Summary
É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal.
Abstract
As secções de tecidos embebidos em parafina são rotineiramente utilizadas para estudar histologia de tecido e histopatologia. No entanto, é difícil determinar qual é a morfologia tridimensional do tecido a partir dessas seções. Além disso, as secções dos tecidos examinados podem não conter a região dentro do tecido que é necessária para a finalidade do estudo em curso. Esta última limitação dificulta estudos histopatológicos de vasos sanguíneos uma vez que as lesões vasculares se desenvolvem de forma focalizada. Isto requer um método que nos permita examinar uma vasta área da parede dos vasos sanguíneos, desde a sua superfície até regiões mais profundas. Uma montagem completa en face preparação dos vasos sanguíneos cumpre este requisito. Neste artigo, vamos demonstrar como fazer preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida e imunofluorescentemente mancha-los para microscopia confocal e outros tipos de imagem baseada em fluorescência.
Introduction
Para estudos histopatológicos por microscopia óptica, tridimensional partes de tecidos biológicos são rotineiramente processados para parafina embedment seguido de seccionamento e coloração. Uma amostra de tecido que foi embebida em parafina pode ter vários milímetros em todas as três dimensões. No entanto, para a finalidade da microscopia de luz, deve ser primeiro seccionado de modo que a luz possa atravessar e manchada então de modo que a seção fina rendesse o suficiente contraste para a imagem latente. Porque os espécimes seccionados são geralmente 5-10 μm na espessura, um vê somente uma fração muito pequena do espécime inteiro em duas dimensões de cada vez. É possível coletar seções seqüenciais e, após a imagem de cada seção individualmente, realizar reconstrução assistida por computador das imagens 3D, mas este é um trabalho tedioso. Histopatologia dos vasos sanguíneos, especialmente para o estudo da patogênese da aterosclerose, apresenta problemas únicos. A aterosclerose é uma doença focalizada que desenvolveLocalmente em áreas onde ocorre o fluxo sanguíneo perturbado. Além disso, a doença é iniciada dentro da íntima, um tecido fino constituído por uma monocamada de células endoteliais e matriz extracelular, de grandes artérias. Por estas razões, é um desafio para localizar e estudar lesões precoces usando vasos sanguíneos seccionados, porque pode-se facilmente deixar de seccionar a lesão. Mesmo se uma secção incluir uma área doente, ver-se-á apenas uma porção de 5-10 μm contendo células endoteliais e outras células da parede vascular nos meios e adventitia.
Preparações completas de montagem em face (pronunciadas än fäs) nos permitem examinar uma vasta área da superfície do vaso sanguíneo, como a aorta inteira da raiz da aorta, até as artérias ilíacas comuns. Utilizando um tal espécime corado com anticorpos específicos e outras sondas específicas, pode-se identificar a localização das lesões e também onde ocorrem vários eventos moleculares em células endoteliais em conjunção comA aterogénese, tais como alterações na expressão, localização e modificações pós-traducionais de proteínas. Além de estudar a aterogênese, a forma de célula endotelial observada em preparações faciais é usada como um indicador do padrão regional de fluxo sanguíneo em tempo médio. Tais dados são importantes para o estudo da cicatrização mecânica de células endoteliais in situ. Para esta finalidade, os vasos sanguíneos histológicos transversais de corte não são úteis. Assim, para medicina vascular e biologia, é especialmente importante adquirir uma técnica para fazer preparações en face de vasos sanguíneos que permite observar uma vasta área da superfície do vaso, bem como as áreas mais profundas subsuperfície do vaso.
Conforme revisto por Jelev e Surchev 1 , os biólogos vasculares desenvolveram vários métodos para observar o revestimento dos vasos sanguíneos em face. Alguns métodos engenhosos foram desenvolvidos nos anos 1940 e 1950. Usando esses métodos, eles foram Capaz de estudar a organização fundamental das células endoteliais que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. No entanto, devido ao modo como estas preparações em face são preparadas (o chamado método de Hautchen 2 , 3 , 4 ou descascamento da superfície do recipiente 5 ) e a forma como o espécime foi corado, nem sempre foi possível obter uma morfologia morfológica ininterrupta Informações da superfície do vaso para as áreas mais profundas da parede dos vasos sanguíneos. A preparação de vasos en-face de montagem completa combinada com a coloração por imunofluorescência permitiu não apenas estudar a morfologia das células endoteliais ea expressão e localização das proteínas nessas células, mas também estender esses estudos à região subendotelial da parede do vaso. Os primeiros estudos usando vasos sanguíneos en face preparações imunoflurescently manchadas começaram a aparecer na década de 1980 6 ,7. Com o advento da microscopia confocal de varrimento a laser e, mais recentemente, a microscopia multifotónica, pode-se agora obter imagens nítidas claras da estrutura da parede dos vasos sanguíneos em amostras de vasos en face imunofluorescentemente corados bem como a rede vascular em animais vivos 8 , 9 , 10 , 11. Estas técnicas de imagem baseadas em computador criam imagens seccionadas ópticas em foco e, empilhando-as, podem obter-se imagens 3D reconstruídas da parede vascular e da rede vascular nos tecidos. Pode gerar imagens de uma secção feita ao longo do eixo Z da imagem reconstruída 12 , 13 .
