Summary
En fremgangsmåde til fremstilling af ansigtspræparater af muscarotidarterien og aorta er beskrevet. Sådanne præparater gør det muligt at studere lokalisering af proteiner og identifikation af celletyper inden for hele vaskulærvæggen ved konfokal mikroskopi, når immunofluorescens farves med specifikke antistoffer.
Abstract
Afsnit af paraffinindlejrede væv anvendes rutinemæssigt til at studere vævshistologi og histopatologi. Det er imidlertid svært at bestemme, hvad den tredimensionelle vævsmorfologi er fra sådanne sektioner. Desuden kan de undersøgte dele af væv ikke indeholde det område i vævet, der er nødvendigt med henblik på den igangværende undersøgelse. Denne sidstnævnte begrænsning forhindrer histopatologiske undersøgelser af blodkar, da vaskulære læsioner udvikles på en fokaliseret måde. Dette kræver en metode, der gør det muligt for os at undersøge et bredt område af blodkarvæggen, fra overfladen til dybere områder. Et helt monteret ansigtspræparat af blodkar opfylder dette krav. I denne artikel vil vi demonstrere, hvordan man fremstiller ansigtspræparater af musa aorta og halspulsårer og immunofluorescens pletter dem for konfokal mikroskopi og andre typer af fluorescensbaseret billeddannelse.
Introduction
Til histopatologiske undersøgelser ved lysmikroskopi behandles tredimensionale stykker biologiske væv rutinemæssigt til paraffinindlejring efterfulgt af snitning og farvning. En vævsprøve, der har været paraffinindlejret, kan være flere millimeter i alle tre dimensioner. Men med henblik på lysmikroskopi skal den først snittes, således at lyset kan passere og derefter farves, så det tynde afsnit giver tilstrækkelig kontrast til billeddannelse. Fordi snittede prøver typisk er 5-10 μm i tykkelse, ser man kun en meget lille brøkdel af hele prøven i to dimensioner ad gangen. Det er muligt at indsamle sekventielle sektioner, og efter billeddannelse af hvert afsnit individuelt udfører computerassisteret rekonstruktion af 3D-billederne, men det er faktisk et kedeligt job. Histopatologi af blodkar, specielt til undersøgelse af patogenesen af aterosklerose, giver unikke problemer. Aterosklerose er en fokaliseret sygdom, der udvikler sigLokalt i områder hvor forstyrret blodgennemstrømning forekommer. Desuden initieres sygdommen i intima, et tyndvæv bestående af et monolag af endotelceller og ekstracellulær matrix, af store arterier. Af disse grunde er det en udfordring at lokalisere og studere tidlige læsioner ved hjælp af sektionerede blodkar, fordi man let kan gå glip af at snitte læsionen. Selvom en sektion indbefatter et sygt område, vil man kun se en 5-10 μm portion indeholdende endotelceller og andre vaskulære vægceller i medierne og adventitia.
Hele Mount en Face (udtalte end fäs) præparater giver os mulighed for at undersøge et bredt område af blodkarets overflade, såsom hele aorta fra aorta rotten helt ned til de fælles iliac arterier. Ved anvendelse af en sådan prøve farvet med specifikke antistoffer og andre specifikke prober kan man bestemme placeringen af læsioner og også hvor forskellige molekylære hændelser forekommer i endotelceller sammen med wiAtherogenese såsom ændringer i ekspression, lokalisering og posttranslationelle modifikationer af proteiner. Udover at studere atherogenese anvendes den endotelcelleform, der observeres i en-ansigtspræparater, som en indikator for det regionale tidsforbrugte blodstrømningsmønster. Sådanne data er vigtige for at studere mekanosignalering af endotelceller in situ. Til dette formål er rutinemæssige histologiske tværsnit af blodkar ikke nyttige. For vaskulær medicin og biologi er det således særlig vigtigt at erhverve en teknik til fremstilling af ansigtspræparater af blodkar, der gør det muligt for en at observere et bredt område af beholderoverfladen såvel som de dybere undergrundsarealer af fartøjet.
