Summary
Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.
Abstract
Hartweefsel techniek beschreven technieken driedimensionale kracht opwekkende gemanipuleerde weefsels vormen. Voor de uitvoering van deze procedures in fundamenteel onderzoek en preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen, is het belangrijk om protocollen voor automatisch genereren en analyses te ontwikkelen onder gestandaardiseerde omstandigheden. Hier presenteren we een techniek om Engineered hartweefsel (EHT) van cardiomyocyten van verschillende species (rat, muis, mens) te genereren. De techniek berust op de montage van een fibrine-gel die gedissocieerd cardiomyocyten tussen elastische polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten in een 24 putjes format. Driedimensionale, kracht opwekkende EHTs vormen binnen twee weken na het gieten. Deze procedure maakt het mogelijk om het genereren van enkele honderden EHTs per week en is technisch alleen beperkt door de beschikbaarheid van hartspiercellen (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluatie van auxotonic spiercontracties wordt uitgevoerd in een gewijzigde incubatiekamer met een mechanical interlock 24-wells platen en een camera bovenop deze kamer. Een software bestuurt een camera bewogen op een XYZ-assenstelsel elke EHT. EHT contracties gedetecteerd worden door een geautomatiseerd figuur algoritme en kracht berekend op basis van verkorting van de EHT en elastische neiging en geometrie van de PDMS posten. Deze procedure maakt het mogelijk voor automatische analyse van grote aantallen EHT onder gestandaardiseerde en steriele omstandigheden. De betrouwbare detectie van effecten van geneesmiddelen op cardiomyociet samentrekking is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van het hart van geneesmiddelen en veiligheid farmacologie. We demonstreren het voorbeeld van het hERG kanaal remmer E-4031, dat het menselijke EHT systeem repliceert drug reacties op contractie kinetiek van het menselijk hart, wat aangeeft dat een veelbelovend voor cardiale drugveiligheid screening.
Introduction
Cardiale bijwerkingen zoals de door drugs veroorzaakte lange QT-syndroom hebben geleid tot de markt nemen van de afgelopen jaren. Statistieken tonen aan dat ongeveer 45% van alle opnames zijn te wijten aan ongewenste effecten op het cardiovasculaire systeem 1. Dit medicijn niet na de dure ontwikkelingsproces en goedkeuring is het worst-case scenario voor farmaceutische bedrijven. Onderzoek en ontwikkeling afdelingen daarom richten op het opsporen van dergelijke ongewenste cardiovasculaire effecten vroeg op. Voor economische en ethische bezwaren, de inspanningen om dierproeven te verminderen en te vervangen door nieuwe in vitro screeningstesten zijn gaande.
Een set van gevestigde assays zijn opgenomen in de Verenigde Staten Food and Drug Administration (FDA) en het European Medicines Agency (EMA) richtsnoeren voor preklinische evaluatie van pro-aritmische effecten van geneesmiddelen 2. De technologie van herprogrammering somatische cellen, gevolgd door differentiatie vanhumane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) versterkt dit onderzoeksgebied 3. Het biedt nu de mogelijkheid om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen op de menselijke hartspiercellen in vitro screenen en voorkomt problemen met de inter-species verschillen. Recente cardiale differentiatie protocollen 4, 5 bieden onbeperkt aanbod van hartspiercellen zonder ethische zorg. Echter, het meten van de contractiele kracht, de belangrijkste en best gekarakteriseerd in vivo parameter van hartspiercellen, is niet goed vastgesteld. Dit hangt samen met de relatieve onrijpheid 6 van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) in vergelijking met de volwassen cardiomyocyten. Een mogelijke verbetering te construeren 3-dimensionele hartweefsel van enkelvoudige cellen 7 (engineered hartweefsel EHT). De EHT protocol is gebaseerd op het inbedden één murine of humane hartspiercellen 8 sup>, 9, 10 in fibrine hydrogel tussen twee flexibele polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten 11 24 putjes. Binnen een paar dagen de hartspiercellen spontaan beginnen te contracteren als enkele cellen en beginnen te cellulaire netwerken te vormen. Na 7-10 dagen, macroscopische contracties van het gehele weefsel zichtbaar. Tijdens dit proces wordt de extracellulaire matrix wordt verbouwd, hetgeen leidt tot een vermindering van diameter en lengte. De verkorting van de EHT resultaten bij het buigen van de PDMS plaatsen zelfs tijdens rust, het onderwerpen van hartspiercellen in de ontwikkelingslanden EHT om continue belasting. EHTs blijven auxotonic spiercontracties te voeren over een aantal weken. Menselijke EHTs tonen respons op fysiologische en farmacologische stimulering vermelding van hun geschiktheid voor drug screening en ziektemodel 7.
In dit manuscript presenteren we een robuust en eenvoudig protocol voor de Generatiop menselijke EHT en contractiliteit geautomatiseerde analyse van concentratie afhankelijke veranderingen van de contractie patroon in aanwezigheid van hERG kanaal remmers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven een celcultuur protocol. Gelieve te presteren onder steriele omstandigheden en het gebruik van voorverwarmde media.
1. Cardiac Differentiatie van iPSC
- Cultiveren van de iPSC
- Coat 6 putjes (1 ml / putje) of T75-kolven (7 ml / kolf) waarvan de groeifactor basaalmembraanmatrix (bijv geltrex, 1: 200; zie tabel materiaalkosten) verdund in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) voor 30 min bij 37 ° C. Bereid FTDA medium 12 door mengen basische DMEM / F-12 medium met 2 mM L-glutamine, 0,5% penicilline / streptomycine, 5 mg / l transferrine, 5 ug / l selenium, 0,1% menselijk serumalbumine, 1x lipide-mengsel, 5 mg / l insuline, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / ml activine A, 0,5 ng / ml humaan TGFß1 en 30 ng / mL FGF2.
