Abstract
白粉病菌是一类重要经济价值的植物病原真菌。相对知之甚少的分子生物学和这些病原体的遗传学，部分原因是由于缺乏发达的遗传和基因组资源。这些有机体具有大的，重复的基因组，这取得了基因组测序和装配极其困难。在这里，我们描述了从一个白粉病物种， 高氏cichoracearum高分子量的基因组DNA的集合，提取，纯化和质量控制评估方法。所描述的协议包括孢子，随后优化的苯酚/氯仿基因组DNA提取的机械破坏。典型的产率是每150个毫克分生孢子7微克DNA。正在使用此过程中分离的基因组DNA是适合长时间读测序（ 即 ，> 48.5 kbp的）。质量控制措施，以确保尺寸，收量，以及基因组DNA的纯度也在该方法中描述的。这里所描述的质量的基因组DNA的测序将允许组件和多个白粉病的基因组，这反过来将导致更好地理解的比较和改进了这一农业病原体的控制。
Introduction
白粉病是一组专性活体营养真菌植物致病菌，当合起来，为植物病害全球1的最大原因。有白粉病的超过900种描述，已经在分类学上分为家庭Erisyphaceae 2中的五个部落。两个原因，一是经济上的重要性，他们用自己的主机发展的亲密关系，白粉病病一直为>百年研究的课题。感染后，白粉菌引起的细胞结构，代谢及宿主分子生物学剧变，受益这种病原体。然而，白粉病的研究是特别具有挑战性的，因为它们专生活方式，并且在纯培养的真菌生长的尚未描述3，4，5，“外部参照”> 6，7，8。白粉病的可靠，稳定的遗传转化还尚未完成，虽然瞬时转化已经在一些物种中9，10的报道。
白粉病基因组测序和组装已经证明，很难因数量的基因组本身的特性。白粉病基因组是大的（120 - 180 MBP）相对于其它真菌的基因组，和包括60 - 90％的均匀分布的重复元件11。这些元件包括非长末端重复，以及未分类的重复元件。单白粉病品种， 白粉病的F两个专化型 。 SP。 大麦和f。 SP。 小麦（BGH和白粉菌，分别地）以及葡萄白粉病葡萄白粉菌，有蜂ñ测序，以及其他几个人的基因组草案已经完成12，13，14。基因组的重复性质取得了组装困难，并且已完成的基因组BGH组装到6989个supercontigs具有2 MB 12的L50。
尽管有大量的基因组中，白粉病似乎具有少量的蛋白质编码基因，分别在BGH和白粉菌预测，5845倍6540的基因。测序白粉病似乎也缺少了在其他真菌，这是对他们的寄主植物的真菌生存11，12，13，14依赖性一致至关重要至少99核心基因。
近端粒，着丝粒，核糖体RN重复序列A基因阵列和在可转座元件富集区域是从短读测序策略组装不良和低于限额在基因组组件15常常。这样的区域被认为是负责许多发生在基因组序列的间隙，并且这适用于白粉病与它们广泛重复元件16的膨胀。高塑性的基因组区域在这种重复区域3经常发现。它们充当的染色体重排的一个位点和通常编码在强选择压力的基因，如编码效应蛋白的基因和编码次生代谢的酶的基因。在单分子长读测序技术的进步提供了跨越基因组15的重复区域测序潜在的解决方案。例如，Faino 等。 （2015）发现，其中包括长序列读技术和光学米apping允许他们产生的间隙少的基因组序列为植物病原真菌黄萎病大丽花的两个菌株，三倍基因组中的重复DNA序列的比例，增加基因注释的数量（和减少的部分的数目或丢失的基因注解）和揭示基因组重排17。
为了采用这些长读测序技术，高浓度的高品质的基因组DNA，以最小的尺寸> 20 kbp的，是必要的。在这里，我们描述了我们的分生孢子收集，高分子量DNA的纯化方法从分生孢子和我们使用白粉病品种高氏cichoracearum质量控制评估生长在黄瓜18。该协议是基于B·凯勒实验室集团（苏黎世大学，苏黎世瑞士）13，19开发的协议和包括几个修饰导致增加的DNA产量和DNA> 48.5千碱基对大小的比例较高。该协议还包括基于来自能源联合基因组的美国国防部研究所20，21，22项建议的质量控制措施。
包括在裂解缓冲液中的各试剂，并且对于每个纯化步骤的基本原理的功能，在亨利（2008）23所描述的。用于从植物和微生物组织高分子量的基因组DNA的分离可用公开的方案本协议24，25，26，27，28的设计期间进行了协商。
