülebilir. Sıralı bölümler toplamak ve her bölümü tek tek görüntülemenin ardından 3D görüntülerin bilgisayar destekli yeniden yapılandırılması yapmak mümkündür, ancak bu gerçekten sıkıcı bir iştir. Kan damarlarının histopatolojisi, özellikle ateroskleroz patogenezinin incelenmesi için benzersiz problemler bulunmaktadır. Ateroskleroz gelişen fokalize bir hastalıktırKan akımının bozulduğu yerlerde lokal olarak. Dahası, hastalık, intima içinde, endotel hücrelerinin tek katmanı ve hücre artı matrisinden oluşan ince bir dokuda, büyük arterlerde başlatılır. Bu nedenlerden dolayı, lezyonun kesilmesini kolaylıkla kaçırabileceği için, kesit kan damarları kullanarak erken lezyonları bulmak ve incelemek bir zorluktur. Bir bölüm hastalıklı bir alanı içerse bile, medyada ve adventitide endotel hücreleri ve diğer vasküler duvar hücreleri içeren sadece 5-10 μm'lik bir bölüm göreceksiniz.
Bütün yüzeye monte edilmiş preparatlar (fäs olarak telaffuz edilir) hazırlıkları, aort kökünden genel iliyak arterlere kadar tüm aort gibi kan damarı yüzeyinin geniş bir alanını araştırmamızı sağlar. Spesifik antikorlarla ve diğer spesifik problarla lekelenen böyle bir örneği kullanarak, lezyonların yerini ve aynı zamanda endotel hücrelerinde çeşitli moleküler olayların meydana geldiği noktaları kesin olarak belirleyebilirLokalizasyonu ve proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlarındaki değişiklikler gibi aterogenezis. Aterojenezi incelemenin yanı sıra, yüz yüze yapılan preparatlarda gözlemlenen endotel hücre şekli, bölgesel zaman ortalamalı kan akış modelinin bir göstergesi olarak kullanılır. Bu veriler, in situ endotel hücrelerinin mekanik işaretlenmesinin incelenmesi için önemlidir. Bu amaçla, rutin histolojik kesitsel kan damarları yararlı değildir. Dolayısıyla, damar tıbbı ve biyolojisi için, damar yüzeyinin geniş bir alanının yanı sıra teknenin daha derin yüzey altı alanlarını gözlemlemenize olanak sağlayan, kan damarlarının yüz yüze hazırlıkları yapmak için bir teknik edinmek için özellikle önemlidir.
Jelev ve Surchev 1 tarafından gözden geçirildiğinde, vasküler biyologlar, kan damarlarının yüzeyi gözlemlemek için çeşitli yöntemler geliştirmiştir. Bazı ustaca yöntemler 1940'larda ve 1950'lerde geliştirildi. Bu yöntemleri kullanarak, Kan damarlarının iç yüzeyini çizen endotel hücrelerinin temel organizasyonunu inceleyebilme yeteneği. Bununla birlikte, bu yüzey preparatlarının hazırlanma şekli (Hautchen yöntemi 2 , 3 , 4 olarak adlandırılan veya kap yüzeyinden 5 soyulması) ve numunenin lekelenme şekli nedeniyle kesintisiz morfolojik Damar yüzeyinden kan damarı duvarının daha derin bölgelerine bilgi. İmmünofloresan boyayla birleştirilen tüm yüzeye bakan gemi hazırlığı sadece endotel hücresi morfolojisi ve protein ekspresyonu ve lokalizasyonu bu hücrelerde değil, aynı zamanda bu tür çalışmaları damar duvarının subendotel bölgesine de genişletmemizi sağladı. Erken yapılan çalışmalar, immünfüzesensif olarak lekelenmiş kan damarı yüzey preparatlarını kullanarak 1980'li yıllarda ortaya çıkmaya başladı 6 ,F "> 7. Lazer tarama konfokal mikroskobu ve son zamanlarda çok ışıklı mikroskopi ile birlikte, canlı fotosentez lekeli yüz gemi örneklerinde kan damarı duvar yapısının net görüntüleri ve canlı hayvanlardaki vasküler ağ görüntüleri elde edilebilir 8 , 9 , 10 , 11. Bu bilgisayar tabanlı görüntüleme teknikleri odak içi optik kesitli görüntüler oluşturur ve bu görüntüleri bir araya getirerek damar duvarının ve dokulardaki vasküler ağın yeniden yapılandırılmış 3D görüntüsünü elde edebilirsiniz. Yeniden yapılandırılmış görüntünün 12 , 13 Z-ekseni boyunca yapılmış bir bölüm görüntüleri üretebilir.