Som gennemgået af Jelev og Surchev 1 har vaskulære biologer udviklet forskellige metoder til at observere foringen af blodkar i ansigtet. Nogle geniale metoder blev udviklet i 1940'erne og 1950'erne. Ved hjælp af disse metoder var de Kunne studere den grundlæggende organisering af endotelceller, der linjer den indre overflade af blodkar. På grund af den måde, hvorpå disse ansigtspræparater fremstilles (den såkaldte Hautchen-metode 2 , 3 , 4 eller afskalning af beholderoverfladen 5 ) og måden prøven blev farvet på, var det ikke altid muligt at opnå uafbrudt morfologisk Information fra fartøjets overflade til de dybere områder af blodkarvæggen. Hele montering af ansigtsbeholderpræparat kombineret med immunofluorescensfarvning tillod os ikke kun at studere endotelcellemorfologi og proteinekspression og lokalisering i disse celler, men også at udvide sådanne undersøgelser til den subendoteliale region af beholdervæggen. Tidlige undersøgelser ved hjælp af blodkar og ansigtspræparater blev farvede immunoflurer begyndt at fremstå i 1980'erne 6 ,F "> 7. Med fremkomsten af laserscanning-konfokal mikroskopi og nyere mikrofonmikroskopi kan man nu opnå klare in-fokusbilleder af blodkarets vægstruktur i immunofluorescensfarvede ansigtsbeholdere samt det vaskulære netværk i levende dyr 8 , 9 , 10 , 11. Disse computerbaserede billedteknikker skaber optiske snitbilleder i fokus og ved at stable sådanne billeder kan man få rekonstruerede 3D-billeder af karvæggen og det vaskulære netværk i væv. Desuden er en Kan generere billeder af et afsnit lavet langs Z-akse i det rekonstruerede billede 12 , 13 .
I denne artikel vil vi illustrere en metode til fremstilling af en ansigtspræparater af musaorta og carotidarterien til immunfluorescerende farvning. En ansigt forberedelserKan laves, selv efter at disse fartøjer er blevet manipuleret eksperimentelt. For eksempel kan en carotisarterie ligeres delvist og derefter et ansigtspræparat fremstillet efter en sådan operation. Af denne grund vil vi også i denne artikel beskrive, hvordan vi gør en partiel ligation på halspulsåren. Sammenlignet med at lave lignende præparater fra større dyr som rotter, kaniner og mennesker er musekarrene små i størrelse og mere skrøbelige og kræver således ekstra pleje for håndtering under kirurgisk isolering af kar og fremstilling af dem til antistoffarvning og mikroskopi. Fordi den mest anvendte dyremodel for genetisk modifikation er musen, bliver det kritisk for mange efterforskere at håndtere muskasser uden at skade dem. I dette manuskript beskriver vi, hvordan du håndterer museblodkar, når du fremstiller ansigtspræparater af musaorta og karotidarterie. Til demonstration vil vi bruge vildtype C57 / b6 mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollerne for musens partielle carotidarterie-ligering og isolering af musaorta og carotidarterien til en-ansiktsimmunfarvning er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IBT 2014-9231).
1. Venstre Partial Carotid Artery Ligation
- Forbered det kirurgiske rum ved at placere en 12 tommer x 14 tommer varmepude på bordet og dække puden og bordpladen med en stor ren kirurgisk drap. Juster armen på bommestativet, så stereomikroskopets synsfelt er i midten af varmepuden.
- Tænd varmepuden på bordet, og indstil 3-indstillings styrehjulet til mediumvarmen. Ved denne temperaturindstilling vil kirurgisk pladeoverflade (se 1.6.1) være 38-40 ° C.
- Anbring et rent bur på en anden varmepude. Sæt varmelegemet på som ovenfor. Dette bur vil blive brugt til genopretning efter kirurgi (se 1.16) samt boliger.
- Veje en mus Kropsvægten er nødvendig for at bestemme den passende mængde analgesi, som vil blive indgivet umiddelbart før operationen.
- Anbring en mus i induktionskammeret.
- Tænd iltanken og bedøvelsesfordamperen for at bedøve musen i induktionskammeret. Opretholde isofluran niveauet ved 2%. Det tager 3-5 minutter, før musen stopper med at flytte.
- Mens musen er anæstetLægge et mindre stykke sterilt kirurgisk draperi (24 tommer x 24 tommer) under stereomikroskopet for at skabe en kirurgisk overflade. Derefter anbringes et akryl kirurgisk bord (som er blevet renset med 70% alkohol) på den draperede overflade. Kirurgisk bord bør derfor være på varmepuden, men adskilt af to lag kirurgiske gardiner.
- Når musen stopper med at bevæge sig i induktionskammeret, skal musen overføres til et prækirurgisk præparationsområde og placeres i næsekeglen forbundet med fordamperen (2% isofluran). Fjern håret rundt i livmoderhalsen ved hjælp af en elektrisk trimmer eller hårfjerner lotion. Vi anbefaler hår fjernelse lotion, fordi denne metode ikke vil producere løse hårstykker, som er vanskelige at helt fjerne fra det kirurgiske område.