- Zaad iPSC (~ 3 x 10 10/05 cm²) in FTDA medium en kweek bij 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 met dagelijkse mediumverversing (Figuur 1A). Bij 80% confluentie doorgang (1: 2-1: 6) met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 0,5 mM; incubatietijd ~ 4 min).
- De vorming van embryo lichamen (EB)
- Cultiveren iPSC in T75 kolven tot hoge dichtheid.
- Wassen flessen met confluente cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en geïncubeerd in 0,5 mM EDTA gedurende -10 min. Zorg ervoor dat de cellen niet los van de bodem van de kolf.
- Verwijder EDTA met glazen pipet, spoelen uit cellen met 10 ml PBS, tikt kolven bij de bank om cellen los.
OPMERKING: Gebruik cel schraper indien nodig. - Verzamel cellen in 50 ml conische buis, voeg ¼ volume (bijvoorbeeld 10 ml RMPI tot 40 ml celsuspensie) RPMI 1640 medium (of een andere standaard medium dat 1,8 mM calcium) en gecentrifugeerd bij 250 xg gedurende 5 minuten.
- Hersuspenderen celpellet in FTDA medium aangevuld met 4 mg / ml polyvinylalcohol (PVA) en10 uM Y27632 en tel de cellen in een Neubauer kamer.
- Vul de centrifugekolf met de celsuspensie (30 x 10 6 cellen / 100 ml FTDA medium aangevuld met PVA en Y-27632; zie stap 1.2.2) en start EB formatie in spinner kolven (pas rotorsnelheid magnetische roerder 40 rpm ) in de celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) overnacht.
- Cultiveren iPSC in T75 kolven tot hoge dichtheid.
- mesodermale differentiatie
- Tijdens EB vorming, laag celkweek flessen geschikt voor suspensiekweek met niet-ionogene oppervlakteactieve stof (14 ml / T175) overnacht bij 37 ° C.
- De volgende ochtend was surfactant gecoate kolven tweemaal met PBS (30 ml / T175). Voeg PBS opnieuw en in de incubator te houden totdat het nodig is.
- Verwijder de centrifugekolf uit de incubator.
OPMERKING: De celsuspensie moet duidelijk met kleine macroscopisch zichtbare EBS (figuur 1B) zijn. - Breng 50 ml suspensie aan een 50 ml conische kuipe EBS en laat bezinken gedurende 5-20 min.
- Verwijder het supernatant en was het pellet met 7 ml RPMI 1640 aangevuld met 2% PVA en 10 pM Y-27632. Overdracht suspensie tot een gegradueerde 15 ml conische buis en schatting EB volume (~ 50-100 pi).
- Transfer inhoud van de spinner kolven niet beklede T175 flessen en verlaat deze op V-vormige rek voor sedimentatie gedurende maximaal 20 minuten. Verwijder supernatant en was embryoïde lichamen zoals hierboven vermeld. Vul niet de T175 kolf met meer dan 200 ml als sedimentatie te lang zou duren. Als aanvankelijk centrifugekolf volume groter is dan 200 ml, verdeeld EB suspensie verscheidene T175 flessen en combineer EBS opnieuw na wassen.
- Verwijder wasmedium en resuspendeer in mesodermale medium voor differentiatie, dat RPMI aangevuld met 4 mg / ml PVA, 0,5% penicilline / streptomycine, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethaansulfonzuur (HEPES), 0,05% humaan serum albumine, 5 ug / ml transferrine, 5 ng / ml natriumseleniet, 0,1% lipide mix, 250 uM fosfo-ascorbaat, 10 pM Y-27632, 10 ng / ml botmorfogeenproteïne-4 (BMP-4), en 3 ng / ml activine A, 5 ng / mL FGF2 stabiel.
- Verwijderen uit PBS-surfactant gecoate T175 flessen en vul met celsuspensie (200 pl EB in 40 mL). Gebruik kleinere kolven voor kleinere EB volume.
- Cultiveren EBS in suspensie gedurende drie dagen (37 ° C, 5% CO2, 5% O2). Uitwisseling 50% van het medium (zelfde samenstelling als in stap 1.3.7) dagelijks (gebruik V-vormige sedimentatie rack). Bereid medium elke dag vers vóór het voeren.
- Cardiac differentiatie
- Bereid nieuwe oppervlakte-actieve stof beklede schepen de dag vóór en behandelen zoals hierboven (1.3.2) aangegeven.
- Na drie dagen van mesodermale inductie, laat EBS genoegen nemen met maximaal 5 min op sedimentatie rek. Verwijder meeste van het medium en wassen met RPMI 1640 aangevuld met 0,5% penicilline / streptomycine en 10 mM HEPES.
- Breng 10 ml EB suspensie gegradeerde15 mL buis en schatting EB volume na sedimentatie.
- Resuspendeer EBS zorgvuldig cardiale differentiatie medium bestaande uit RPMI 1640 aangevuld met 0,5% penicilline / streptomycine, 10 mM HEPES, 0,05% menselijk serumalbumine, 5 ug / ml transferrine, 5 ng / ml natriumseleniet, 0,1% lipide mengsel, 250 pM fosfo -ascorbate, 1 pM Y-27632, 100 nM Wnt-remmer DS-I-7 13.