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Protocol
1.真菌材料的制备
- 成长白粉病
- 生长在生长室的植物在以下条件下：22℃白天温度，20℃夜间温度，80％相对湿度，14-H昼长和125μE/米2 / s的光强度（由荧光灯提供）。
- 感染的黄瓜植物（ 黄瓜苜蓿为Bush Champion）与高氏cichoracearum应变UCSC1如所描述的18，29。
- 收获白粉病分生孢子
- 从感染的植物收获的分生孢子在7 - 接种后10天使用小真空与在线过滤器（11微米），其上的分生孢子积聚。施加轻柔的压力，运行真空喷嘴沿叶片的表面以收集分生孢子。
注：G. cichoracearum的平均产量为20mg分生孢子从一个重INFE在面积约130厘米2反恐执行黄瓜叶。 - 刷约150mg的分生孢子（约375μL体积，或分生孢子从7-8感染黄瓜叶子）从所述过滤器的清洁上纸的片材。从这里，分生孢子转移到2个毫升冷冻管具有两个32分之5英寸直径预冷（在液氮中）钢研磨球。立即返回管到液氮中。商店管在-80℃下。
- 从感染的植物收获的分生孢子在7 - 接种后10天使用小真空与在线过滤器（11微米），其上的分生孢子积聚。施加轻柔的压力，运行真空喷嘴沿叶片的表面以收集分生孢子。
- 砸开分生孢子球磨
- 闪光冻结球磨机的铝板在液氮中。装载冷冻管进入球磨机架。在30个循环/秒（室温）剧烈摇晃以在球磨机中进行30秒和分生孢子钢球的冷冻管。立即重新冷冻在液氮中的冷冻管。
注意：首先，通过显微镜在研磨过程中在100X放大率访问分生孢子的样品为细胞壁破裂的效率。如果需要，研磨另外的1 - 2轮的30秒30个循环/ S，BUT保持轮数降到最低。一旦最佳条件已建立通过显微镜在这个阶段分生孢子破裂的常规评估是不必要的。
- 闪光冻结球磨机的铝板在液氮中。装载冷冻管进入球磨机架。在30个循环/秒（室温）剧烈摇晃以在球磨机中进行30秒和分生孢子钢球的冷冻管。立即重新冷冻在液氮中的冷冻管。
2.基因组DNA纯化
- 分生孢子裂解
- 工作迅速，避免融化的分生孢子，从冷冻管用磁铁取出钢珠。直到形成淤浆10秒-加入700μl65℃的裂解缓冲液（ 表1）并涡旋5。
- 添加300μL预温（65℃）5％（V / V）十二烷基肌氨酸钠和轻轻颠倒以混合（每3秒1点反转）五次。在65°C孵育管30分钟;在10，20和30分钟轻轻颠倒3次。使用宽孔移液管尖端，转移到新的2毫升的离心管中全部溶液。在所有后续步骤，通过温和，缓慢翻转混合，并用宽口移液管尖端转移含DNA的溶液。
- DNA提取我
- 加入1个体积的氯形式：异戊醇（24：1体积/体积），以裂解溶液和轻轻颠倒以混合五次。孵育在室温下10分钟，轻轻翻转到在中途点再次在温育结束时混合五次和。离心机在室温下以14,000×g的15分钟。使用大口径的移液管尖端，小心地转移水层到新的2ml微量离心管中;避免包括从所述界面材料。
- DNA沉淀我
- 加入1倍体积室温100％异丙醇（约750微升），并轻轻颠倒以混合六次。离心机在室温下以14,000×g的15分钟。小心取出上清液并丢弃。
- 添加450μL预冷却（-20℃）70％乙醇。离心机在室温下以14,000×g下5分钟。小心取出上清液并丢弃。离心机中以1000×g离心3秒钟，小心地取出用细枪头上清液并丢弃。空气干燥15分钟将沉淀吨室温。不要干燥时间超过15分钟。
- 重悬300μL的TE颗粒（10毫摩尔Tris-CL，1mM的乙二胺四乙酸，pH 8.0）中。在4℃下孵育过夜。轻轻一抖重悬任何残留的材料，没有去成的解决方案。
- 以除去RNA污染，加入10μL的RNA酶A（10毫克/毫升）。轻轻倒转混合三次。离心1000 XG为3秒。孵育在37℃下2小时。
- DNA提取II
- 添加300μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积/体积）并轻轻颠倒以混合五次。在室温下孵育10分钟，轻轻倒置在半路标记再次在温育结束时混合五次和。在以14,000×g下室温离心15分钟。使用宽孔移液管尖端，将上清转移至新的1.5毫升离心管中。