- Med næsekeglen på plads, flyt musen til kirurgisk bord.
- Tape ned højre og venstre forpote til kirurgisk bord. Tape ned begge bagben slidDer på højre side af musen. Dette medfører en lille rotation af musekroppen, således at venstre side af nakkeområdet af musen bliver bedre positioneret til operation.
- Desinficere snitområdet med 70% alkohol, chlorhexidin kirurgisk skrubbe og igen med 70% alkohol. Dæk musen med en steriliseret kirurgisk drap undtagen det livmoderhalske snitområde.
- Bekræft ved tå klemme, at musen er bedøvet og giver analgesi (Caprofen 3-5 mg / kg) via intraperitoneal eller subkutan injektion.
- Under dissekeringsmikroskopet laves en ventral midtlinie snit rundt i livmoderhalsområdet med enten en skalpel eller iris saks.
BEMÆRK: Vi bruger saks, fordi stereomikroskopets arbejdsstilling er begrænset, hvilket gør det vanskeligt at bruge en skalpel. - Udsæt den venstre fælles halspulsår (LCCA) ved at skubbe til side og omplacere spytkirtlerne, der dækker blodkarrene til venstre for aNimal.
- Identificer alle blodkarrene i det kirurgiske felt ( figur 1 ). LCCA bifurcates i den venstre indre halspulsår (ICA) og den venstre ydre halspulsår (ECA). Den overfladiske skjoldbruskkirtel arterie (STA) stammer fra ECA på den mediale side. Den occipitale arterie (OA) opstår normalt fra ECA, men hos nogle mus opstår det fra ICA.
- Ligér alle arteriegrene undtagen OA ved hjælp af steriliseret 6-0 silkesuting. For at opnå dette laves følgende to ligeringer.
- Fjern forsigtigt bindevævet rundt og under den venstre indre halspulsår (ICA). Tag et stykke forklædt 6-0 silke sutur (~ 2,5 cm) med tang og send det under arterien. Brug et andet par tænger, træk suturen ca. 1/3 af dens længde og ligat arterien.
- Fjern bindevæv omkring den venstre ydre carotisarterie (ECA) på samme måde som beskrevet ovenfor og foretag en ligation proksimal til venstre overlegen thyroiD arterie (STA) ( figur 1 ). Pas på ikke at skade nervefibre, der løber inden for det kirurgiske område.
- Når disse ligeringer er lavet, returner spytkirtlerne til den oprindelige position og hydrater det kirurgiske felt ved at placere 2-3 dråber steril saltvand. Luk huden med 6-0 coatede vicryl suturer.
- Efter operationen skal du placere musen i det forvarmede bur (se 1.2.1). Musen skal vågne op inden for 5 minutter og begynde at gå rundt. Når først det er bekræftet, at musen opfører sig normalt, skal du bringe buret til dyrehusrummet.
- Overhold musen dagligt for de første 3 dages recovery. Musen kan holdes så længe eksperimentet kræver under de forskellige forhold, som den eksperimentelle protokol kræver. En ansigt forberedelser kan foretages på ethvert tidspunkt efter operationen.
2. En Ansigt Immunostaining
- Ødelæg en mus med CO 2 ved indånding af overdosering.
- Tape musen i en liggende (mave side op) position på et dissecting board.
- Udsug bukhulen ved at lave et midtlinie snit ved hjælp af iris saks.
- Udsæt thoracic hulrum ved at skære ribbenene sideværts til brystbenet.
- Lav et kig i vena cava eller skær en af femorale arterier til dræning af blod.
- Indsæt en 26 G nål fastgjort til en gravity perfusion opsætning (120 cm vandtryk) ind i apex i venstre ventrikel og perfuse cirkulationssystemet med saltopløsning indeholdende heparin (40 U / mL). Fortsæt perfusionen indtil saltvand, der strømmer ud fra klippet, bliver tydeligt.
- Skift perfusionssystemet fra saltopløsning til fikseringsopløsningen indeholdende 4% paraformaldehyd i PBS (phosphatpufret saltopløsning) og fortsæt perfusionen i yderligere 5 minutter.
- Høst aorta og både venstre og højre halspulsårer ved hjælp af stumpe saks og tænger, og anbring et 50 ml konisk rør indeholdende fixativet på is.