Bu yazıda, immünofloresan boyama için fare aortu ve karotis arterinin yüz preparatlarının hazırlanması için bir yöntem gösterilecektir. Yüzü hazırlıklarBu kaplar deneysel olarak manipüle edildikten sonra bile yapılabilir. Örneğin, bir karotis arteri kısmen bağlanabilir ve daha sonra böyle bir ameliyattan sonra bir yüz hazırlığı yapılabilir. Bu nedenle, bu makalede karotis atardamarında kısmi ligasyon yapmayı da anlatacağız. Sıçanlar, tavşanlar ve insanlar gibi daha büyük hayvanlardan benzer preparatlar yapmakla karşılaştırıldığında, fare kapları boyutları küçüktür ve daha kırılgandır, bu nedenle damarların cerrahi yalıtımı sırasında ele alınması ve antikor boyama ve mikroskopisi için hazırlanması için ek bakım gerektirir. Genetik modifikasyon için en yaygın kullanılan hayvan modeli fare olduğundan, birçok araştırmacı için fare damarlarına zarar vermeksizin onları ele alması kritik hale gelir. Bu yazıda, fare aortu ve karotis atardamarının yüz hazırlıkları yaparken fare kan damarlarının nasıl işleneceğini anlatacağız. Gösterim amacıyla, vahşi tip C57 / b6 fareler kullanacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare parsiyel karotid arter ligasyonu ve fare aortu ve karotid arteri izolasyon için izole etme protokolleri, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IBT 2014-9231) tarafından onaylanmıştır.
1. Sol Kısmi Karotid Arter Ligasyonu
- Masaya 12 inç x 14 inçlik bir ısıtma yastığı yerleştirerek cerrahi alanı hazırlayın ve ped ve masa üstünü büyük, temiz bir cerrahi örtüyle örtün. Bom standının kolunu, stereomikroskopun görüş alanının ısıtma pedinin orta alanında olacak şekilde ayarlayın.
- Masadaki ısıtma pedini açın ve 3 ayar kontrol düğmesini orta dereceli ısı seviyesine ayarlayın. Bu sıcaklık ayarında, cerrahi yüzeyin yüzeyi (bkz 1.6.1) 38-40 ° C olacaktır.
- Temiz bir kafesi başka bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Isıtma pedini yukarıdaki gibi açın. Bu kafes ameliyattan sonra iyileşme için kullanılır (bkz. 1.16) ve mahfaza.
- Bir fare tartın. Vücut ağırlığı ameliyattan hemen önce verilecek uygun analjezi miktarını belirlemek için gereklidir.
- İndüksiyon odasına bir fare yerleştirin.
- İndüksiyon odasında fare anestezisi için oksijen tankı ve anestetik vaporizer açın. İzofluran seviyesini% 2'de muhafaza edin. Fare hareket etmeden önce 3-5 dakika sürer.
- Fare aneste ikenCerrahi bir yüzey oluşturmak için stereomikroskopun altına steril cerrahi örtüyü (24 inç x 24 inç) daha küçük bir parça yerleştirin. Ardından, draje yüzeyinde bir akrilik cerrahi tahtası (% 70 alkol ile temizlenmiş) yerleştirin. Cerrahi kurul, bu nedenle ısıtma yastığı üzerinde olmalı, ancak iki kat cerrahi örtü ile ayrılmalıdır.
- Fare indüksiyon hücresinde hareket etmeyi bıraktığında fareyi cerrahi öncesi hazırlık alanına aktarın ve burnunu buharlaştırıcıya (% 2 izofluran) bağlı olan burun konisine yerleştirin. Elektrikli düzeltici veya saç temizleyici losyon kullanarak servikal bölge çevresindeki saçları alın. Saç kaldırma losyonunu öneriyoruz çünkü bu yöntem cerrahi alanın tamamen çıkarılması zor gevşek saç parçaları üretmeyecektir.