- DNA沉淀II
- 添加0.01体积的3M乙酸钠pH 5.2（approximatelY 3微升），轻轻颠倒混合五倍。加入2.5倍体积预冷（-20℃）的100％乙醇（约750微升）。轻轻颠倒混合五倍。在-20℃下孵育过夜
- 离心机在4℃下30分钟，在14,000×克。小心取出上清液并丢弃。
- 添加450μL预冷却（-20℃）70％乙醇。离心机在4℃下5分钟，在14,000×g下。小心取出上清液并丢弃。离心1000 XG为3秒。小心地取出用细移液管尖，弃上清。
- 空气干燥沉淀，在室温下30-60分钟。重悬27.5微升TE沉淀。在4℃下孵育过夜。轻轻一抖重悬任何残留的材料，没有去成的解决方案。
- 等分试样2.5μL到22.5μLTE（终体积25微升）用于质量控制测试（见下文）。商店的DNA样品在4℃下，直到提交用于测序。对于长期储存，储存样本在-80℃下，并尽量减少冻融循环，以防止剪切。
注意：在此步骤作为所述高分子量的基因组DNA可以吹打难以正确地吸取时要小心，并确保“QC等分试样”是基因组DNA样品的精确表示是非常重要的。
3.质量控制
- 样品纯度
- 使用TE空白，通过在小容积分光光度计加载QC等分试样的1μL评估DNA的样品纯度。记录A260 / A280和A260 / A230读数。纯DNA将具有约1.8和A260 / A230比值在1.8和2.2之间的A260 / A280比值。
- 基因组DNA的定量
- 使用根据制造商的说明书商业双链DNA定量测定试剂盒进行QC等分试样的定量。
- DNA质量评价我
- 负载大约60纳克基因组DNA和一个在1×TAE（40毫摩尔Tris，20mM乙酸和1mM EDTA，pH 8.0）中的0.7％琼脂糖凝胶DNA梯。在70 V代表40运行凝胶装置 - 45分钟，直到基因组DNA带是大约从梯井和频带分离2厘米是显而易见的。这些条件可能需要基于可用凝胶电泳装置进行调整。
- DNA质量评估II
- 负载上在0.5×TBE（44.5毫摩尔Tris，44.5毫摩尔硼酸，1mM EDTA中，pH值8.3）和1％琼脂糖凝胶约60纳克基因组DNA和高分子量DNA梯（适于脉冲场凝胶电泳） 80 kbp的波形脉冲场凝胶电泳协议16小时 - 在0.5X TBE缓冲液中运行使用5运行。
- 细菌，真菌和植物污染物的评估
- 进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，使用引物和扩增条件列表中的核糖体基因的适当的内转录间隔区（ITS）区域编在表2中 。负载10μL在凝胶上得到的反应的。
注：表示白粉病ITS区域应与真菌ITS引物扩增带。从该扩增子和与细菌或植物的引物产生的扩增子的任何DNA应当测序，以确定污染的来源。只有白粉病ITS序列应在真菌扩增子被发现。
- 进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，使用引物和扩增条件列表中的核糖体基因的适当的内转录间隔区（ITS）区域编在表2中 。负载10μL在凝胶上得到的反应的。
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Representative Results
60ng从G.纯化的基因组DNA的代表性实例cichoracearum使用凝胶电泳在琼脂糖凝胶上运行，并用脉冲场凝胶电泳在图1和2，分别被示出。基因组DNA制备物通，勉强通过和失败的质量控制的代表。基因组DNA制备物，充分通过质量控制是理想的使用长读基因组测序方法测序。制剂，该制剂通过轻微的质量控制是可接受的，但制剂，充分传递是优选的。失败的质量控制的筹备工作时间不长，读取的基因组测序方法可以接受的。