- Overfør hvert fartøj separat til en brønd i en 12-brønds plade indeholdende 0,5 ml af en permeabiliserende opløsning (0,1% Triton X-100 i PBS) pr. Brønd. Permeabiliser blodkar i 10 minutter med rocking ved stuetemperatur (RT).
- Vask kort med PBS.
- For at blokere ikke-specifikke antistofbindingssteder inkuberes blodkar i 10% normalt serum fra dyrearten, hvori de sekundære antistoffer er fremstillet, i TTBS (Tris-pufret saltvand (TBS) med 2,5% Tween 20) i 30 minutter med Rocking ved RT.
- Inkuber beholdere med de primære antistoffer hensigtsmæssigt fortyndet i TTBS med 10% normalt serum (som beskrevet ovenfor) natten over med rocking ved 4 ° C. NiveauetFortynding skal bestemmes for hvert antistof.
- Udfør følgende kontrolfarvning.
- Inkubere kar med TTBS i stedet for et primært antistof efterfulgt af inkubation med et sekundært antistof.
- Inkubere beholdere med TTBS indeholdende ikke-immune (eller præimmun) serum eller Ig af samme dyr (arter), hvori primære antistoffer er blevet fremstillet efterfulgt af inkubation med et sekundært antistof.
- Fjern inkubationen med et sekundært antistof. Disse kontrolprøver skal håndteres på samme måde og på samme tid, når farvning med specifikke antistoffer udføres.
- Vask blodkar 3 gange med TTBS i 10 minutter hver med rocking ved RT.
- Inkuber med fluorescensmærkede sekundære antistoffer, der fortyndes hensigtsmæssigt i TTBS med 10% normalt serum (som beskrevet ovenfor) i 1 time med gnistning ved RT. Kernefarvning med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) kan samtidigt udføres enT denne fase ved at tilføje 1/5000 volumen af en DAPI stamopløsning, der indeholder 5 mg / ml DAPI i H20.
- Vask 3 gange med TTBS i 10 minutter hver med rocking ved RT.
- Skyl kort i PBS.
- Anbring en dråbe anti-fade-reagens på et dækglas (22 mm x 50 mm) og læg et blodkar på dækslet med endotelet nedad.
- Anbring et glidestykke (22 mm x 75 mm) på blodkarret, mens du undgår fældebobler.
- Placér diætet på et rent laboratorietørkemiddel ( f.eks. Kimwipe) og dækslet glideren med to stykker laboratorietørre. Placer forsigtigt 3,5 kg vægt ( fx brug en flaske vand på en tykk bog) på glideren i maks. 5 min. Til at flette blodprøven i ansigtet.
- Fjern vægten og tør den overskydende opløsning ud af dækslet.
- Påfør neglelak i de 4 hjørner af dækslet, læg gliderne i en glideboks, dækslip side op og hold i mørket ved RT(Eller 4 ° C) natten over. Denne proces fladder vævet yderligere og gør det lettere at lave mikroskopi ved høje forstørrelser.
- Tæt dækslet fuldstændigt ved hjælp af neglelak.
- Udfør mikroskopi så snart neglelaket er tørt.
- Opbevar dias ved -20 ° C, hvis det er nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk en-face-immunofluorescensbillede af endotelet er vist i figur 3 . Dette billede viser et enkelt optisk afsnit af en musaorta i nærheden af åbningen af en interkostalarterie (det store mørke ægformede område). Aorta blev dobbeltfarvet med anti-VE-cadherin (grøn) og anti-VCAM-1 (vaskulærcelleadhæsionsmolekyle-1) (rød). Hver endotelcelle er skitseret med en grøn lineær farvning ved adhærensforbindelsen. På grund af mindre ujævnheder i prøven er nogle adhærensforbindelser uden for denne optiske sektion. Anti-VCAM-1-farvning er stærkere ved åbningen af intercostalarterien, hvor forstyrret blodgennemstrømning er kendt for at forekomme. Figur 4 viser ansigtsfarvning af carotidarterier med anti-VE-cadherin (grøn), anti-VCAM-1 (rød) og DAPI (lilla). Den venstre karotidarterie (LCA) blev delvist ligeret, mens den højre carotidarterie (RCA) var uberørt. Beholderprøverne blev lavet 1 dag efter Kirurgi og farvet. Bemærk øget anti-VCAM-1 farvning i den ligerede beholder. Prøver, der er farvet immunofluorescens med forskellige antistoffer, kan anvendes til at undersøge ekspressionsniveauet af proteiner af interesse, omfanget af posttranslationelle modifikationer af målproteiner og naturligvis mønsteret for lokalisering af forskellige proteiner inde i endotelceller såvel som i andre celler inden for Blodkarvæg 10 , 11 .