- Transfer EBS nieuwe surfactant gecoate celkweek flessen (-200 pl EBS in 46 ml / T175).
- Incubeer gedurende drie dagen (37 ° C, 5% CO2, 21% O2) met 50% mediumverandering (mediumsamenstelling zie stap 1.4.4) op de tweede en derde dag. Laat het medium binnen de eerste 48 uur niet veranderen.
- Incuberen in een medium bestaande uit RPMI 1640 aangevuld met 500 uM 1-thioglycerol, 10 mM HEPES, 0,5% penicilline / streptomycine, 1 pM Y-27632, 2% serumvrij neurale celcultuur supplement (bv B27) insuline, 100 nM Wnt remmer DS-I-7 met dagelijkse uitwisseling van 50% medium voor de komende vier dagen. EBS moet gaan kloppen binnen deze periode.
- Na een week van cardiale differentiatie, over te schakelen naar hetzelfde medium zonder Wnt remming en met serum-vrij neurale celcultuur supplement. Ververs 50% van het medium elke dag, met uitzondering van de eerste dag.
- Dissociatie van menselijke hartspiercellen
OPMERKING: Na twee weken differentiatieprotocol dient EBS spontane contracties (figuur 1C) vertonen. Als dat zo is, start dissociatie en voor te bereiden collagenase oplossing.- Bereid collagenase oplossing door weging en oplossen 200 U / ml calcium-vrije Hanks' gebalanceerde zoutoplossing zonder calcium / magnesium (HBSS) en voeg 1 mM HEPES, 10 pM Y-27632, 30 uM N-benzyl-p-tolueensulfonamide ( BTS). Steriliseren door filtratie (0,2 urn filter) en bewaar monsters bij -20 ° C. Ontdooi monsters bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Settle EBS op sedimentatie rek,aspireren medium en vervangen door 20-25 ml voorverwarmde HBSS. Herhaal deze wasstap eens te meer.
- Aspireren HBSS en vervangen voorverwarmd collagenase-oplossing (15 ml / T175). Incubeer gedurende 4 uur in de celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2, 21% O2).
- Bereid blokkeerbuffer met DMEM aangevuld met 1% penicilline / streptomycine en DNase (12 ug / ml).
- Tik op de celkweek kolven op de bank, los EBS moet desintegreren en uit elkaar vallen (indien niet, verhoog incubatietijd). Voorzichtig fijnstampen celsuspensie overgebracht in een conische buis van 50 ml. Wassen flessen met blokkerende buffer (15 ml / T175) en breng aan de buis.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 100 x g. Resuspendeer cellen in warm DMEM, vermaal en tel cellen.
2. Genereren van Engineered hartweefsel (EHT)
- Autoclaaf handel verkrijgbare PDMS rekken en polytetrafluorethyleen (PTFE) afstandhouders (zie Materialen enEquipment spreadsheet; Figuur 2) en de voorbereiding van de volgende oplossingen onder steriele omstandigheden, een dag voor EHT genereren.
- Bereid 2% agarose door wegen en oplossen in geschikt volume van PBS, autoclaaf, direct bewaren bij 60 ° C.
- Bereid aprotinine (33 mg / ml) door weging en oplossen in geschikt volume aqua ad iniectabilia, steriel filter (0,22 urn filter), hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid fibrinogeen (200 mg / ml) door oplossen steriele fibrinogeen geschikt volume steriel 0,9% NaCl (lauw), hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid thrombine (100 U / ml) door oplossen steriele trombine in drie delen steriel PBS en 2 delen aqua ad iniectabilia, analyseren hoeveelheid van 3 pi in kleine buisjes en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid 10x DMEM door oplossen van 670 mg 10x DMEM poeder in 5 ml aqua ad iniectabilia, steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid 2x DMEMdoor het mengen van 2 ml DMEM met 10 x 2 ml door warmte geïnactiveerd paardenserum, 0,2 ml penicilline / streptomycine en 5,8 ml aqua ad iniectabilia, steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid EHT-casting medium (ECM) door mengen DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfserum, 1% penicilline / streptomycine en 1% L-glutamine (200 mM), bewaar bij 4 ° C.
- Bereid gietvormen in 24-putjesplaten pipetteren 1,6 ml warm agarose (2% PBS) en het plaatsen van de PTFE afstandhouder (figuur 2A) in de putjes.
LET OP: Plaats spacer onmiddellijk na pipetteren tot een maximum van 8 putten - agarose stolt zeer snel. Laat de agarose bij kamertemperatuur niet gedurende langer dan 5 min. - Na agarose stolling (~ 10 min, agarose wordt opaak draaien) Verwijder de PTFE afstandhouders (figuur 2C) en plaats de PDMS rekken (figuur 2B) in de gietvormen zodat paren PDMS posten bereiken in elke vorm (Figuur 2D).
- Bereid 110% van het geschatte volume van reconstitutie mengsel in een ronde bodem 15-mL buis op ice.For 24 EHTs, pipet reconstitutie mengsel vermeld in tabel 1 van mens, rat of muis cardiomyocyten, respectievelijk (10% extra is inbegrepen).
