Summary
माउस कैरोटिड धमनी और महाधमनी के चेहरे की तैयारी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इस प्रकार की तैयारी, जब विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence रंगा हुआ हो, तो हमें प्रोपोटिन के स्थानीयकरण और सेल प्रकार की पहचान को पूरी तरह से नाड़ी की दीवार के भीतर confocal microscopy द्वारा पढ़ने में सक्षम बनाता है।
Abstract
पैराफिन एम्बेडेड ऊतकों के अनुभाग नियमित रूप से ऊतक ऊतक विज्ञान और हिस्टोपैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि तीन-आयामी ऊतक आकारिकी ऐसे वर्गों से क्या है। इसके अलावा, जांच किए गए ऊतकों के वर्गों में ऊतक के भीतर इस क्षेत्र को शामिल नहीं किया जा सकता है जो चालू अध्ययन के उद्देश्य के लिए आवश्यक है। यह बाद की सीमा रक्त वाहिकाओं के हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों को बाधित करती है क्योंकि वास्कुलर घावों को एक फोकल रूप से विकसित किया जाता है। इसके लिए एक ऐसी विधि की आवश्यकता है जो हमें रक्त वाहिका की एक विस्तृत क्षेत्र का सर्वेक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है, इसकी सतह से गहरी क्षेत्रों तक। रक्त वाहिकाओं की एक पूरी श्रृंखला को तैयार करना इस आवश्यकता को पूरा करता है। इस लेख में, हम दिखाएंगे कि कैसे माउस एओरोटा और कैरोटिड धमनी के चेहरे की तैयारियों को बनाने और immunofluorescently उन्हें confocal माइक्रोस्कोपी और अन्य प्रकार के प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग के लिए दाग़।
Introduction
प्रकाश सूक्ष्मदर्शी द्वारा हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययन के लिए, जैविक ऊतकों के तीन आयामी टुकड़े नियमित रूप से पैरालिंग के लिए अनुक्रमित और धुंधला हो जाने के बाद पैराफिन एम्बेडिंग के लिए संसाधित होते हैं। पैरासिफ़ेन-एम्बेडेड किया गया एक ऊतक नमूना सभी तीन आयामों में कई मिलीमीटर हो सकता है। हालांकि, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के उद्देश्य के लिए, यह पहले सेक्शन किया जाना चाहिए ताकि प्रकाश पारित हो सके और फिर दाग हो ताकि पतली धारा इमेजिंग के लिए पर्याप्त विपरीत पैदा कर सकें। चूंकि खंडित नमूने आमतौर पर मोटाई में 5-10 माइक्रोन हैं, इसलिए एक समय में दो आयामों में पूरे नमूने का केवल बहुत ही छोटा अंश देखता है। प्रत्येक अनुभाग व्यक्तिगत रूप से इमेजिंग के बाद, अनुक्रमिक वर्गों को एकत्र करना संभव है, और 3 डी छवियों के कंप्यूटर-समर्थित पुनर्निर्माण करने के बाद, लेकिन यह वास्तव में एक थकाऊ काम है रक्त वाहिकाओं के हिस्टोपैथोलॉजी, विशेषकर एथेरोसलेरोसिस के रोगजनन के अध्ययन के लिए, अद्वितीय समस्याएं प्रस्तुत करता है एथ्रोस्क्लेरोसिस एक फोकली रोग है जो विकसित होती हैस्थानीय स्तर पर उन क्षेत्रों में जहां रक्त का प्रवाह बिगड़ता है। इसके अलावा, बीमारी की शुरूआत अंतःक्षेम के भीतर की जाती है, एक पतली ऊतक जिसमें बड़ी धमनियों का अंतकोशिकाय कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स शामिल होता है। इन कारणों के लिए, खंडित रक्त वाहिकाओं का उपयोग करते हुए शुरुआती घावों का पता लगाने और उनका अध्ययन करना एक चुनौती है क्योंकि एक आसानी से घावों को विभाजित कर सकता है। यहां तक कि अगर किसी अनुभाग में एक रोगग्रस्त क्षेत्र शामिल होता है, तो एक को केवल 5-10 माइक्रोन भाग मिलेगा जिसमें एन्डोथेलियल कोशिकाओं और मीडिया और एडमिटीया में अन्य संवहनी दीवार कोशिकाएं शामिल हैं।