Figur 1 : Detaljeret fartøjs anatomi i musens livmoderhalsområde. Det vaskulære netværk før og efter dissektion er vist til venstre. Alle arterierne er identificeret i diagrammet vist til højre. Sorte linjer angiver ligationer. Skala: 1 division = 1 mm._blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Diagram, der viser, hvordan carotidarterier og Aorta er lavet til En Face Preparations. Stiplede linjer langs skibsvæggen angiver udskæringer, der skal gøres for at åbne skibene. De farvede mikrografer viser egentlige ansigtspræparater. Skala: 1 division = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: En En-Face Image af Endotelet Stained med Anti-VE-cadherin (Green) og Anti-VCAM-1 (Red). En konfokal enkelt optisk del af endotelceller nær en intercostal åbning ervist. Bemærk, at VCAM-1-ekspression er forøget i endotelceller, der er placeret ved fartøjets grenpunkt, hvor blodstrømmen er ikke-laminær. Billedet blev optaget ved hjælp af en objektiv objektiv på 60 x (NA 1,4, olie). Skalbjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: En ansigtsbilleder af venstre og højre karotidarterier farvet med anti-VE-cadherin (grøn), anti-VCAM-1 (rød) og DAPI (lilla). Den venstre karotidarterie blev delvist ligeret, og den højre carotid blev efterladt intakt. Disse ansigtspræparater blev foretaget 24 timer efter operationen. Øget ekspression af VCAM-1 på den ligerede side sammenlignet med den intakte beholder er tydelig. Disse billeder blev taget i nærheden af bifurcation af fælles carotidarterier medVed hjælp af et laserskannende konfokalt mikroskop med en objektiv objektiv på 60 x (NA 1,4, olie). Skalestænger = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved håndtering af museblodkar, er det vigtigt at huske, at endotelet er skrøbeligt, og at enhver overdreven mekanisk kraft vil skade endotelceller. Endotelceller kan for eksempel bryde eller løsne sig fra beholdervæggen, hvis karret bliver perfunderet for kraftigt, hvilket let kan ske, når vaskulaturen perfuseres ved hjælp af en hånddrevet sprøjte.
For at opnå konstant perfusionstryk bruger vi et tyngdekraftsperfusionssystem med et tryk på 120 cm vandkolonne. Det er blevet rapporteret, at det gennemsnitlige arterielle tryk af en mus, som adskiller sig fra stamme, ligger mellem 130 og 170 cm H2014. Således er det perfusionstryk, vi bruger, lidt mindre end det målte arterielt tryk. Når vi perfusion-fikseret rotte aorta blev der brugt 90 cm H 2 O kolonne tryk 6 .
In situ endotelceller er også beskadiget, hvis beholderen strækkes under høst, Rengøring, langsgående spaltning, immunfarvning og montering. Faktisk er mekanisk skade en af de almindelige årsager til at miste endotelceller i en ansigtspræparater. Fartøjsudstrækning kan forekomme på ethvert trin under proceduren, men oftest forekommer det på tidspunktet for høstning af fartøjet. Det er også let at strække beholderen, når du fjerner fedtvæv, der er fastgjort til adventitia.
En ansigtspræparater fremstilles ved at skære et fartøj langsgående langs hele længden. Dette gøres normalt ved hjælp af skarpe oftalmiske saks. Saksens spids kan imidlertid være for stort, hvis målkarrets indre diameter er lille. I et sådant tilfælde kan man bruge et brudt tyndt engangs barberblad til at lave et snit. Vi har brugt denne teknik til at lave en ansigt forberedelser af chick mesenteric arterie 15 .
Efter fikseringen permeabiliseres en ansigtspræparater. Normalt bruges PBS indeholdende Triton X-100 tilDette formål, men det er muligt at anvende andre permeabiliseringsreagenser, såsom Tween-20, Nonidet P-40, saponin, digitonin og Leucomerm. Ideelt set bør permeabiliseringsbetingelsen optimeres i hvert laboratorium. For mus aorta og karotidarterier behandler vi dem med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur, og denne behandling er tilstrækkelig til at permeabilisere alle cellerne i beholdervæggen. Permeabiliserede prøver behandles derefter sekventielt først med et primært antistof og derefter et sekundært antistof, der er mærket fluorescens. Til farvning af muskasser er det kritisk, at det primære antistof ikke fremstilles i mus, fordi musens vaskulære væv vil indeholde muse-IgG, som vil blive mærket af det fluorescensmærkede sekundære anti-mus-IgG, hvilket forårsager høj baggrundsfarvning. Til mikroskopi bør prøven være så flad som mulig. Vi trykker dias i 5 min med 3,5 kg vægt. Denne specifikke vægt blev bestemt empirisk.