OPMERKING: celconcentratie van reconstitutie mengsel verschilt voor menselijk (10 x 10 6 cellen / ml), ratten (4,1 x 10 6 cellen / ml) en muizen (6,8 x 10 6 cellen / ml) EHTs. Afhankelijk van de concentratie van de celsuspensie, voeg extra ECM tot een eindvolume van 2640 pi. Fibrinogeen lauw voor pipetteren te zijn. Vul langzaam de punt van de pipet en niet het oppervlak van de koude reconstitutie mengsel niet met de fibrinogeen bevattende pipet bij het toevoegen van fibrinogeen aan reconstitutie mix - de viscositeit van de fibrinogeen in de pipetpunt onmiddellijk zou toenemen. - Vermaal de reconstitutie mengsel 10-15 maal met een serologische pipet tot de fibrinogeen stolsel wordt opgelost. Controleer de reconstructie mix in de pipet voor homogeniteit.
- Voor elke EHT Pipetteer 100 ul reconstitutie mengsel in een hoeveelheid trombine (3 pl in 200 pl buis), mengen en pipet het mengsel in de agarose-sleuven zo snel mogelijk (figuur 2E). Gebruik een nieuwe filter tip voor elke EHT. Resuspendeer de reconstructie mix (trituratie met serologische pipet 5-10 maal) na elke 8 EHTs.
- Zodra alle slots zijn gevuld met reconstitutie mix, sluit het deksel van de celkweekschaal en incubeer bij 37 ° C, 7% CO2 gedurende 2 uur.
- Verwijder de plaat uit de incubator en plaats onder een steriele kap. Bedek elk putje met een kleine hoeveelheid medium (bijvoorbeeld DMEM, ongeveer 200-500 pl) Schud de platen voorzichtig opnieuw incuberen bij 37 ° C gedurende ten minste 10 min. De toevoeging van DMEM zal het verwijderen van fibrine gels uit agarose gietmallen verlichten.
- Verwijder voorzichtig de PDMS rekken uit de agarose gietmallen en overbrengen naar de met medium gevulde plaat met 24 putjes (figuur 2F). Plaats de schaal terug in de incubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O2 voor menselijk en ratten EHTs, 21% O2 voor muizen EHTs) en diervoeders maandag, woensdag en vrijdag met vers bereide EHT-medium. EHTs moet spontane contracties afbuigen van de posten van de PDMS rekken tonen 7-10 dagen na het gieten (figuur 1D, 2G).
- Voor muizen EHTs voeg 25 ug / ml 5-cytosine βDarabinofuranoside kweekmedium gedurende 48 uur tot fibroblast proliferatie te beperken.
3. Analyse Contractie
LET OP: De krimp analyse is gebaseerd opVideo-optische registratie in een commercieel verkrijgbaar EHT analyseapparaat (zie tabel van materialen). De centrale eenheid van dit instrument een incubatiekamer (Figuur 3A). De software die bij het instrument berekent contractiekracht basis van afbuiging van de PDMS palen met bekende elasticiteitsmodulus en de vorm 11 (aanvullend Figuur 1).
- Schakel de verwarmingsinrichting van de machine 2 uur voor de meting. Schakel gastoevoer en elektronische voorziening van de as onmiddellijk vóór de samentrekking analyse.
- Voor baseline opname (referentiepunt in de analyse), plaatst de 24-well plaat met EHTs in EHT-medium in de EHT analyseapparaat en start de contractie analysesoftware volgens leveranciershandboek.
- Klik op het tabblad "Protocol" in het rechter paneel en voer de relevante informatie met betrekking tot studie, gebruikersnaam, species, ceType II, leeftijd, opnameduur en aanvullende opmerkingen.
- Klik op het tabblad "Camera" op het linker paneel en beginnen met camera live-modus met automatische figuur detectie-modus. Klik op het tabblad "Setup" op het rechter paneel andadjust de camera positie met de xyz coördinaten voor elk putje in de 24-well-schotel. Zorg ervoor dat de EHT is in het midden van het raam en in de focus van de camera.
- Zorg ervoor dat het deksel van de celkweek gerecht is niet mistig, omdat dit cijfer erkenning en krimp analyse zal aantasten.
NB: Het cijfer erkenning algoritme is gebaseerd op het opsporen van een hoog contrast gebieden en het toezicht op de verandering in de positie. In de software die gebieden van figuur herkenning met een blauwe kruis dat beweegt met de contracties van de EHT gemarkeerd. - Ervoor zorgen dat de posities van de blauwe kruisen aan de boven- en ondereinden van de EHTs en bewegende alleen verticaal afstemmen van de contracties van de EHTs (Figuur 3B). Save setup posities van elk putje door op de knop "positie ok".
- Zorg ervoor dat het deksel van de celkweek gerecht is niet mistig, omdat dit cijfer erkenning en krimp analyse zal aantasten.
- Klik vervolgens op het tabblad "Parameters" op het linkerpaneel. De hier getoonde parameters bepalen de criteria op basis waarvan de software identificeert een samentrekking piek en markeert het met een groen plein. Deze waarden zijn zeer belangrijk voor correcte identificatie van contractie pieken (figuur 3C) en geen valse gegevenspunten (figuur 3E-F).
OPMERKING: Een lijst van soorten afhankelijke parameters en voorbeelden is weergegeven in figuur 3H. Voor meer informatie, raadpleeg de software handleiding. - Klik op het tabblad "Automatic" op het rechter paneel en de inleiding van de analyse door het activeren van de knop "Start". De software zal achtereenvolgens van de ene put naar het volgende, opnemen EHT contracties en bereken kracht tijdens het opnemen (weergegeven in de tab "real time" in het linkerpaneel). Aan het einde van de analyse, een pdf-rapport summarizing de resultaten automatisch gegenereerd.