पूरे माउंट एन चेहरे (उल्लेखित आन फास्ट) की तैयारी हमें रक्त वाहिनियों की एक विस्तृत क्षेत्र की जांच करने की अनुमति देती है जैसे कि महाधमनी जड़ से पूरे महाधमनी सभी तरह से आम iliac धमनियों के नीचे। विशिष्ट एंटीबॉडी और अन्य विशिष्ट जांच के साथ दाग वाले इस तरह के नमूने का उपयोग करते हुए, कोई भी घावों के स्थान को इंगित कर सकता है और साथ ही साथ संयोजन के अंतःथल कोशिकाओं में विभिन्न आणविक घटनाएं भी हो सकती हैं।वें एथरेोजेनेसिस जैसे कि अभिव्यक्ति में परिवर्तन, स्थानीयकरण, और प्रोटीन के पोस्ट ट्रांसलेशनलेटिक सुधार। एथरेोजेनेसिस का अध्ययन करने के अलावा, एंटीऑथेलियल सेल आकृति जो एन चेहरे की तैयारी में देखी जाती है, इसका प्रयोग क्षेत्रीय समय-औसत रक्त प्रवाह पैटर्न के सूचक के रूप में किया जाता है। सीटू में एंडोथेलियल कोशिकाओं के तंत्र-विश्लेषण का अध्ययन करने के लिए इस तरह के डेटा महत्वपूर्ण हैं। इस उद्देश्य के लिए, नियमित हिस्टोलॉजिकल क्रॉस-सेक्स्ड रक्त वाहिकाओं उपयोगी नहीं हैं। इस प्रकार, संवहनी चिकित्सा और जीव विज्ञान के लिए, रक्त वाहिकाओं के चेहरे की तैयारी करने के लिए एक तकनीक का अधिग्रहण करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है जो किसी को पोत की सतह के व्यापक क्षेत्र के साथ-साथ पोत के गहरे उपसतहों के क्षेत्र का पालन करने की अनुमति देता है।
जेवेल और सर्चेव 1 द्वारा समीक्षा के अनुसार, रक्त वाहिकाओं के चेहरे को देखने के लिए संवहनी जीवविज्ञानियों ने विभिन्न तरीकों का विकास किया है। 1 9 40 और 1 9 50 के दशक में कुछ सरल तरीके विकसित किए गए थे। इन विधियों का उपयोग करते हुए, वे थे एंडोथेलियल कोशिकाओं के मूलभूत संगठन का अध्ययन करने में सक्षम है, जो रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सतह को रेखांकित करता है। हालांकि, जिस तरह से इन चेहरे की तैयारी तैयार की जाती है (तथाकथित हौत्चन विधि 2 , 3 , 4 या पोत की सतह 5 से छीलकर) और जिस तरह से नमूना रंगा हुआ था, उसमें निरंतर रूपात्मकता प्राप्त करने के लिए हमेशा संभव नहीं था पोत की सतह से जानकारी रक्त वाहिनियों के गहरे हिस्से में होती है। इम्योनोफ्लोरेसैंस स्टेनाइजिंग के साथ मिलकर पूरे जहाज की तैयारी के लिए हमें इन कोशिकाओं में एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का अध्ययन करने की अनुमति नहीं थी, बल्कि इस तरह के अध्ययन को पोत की दीवार के उप-क्षेत्रीय क्षेत्र में विस्तार करने की अनुमति दी गई थी। प्रारंभिक अध्ययन रक्त वाहिका और चेहरे की तैयारी का उपयोग करते हुए 1 9 80 के 6 में दिखाई देने लगे ,7. "लेजर स्कैनिंग confocal microscopy और अधिक हाल ही में multiphoton माइक्रोस्कोपी के आगमन के साथ, अब एक immunofluorescently दाग वाले चेहरे पोत के नमूनों के साथ ही जीवित जानवरों में संवहनी नेटवर्क में रक्त वाहिनियों की दीवार संरचना की स्पष्ट ध्यान केंद्रित छवियों प्राप्त कर सकते हैं 8 , 9 , 10 , 11. ये कंप्यूटर-आधारित इमेजिंग तकनीक इन-फ़ोकस ऑप्टिकल सेक्शनेड छवियां बनाती हैं, और ऐसी छवियां खड़ी करके, एक पोत की दीवारों के पुनर्संचित 3 डी छवियां और ऊतकों में संवहनी नेटवर्क प्राप्त कर सकती हैं। इसके अलावा, एक पुनर्निर्मित छवि 12 , 13 के जेड-अक्ष के साथ बनाए गए एक अनुभाग की छवियां उत्पन्न कर सकते हैं।
इस लेख में, हम माउस एरोरो की चेहरे की तैयारियों और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए मन्या धमनी तैयार करने के लिए एक विधि को वर्णन करेंगे। चेहरा तैयारियांइन जहाजों को प्रयोगात्मक रूप से छेड़छाड़ के बाद भी बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक कैरोटिड धमनी आंशिक रूप से ligated हो सकता है और फिर इस तरह के एक शल्य चिकित्सा के बाद एक एन चेहरा तैयार किया जा सकता है। इस कारण से, हम इस लेख में भी वर्णन करेंगे कि हम कैरोटिड धमनी पर आंशिक रूप से कैसे बंधन करते हैं। चूहों, खरगोशों और मनुष्यों जैसे बड़े जानवरों से समान तैयारियां बनाने के मुकाबले, माउस का आकार आकार में छोटा और अधिक नाजुक है, इस प्रकार जहाजों के शल्यचिकित्सात्मक अलगाव के दौरान निपटने और एंटीबॉडी धुंधला और माइक्रोस्कोपी के लिए उन्हें तैयार करने की अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है। चूंकि आनुवांशिक संशोधन के लिए सबसे ज्यादा इस्तेमाल किया जाने वाला पशु मॉडल माउस है, कई जांचकर्ताओं को उन्हें हानि पहुंचाए बिना माउस वाले जहाजों को संभालना महत्वपूर्ण होता है। इस पांडुलिपि में, हम यह बताएंगे कि माउस एरोरा और कैरोटिड धमनी की चेहरे की तैयारी करते हुए माउस रक्त वाहिकाओं को कैसे संभालना है। प्रदर्शन के उद्देश्य के लिए, हम जंगली प्रकार C57 / बी 6 चूहों का उपयोग करेंगे।