图1：纯化基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳。 第1道： 泳道2：通过质量控制的基因组DNA; 泳道3：这被认为边际基因组DNA;和泳道4：基因组DNA失败质量控制。可接受的，并且边缘的基因组DNA样品具有运行高于20千碱基的单一条带以最小的涂抹在<20千碱基。失败的质量控制基因组DNA样品已涂抹低于20 kbp的，并且可以包括低分子量的片段在约100bp（*）。脉冲场凝胶电泳需要可接受的，并且边缘的DNA样品之间进行区分。溴化乙锭加入到凝胶电泳之前以可视化的基因组DNA。将样品在60 V电泳50分钟。凝胶用凝胶记录系统在UV光下成像。
数字2：脉冲场凝胶电泳纯化白粉病基因组DNA（PFGE）。 泳道1：分子量标准，与48.5 kbp的最高频带和在8.1千对碱基的最低水平。 泳道2和5：分子量标准示出（在凝胶图像的底部）20，10，7,5，4，3，2和1.5千对碱基的带。 泳道3：边缘DNA样品，并在尺寸为20个48.5千碱基之间多数的DNA。 泳道4：可接受的DNA样品，与大多数DNA> 48.5 kbp的（*）的。将样品在75伏用于使用5-80 kbp的PFGE波形程序15个小时运行。 DNA染色染料加入到该凝胶电泳后，将凝胶用凝胶记录系统在UV光下成像。
| 试剂 | 终浓度 |
| 钾代谢isulfite（K 2 S 2 O 5） | 0.25M的 |
| 的Tris缓冲液pH 7.5 | 0.2M的 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | 50毫 |
| 氯化钠（NaCl） | 2M的 |
| 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） | 2％V / V |
表1： 裂解缓冲液 的制备 。带来至5mL的与卫生署2 O的体积
| 目标 | 底漆名称 | 引物序列 | 的Tm（℃） | 预计产品尺寸（BP） |
| 真菌ITS2 | FW（ITS9） | GAACGCAGCRAAIIGYGA | 56-61.3 | 336 |
| RV（ITS4） | TCCTCCGCTTATTGATATGC | 52.1 | ||
| 细菌16S V4 | FW（515F） | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA | 63.8-66.5 | 331 |
| RV（805R） | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | 46.9-53.8 | ||
| 细菌16S V4，V5 | FW（515F-Y） | GTGYCAGCMGCCGCGGTAA | 60.8-66.5 | 450 |
| RV（926R） | CCGYCAATTYMTTTRAGTTT | 43.9-53.8 | ||
| 真菌18S V4 | FW | CCAGCASCYGCGGTAATTCC | 58.7-61.5 | 431 |
| RV | ACTTTCGTTCTTGATYRA | 43.2-48.3 | ||
| 黄瓜PDS（LOC101204524） | CsPDS˚F | GTGAGTAAGGTTACCGTTTGGGGCTTATCCCAAT | 63.8 | 750 |
| CsPDS [R | GCGTGAGCTCGGTACTCTCATCCACTCTTGCAC | 66.6 |
表2：污染评估引物。
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Discussion
为了从专性活体营养性白粉病菌获得纯的，高分子量的基因组DNA中，先前所描述的方法的修改版本被开发30。使用该优化的协议的平均产量是每150毫克分生孢子7微克DNA，与现有协议中得到的产率加倍。另外，平均尺寸从大约20 kbp的增加到超过48.5 kbp的。该协议是在黄瓜- G. cichoracearum系统进行了优化。为了获得在其他白粉病最好的质量和纯度最高的DNA或专性活体营养性真菌，可能需要这种协议的其他修改。在未来，该协议可被用于获得高分子量DNA适合于从其他专性活体营养性真菌的长读取DNA测序，尽管可能需要进一步修改。