- Opslaan en analyseren van de PDF-rapport het systeem gegenereerd om de resultaten samen te vatten.
- Bewaken van de contractiele parameters door herhaalde meting over meerdere dagen. De EHT zal toenemen in contractie van kracht totdat het een plateau (meestal rond dag 15 van de cultuur) heeft bereikt.
- geneesmiddelscreening
- Prepare proteïne vrije Tyrode oplossing een dag vóór de meting en equilibreren in 24-putsplaten (2 ml / putje) in de celkweek incubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O2) overnacht: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1 mM MgCl2, 0,1-5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH 2PO 4, 22,6 mmol NaHCO3, 5 mM glucose, 0,05 mM Na2EDTA, 25 mM HEPES. Voeg calcium tot 1,8 mm of de eerder bepaalde [EC 50] om positieve inotrope effecten te onderzoeken.
- Weeg en los het geneesmiddel in DMSO en filtreer steriel, indien nodig.Bereid 6 verschillende 1000x-sub-voorraadoplossingen (in DMSO) van de werkconcentratie (bv 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 pM voor de respectieve nanomolaire bereik).
- Verdun de respectievelijke beelden in de Tyrode platen (2 pl per put 2 ml) en meng. Plaats de borden terug in de couveuse totdat het nodig is.
- Start de nulmeting door de eerste-Tyrode gevulde 24-well-plaat onder de motorkap en steriele positie koolstof elektroden in de putjes. Breng de PDMS rekken met EHTs bovenop koolstofelektroden, sluit het deksel, zet de plaat terug in de incubator en wacht op een equilibratie gedurende -30 min.
- Breng de EHTs uit de incubator naar de vergrendeling in de EHT analyse-instrument. Sluit het instrument en opnemen spontane basislijn contractiliteit (20 s / EHT).
- Sluit de koolstofelektroden de stimulatie- kabel en start elektrische stimulatie van de EHTs (2,5 V, 4 ms pulsduur, humaan: ~ 1 Hz, rat: ~ 2Hz, muis: ~ 4 Hz). Noteer het "tempo" basislijn (10 s / EHT). Zorg ervoor dat alle EHTs goed zijn tempo. Stimulatiefrequentie en de spanning kan variëren van cellijn tot cellijn.
- Na basislijn opname verwijderen EHTs uit het instrument en breng de elektroden met PDMS rekken geplaatst, de 24-well-plaat met de eerste geneesmiddelconcentratie. Breng de EHTs weer op de vergrendeling van de EHT analyseapparaat onmiddellijk en incubeer er (standaarddrugtests incubatietijd bijvoorbeeld 20 min).
- Sluit stimulatie kabels passen figuur herkenning en opname EHT contracties reageren op het eerste geneesmiddelconcentratie.
- Voor de volgende geneesmiddelconcentraties Herhaal stap 3.5.7 en 3.5.8 met de 24-well-platen met hogere geneesmiddelconcentraties.
- Sla alle pdf opnames. Controleer elke opname voor figuur erkenning juiste positionering van groene pleinen identificeren contractie pieken en artefacten (zie 3.2.1 en figuur 3
- Voer extra offline analyse indien nodig.
- Kies de betreffende vlucht voor de "Runs" database op het linker paneel door te klikken op "Select run". In het tabblad "Parameter" aan de linkerkant, te wijzigen parameter voor krimp analyse. Kies nu "Offline analyse" op het tabblad "Offline" op het rechter paneel om de video's opnieuw analyseren.
- Figuur erkenning aan te passen en dus een nieuw videobestand te nemen, kiest "Sample beoordeling" na het aanpassen van het cijfer herkenning in het tabblad "real time". LET OP: Sample beoordeling kan alleen heranalyseren één putje in een tijd, terwijl offline analyse nieuwe parameter kan gelden voor alle putten door te klikken op de knop "Use parameter op alle putjes" in het "Parameter" paneel aan de linkerkant. Beide soorten offline analyses zullen automatisch nieuwe data bestanden en pdf-weergave van de resultaten te creëren.
- Analyseer het experiment door het combineren van de resultaten van de biological repliceert en samenvatting van de gegevens in concentratieresponskrommen voor frequentie contractiekracht, samentrekkingstijd en relaxatietijd (Figuur 5D) en / of grafische weergave van de gemiddelde contractie pieken (figuur 5C).
OPMERKING: PDMS rekken en PTFE afstandhouder kan herhaaldelijk worden gebruikt (PDMS rekken max 5 keer en PTFE afstandhouder eindeloos.). Na gebruik handmatig met water, koken tweemaal in gedemineraliseerd water en autoclaaf. Wees je bewust van mogelijke carry-over effecten, bij het opnieuw gebruik van de rekken, zoals drugs zouden kunnen worden geabsorbeerd door het PDMS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cardiale differentiatie en Bereiding van EHT
IPSC werden uitgebreid op verkorte groeifactor basaalmembraanmatrix, gedissocieerd met EDTA en embryoid lichamen (EB's), gevormd in spinner kolven overnacht. Na mesodermale inductie gedurende drie dagen werd cardiale differentiatie gestart met het Wnt-remmer. Na ~ 17 dagen differentiatieprotocol, sloegen EBS gedissocieerd tot afzonderlijke cellen met collagenase type II (figuur 1). EHTs werden bereid uit vers geïsoleerde cardiomyocyten met 1,0 x 10 6 cellen per 100 pl weefsel direct na EB dissociatie (figuur 2). Voor bereiding van ingevroren cellen (bijvoorbeeld commerciële leveranciers), werden de cellen ontdooid door druppelsgewijs resuspensie in medium en opnieuw gesuspendeerd in ECM na centrifugeren. Binnen 48 uur werd spontaan kloppen van enkele cellen microscopisch waargenomen in de EHT. In de komende dagen, cardiomyocyten verspreid lengterichting langs de krachtlijnen van het weefsel, gekoppeld en vormde een coherent slaan EHT. De macroscopisch zichtbare doorbuiging van de PDMS posten werden met de EHT analyseapparaat.