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Protocol
माउस आंशिक कैरोटीड धमनी लगीकरण और माउस महाधमनी का अलगाव और चेहरे पर immunostaining के लिए मन्या धमनी के लिए प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IBT 2014-9231) द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।
1. वाम आंशिक गाढ़ा धमनी लिगेई
- मेज पर 12 इंच x 14 इंच के हीटिंग पैड रखकर सर्जिकल स्पेस तैयार करें और बड़े स्वच्छ शल्य चिकित्सा के साथ पैड और टेबल टॉप को कवर करें। बूम स्टैंड के हाथ को समायोजित करें ताकि स्टिरीओमिकोरोस्कोप के क्षेत्र का दृश्य हीटिंग पैड के केंद्र क्षेत्र में हो।
- मेज पर हीटिंग पैड चालू करें और 3-सेटिंग नियंत्रण डायल मध्यम गर्मी स्तर पर सेट करें। इस तापमान सेटिंग पर, सर्जिकल बोर्ड की सतह (1.6.1 देखें) 38-40 डिग्री सेल्सियस होगी।
- एक अन्य पिंजरे पर एक स्वच्छ पिंजरे रखें। ऊपर के रूप में हीटिंग पैड को चालू करें यह पिंजरे सर्जरी के बाद वसूली के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (1.16 देखें) और साथ ही साथ आवास
- एक माउस वजन। एनाल्जेसिया की उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए शरीर के वजन की आवश्यकता होती है, जो सर्जरी से ठीक पहले प्रशासित किया जाएगा।
- प्रेरण कक्ष में एक माउस रखें
- प्रेरण कक्ष में माउस को anesthetize करने के लिए ऑक्सीजन टैंक और संवेदनाहारी vaporizer चालू करें। Isoflurane स्तर 2% पर बनाए रखें माउस को चलने से पहले 3-5 मिनट लगते हैं।
- चूंकि माउस को एन्स्थेह किया जा रहा हैTized, एक सर्जिकल सतह बनाने के लिए stereomicroscope के तहत बाँझ शल्य परिधान (24 इंच x 24 इंच) का एक छोटा टुकड़ा जगह फिर एक लिपटी सतह पर ऐक्रेलिक शल्यचिकित्सा बोर्ड (जिसे 70% शराब से साफ किया गया है) रखें। सर्जिकल बोर्ड इसलिए हीटिंग पैड पर होना चाहिए, लेकिन सर्जिकल पर्दे की दो परतों से अलग है।
- जब माउस प्रेरण कक्ष में आगे बढ़ना बंद हो जाता है, माउस को पूर्व सर्जिकल तैयारी के क्षेत्र में स्थानांतरित करें और नाक-शंकु में vaporizer (2% isoflurane) से जुड़ा हुआ है। इलेक्ट्रिक ट्रिमर या हेयर रिमूवर लोशन का उपयोग करके ग्रीवा क्षेत्र के आसपास बाल निकालें। हम हेयर लोशन को हटाने का सुझाव देते हैं क्योंकि यह विधि ढीली बाल के टुकड़े नहीं उत्पन्न करती है, जो सर्जिकल क्षेत्र से पूरी तरह से हटाने के लिए कठिन हैं।
- जगह में नाक-शंकु के साथ, माउस को सर्जिकल बोर्ड पर ले जाएं।
- सर्जिकल बोर्ड को दाएं और बाएं अग्र-पंजे नीचे टेप करें दोनों हिंद पैरों को टेप नीचे टेपमाउस के दाहिनी ओर पर। यह माउस शरीर की थोड़ी सी रोटेशन का कारण बनता है जैसे कि माउस के गर्दन क्षेत्र के बाईं तरफ़ सर्जरी के लिए बेहतर स्थिति होती है।
- 70% शराब, क्लोरहेक्साइडिन शल्यचिकित्सा, और फिर 70% शराब के साथ चीरा क्षेत्र कीटाणुरहित। ग्रीवा चीरा क्षेत्र को छोड़कर एक निष्फल शल्य चिकित्सा के साथ माउस को कवर करें।
- पैर की अंगुली चुटकी से पुष्टि करें कि माउस पूरी तरह से संवेदनाहारी है और इंट्रापेरटोनियल या चमड़े के नीचे इंजेक्शन के जरिए एनाल्जेसिया (कैप्रोफेन 3-5 मिलीग्राम / किग्रा) दे।
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, एक स्केलपेल या आईरिस कैंची का उपयोग करके ग्रीवा क्षेत्र के चारों ओर एक ऊतक मिडलाइन चीरा बनायें।