Neste artigo, iremos ilustrar um método para preparar preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida para a coloração imunof luorescente. En face preparaçõesPode ser feita mesmo depois destes vasos terem sido experimentalmente manipulados. Por exemplo, uma artéria carótida pode ser ligada parcialmente e depois uma preparação en face preparada após tal cirurgia. Por esta razão, também descreveremos neste artigo como realizamos uma ligadura parcial na artéria carótida. Comparados com preparações semelhantes de animais maiores tais como ratos, coelhos e seres humanos, os vasos de ratinho são de pequeno tamanho e mais frágeis, necessitando assim de cuidados adicionais durante o isolamento cirúrgico dos vasos e preparando-os para a coloração de anticorpos e a microscopia. Como o modelo animal mais comumente usado para a modificação genética é o mouse, torna-se crítico para muitos pesquisadores lidar com vasos de mouse sem danificá-los. Neste manuscrito, vamos descrever como lidar com os vasos sanguíneos do rato quando se fazem preparações en face da aorta do rato e da artéria carótida. Para efeitos de demonstração, utilizaremos ratinhos C57 / b6 de tipo selvagem.
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Protocol
Os protocolos para a ligadura da artéria carótida parcial do mouse e o isolamento da aorta do rato e da artéria carótida para a imunocoloração de face são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IBT 2014-9231).
1. Ligação da Artéria Carótida Parcial Esquerda
- Prepare o espaço cirúrgico, colocando uma almofada de aquecimento de 12 polegadas x 14 polegadas sobre a mesa e cobrir a almofada e tampo da mesa com um grande drapeado cirúrgico limpo. Ajuste o braço do suporte da barra para que o campo de visão do estereomicroscópio esteja na área central da almofada de aquecimento.
- Ligue a almofada de aquecimento na mesa e coloque o botão de controlo de 3 posições no nível de calor médio. Neste ajuste de temperatura, a superfície da placa cirúrgica (ver 1.6.1) será de 38-40 ° C.
- Coloque uma gaiola limpa em outra almofada de aquecimento. Gire a almofada de aquecimento como acima. Esta gaiola será utilizada para a recuperação após a cirurgia (ver 1.16), bem como para a habitação.
- Pesar um mouse. O peso corporal é necessário para determinar a quantidade adequada de analgesia, que será administrada imediatamente antes da cirurgia.
- Coloque um mouse na câmara de indução.
- Ligue o tanque de oxigênio eo vaporizador anestésico para anestesiar o mouse na câmara de indução. Manter o nível de isoflurano a 2%. Demora 3-5 minutos antes que o mouse parar de se mover.
- Enquanto o mouse está sendo anestheColoque um pedaço menor de tecido cirúrgico estéril (24 polegadas x 24 polegadas) sob o microscópio estereoscópico para criar uma superfície cirúrgica. Em seguida, coloque uma placa cirúrgica acrílica (que foi limpo com álcool 70%) na superfície drapejada. A placa cirúrgica deve, portanto, estar na almofada de aquecimento, mas separada por duas camadas de cortinas cirúrgicas.
- Quando o mouse pára de se mover na câmara de indução, transfira o mouse para uma área de preparação pré-cirúrgica e posicione seu nariz no cone nariz conectado ao vaporizador (isoflurano a 2%). Remova o cabelo em torno da área cervical usando um aparador elétrico ou loção removedor de cabelo. Recomendamos loção remoção de pêlos, porque este método não vai produzir pedaços de cabelo solto, que são difíceis de remover completamente da área cirúrgica.
- Com o nariz-cone no lugar, mova o mouse para a placa cirúrgica.