- Burun konisi yerinde olduğunda fareyi cerrahi tahtaya getirin.
- Sağ ve sol ayak pedallarını cerrahi masaya bantlayın. Her iki arka ayakları da sıkıştırınOrada fare sağ tarafında. Bu, fare gövdesinin hafif bir şekilde dönmesine ve böylece farenin boyun bölgesinin sol tarafının ameliyat için daha iyi konumlandırılmasına neden olur.
- İnsizyon alanını% 70 alkol, klorheksidin cerrahi fırçalamayla ve tekrar% 70 alkol ile dezenfekte edin. Fare, servikal insizyon bölgesi haricinde sterilize cerrahi bir örtüyle örtün.
- Fare tamamen parlatılmış olduğunu doğrulayın ve intraperitoneal veya subkütan enjeksiyon yoluyla analjezi (Caprofen 3-5 mg / kg) verin.
- Diseksiyon mikroskopu altında, neşter veya iris makası kullanarak servikal bölge çevresinde ventral orta hat kesisi yapın.
NOT: Makas kullanıyoruz, çünkü stereomikroskopun çalışma mesafesi sınırlıdır, bu da bir neşterin kullanılmasını zorlaştırır. - Sol karotis arterini (LCCA) bir kenara iterek ve kan damarlarını örten tükürük bezlerini a'nın sol tarafına yerleştirerek maruz bırakınNimal.
- Cerrahi sahadaki tüm kan damarlarını tanımlayın ( Şekil 1 ). LCCA, sol internal karotid artere (ICA) ve sol harici karotid artere (ECA) bifurkat oluşturur. Yüzeysel tiroid arteri (STA) medialde ECA'dan kaynaklanır. Oksipital arter (OA) genellikle ECA'dan kaynaklanır, ancak bazı farelerde ICA'dan kaynaklanır.
- Sterilize edilmiş 6-0 ipek dikiş kullanarak OA haricindeki tüm arter dallarını ligate edin. Bunu başarmak için, aşağıdaki iki bağlantıyı yapın.
- Sol internal karotid arterin (ICA) çevresindeki ve altındaki bağ dokusunu hafifçe çıkarın. Forseplerle önceden kesilmiş 6-0 ipek sütürden (~ 2.5 cm) bir parça alın ve atardamarın altına geçirin. Başka bir forseps kullanarak, dikişin kabaca 1/3 boyunu çekin ve arteri bağlayın.
- Sol dış karotis atardamarının (ECA) çevresindeki bağ dokusunu yukarıda açıklanan şekilde çıkarın ve sol üst tiroya yakın bir ligasyon yapınD arteri (STA) ( Şekil 1 ). Cerrahi alan içerisinde sinir liflerine zarar vermemek için dikkatli olun.
- Bu ligasyon yapıldığında tükürük bezlerini orijinal pozisyonuna getirin ve 2-3 damla steril salin yerleştirerek cerrahi alanı hidratlayın. 6-0 kaplamalı vicry sütürleri kullanarak cildi kapatın.
- Ameliyattan sonra, fareyi önceden ısıtılmış kafese yerleştirin (1.2.1'e bakın). Fare 5 dakika içinde uyanmalı ve dolaşmaya başlanmalıdır. Farenin normal bir şekilde davrandığını teyit ettikten sonra kafes hayvan barınak odasına getirilir.
- Kurtarmanın ilk 3 günü boyunca her gün fare takın. Deney, deney protokolünün gerektirdiği çeşitli koşullar altında gerektirdiği sürece fare tutulabilir. En yüz hazırlıkları ameliyattan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir.
2. En Yüz İmmünolojik Boyama
- Solunum aşırı doz ile CO 2 ile bir fare Euthanize.
- Fare, sırtüstü (karın tarafındaki yukarı) bir diseksiyon tahtasına bantlayın.