平衡高DNA产量和提取的DNA的高分子量是一个问题这个协议的优化期间。步骤包括涡旋，以便最小化所述DNA的剪切被淘汰，并通过倒置轻轻地混合所取代。这种变化提高了提取的DNA的质量而不显著降低产率。另外，在开始时除去钢球相比离开球在溶液中，直至溶解步骤结束时，细胞裂解步骤显著增加的DNA产率。
无G. cichoracearum分生孢子保持在步骤1.3球磨过程后完好无损。为了获得高分子量的基因组DNA的良好的产率，这是至关重要的，在此步骤中的真菌细胞壁被破坏。分生孢子完整性可显微镜来评估，并且可能需要对其他真菌种类附加球磨或破坏的替代方法。
有些真菌孢子，特别是布氏白粉菌，含有可续颜料氨化DNA的提取和纯化的尝试。在这些情况下，我们建议，包括如在Bourras 等人概括的DNA过滤步骤。 （2015）协议19，并用TE在过滤步骤之后的附加洗涤步骤。在添加过滤步骤导致DNA降解一个小而显著增加，并且如果过度色素沉着保持所述第二DNA沉淀步骤后只应被包括在内。这些颜料中，如果允许保留在溶液中，可与DNA的质量和数量的以后的分析和干扰可能与测序反应干扰。
该协议包括一个传统的琼脂糖凝胶电泳步骤和脉冲场凝胶电泳步骤。首先是DNA的分数即> 20千碱基和运行于<20 kbp的涂片分数的初始评估。对于下游测序反应的粉状密耳所需的目的露基因组，DNA的级分<20 kbp的应该是最小的（ 见图1， 泳道2 与 泳道4）。脉冲场凝胶电泳评估提供的大小为DNA> 20千碱基对的更好的估计可以通过大小来分离。 > 48.5千碱基对的DNA是理想的在随后的测序反应（ 见图2， 泳道4）的使用。
在这些实验中使用的真菌材料在生长室中繁殖和污染，使用严格隔离的协议和控制人员的限制。正因为如此，与其他的非白粉病病原体污染是最小的，并使用特定的真菌引物仅回收G. cichoracearum序列扩增的ITS区域的测序。这可能不是在这些CA从外地网站或缺乏相同的隔离控制温室收集白粉病的情况下，和污染评估ES将是高品质的基因组从所提取的DNA的组件的关键。
各真菌DNA提取协议没有一个修改是唯一重要的。而在许多步骤轻微的修改导致了本文报道的高分子量白粉病DNA的相对高的产率。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2 mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65 °C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37 °C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) |
Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20 °C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000x in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10 mg/mL | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8 - 48 kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1x) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10x Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1x) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
References
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