Summary
Konformationel fleksibilitet spiller en afgørende rolle i protein funktion. Heri, beskriver vi anvendelsen af tidsopløst elektrospray massespektrometri koblet til hydrogen-deuterium gengæld for probing de hurtige strukturændringer, som driver funktion i ordnede og uordnede proteiner.
Abstract
Intrinsisk uordnede proteiner (IDP) har længe været en udfordring at strukturelle biologer på grund af deres mangel på stabile sekundære strukturelementer. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) målt ved hurtige tidsskalaer er unikt egnet til at detektere strukturer og hydrogenbindende netværk, der er kort befolkede, hvilket muliggør karakteriseringen af forbigående konformere i native ensembler. Kobling af HDX til massespektrometri tilbyder flere vigtige fordele, herunder høj følsomhed, lavt prøve og ingen begrænsning på protein størrelse. Denne teknik har avancerede kraftigt i de sidste mange årtier, herunder evnen til at overvåge HDX mærkningsordninger gange på millisekund tidsskala. Desuden ved at inkorporere HDX arbejdsgang på en mikrofluid platform huser en sur protease mikroreaktor, er vi i stand til at lokalisere dynamiske egenskaber på peptidet niveau. I denne undersøgelse, tidsopløst elektrosprayionisering massespektrometri (Tresi-MS) koblet til HDX was bruges til at give et detaljeret billede af tilbageværende struktur i tau-protein, såvel som de konformationelle forskydninger induceret ved hyperphosphorylering.
Introduction
I de sidste adskillige årtier har betydelige fremskridt er gjort i udvikling af analytiske metoder, der skal måle proteinstruktur og dynamik 1, 2, 3, 4. Mens røntgenkrystallografi forbliver princippet værktøj til bestemmelse proteinstruktur der høje koncentrationer af protein nødvendig og omfattende optimering er nødvendig for at fremstille krystaller af diffraktionskvalitet. Proteiner, som er vanskelige at krystallisere, såsom membranassocierede og uløseligt uordnede proteiner er klassisk blevet undersøgt af hydrogen-deuterium udveksling (HDX) NMR 5. Men i de seneste årtier, kobling af elektrospray-massespektrometri (ESI-MS) til HDX har hurtigt vundet popularitet 6, 7.
Massespektrometri tilbyder en løsningtil mange af de begrænsninger, der er forbundet med røntgenkrystallografi og NMR. Især MS er meget følsom (nM til uM nødvendige koncentrationer), og der er næsten ingen grænse for protein størrelse. Desuden høj arbejdscyklus på MS-analyse giver mulighed for at studere proteiner som de undergår enzymatisk omsætning, misfoldning, kompleksdannelse og andre biologisk relevante processer. Disse processer opstår ofte på millisekund til anden tidsskala og kræver hurtig blanding af reagenser inden analyse.
Udviklingen af tidsopløst elektrosprayionisering (Tresi) af Wilson og Konermann i 2003 tilladt reaktioner, der skal overvåges i pseudo-realtid ved ESI-MS. Deres setup inkorporeret en kapillær mixer med en kontinuerligt regulerbar reaktion kammervolumen 8. Anordningen består af to koncentriske kapillærer, med den indre kapillar forseglet og et hak skåret i siden for at muliggøre blanding inden for det snævre inter-kapillary plads fra indhakket til enden af den indre kapillar (typisk 2 mm). Ved påføring på HDX eksperimenter, den indre kapillar bærer proteinet af interesse, den ydre kapillar bærer mærkningen D2O opløsning, som derefter undergår blanding med proteinet før indtastning justerbare reaktionskammer tillader HDX mærkning forud for direkte overførsel til ESI kilde.