- Karın boşluğunu, iris makas kullanarak orta hat insizyonu yaparak maruz bırakın.
- Kaburgaları göğüs kafesine lateral olarak keserek göğüs boşluğunu açın.
- Kan boşaltmak için vena kava içine bir leke sokun veya femoral arterden birini kesin.
- Sol ventrikülün tepesine bir yerçekimi perfüzyon düzeneğine (120 cm su basıncı) tutturulmuş bir 26 G iğne takın ve kan dolaşım sistemini, heparin (40 U / mL) ihtiva eden salin solüsyonu ile saflaştırın. Kesikten akan salin temizleninceye kadar perfüzyona devam edin.
- PBS (fosfat tamponlu salin) içinde% 4 paraformaldehit içeren fiksasyon solüsyonundan perfüzyon sistemini tuzlu sudan değiştirin ve 5 dakika daha perfüzyona devam edin.
- Künt uçlu makas ve forseps kullanarak aorta ve sol ve sağ karotis arterlerini toplayın ve buz üzerinde fiksatif içeren 50 mL'lik bir konik tüp içine yerleştirin.
- Her gemi, ayrı ayrı 0.5 mL permeabilize edici bir solüsyon (PBS içerisinde% 0.1 Triton X-100) ihtiva eden 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ayrı ayrı aktarın. Oda sıcaklığında (RT) sallanarak kan damarlarını 10 dakika boyunca geçirir.
- PBS ile kısa bir yıkayın.
- Özgül olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için, ikincil antikorların yapıldığı hayvan türlerinden% 10 normal serumda kan damarlarını TTBS'de (% 2.5 Tween 20 ile Tris tamponlu salin (TBS)) 30 dakika boyunca RT'de sallanır.
- Gemileri, bir gece boyunca 4 ° C'de sallanan,% 10 normal serum ile TTBS'de uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikorlarla inkübe edin. SeviyeHer bir antikor için seyreltme miktarı belirlenmelidir.
- Aşağıdaki kontrol lekelerini uygulayın.
- Gemileri birincil bir antikor yerine TTBS ile kuluçkalayın ve bunu takiben ikincil bir antikor ile inkübe edin.
- Gemileri, birincil antikorların yapıldığı aynı hayvanın (bağışık olmayan) (veya immün öncesi olmadan) serum veya Ig içeren TTBS ile inkübe edin, bunu takiben ikincil bir antikor ile kuluçkalayın.
- İkincil bir antikor ile inkubasyonu atlayın. Bu kontrol numuneleri, spesifik antikorlarla boyama yapıldığında aynı şekilde ve aynı zamanda ele alınmalıdır.
- Kan damarlarını 3 kez TTBS ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanırken yıkayın.
- Oda sıcaklığında sallanan 1 saat süreyle% 10 normal serum (yukarıda açıklandığı gibi) ile TTBS içinde uygun şekilde seyreltilmiş flüoresan etiketli sekonder antikorlar ile inkübe edin. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ile nükleer boyama, aynı andaBu aşamada, H20 içinde 5 mg / mL DAPI içeren bir DAPI stok solüsyonunun hacimce 1 / 5,000 oranında ilave edilmesi.
- RT'de sallanan her biri için 3 kez TTBS ile 10 dakika yıkayın.
- PBS'de kısaca durulayın.
- Bir damla anti-solma reaktifini bir kapak camına (22 mm x 50 mm) yerleştirin ve endotelin aşağı bakacak şekilde kapak camının üzerine bir kan damlası yerleştirin.
- Kabarcıkları yakalamaktan kaçınırken, kan damlasına bir slayt camı (22 mm x 75 mm) yerleştirin.
- Slayt, temiz bir laboratuar silin ( örneğin Kimwipe) üzerine yerleştirin ve slayt laboratuar silin iki parça ile örtün. Yüz kan damarı örneğini düzleştirmek için hafifçe 3.5 kg ağırlığa ( örn . Kalın bir kitapta bir şişe su kullanın) en fazla 5 dakika slayt üzerine koyun.
- Ağırlığı alın ve lamelin etrafından gelen aşırı çözümü silin.