- Tape para baixo as patas dianteiras direita e esquerda para a placa cirúrgica. Tape para baixo ambas as pernas traseiras togeNo lado direito do mouse. Isto provoca uma ligeira rotação do corpo do rato de tal modo que o lado esquerdo da área do pescoço do rato fica melhor posicionado para a cirurgia.
- Desinfectar a área da incisão com 70% de álcool, clorexidina esfrega cirúrgica, e novamente com 70% de álcool. Cubra o mouse com um pano cirúrgico esterilizado, exceto para a área da incisão cervical.
- Confirme com uma pitada de dedo que o ratinho está completamente anestesiado e administre analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) via injecção intraperitoneal ou subcutânea.
- Sob o microscópio dissecante, faça uma incisão ventral da linha média ao redor da área cervical usando um scalpel ou tesoura de íris.
NOTA: Usamos tesoura porque a distância de trabalho do estereomicroscópio é limitada, o que torna difícil usar um bisturi. - Expor a artéria carótida comum esquerda (LCCA), empurrando para o lado e reposicionando as glândulas salivares que cobrem os vasos sanguíneos para o lado esquerdo da aNimal.
- Identificar todos os vasos sanguíneos no campo cirúrgico ( Figura 1 ). A LCCA bifurca na artéria carótida interna esquerda (ICA) e na artéria carótida externa esquerda (ECA). A artéria tireoidiana superficial (STA) surge da ECA no lado medial. A artéria occipital (OA) costuma surgir da ECA, mas em alguns ratos ela surge da ICA.
- Ligatar todos os ramos da artéria, exceto o OA usando sutura de seda esterilizada 6-0. Para conseguir isto, faça as duas ligações seguintes.
- Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor e abaixo da artéria carótida interna esquerda (ICA). Pegue um pedaço de sutura de sutura pré-cortada 6-0 (~ 2,5 cm) com fórceps e passe-o sob a artéria. Usando outro par de pinças, puxe a sutura cerca de 1/3 do seu comprimento e ligue a artéria.
- Remova o tecido conjuntivo em torno da artéria carótida externa esquerda (ECA) da mesma maneira descrita acima e faça uma ligadura proximal ao tiróide superior esquerdoD (STA) ( Figura 1 ). Tenha cuidado para não danificar as fibras nervosas que correm dentro do campo cirúrgico.
- Quando estas ligaduras foram feitas, retornar as glândulas salivares para a posição original e hidratar o campo cirúrgico, colocando 2-3 gotas de solução salina estéril. Feche a pele usando suturas Vicryl revestidas com 6-0.
- Após a cirurgia, coloque o mouse na gaiola pré-aquecida (ver 1.2.1). O rato deve acordar dentro de 5 min e começar a andar ao redor. Uma vez confirmado que o mouse se comporta normalmente, leve a gaiola para a sala de alojamento dos animais.
- Observe o mouse diariamente durante os primeiros 3 dias de recuperação. O rato pode ser mantido, desde que a experiência exija sob as várias condições que o protocolo experimental requer. As preparações faciais podem ser feitas a qualquer momento após a cirurgia.
2. En Face Immunostaining
- Eutanizar um rato com CO 2 por overdose por inalação.
- Tape o mouse em uma posição supina (lado do ventre para cima) em uma placa de dissecação.
- Exponha a cavidade abdominal fazendo uma incisão na linha média usando uma tesoura de íris.
- Expor a cavidade torácica cortando as costelas lateralmente ao esterno.
- Fazer um entalhe na veia cava ou cortar uma das artérias femorais para drenar o sangue.
- Inserir uma agulha de 26 G ligada a uma instalação de perfusão por gravidade (120 cm de pressão de água) no ápice do ventrículo esquerdo e perfundir o sistema circulatório com solução salina contendo heparina (40 U / mL). Continue a perfusão até que a solução salina que flui para fora do corte torna-se clara.
- Mudar o sistema de perfusão de soro fisiológico para a solução de fixação contendo paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato) e continuar a perfusão durante mais 5 min.
- Colher a aorta e ambas as artérias carótidas esquerda e direita usando tesoura de ponta romba e fórceps, e colocar em um tubo cônico de 50 mL contendo o fixador em gelo.
- Transferir cada recipiente separadamente para um poço de uma placa de 12 poços contendo 0,5 mL de uma solução permeabilizante (Triton X-100 a 0,1% em PBS) por poço. Permeabilize vasos sanguíneos durante 10 min com oscilação à temperatura ambiente (RT).