नोट: हम कैंची का उपयोग करते हैं क्योंकि स्टिरिओमिकोरोस्कोप की कार्य दूरी सीमित है, जो स्केलपेल का उपयोग करना मुश्किल बनाता है - बाएं आम कैरोटिड धमनी (एलसीसीए) को एक तरफ धकेलने और लार ग्रंथियों को पुनर्स्थापित करके बताएं जो रक्त वाहिकाओं को एक के बाईं ओर कवर करते हैं।Nimal।
- सर्जिकल फील्ड में सभी रक्त वाहिकाओं को पहचानें ( चित्रा 1 )। एलसीसीए बाएं आंतरिक कैरोटीड धमनी (आईसीए) और बाएं बाहरी कैरोटीड धमनी (ईसीए) में विभाजन करता है। माध्यमिक पक्ष पर ईसीए से सतही थायरॉयड धमनी (एसटीए) उत्पन्न होती है ओसीसीपेटियल धमनी (ओए) आमतौर पर ईसीए से उत्पन्न होती है, लेकिन कुछ चूहों में यह आईसीए से उत्पन्न होता है।
- OA को छोड़कर सभी धमनी शाखाओं को लुगाने का प्रयोग 6-0 रेशम सिवनी में निष्फल। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, निम्न दो अवयवों को बनायें।
- धीरे-धीरे बाएं आंतरिक कैरोटीड धमनी (आईसीए) के आसपास और नीचे संयोजी ऊतक को हटा दें संदंश के साथ सटीक 6-0 रेशम सिवनी (~ 2.5 सेमी) का एक टुकड़ा लें और इसे धमनी के नीचे दें। संदंश की एक और जोड़ी का प्रयोग करना, सिवनी को इसकी लंबाई के लगभग 1/3 खींचें और धमनी को दबाना।
- बाएं बाहरी कैरोटीड धमनी (ईसीए) के चारों ओर संयोजी ऊतक को ऊपर वर्णित उसी तरह से निकालें और बाईं तरफ बेहतर थायरोइ के लिए समीपस्थ बंधन बनाएं।डी धमनी (एसटीए) ( चित्रा 1 )। शल्यचिकित्सा के क्षेत्र में चलने वाले तंत्रिका फाइबर को नुकसान पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
- जब ये ligations बना दिया गया है, लालीदार ग्रंथियों को मूल स्थिति में लौटना और बाँझ खारा की 2-3 बूँदें रखकर शल्य चिकित्सा क्षेत्र को हाइड्रेट करें। 6-0 लेपित vicryl टायर्स का उपयोग कर त्वचा को बंद करें
- सर्जरी के बाद, माउस को पूर्व-गरम पिंजरे में रखें (1.2.1 देखें)। माउस को 5 मिनट के भीतर जगा जाना चाहिए और चारों ओर घूमना शुरू करना चाहिए। एक बार पुष्टि की कि माउस सामान्य रूप से व्यवहार करता है, पिंजरे को पशु आवास कक्ष में लाता है।
- पुनर्प्राप्ति के पहले 3 दिनों के लिए माउस का ध्यान रखें। जब तक प्रायोगिक प्रोटोकॉल के लिए कॉल की जाने वाली विभिन्न स्थितियों के लिए प्रयोग की आवश्यकता होती है तब तक माउस को रखा जा सकता है। शल्य चिकित्सा के बाद किसी भी समय तैयार हो सकते हैं।
2. एन फेस इम्यूनोस्टाईनिंग
- साँस लेना ओवरडोज द्वारा सीओ 2 के साथ एक माउस का नाम दें।
- एक विदारक बोर्ड पर एक लापरवाह (पेट की ओर) स्थिति में माउस को टेप करें।
- आईरिस कैंची का उपयोग करके एक मिडलाइन चीरा बनाने के द्वारा उदर गुहा का पर्दाफाश करें।
- उदर की तकली पसलियों को काटने से वक्षीय गुहा का खुलासा करें।
- वेना कावा में एक निक बनाओ या खून से निकलने के लिए ऊर का धमनियों में से एक काट लें।
- बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष पर गुरुत्वाकर्षण छिड़काव सेटअप (120 सेंटीमीटर पानी के दबाव) से जुड़ी एक 26 जी सुई डालें और रक्त परिसंचरण युक्त हेरपिरीन (40 यू / एमएल) युक्त संचार प्रणाली को छिड़कना। छिड़काव जारी रखें जब तक कि कटौती से बाहर खारे हुए खारा स्पष्ट हो जाता है
- छिड़काव प्रणाली को खारा से पीबीएस (फॉस्फेट बुफ़र खारा) में 4% पैराफॉर्मालाइहाइड युक्त निर्धारण समाधान तक स्विच करें और 5 मिनट के लिए प्रतिफ्यूस जारी रखें।
- कुंडली के अंत कैंची और संदंश का उपयोग करके महाधमनी और दोनों बाएं और दाएं कैरोटीड धमनियों का फसल डालें और बर्फ पर लगाने वाले युक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
- प्रत्येक पोत को अलग से एक 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरण करें जिसमें 0.5 मिलीलीटर का एक परिमाहण समाधान (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100) प्रति अच्छी तरह से होता है। कमरे के तापमान (आरटी) पर कमाल के साथ 10 मिनट के लिए रक्त वाहिकाओं को स्थिर करें।