contractie Analyse
Analyse van EHT contractiliteit was gebaseerd op video-optisch registratiemedium (figuur 3). Binnen het systeem de 24-well plaat met EHTs werd geplaatst in de gas- en getempereerde incubator kamer met een glazen dak. Een camera is aangesloten op een gemotoriseerde XYZ-as is daarboven geplaatste eenheid, en XYZ-coördinaten werden bepaald voor elke EHT met software. Analyse van elke EHT was gebaseerd op figuur erkenning aan de boven- en ondereinden van het weefsel. Een geautomatiseerde software algoritme geanalyseerd de gefilmde EHT contracties en berekende krachtontwikkeling gebaseerd op post doorbuiging en Elasticity / geometrie van het PDMS posten (aanvullende figuur 1) 11. Na de bepaling van de pieken volgens vooraf bepaalde criteria, een pdf samengevatte parameters van contractiliteit voor EHTs (aanvullend figuur 2).
Stabiliteit in Long Term Measurement
termijn meting van EHTs lang werd op continue wijze met geautomatiseerde herhaalde metingen om de 20 minuten. Samentrekking analyse toonde geen tijdsafhankelijke veranderingen (Voeg test voor lineaire trend was niet significant) in contractie kracht, het verslaan van de frequentie, contractie tijd T1 of ontspanning tijd T2 voor maximaal 20 uur, wat wijst op een hoge mate van stabiliteit (Figuur 4). Zoals bij elke biologisch monster echter de EHTs vertonen een zekere mate van variatie, zoals verwacht voor biologische herhalingen. De variatie coëfficiënten aan het begin en het einde van de lange termijn measurement waren 13/07% voor force, 06/12% voor frequentie 4/3% voor samentrekkingstijd en 4/3% voor relaxatietijd respectievelijk (n = 4). Deze variabiliteit tussen biologische repliceert geen artefact van fig herkenning of analyse van de resultaten voor elke afzonderlijke EHT reproduceerbaar en lage variabiliteit (aanvullend figuur 2).
drugscontrole
Drug screening werd uitgevoerd in oplossing serumvrij Tyrode. Cumulatieve concentratie-responskrommen werden verkregen met DMSO-vehikel maximale concentratie van 0,1%. Baseline samentrekking analyse toonde heel weinig onregelmatigheid patroon en een zeer lage variabiliteit slaan tussen de herhalingen. Blootstelling aan het hERG kanaalblokkeereenheid E4031 resulteerde in een significante verlenging van de relaxatietijd (T2) bij 10 nM en onregelmatig kloppen patroon bij hogere concentraties (Figuur 5). voor frequency gecontroleerde krimp analyse werden metingen eventueel uitgevoerd met behulp van elektrische stimulering koolstofelektroden.
Figuur 1: Cardiac differentiatie. (A) menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen. Schaal bar = 100 urn. (B) embryoiden organen aan het begin van mesodermale differentiatie. Schaal bar = 100 urn. (C) Contracting embryoïde lichamen eind cardiale differentiatie. Schaal bar = 100 urn. (D) Human gemanipuleerd hartweefsel. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Vorming van Engineered hartweefsel (EHT). (A) PTFE afstandhouder. (B) PDMS rack. A, (B) schaalbalk = 1 cm (C) Bovenaanzicht op een putje van een 24-well-plaat met gietmal in agarose na verwijdering van de PTFE afstandhouder. (D) paar posten van de PDMS rack geplaatst in de gietmal. (E) Het oplossen mengsel gepipetteerd in de gietvorm en rondom het PDMS posten. (F) Vers gegenereerd EHT op dag 0, overgebracht naar een kweekschaal met nieuwe medium. (G) Gerenoveerd EHT in medium op dag 15. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Analyse van Contractie Engineered hartweefsel (EHT). (A) EHTanalyseapparaat met computergestuurde camera boven de gas- en getempereerde incubatiekamer met EHTs in 24-well-kweekschaal op een LED-paneel. (B) Levende weergave van een EHT tijdens analyses met de automatische samentrekking analyse software. (C) Voorbeelden van contractie patroon dat contractiekracht tijd gemeten met 100 frames per seconde en vergroot schematisch contractie piek, tonen de analyseparameter kracht samentrekkingstijd (T1), relaxatietijd (T2), contractie velocity (CV), relaxatie snelheid ( RV; deze figuur is overgenomen uit 7 en 27). DH: Parameters voor samentrekking analyse. (D) Voorbeelden van verschillende filterniveaus (blauw gefilterde lijn) beïnvloeden de figuur herkenning. Links: Filter level = 0. Merk op dat geen blauwe gefilterde lijn zichtbaar, maar alleen de rode oorspronkelijke spoor. Midden: Filter level = 3, wat aangeeft ideale erkenning / analyse van the samentrekking pieken. Rechts: Filter level = 20. Merk op dat de blauwe gefilterde lijnen zijn veel kleiner dan de oorspronkelijke sporen wijzen op een gebrek samentrekking