- Lambadanın dört köşesine tırnak cilası uygulayın, slaytları bir slayt kutusuna yerleştirin, lamel yüzü yukarı gelecek ve RT'de karanlıkta saklayın.(Veya 4 ° C) gece boyunca. Bu işlem dokuyu daha da düzleştirir ve yüksek büyütmede mikroskopi yapmayı kolaylaştırır.
- Lamel tamamen oje ile mühürleyin.
- Tırnak cilası kuruduktan sonra mikroskopla inceleme yapın.
- Gerekirse, slaytları -20 ° C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotelin tipik bir yüz yüze immünofloresans görüntüsü Şekil 3'te gösterilmektedir. Bu görüntü, interkostal arterin (büyük koyu yumurta biçimli alanın) açılması yakınında alınan fare aortunun tek bir optik bölümünü göstermektedir. Aorta, anti-VE-kadherin (yeşil) ve anti-VCAM-1 (vasküler hücre adezyon molekülü-1) (kırmızı) ile çift boyandı. Her endotel hücre, adherens kavşağında yeşil bir çizgisel lekelenme ile özetlenir. Numunenin ufak düzgünsüzlüğü nedeniyle, bazı adherens kavşakları bu optik bölümün dışındadır. Anti-VCAM-1 boyaması rahatsız edici kan akışının olduğu bilinmeyen interkostal arterin açılmasında daha kuvvetlidir. Şekil 4, anti-VE-kadherin (yeşil), anti-VCAM-1 (kırmızı) ve DAPI (mor) ile karotid arterlerin yüz boyanmasını göstermektedir. Sağ karotis arteri (RCA) dokunulmazken sol karotid arter (LCA) kısmen lige edildi. Gemi örnekleri 1 gün sonra yapıldı. Ameliyat ve lekeli. Bağlanmış damarda artmış anti-VCAM-1 boyanmasına dikkat edin. İmmünofloresan olarak lekelenmiş örnekler çeşitli antikorlarla ilgilenilen proteinlerin ekspresyon seviyelerini, hedef proteinlerin posttranslasyonel modifikasyonlarının derecesini ve tabii ki endotel hücreleri içerisindeki çeşitli proteinlerin ve diğer hücrelerdeki lokalizasyon modellerini araştırmak için kullanılabilir. Damar çeperi 10 , 11 .
Şekil 1 : Fare Servikal Bölgesindeki Ayrıntılı Gem Anatomisi. Solda, disseksiyon öncesi ve sonrası vasküler ağ gösterilmektedir. Tüm arterler sağdaki diyagramda tanımlanmaktadır. Siyah çizgiler bağlamaları belirtmektedir. Ölçek: 1 bölme = 1 mm.Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Karotid Arterler ve Aortların Yüz Yüzeyindeki Preparatlarına Nasıl Üretildiğini Gösteren Diyagram. Damar duvarı boyunca noktalı çizgiler damarları açmak için yapılacak kesiklikleri göstermektedir. Renkli mikrograflar gerçek yüz hazırlıklarını gösterir. Ölçek: 1 bölme = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Anti-VE-kaderin (Yeşil) ve Anti-VCAM-1 (Kırmızı) ile boyanan endotelin en yüz görüntüsü. Bir interkostal açıklığa yakın endotel hücrelerinin konfokal tek bir optik bölümügösterilen. VCAM-1 ekspresyonunun, kan akışının laminar olmayan damar dallanma noktasında yer alan endotel hücrelerinde arttığını unutmayın. Görüntü 60X (NA 1.4, yağ) objektif lens kullanılarak kaydedildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Anti-VE-cadherin (Yeşil), Anti-VCAM-1 (Kırmızı) ve DAPI (Mor) ile Boyanan Sol ve Sağ Karotis Arterlerin En Yüz Görüntüleri. Sol karotis arteri kısmen bağlandı ve sağ karotid bozulmadı. Bu yüz yüze hazırlıklar ameliyattan 24 saat sonra yapılmıştır. Sağlam damarla karşılaştırıldığında bağlanmış tarafta VCAM-1'in artmış ifadesi belirgindir. Bu görüntüler, genel karotid arterlerin çatallanma yakınına çekilmiştir.60X (NA 1.4, yağ) objektif lensli bir lazer tarayıcı konfokal mikroskop kullanarak. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare kan damarlarını tutarken, endotelin kırılgan olduğunu ve aşırı mekanik kuvvetin endotel hücrelerine zarar vereceğini unutmamak önemlidir. Örneğin, damar çok güçlü bir şekilde perfüze edildiğinde endotel hücreleri damar duvarından kopar veya ayrılır; vaskülatür elle çalıştırılan bir şırınga ile perfüze edildiğinde kolayca olabilir.