- पीबीएस के साथ संक्षेप में धोएं
- गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए, टीटीबीएस (2.5% टिच 20) के साथ टीटीबीएस (ट्रिस्-बफ़ेड खारा (टीबीएस) में 30 मिनट के लिए पशु प्रजातियों से 10% सामान्य सीरम में रक्त वाहिकाओं को सेते हैं। आरटी पर कमाल
- टीटीबीएस में 10% सामान्य सीरम (जैसा कि ऊपर वर्णित है) के साथ उचित रूप से पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ रातोंरात के साथ निहित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जहाजों सेते हैं। स्तरकमजोर पड़ने के प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए
- निम्न नियंत्रण धुंधला हो जाना
- एक प्राथमिक एंटीबॉडी के बजाय टीटीबीएस के साथ जहाजों को सेते हैं जो एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन करते हैं।
- गैर-प्रतिरक्षा (या प्री-इम्यून) सीरम या एक ही जानवर (प्रजातियों) के आईजी में टीटीबीएस युक्त जहाजों को सेते हैं जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी बनाई गई हैं, इसके बाद एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया है।
- एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन छोड़ दें ये नियंत्रण नमूनों को उसी तरीके से और उसी समय संभाला जाना चाहिए जब विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ धुंधला किया जाता है।
- टीटीबीएस के साथ तीन बार रक्त वाहिकाओं को 10 मिनट के लिए आरटी पर कमाल के साथ धो लें
- टीटीबीएस में 10% सामान्य सीरम (जैसा कि ऊपर वर्णित है) के बराबर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ आरटी पर कमाल के 1 घंटे के लिए सेते हैं। डीएपीआई के साथ परमाणु धुंधला हो जाना (4 ', 6-डायरीडिनो-2-फेनिलंडोल) एक साथ किया जा सकता हैडीएपीआई शेयर समाधान की मात्रा के द्वारा 1/5000 जोड़कर इस चरण को एच एच ओ ओ में 5 एमजी / एमएल डीएपीआई शामिल कर सकते हैं।
- आरटी पर कमाल करने के साथ टीटीबीएस के साथ 3 बार धोएं, प्रत्येक 10 मिनट के लिए धोएं।
- पीबीएस में संक्षेप में कुल्ला
- एक आवरण कांच (22 मिमी x 50 मिमी) पर फीड अभिकर्मक के एक बूंद को रखें और कण गिलास पर एक रक्त वाहिका लगाओ जिससे एन्डोथिलियम का सामना करना पड़ रहा हो।
- रक्त वाहिका पर एक स्लाइड कांच (22 मिमी x 75 मिमी) रखें, जबकि फँसाने के बुलबुले से बचें।
- एक साफ प्रयोगशाला के पोंछ पर स्लाइड रखें ( जैसे किमविप) और प्रयोगशाला के दो टुकड़ों के साथ स्लाइड को कवर करें। धीरे से 3.5 किलोग्राम वजन रखें ( जैसे मोटी किताब पर पानी की बोतल का उपयोग करें।) अधिकतम 5 मिनट के लिए स्लाइड पर एन चेहरा रक्त वाहिका नमूना को समतल करना।
- वजन निकालें और कवरलिप के आस-पास से अतिरिक्त समाधान मिटाएं।
- कवरलिप के 4 कोनों पर नेल पॉलिश लागू करें, स्लाइड्स को एक स्लाइड बॉक्स में रखें, coverslip side up और RT पर अंधेरे में रखें(या 4 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात। यह प्रक्रिया ऊतकों को आगे बढ़ाती है और उच्च आवर्धन पर माइक्रोस्कोपी करना आसान बनाता है।
- कवर कील पूरी तरह से नेल पॉलिश का उपयोग करके सील करें
- नेल पॉलिश शुष्क होने पर ही सूक्ष्मदर्शी प्रदर्शन करें।
- यदि आवश्यक हो, तो -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड करें
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Representative Results