WHænder og ansigtspræparater mærkes immunofluorescens, de kan studeres ved anvendelse af et almindeligt epifluorescensmikroskop, et laserscanning-konfokalt mikroskop og et multiphotonmikroskop. Konfokal mikroskopi er bedst at opnå billeder af endotelet og subendotelialområdet op til 50 μm eller deromkring fra beholderoverfladen, mens dyb penetration af excitationslyset opnået ved multiphoton-tilstanden af belysning gør det muligt for en at opnå in-fokusbilleder fra dybden af Op til 2 mm fra fartøjets vægoverflade. Derudover kan multiphotonmikroskopi anvendes til anden harmonisk billeddannelse, mest typisk for at studere kollagenfibreorganisering i beholdervæggen. En ansigt forberedelser er store, så vi kan undersøge et stort vaskulært område såsom hele længden af aorta. Disse er nogle af fordelene ved at anvende immunofluorescensfarvede ansigtsblodpræparater. Der er dog nogle ulemper ved denne teknik. Først og fremmest er metoden begrænset tilTilgængelighed af specifikke antistoffer og andre fluorescensmærkede reagenser, såsom fluorescerende phalloidin, DAPI og DiI-Ac-LDL (acetyleret lavdensitetslipoprotein mærket med 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin perchlorat). Da billeddannelsen er baseret på fluorescens, kan ikke-fluorescerende dele af prøver ikke afbildes. Hele bjergprøverne udviser generelt autofluorescens, og elastinfibre, der findes i store blodkar fluorescerer i grønt. Denne fluorescens er især problematisk ved anvendelse af et epifluorescensmikroskop; Derfor anbefales billeddannelse med et konfokalmikroskop. Interferens af denne grønne autofluorescens kan imidlertid reduceres signifikant ved anvendelse af sekundære antistoffer mærket med et rødt fluorescerende farvestof. Endelig, da en ansigtsprøve er tyk, er billeddannelse ved overført belysning ikke mulig.
Kommercielle konfokale og multiphoton-mikroskoper leveres med billedanalysesoftware, herunderEn til kvantitativ analyse af fluorescerende intensitet af billeder. Kvantificerede data er mere pålidelige, hvis sammenligninger foretages inden for samme dias. Dette er fordi alle betingelserne for immunfarvning er de samme for prøven. Hvis der skal sammenlignes farvningsintensiteter mellem forskellige dias (f.eks. Normale vs syge skibe), er den eneste måde at validere dataene på at øge prøveantalet, så både tekniske og biologiske variationer kan gennemsnites. Generelt er intensitetsmålinger på konfokale billeder opnået nær overfladen af fartøjer mere pålidelige. Fluorescerende intensiteter af billeder opnået fra dybere områder af væv tendens til at være mere variable på grund af forskellige grader af spredning og absorption af både excitation og emitteret fluorescerende lys. Generelt skal man være forsigtig med at fortolke subtile intensitetsforskelle påvist i de dybe områder af prøver. For at forbedre billeddannelsesevnen fra dybere områder af væv, gøres forsøg på at gøre tProblemer gennemskinnelige, og nogle imponerende billeder er opnået (for eksempel se en ny artikel fra Neckel et al. 16 og papirer citeret af disse forfattere). Selvom det er muligt, at de behandlinger, der anvendes til at gøre væv gennemskinnelige, kan ekstrahere visse antigener og / eller denaturere bestemte epitoper, kan denne metode anvendes til at få mere reproducerbare fluorescerende signaler fra dybere områder af væv.
Anvendelsen af ansigtspræparater er ikke begrænset til billeddannelse ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Ved hjælp af et stereomikroskop kan en ansigtsbeholderpræparater anvendes til at studere omfanget af aterosklerotisk plaqueformation efter farvning af dem med Olie Rød O. En ansigtsbeholderpræparater kan fremstilles aseptisk. Sådanne præparater kan opbevares i kultur og kan anvendes som et ex vivo system til undersøgelse af leukocyt-endotelcelleinteraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Forfatterens forskningsaktiviteter understøttes af tilskud fra National Institute of Health til Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