piek analyse. (E) Voorbeeld aritmische EHT contracties geanalyseerd met een te grote kracht drempel (links) en onderste krachtdrempel (rechts) met alle pieken opgenomen. (F) Voorbeelden sporen EHTs blootgesteld aan de natriumkanaal agonist ATX-II wat resulteert in een langere relaxatietijd met vroeg na contracties. Merk op dat de vierde samentrekking piek aan de linker paneel niet wordt herkend (geen groen vierkantje) als gevolg van een te lage minimum factor. (G) Voorbeelden van contractie met pieken (rechter paneel) en zonder (rechter paneel) pink curve (eerste afgeleide van contractiecurve, contractie en relaxatie velocity). (H) Overzicht van de parameter aanbevelingen voor muis en mens EHTs. Merk op dat deze parameters zouden moeten worden aangepast als veranderingen samentrekking patroon tijdens blootstelling aan het geneesmiddel (zie E,F). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Time Control Tijdens Long Term Meting van spontaan kloppende Human Engineered hartweefsel (EHT). controle tijd tijdens langdurige meting van de spontaan kloppend menselijk engineered hartweefsel (EHT). EHTs werden geplaatst in de EHT analyseapparaat en geïncubeerd gedurende 20 uur. Geautomatiseerde contractie werden uitgevoerd elke 20 minuten met niet significant na de test voor lineaire trend (n = 4; gegevens stellen gemiddelde ± standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
t = "Figuur 5" src = "/ files / ftp_upload / 55461 / 55461fig5.jpg" />
Figuur 5: Effect van hERG Channel Blocker E4031 on Human Engineered hartweefsel (EHT).
(A) Voorbeelden contractie patroon op de basislijn. (B) Voorbeelden contractie patroon na incubatie van 300 nM E4031. (C) gemiddelde contractie piek (n = 4) van elektrisch gestimuleerde EHTs bij aanvang (zwart) en na 30 min incubatie in 100 nM E4031 (rood). Analyse met 100 frames per seconde. (D) concentratiereactiekrommen voor E4031 spontaan aan het verslaan van de menselijke EHTs. Let op de kleinere grootte in werking T2 verlenging in de elektrisch gestimuleerde EHTs (C) versus spontaan kloppende EHTs (D). One-way ANOVA, herhaalde metingen met Dunnett's post-test vs. basislijn; * P <0,05; n = 4. Z' factor 25 voor T2 verlenging bij 300 nM E4031 0.75.pg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| menselijk | Rat | Muis | |
| Cellen | 26.4x10 6 | 10.8x10 6 | 18.0x10 6 |
| 2xDMEM [ul] | 147 | 147 | 147 |
| Basaalmembraanmatrix [ul] | 264 | - | 264 |
| Y-27632 [ul] | 2.6 | - | - |
| Fibrinogeen [ul] | 66.8 | 66.8 | 66.8 |
| ECM [ul] | ad 2640 | ad 2640 | ad 2640 |
Tabel 1: Pipetting Stelsel voor Preparatie van Reconstitutie Mix voor 24 van de mens, rat en muis EHTs. Fibrinogeen concentratie 5 mg / ml voor alle EHTs. Merk op dat de cel concentratie is verschillend voor elke soort. Menselijke EHTs, voeg basaalmembraanmatrix (bijv Matrigel, zie Materialen tabel) en Rho-kinase remmer Y-27632 aan het mengsel. Voor muis EHTs, voeg basaalmembraanmatrix. Afhankelijk van de beginconcentratie van de celsuspensie, voeg extra ECM tot een totaal volume van 2640 gl reconstitutie mix bereiken.
Aanvullende Figuur 1: Berekening Formule voor Inkrimping Force Gebaseerd op Post doorbuiging 26. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend Figuur 2: Voorbeeldige gegevens Uittreksel uit de samentrekking Analysis Report van de Software.
Top: Krimp toppen boven de 20 s die zijn geregistreerd met 100 frames / s (rood: samentrekking van kracht; roze: samentrekking velocity). Bodem: Geanalyseerde contractie parameter geeft minimum gemiddelde, maximale waarde en de standaarddeviatie van de 18 geanalyseerde contractie pieken aangeduid met een groen vierkant (boven). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Engineered hartweefsel biedt een waardevolle optie om de gereedschapskist van het cardiovasculair onderzoek. EHTs in 24 putjes zijn waardevol gebleken voor ziektemodel 8, 14, drugveiligheid screenen 7, 8, 10, 11, 15, of basische cardiovasculair onderzoek 16, 17.
Potentiële modificaties van de basis EHT protocollen studies cellulaire interactie met gedefinieerde mengsels van cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten 18 en afterload versterking 14. Belangrijke aspecten voor het oplossen van problemen onder meer de kwaliteit van de ingang celpopulatie en de kwaliteit van fibrinogeen. Indien de initiële gelvorming onregelmatig of niet compact genoeg t plakkeno PDMS berichten, of als de gel snel binnen een paar dagen na het gieten als gevolg van lage aprotinine concentratie wordt gedegenereerd, EHTs generatie zal niet succesvol zijn.