एंडोथेलियम की एक विशिष्ट एन फेस इम्युनोफ्लोरेसेंस इमेज आकृति 3 में दिखाया गया है। यह चित्र इंटरकॉस्टल धमनी के उद्घाटन (बड़े अंधेरे अंडा के आकार वाले क्षेत्र) के पास ले गए माउस एओर्टा का एक ऑप्टिकल अनुभाग दिखाता है। महाधमनी- VE-cadherin (हरा) और एंटी-वीसीएएम-1 (संवहनी कोशिका आसंजन अणु-1) (लाल) के साथ डबल-दाग था। प्रत्येक एंडोथेलियल सेल को अनुयायियों के जंक्शन पर एक हरे रंग की रेखीय धुंधला के साथ रेखांकित किया जाता है। नमूना की मामूली असमानता के कारण, कुछ अनुवर्ती जंक्शनों इस ऑप्टिकल अनुभाग के बाहर हैं। इंटरकॉस्टल धमनी के उद्घाटन पर एंटी-वीसीएएम-1 स्टेनिंग मजबूत होता है, जहां परेशान रक्त प्रवाह उत्पन्न होता है। चित्रा 4 दिखाता है कि विरोधी VE-cadherin (हरा), विरोधी वीसीएएम-1 (लाल), और डीएपीआई (बैंगनी) के साथ कैरोटिड धमनियों का सामना धुंधला हो जाना। बाएं कैरोटिड धमनी (एलसीए) आंशिक रूप से ligated था, जबकि सही मन्या धमनी (आरसीए) अछूता था। जहाज के नमूनों को 1 दिन बाद बनाया गया था सर्जरी और दाग़ नोट ligated पोत में विरोधी VCAM-1 धुंधला वृद्धि हुई। विभिन्न एंटीबॉडी के साथ प्रतिदीप्त इम्योनोफ्लोरेसेर्स के नमूने का उपयोग ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तर, लक्ष्य प्रोटीनों के पोस्ट ट्रांसलेशन के संशोधनों की जांच, और निश्चित रूप से, एंडोथेलियल कोशिकाओं के अंदर विभिन्न प्रोटीनों के साथ-साथ अन्य कोशिकाओं में स्थानीयकरण के पैटर्न की जांच के लिए किया जा सकता है। रक्त वाहिका दीवार 10 , 11
चित्रा 1 : माउस सरविक क्षेत्र में विस्तृत पोत एनाटॉमी। विच्छेदन से पहले और बाद में संवहनी नेटवर्क बाईं ओर दिखाया गया है सभी धमनियों को सही पर दिखाए गए चित्र में पहचाना गया है। ब्लैक लाइनें लिगेशन दर्शाती हैं स्केल: 1 विभाजन = 1 मिमी_blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: आरेख दिखाता है कि कैरोटीड धमनियों और महाधमनी एन चेहरे की तैयारी में बने होते हैं। पोत दीवार के साथ बिंदीदार रेखाएं जहाजों को खोलने के लिए कटौती का संकेत करती हैं। रंगीन माइक्रोग्राफ वास्तविक चेहरे की तैयारी दिखाते हैं। स्केल: 1 विभाजन = 1 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: एंटी-व्हेई-कैडरिन (ग्रीन) और एंटी-वीसीएएम-1 (रेड) के साथ ऐन्दोथेलियम की एक एन फेस इमेज। अंतकोस्टल खोलने के पास एंडोथेलियल कोशिकाओं का एक confocal एकल ऑप्टिकल अनुभाग हैदिखाया गया है। ध्यान दें कि वीसीएएम -1 अभिव्यक्ति पोत शाखा बिंदु पर स्थित एंडोथेलियल कोशिकाओं में बढ़ जाती है जहां रक्त प्रवाह गैर-लामिनार होता है। छवि को 60x (एनए 1.4, ऑयल) ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। स्केल बार = 20 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: एंटी-वीई-कैडरिन (ग्रीन), एंटी-वीसीएएम-1 (रेड), और डीएपीआई (पर्पल) के साथ सना हुआ वाम और दाएं कैरोटीड धमनियों का एन फेस इमेज। बाईं मन्या धमनी आंशिक रूप से ligated था और सही कैरोटीड बरकरार छोड़ दिया गया था। शल्य चिकित्सा के बाद इन्हें 24 घंटे बनाया गया था। बरकरार पोत के मुकाबले लिग्एटेड पक्ष पर वीसीएएम -1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि स्पष्ट है। इन छवियों को आम कैरोटिड धमनियों के विभाजन के पास ले जाया गया60X (एनए 1.4, ऑयल) ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ एक लेज़र स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
जब माउस रक्त वाहिकाओं को संभालते हैं, तो यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि एन्डोथेलियम नाजुक है और किसी भी अत्यधिक यांत्रिक बल से एन्डोथिलियल कोशिकाओं को नुकसान होगा। उदाहरण के लिए, पोत की दीवार से एन्डोथेलियल कोशिकाओं को तोड़ या अलग कर दिया जाता है, यदि पोत बहुत मजबूती से लगाया जाता है, जो आसानी से तब हो सकता है जब वास्क्यूलेट को हाथ से संचालित सिरिंज का उपयोग करके परिरक्षित किया जाता है।
लगातार छिड़काव के दबाव को प्राप्त करने के लिए, हम एक 120 सेमी पानी स्तंभ दबाव के साथ गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली का उपयोग करते हैं। यह बताया गया है कि एक माउस का औसत धमनीय दबाव, जो तनाव से अलग होता है, 130 और 170 सेमी एच 2 ओ 14 के बीच होता है इस प्रकार, हम उपयोग किए जाने वाले छिड़काव दबाव मापा धमनी दाब से थोड़ा कम है। जब हम छिड़काव-निर्धारित चूहे महाधमनी, 9 0 सेमी एच 2 हे स्तंभ दबाव 6 का इस्तेमाल किया गया था।