Sabit perfüzyon basıncını elde etmek için, 120 cm su sütunu basıncına sahip bir yerçekimi perfüzyon sistemi kullanırız. Bir fare ortalama gerilme farkı 130 ila 170 cm H 2 O 14 arasında değişen ortalama arter basıncının olduğu bildirilmiştir. Böylece, kullandığımız perfüzyon basıncı ölçülen arteryal basınçtan biraz daha düşüktür. Perfüzyona sabitlenmiş sıçan aortunda 90 cm H20 sütun basıncı kullanıldı 6 .
In situ endotel hücreleri, hasat sırasında gemi uzarsa zarar görürler, Temizlik, boyuna bölme, immün boyama ve montaj. Aslında, mekanik hasar yüz yüze müstahzarlardaki endotel hücrelerini kaybetmenin yaygın nedenlerinden biridir. Gem gerilmesi işlemi sırasında herhangi bir aşamada meydana gelebilir, ancak en yaygın olarak gemi hasadı sırasında gerçekleşir. Adventivaya bağlı yağ dokusunu çıkartırken de germeyi kolaylaştırmak kolaydır.
En yüz hazırlıkları bir teknenin boyuna boyunca boyuna kesilmesi ile yapılır. Bu genellikle keskin oftalmik makas kullanılarak yapılır. Bununla birlikte, hedef geminin iç çapı küçükse, makasın ucu çok büyük olabilir. Böyle bir durumda, kesik yapmak için kırılmış ince tek kullanımlık traş bıçağı kullanılabilir. Bu tekniği, civciv mezenterik arterin yüze hazırlıklarını yapmak için kullandık 15 .
Fiksasyondan sonra yüz yüze preparatlar geçirgen hale getirilir. Genellikle, Triton X-100 içeren PBS,Bu amaçla, ancak Tween-20, Nonidet P-40, saponin, digitonin ve Leucomerm gibi diğer permeabilizasyon reaktiflerini kullanmak da mümkündür. İdeal olarak, permeabilization şartı her laboratuarda optimize edilmelidir. Fare aortu ve karotis arterleri için onlara% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden PBS ile 10 dakika RT'de tedavi ediyoruz ve bu tedavi damar duvarındaki tüm hücreleri permeabilize etmek için yeterlidir. Geçirgen hale getirilen numuneler bundan sonra öncelikle birincil bir antikor ile ve daha sonra floresanla işaretlenmiş bir ikincil antikorla arıtılır. Fare damarlarını boyamak için, fare vasküler dokusu, flüoresan etiketli ikincil anti-fare IgG ile etiketlenecek olan fare IgG'sini içereceğinden, birincil antikorun fare içinde yapılmaması kritiktir, bu da yüksek arka plan boyanmasına neden olur. Mikroskopi için numune olabildiğince düz olmalıdır. 3,5 kg ağırlık ile 5 dakika slaytlar. Bu özgül ağırlık ampirik olarak belirlendi.