De volgende beperkingen moeten worden beschouwd. (I) Het debiet van 24 putjes niet goed geschikt voor een primaire screening opstelling, maar is voldoende voor een tweede bevestigingsscherm. (Ii) De geïntegreerde uitlezen van kracht, contractie kinetiek en ritme lage specificiteit, waardoor het moeilijk is om veranderingen van kracht verwijzen naar specifieke moleculaire mechanismen. (Iii) Terwijl de 3D-cultuur formaat en de beperkingen die gebogen PDMS berichten stretch morfologische en functionele aspecten van rijping te verbeteren, het gebrek aan ware geïntercaleerde schijven, spontaan kloppen, en lager dan normaal adrenerge reacties aangeven dat volledige cardiale rijping nog niet is bereikt met dit protocol. (iv) PDMS is aangetoond dat verschillende geneesmiddelen absorberen verschillende uitbreiding 19 en de actuele effectieve concentration op de EHTs kunnen variëren. Dit vooroordeel zou meer prominent in chronische toxiciteit 15 dan die onderzoeken acute effecten van geneesmiddelen 7, 8 en hangt duidelijk af van het geneesmiddel bij de hand te zijn. Bijgevolg moeten alle PDMS rack blootgesteld aan drugs worden weggegooid na gebruik en kan absorptie van andere geneesmiddelen zal rekening moeten worden gehouden bij het analyseren van de data. (v) Aangezien 1x10 6 hiPSCs vereist per EHT de kosten per datapunt hoog.
De betekenis van dit protocol vergeleken met ex vivo hart contractiliteit analyse is de mogelijkheid om te werken in een menselijk systeem, het gebrek aan experimentele run-down, en de gestandaardiseerde productie van EHTs die het mogelijk maakt het opzetten van grote studies op specifieke genetische achtergronden (bv ziektemodel ). In vergelijking met andere iPSC testsystemen (multi elektrodereeks impedantie) Dit systeem analyseerts contractiekracht als belangrijkste fysiologische parameter van cardiomyocyten als een driedimensionale structuur en laat kweken onder bepaalde belasting. EHTs contract regelmatig en stabiele kracht, frequentie en ritme gedurende vele uren en weken, waardoor langdurige metingen en evaluatie chronische toxiciteit. EHT analyse kan worden uitgevoerd onder elektrische stimulatie die belangrijk met betrekking tot de kracht-frequentieverhouding van de spieren en de mogelijke invloed op geneesmiddeleffecten. Wat de onrijpe status van de iPSC-CM, elektrostimulatie heeft de potentie om de cellen te stoten naar een volwassen fenotype 20, 21 en kunnen worden opgenomen in EHT onderhoud. Bovendien, de EHT testsysteem levert hoog gehalte uitlezing waaronder alle standaard histologische parameters en biochemie (RNA, DNA, eiwit isolatie) 11. Mogelijke toekomstige toepassingen omvatten aspecten van geneesmiddelenontwikkeling (targetvalidatie, veiligheidsfarmacologie) en ziektemodel met name in combinatie met CRISPR / Cas9 gemedieerde generatie isogene controles.
Tijdens het onderhoud van EHTs en de prestaties van concentratie-respons curves, is het belangrijk om zorgvuldig te volgen instructies voor het steriele celcultuur procedures om schimmelinfecties besmettingen te voorkomen dat tijdens de overdracht van PDMS rekken tussen de 24-wells platen. De meest kritische fase met EHT echter de cardiomyocyt differentiatie protocol. Voor de EHTs coherent vorming slaan spierstrips, de ingang populatie te bestaan uit ten minste 60% cardiomyocyten. Gelukkig werd de differentiatie protocollen solider en efficiënter door de jaren heen en de hartspiercellen zijn gemakkelijk in de handel verkrijgbaar nu. De rol van niet-myocyten in de ontwikkeling van iPSC afgeleid engineered hartweefsel wordt niet volledig begrepen, maar. Experimenten met iPSC-CM hoge zuiverheid tot verrassend goed EHTass = "xref"> 7, doch integratie van andere celtypen in het weefsel is aangetoond dat weefselfunctie verbeteren en kan het fenotype stoten naar een volwassen fysiologie 22, 23, 24. De weefsels worden opgewekt in een 24-well formaat met één miljoen cellen per weefsel, dit platform nog vrij duur. Schaalverkleining naar een 96-well formaat wordt nagestreefd, maar tot nu toe robuustheid outbalances deze tekortkoming. Het protocol beschreven in dit manuscript is technisch zeer robuust met weinig variatie tussen de herhalingen. De intra-batch variabiliteit is zeer laag voor de kinetiek (gemiddelde variatiecoëfficiënt = 5%), en enigszins groot voor de spontane slaan frequentie (gemiddelde variatiecoëfficiënt 10%) en contractiekracht (gemiddelde variatiecoëfficiënt 17%). De techniek is zeer robuust. In verschillende onderzoekers, de efficiëntie slaan EHTs genereren is> 90% van gegoten hydrogels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IM, TE en AH zijn mede-oprichters van EHT Technologies GmbH, Duitsland.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar Alessandra Moretti en Dennis Schade voor hun vriendelijke bijdrage van het materiaal. Wij erkennen de grote steun van de iPS en EHT werkgroep bij de afdeling Experimentele Farmacologie en Toxicologie van het UKE. Het werk van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de DZHK (German Center for Cardiovascular Research) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Duitse Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National Center for the Replacement Verfijning en Vermindering van Dieren in Onderzoek (NC3Rs BARST-IT verlenen 35.911-259.146), de British Heart Foundation RM / 13/30157, de European Research Council (Advanced Grant IndivuHeart), de Duitse Hartstichting en de Freie und Hansestadt Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 mL falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
References
- Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
- Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
- Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
- Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
- Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
- Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
- Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
- Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
- Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
- Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
- Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
- van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
- Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
- Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.