सीटू अंतःस्थल कोशिकाओं में भी क्षतिग्रस्त हो जाती है अगर कटाई के दौरान पोत फैला हुआ हो, सफाई, अनुदैर्ध्य विभाजन, immunostaining, और बढ़ते। वास्तव में, यांत्रिक क्षति आम चेहरे की तैयारी में एंडोथिलियल कोशिकाओं को खोने के सामान्य कारणों में से एक है। प्रक्रिया के दौरान किसी भी कदम पर पोत खींचने की प्रक्रिया हो सकती है, लेकिन आमतौर पर यह पोत कटाई के समय होता है। आगमन के साथ जुड़ी वसा ऊतक को हटाते समय यह पोत फैलाना भी आसान होता है।
एक पूरी लंबाई के साथ लंबे समय तक एक जहाज को काटने के द्वारा तैयार की जाती है। आमतौर पर तेज नेत्र कैंची का उपयोग किया जाता है। हालांकि, कैंची की नोक बहुत बड़ी हो सकती है, यदि लक्ष्य वाला जहाज़ का भीतरी व्यास छोटा हो। ऐसे मामले में, कोई कटौती करने के लिए फ्रैक्चर वाले डिस्पोजेबल रेजर ब्लेड का इस्तेमाल कर सकता है। हम इस तकनीक का इस्तेमाल करते हैं जिससे कि चीज मेसेन्टरिक धमनी 15 के चेहरे की तैयारी कर सकें।
निर्धारण के बाद, चेहरे की तैयारी कर रहे हैं permeabilized। सामान्यतया, ट्राइटॉन एक्स -100 युक्त पीबीएस का उपयोग इसके लिए किया जाता हैइस प्रयोजन के लिए, लेकिन अन्य पारिएबिलिजेशन अभिकर्मकों जैसे कि टवीन -20, नॉनिडेट पी -40, सैपोनिन, डिजीटोनिन और लेउकमम का उपयोग करना संभव है। आदर्श रूप से, प्रत्येक प्रयोगशाला में परिमेयकरण की स्थिति को अनुकूलित किया जाना चाहिए। माउस महाधमनी और कैरिटिड धमनियों के लिए, हम उन पीबीएस के साथ आरटी युक्त 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 युक्त होते हैं, और यह उपचार पोत की दीवार के भीतर सभी कोशिकाओं को प्रचलित करने के लिए पर्याप्त है। प्रचलित नमूने तब क्रमिक रूप से प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पहले इलाज किया जाता है और फिर एक माध्यमिक एंटीबॉडी जो फ्लोरोसेंटली लेबल होता है। धुंधला माउस के जहाजों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्राथमिक एंटीबॉडी को माउस में नहीं बनाया गया है क्योंकि माउस संवहनी ऊतक में माउस आईजीजी शामिल होगा जो फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माध्यमिक एंटी-माउस आईजीजी द्वारा लेबल किया जाएगा, जिससे उच्च पृष्ठभूमि धुंधला हो सकता है। माइक्रोस्कोपी के लिए, नमूना यथासंभव फ्लैट होना चाहिए। हम 5 मिनट के लिए 3.5 किलो वजन के साथ स्लाइड दबाते हैं। यह विशेष वजन empirically निर्धारित किया गया था।
डब्ल्यूमुर्गी की चेहरे की तैयारी immunofluorescently लेबल कर रहे हैं, वे एक साधारण epifluorescence खुर्दबीन, एक लेजर स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी, और एक multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी, पोत की सतह से 50 माइक्रोन तक के एंडोटेक्लियम और उप-थैले क्षेत्र की छवियों को प्राप्त करना सबसे अच्छा है, जबकि रोशनी के बहुप्रोशन मोड द्वारा प्राप्त उत्तेजना प्रकाश की गहरी पैठ एक को इन-फोकस छवियों को गहराई से प्राप्त करने में सक्षम बनाता है पोत दीवार की सतह से 2 मिमी तक इसके अलावा, मल्टीप्लटन माइक्रोस्कोपी दूसरे हार्मोनिक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो आमतौर पर जहाज की दीवार में कोलेजन फाइबर संगठन का अध्ययन करने के लिए होता है। एन की तैयारी बड़ी होती है, जिससे हमें एक बड़े संवहनी क्षेत्र का सर्वेक्षण करने की अनुमति मिलती है जैसे महाधमनी की पूरी लंबाई। ये इम्योनोफ्लोरेसरसेंटली स्टेड एन फेस ब्लड वास डिलीवरी का उपयोग करने के कुछ फायदे हैं। हालांकि, इस तकनीक के कुछ नुकसान हैं सबसे पहले, यह विधि सीमित हैविशिष्ट एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट फेलोइडिन, डीएपीआई, और डीआई-एसी-एलडीएल (एसिटाइलेटेड लो डेन्सिटी लिपोप्रोटीन जैसे अन्य फ्लोरोसेंट-लेबल अभिकर्मकों की उपलब्धता) 1,1-डायॉकाडेस्किल - 3,3,3 ', 3'-टेट्रामिथिल-इंडोकेरबोकायनिन perchlorate)। चूंकि इमेजिंग प्रतिदीप्ति पर आधारित है, नमूनों के गैर फ्लोरोसेंट भागों को इमेजेट नहीं किया जा सकता है। सामान्य प्रदर्शन में पूरे माउंट नमूनों में autofluorescence, और एलिस्टिन फाइबर्स को बड़े रक्त वाहिकाओं में पाया जाता है जो प्रति हिरन में प्रतिदीप्ति होते हैं। एफ़िफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय यह प्रतिदीप्ति विशेष रूप से समस्याग्रस्त है; इस प्रकार, एक confocal सूक्ष्मदर्शी द्वारा इमेजिंग अत्यधिक की सिफारिश की है। हालांकि, लाल हरे रंग के फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इस हरे रंग के ऑटोफ्लोरेसेंस का हस्तक्षेप काफी कम हो सकता है। अंत में, चूंकि एन चेहरे नमूने मोटे होते हैं, संचरित रोशनी द्वारा इमेजिंग संभव नहीं है।
वाणिज्यिक confocal और multiphoton सूक्ष्मदर्शी सहित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ आते हैंचित्रों की फ्लोरोसेंट तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक समान स्लाइड में तुलना की जाने पर क्वांटिफाइड डेटा अधिक विश्वसनीय हैं ऐसा इसलिए है क्योंकि प्रतिरक्षण के लिए सभी शर्तें नमूने के लिए समान हैं। अगर धुंधला तीव्रता की तुलना अलग-अलग स्लाइड्स (उदाहरण के लिए, रोगी बनाम रोगग्रस्त वाहिकाओं) के बीच की जानी चाहिए, तो डेटा को मान्य करने का एकमात्र तरीका नमूना संख्याओं को बढ़ाना है ताकि तकनीकी और जैविक विविधताओं को औसतन किया जा सके। सामान्य तौर पर जहाजों की सतह के निकट प्राप्त की जाने वाली confocal छवियों पर तीव्रता माप अधिक विश्वसनीय होते हैं। ऊतक के गहरे क्षेत्रों से प्राप्त छवियों की फ्लोरोसेंट तीव्रता अधिक चर हो सकती हैं क्योंकि उत्तेजना और उत्सर्जित फ्लोरोसेंट प्रकाश के बिखरने और अवशोषण के विभिन्न स्तरों के कारण। सामान्य तौर पर, नमूनों के गहरे क्षेत्रों में पाए जाने वाले सूक्ष्म तीव्रता के अंतरों की व्याख्या में सावधान रहना चाहिए। टिशू के गहरे क्षेत्रों से इमेजिंग क्षमता में सुधार करने के लिए, टी बनाने के लिए प्रयास किए जा रहे हैंमुद्दे पारदर्शी, और कुछ प्रभावशाली छवियां प्राप्त की गई हैं (उदाहरण के लिए, नेक्ल एट अल। 16 और इन लेखकों द्वारा उद्धृत कागजात के हालिया लेख देखें)। यद्यपि यह संभव है कि ऊतकों को पारदर्शी बनाने वाले उपचार कुछ विशिष्ट प्रतिजनों को निकाल सकते हैं और / या कुछ विशेषताओं को खंडित कर सकते हैं, इस पद्धति का उपयोग ऊतक के गहरे क्षेत्रों से अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए किया जा सकता है।
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए एन फेस चेयरिंग का उपयोग सीमित नहीं है एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का प्रयोग करते हुए, चेहरे के पोत की तैयारी को तेल रेड ओ के साथ धुंधला होने के बाद एथेरोस्क्लोरोटिक पट्टिका के गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चेहरे के पोत की तैयारी को सीधा रूप से बनाया जा सकता है ऐसी तैयारी संस्कृति में रखी जा सकती है और ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पूर्व विवो प्रणाली के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
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Disclosures
कोई नहीं
Acknowledgments
लेखकों की अनुसंधान गतिविधियों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से डॉ। आबे (एचएल -130193, एचएल-123346, एचएल -118462, एचएल -108551) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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