- Lavar brevemente com PBS.
- Para bloquear locais de ligação de anticorpos não específicos, incubar os vasos sanguíneos em soro normal a 10% da espécie animal na qual os anticorpos secundários foram feitos, em TTBS (solução salina tamponada com Tris (TBS) com Tween 20 a 2,5%) durante 30 min com Balançando na RT.
- Incubar os vasos com os anticorpos primários adequadamente diluídos em TTBS com 10% de soro normal (como descrito acima) durante a noite com oscilação a 4 ° C. O nívelDe diluição deve ser determinada para cada anticorpo.
- Execute a seguinte coloração de controlo.
- Incubar vasos com TTBS em vez de um anticorpo primário seguido por incubação com um anticorpo secundário.
- Incubar vasos com TTBS contendo soro não imune (ou pré-imune) ou Ig do mesmo animal (espécie) em que foram feitos anticorpos primários, seguido de incubação com um anticorpo secundário.
- Omitir a incubação com um anticorpo secundário. Estas amostras de controlo devem ser manuseadas da mesma maneira e ao mesmo tempo em que é realizada a coloração com anticorpos específicos.
- Lavar os vasos sanguíneos 3 vezes com TTBS durante 10 min cada com oscilação à RT.
- Incubar com anticorpos secundários marcados fluorescentemente diluídos apropriadamente em TTBS com 10% de soro normal (como descrito acima) durante 1 h com oscilação à RT. A coloração nuclear com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole) pode ser realizada simultaneamente aT nesta fase adicionando 1/5000 em volume de uma solução stock DAPI que contém 5 mg / mL de DAPI em H2O.
- Lavar 3 vezes com TTBS durante 10 min cada com oscilação à RT.
- Enxaguar brevemente em PBS.
- Coloque uma gota do reagente anti-fade em uma tampa de vidro (22 mm x 50 mm) e coloque um vaso sanguíneo sobre a tampa de vidro com o endotélio virado para baixo.
- Coloque um vidro de slide (22 mm x 75 mm) no vaso sanguíneo, evitando bolhas de captura.
- Coloque a lâmina em um limpador de laboratório limpo ( por exemplo, Kimwipe) e cubra a lâmina com dois pedaços de esfregão de laboratório. Coloque suavemente 3.5 kg de peso ( por exemplo, use uma garrafa de água em um livro grosso.) No slide por um máximo de 5 min para aplainar a amostra de vasos sangüíneos en face.
- Remova o peso e limpe o excesso de solução em torno da lamela.
- Aplique esmalte nas 4 esquinas da lamela, coloque as lâminas em uma caixa de slide, lado da lamela para cima e mantenha no escuro em RT(Ou 4 ° C) durante a noite. Este processo aplana o tecido ainda mais e torna mais fácil fazer a microscopia em altas ampliações.
- Seal o coverslip completamente usando unha polonês.
- Realize a microscopia assim que o esmalte estiver seco.
- Se necessário, armazene as lâminas a -20 ° C.
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Representative Results
Uma imagem de imunofluorescência em face típica do endotélio é mostrada na Figura 3 . Esta imagem mostra uma única secção óptica de uma aorta do rato tomada perto da abertura de uma artéria intercostal (a grande área escura em forma de ovo). A aorta foi duplamente corada com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular-1) (vermelho). Cada célula endotelial é delineada com uma coloração linear verde na junção dos aderentes. Devido a pequenas irregularidades da amostra, algumas junções aderentes estão fora desta secção óptica. A coloração com Anti-VCAM-1 é mais forte na abertura da artéria intercostal, onde se sabe que o fluxo sanguíneo perturbado ocorre. A Figura 4 mostra a coloração da face das artérias carótidas com anti-VE-caderina (verde), anti-VCAM-1 (vermelho) e DAPI (púrpura). A artéria carótida esquerda (LCA) foi parcialmente ligada enquanto a artéria carótida direita (RCA) não foi tocada. Os espécimes dos vasos foram feitos um dia após o Cirurgia e manchado. Observa-se aumento da coloração anti-VCAM-1 no vaso ligado. Os espécimes corados imunofluorescentemente com vários anticorpos podem ser utilizados para investigar o nível de expressão de proteínas de interesse, a extensão das modificações pós-traducionais de proteínas alvo e, claro, o padrão de localização de várias proteínas dentro de células endoteliais assim como em outras células dentro da Parede 10 , 11 do vaso sanguíneo.