WTavuk yüzü preparatları immünofloresan olarak etiketlenmiştir, sıradan bir epifloresan mikroskop, bir lazer tarayıcı konfokal mikroskop ve çok ışıklı bir mikroskop kullanılarak incelenebilir. Konfokal mikroskopi, multiphoton aydınlatma modunda elde edilen uyarma ışığına derin nüfuz ederken bir tanesinin endotelin ve subendotel bölünü 50 μm'ye kadar damar yüzeyinden elde etmek için en iyisidir; Damar duvar yüzeyinden 2 mm'ye kadar. Ayrıca multiphoton mikroskopisi ikinci harmonik görüntüleme için, en tipik olarak damar duvarında kollajen lif organizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Yüz yüzeyi müstahzarları büyüktür, bu da aortun tüm uzunluğu gibi geniş bir vasküler alanı araştırmamızı sağlar. Bunlar, immünofloresanla lekelenmiş yüz gazı preparatlarını kullanmanın bazı avantajlarıdır. Bununla birlikte, bu tekniğin bazı dezavantajları vardır. Her şeyden önce, yöntem yalnızcaDAPI ve DiI-Ac-LDL (1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetrametil-indokarbosiyanin ile işaretlenmiş asetillenmiş Düşük Yoğunluklu Lipoprotein gibi spesifik antikorların ve diğer floresanla işaretlenmiş reaktiflerin bulunabilirliği perklorat). Görüntüleme flüoresan esaslı olduğundan, numunelerin floresan olmayan kısımları görüntülenemez. Bütün montaj örnekleri genel olarak otofloresans gösterir ve büyük kan damarlarında bulunan elastin elyafları yeşil renkte fluoreser olur. Epifloresan mikroskop kullanıldığında bu floresan özellikle sorunludur; Bu nedenle konfokal bir mikroskop ile görüntüleme yapılması şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu yeşil otofloresansın müdahalesi, kırmızı bir floresan boyayla etiketlenmiş sekonder antikorları kullanarak önemli ölçüde azaltılabilir. Sonunda, yüz yüzeyi kalın olduğu için iletilen aydınlatma ile görüntüleme mümkün değildir.
Ticari konfokal ve çok telli mikroskoplar aşağıdakileri içeren görüntü analiz yazılımı ile birlikte gelir:Biri de görüntülerin flüoresan yoğunluğunu nicel olarak analiz eder. Karşılaştırmalar aynı slaytta yapılırsa, nicelenmiş veriler daha güvenilirdir. Bunun nedeni, bağışıklık boyama için tüm koşulların numune için aynı olmasıdır. Boyama yoğunlukları farklı slaytlar (örneğin normal ve hasta damarlar arasında) arasında karşılaştırılmalıdır, verilerin geçerliliğini doğrulamanın tek yolu, hem teknik hem de biyolojik varyasyonların ortalaması alınabilmesi için numune sayısını artırmaktır. Genel olarak, kapların yüzeyi yakınında elde edilen konfokal görüntülerde yoğunluk ölçümleri daha güvenilirdir. Derin doku bölgelerinden elde edilen görüntülerin flüoresan yoğunlukları, hem uyarım hem de yayan flüoresan ışığının farklı dağılım dereceleri ve soğurma dereceleri nedeniyle daha değişken hale gelme eğilimindedir. Genel olarak, numunelerin derin bölgelerinde bulunan ince yoğunluk farklarını yorumlamada dikkatli olmalısınız. Derin doku bölgelerinden görüntüleme yeteneğini geliştirmek için, tYarı saydamdır ve bazı etkileyici görüntüler elde edilmiştir (örneğin, Neckel ve ark.nın 16 yakın bir makalesine ve bu yazarlar tarafından atıfta bulunulan kağıtlara bakınız). Dokuları yarı saydam yapmak için kullanılan tedavilerin belirli antijenler çıkarabildiği ve / veya bazı epitopları denatürebileceği olası olsa da, bu yöntem dokunun daha derin bölgelerinden daha çoğaltılabilir floresan sinyalleri elde etmek için kullanılabilir.
Yüz preparatlarının kullanımı flüoresan mikroskobu ile görüntüleme ile sınırlı değildir. Stereo mikroskop kullanarak, yüzü kap hazırlıkları, Yağ Kırmızı O ile boyadıktan sonra aterosklerotik plak oluşumunun boyutunu incelemek için kullanılabilir. En yüz gemi preparatları aseptik hale getirilebilir. Bu gibi müstahzarlar kültür içinde tutulabilir ve lökosit-endotel hücresi etkileşimini incelemek için bir ex vivo sistem olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yok
Acknowledgments
Yazarların araştırma faaliyetleri Ulusal Sağlık Enstitüsünden Dr. Abe'ye (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551) hibelerle desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