Figura 1 : Anatomia detalhada do vaso na área cervical do rato. A rede vascular antes e depois da dissecção é mostrada à esquerda. Todas as artérias são identificadas no diagrama mostrado à direita. Linhas pretas indicam ligaduras. Escala: 1 divisão = 1 mm._blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2: Diagrama mostrando como as artérias carótidas e a aorta são feitas em preparações faciais. Linhas pontilhadas ao longo da parede do vaso indicam cortes a serem feitos para abrir os vasos. As micrografias coloridas mostram preparações reais de face. Escala: 1 divisão = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Uma imagem frontal do endotélio corado com anti-VE-caderina (verde) e anti-VCAM-1 (vermelho). Uma única secção óptica confocal de células endoteliais perto de uma abertura intercostal émostrando. Note-se que a expressão de VCAM-1 é aumentada em células endoteliais localizadas no ponto de ramificação do vaso onde o fluxo sanguíneo não é laminar. A imagem foi gravada usando uma lente objetiva 60X (NA 1.4, óleo). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens En Face das Artérias Carótidas Esquerda e Direita Coloridas com Anti-VE-caderina (Verde), Anti-VCAM-1 (Vermelho) e DAPI (Roxo). A artéria carótida esquerda foi ligada parcialmente e a carótida direita foi deixada intacta. Estas preparações en face foram feitas 24 h após a cirurgia. É evidente a expressão aumentada de VCAM-1 no lado ligado em comparação com o recipiente intacto. Essas imagens foram coletadas perto da bifurcação de artérias carótidasUsando um microscópio confocal de varredura a laser com uma lente objetiva 60X (NA 1.4, óleo). Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ao manusear os vasos sanguíneos do rato, é importante lembrar que o endotélio é frágil e que qualquer força mecânica excessiva danificará as células endoteliais. Por exemplo, as células endoteliais quebram ou se desprendem da parede do vaso se o vaso é perfundido com muita força, o que pode acontecer facilmente quando a vasculatura é perfundida usando uma seringa operada manualmente.
Para obter uma pressão de perfusão constante, utilizamos um sistema de perfusão por gravidade com uma pressão de coluna de água de 120 cm. Foi relatado que a pressão arterial média de um rato, que difere por estirpe, varia entre 130 e 170 cm H 2 O 14 . Assim, a pressão de perfusão que usamos é ligeiramente menor do que a pressão arterial medida. Quando se utilizou aorta de rato fixada por perfusão, utilizou-se pressão de coluna de 90 cm H 2 O 6 .
As células endoteliais in situ também são danificadas se o recipiente é esticado durante a colheita, Limpeza, separação longitudinal, imunocoloração e montagem. De fato, os danos mecânicos são uma das causas comuns da perda de células endoteliais em preparações faciais. O estiramento do vaso pode ocorrer em qualquer etapa durante o procedimento, mas, mais comumente, ocorre no momento da colheita do vaso. Também é fácil esticar o vaso ao remover o tecido adiposo ligado à adventícia.
As preparações faciais são preparadas cortando um recipiente longitudinalmente ao longo de todo o seu comprimento. Isto é feito geralmente usando tesoura oftálmica afiada. No entanto, a ponta das tesouras pode ser demasiado grande se o diâmetro interno do vaso alvo for pequeno. Nesse caso, pode-se usar uma lâmina de barbear descartável fina fracturada para fazer um corte. Nós usamos esta técnica para fazer preparações en face da artéria mesentérica do pintinho 15 .
Após a fixação, as preparações faciais são permeabilizadas. Normalmente, PBS contendo Triton X-100 é usado paraEste objectivo, mas é possível utilizar outros reagentes de permeabilização tais como Tween-20, Nonidet P-40, saponina, digitonina e Leucomerm. Idealmente, a condição de permeabilização deve ser otimizada em cada laboratório. Para a aorta do rato e as artérias carótidas, tratamo-las com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 durante 10 min à RT, e este tratamento é suficiente para permeabilizar todas as células dentro da parede do vaso. As amostras permeabilizadas são em seguida tratadas sequencialmente primeiro com um anticorpo primário e depois com um anticorpo secundário que é marcado por fluorescência. Para a colora�o de vasos de ratinho, �cr�ico que o anticorpo prim�io n� seja feito em murganho porque o tecido vascular de ratinho conter� IgG de ratinho que ser�tiquetado pela IgG anti-ratinho secund�ia fluorescentemente marcada, provocando uma colora�o de fundo elevada. Para a microscopia, a amostra deve ser o mais plana possível. Pressionamos as lâminas por 5 min com 3,5 kg de peso. Este peso específico foi determinado empiricamente.
WHen en face preparações são rotulados imunofluorescentemente, eles podem ser estudados usando um microscópio ordinário epifluorescência, um microscópio confocal de varredura a laser, e um microscópio multiphoton. A microscopia confocal é melhor para obter imagens do endotélio e da região subendotelial até 50 μm ou mais a partir da superfície do vaso, enquanto a penetração profunda da luz de excitação obtida pelo modo multiphoton de iluminação permite obter imagens focalizadas a partir da profundidade de Até 2 mm da superfície da parede do vaso. Além disso, microscopia multiphoton pode ser usado para imagens de segunda harmônica, mais tipicamente para estudar a organização da fibra de colágeno na parede do vaso. As preparações faciais são grandes, permitindo-nos examinar uma grande área vascular, como todo o comprimento da aorta. Estas são algumas das vantagens da utilização imunofluorescentemente manchada en face vasos sanguíneos preparações. Contudo, existem algumas desvantagens desta técnica. Em primeiro lugar, o método é limitado aoDisponibilidade de anticorpos específicos e outros reagentes marcados fluorescentemente, tais como fluoresceína faloidina, DAPI e DiI-Ac-LDL (Lipoproteína de baixa densidade acetilada marcada com 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametil-indocarbocianina Perclorato). Uma vez que a imagem é baseada na fluorescência, partes não-fluorescentes de espécimes não podem ser visualizadas. Todos os espécimes de montagem em geral exibem autofluorescência, e as fibras de elastina encontradas em grandes vasos sanguíneos fluorescem em verde. Esta fluorescência é especialmente problemática quando se utiliza um microscópio de epifluorescência; Assim, imaging por um microscópio confocal é altamente recomendado. Contudo, a interferência desta autofluorescência verde pode ser significativamente reduzida usando anticorpos secundários marcados com um corante vermelho fluorescente. Finalmente, uma vez que os espécimes en face são grossos, a imagem por iluminação transmitida não é possível.
Os microscópios comerciais confocal e multiphoton vêm com software de análise de imagem, incluindoUm para a análise quantitativa da intensidade fluorescente das imagens. Os dados quantificados são mais confiáveis se as comparações forem feitas dentro do mesmo slide. Isto é assim porque todas as condições para a imunocoloração são as mesmas para o espécime. Se as intensidades de coloração tiverem de ser comparadas entre diferentes lâminas (por exemplo, vasos normais versus doentes), a única forma de validar os dados é aumentar o número de amostras para que as variações técnicas e biológicas possam ser médias. Em geral, as medições de intensidade em imagens confocais obtidas perto da superfície dos vasos são mais confiáveis. As intensidades fluorescentes de imagens obtidas de regiões mais profundas do tecido tendem a ser mais variáveis devido a diferentes graus de dispersão e absorção de excitação e de luz fluorescente emitida. Em geral, deve-se ter cuidado na interpretação de diferenças de intensidade sutis detectadas nas áreas profundas dos espécimes. Para melhorar a capacidade de imagem de regiões mais profundas de tecido, estão a serTranslucidez e algumas imagens impressionantes foram obtidas (por exemplo, ver um artigo recente de Neckel et al.16 e artigos citados por esses autores). Embora seja possível que os tratamentos utilizados para tornar os tecidos translúcidos possam extrair certos antigénios e / ou desnaturar certos epitopos, este método pode ser utilizado para obter sinais fluorescentes mais reprodutíveis a partir de regiões mais profundas do tecido.
O uso de preparações en face não se limita a imagiologia por microscopia de fluorescência. Utilizando um microscópio estéreo, as preparações dos vasos en-face podem ser utilizadas para estudar a extensão da formação da placa aterosclerótica após a sua coloração com Oil Red O. As preparações dos vasos en face podem ser feitas assepticamente. Tais preparações podem ser mantidas em cultura e podem ser utilizadas como um sistema ex vivo para estudar a interacção leucócito-célula endotelial.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
As atividades de pesquisa dos autores são suportadas por concessões do instituto nacional da saúde ao Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag | Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G | |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch | Cardinal Health | 4024 | |
| Blunt retractors, 2.5 mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity gauze sponges 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Electric heating pad, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Micro cover glass 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petri dishes 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 | |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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