Kort fortalt HDX afhængig af backbone amide hydrogener undergår udveksling med deuteriumatomer i opløsning 9, 10. Udvekslingen er basekatalyseret ved fysiologisk pH, med syre-katalyse bliver fremherskende ved pH under ca. 2,6. Den vekselkurs er baseret på fire hovedfaktorer: pH, temperatur, opløsningsmiddel tilgængelighed og intramolekylær hydrogenbinding. Som de tidligere to forhold holdes konstant under hele forsøget, den vekselkurs, især ved peptidskeletmodifikationer amid stillinger, primært dependent på proteinstruktur 11. Stramt foldet regioner med omfattende, stabile hydrogenbindende netværk i a-helixer og p-sheets vil tage op deuterium ved væsentligt langsommere hastigheder sammenlignet med løkker og uordnede områder (og undertiden slet ikke) 12. Dette giver mulighed for global proteinanalyse, hvor forstyrrelser i struktur (f.eks., Upon aggregering eller substratbinding) medføre afvigende deuterium optagelse (figur 1).
Den kinetiske kapillære mixer kan inkorporeres i en mikrofluid platform med et proteolytisk kammer til lokalisering af deuterium-optagelse. Denne proteolytiske kammer holdes ved lav pH for effektivt standse udskiftningsreaktion, og kræver en immobiliseret sur protease for at fordøje proteinet i lokaliserede peptider (figur 2). Overvågning rygrad udveksling på millisekund til anden tidsskalaer er især vigtigt for dekarakterisering af konformationsændringer inden vanskeligt at karakterisere sløjferegioner, smeltede kugler og uløseligt uordnede proteiner (IDP) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX også anvendes til at karakterisere proteiner, som i øjeblikket ikke har en løst atomare struktur gennem fremgangsmåderne ifølge røntgenkrystallografi og NMR under anvendelse af deuterium udveksling koblet til Corex algoritme (DX-Corex) tilgang 15, 16. Denne detaljerede protokol vil gælde Tresi-HDX at studere tau, en IDP, i både det oprindelige form såvel som det er patogene hyperphosphoryleret tilstand. Mens indfødte tau er en af de mest godt studerede internt fordrevne, der er lidt kendt om dens amyloidogent modstykke 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Venligst høre alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Gassen, laserablation af poly (methylmethacrylat) (PMMA) kan være giftige. Vær sikker på, at laseren gravør er sluttet til en fungerende ventilationssystem. Brug alle passende sikkerhedsforanstaltninger, når bygningen mikrofluidapparatet herunder anvendelse af tekniske kontroller (stinkskab, kanylebøtte) og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, ansigtsmaske, handsker, kittel, fuld længde bukser, lukket-toe sko). Det er yderst vigtigt at anvende højtryksvæskekromatografi (HPLC) reagenser vidt muligt med alle er af ACS-kvalitet eller højere for at reducere interfererende forureninger under analyse.
1. Fremstilling af mikrofluidapparatet
- Opførelsen af PMMA Mikrofluid Platform
- Opnå en standard PMMA blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) og laser-ablation en indgangskanal til indføring af reagenserne, et proteolysis kammeret og en udgangskanal hjælp af en laser gravør 17, 18.
BEMÆRK: Etch proteolysen kammer i en aflang oval form (30 x 5 x 0,05 mm). Input og output kanal skal strække sig til enden af PMMA blokken og ikke være større end 75 um i både bredde og dybde med henblik på at rumme en 30 ga kapillær. - Skær en 30 ga rustfrit stål kapillar i to stykker på ca. 10 cm hver anvendelse af en roterende værktøj med en 1/64" tyk cut-off disk. Brug sandpapir til at udjævne enderne af kapillærer (dette kan lettes ved at se under en lysmikroskop).
- Smelt kapillærerne i den ætsede poly (methylmethacrylat) blok ved hjælp af en loddekolbe. Indgangskanal vil blive forbundet til automatiserede sprøjtepumper, og udgangskanalen vil blive anvendt til kobling til MS.
- Opnå en standard PMMA blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) og laser-ablation en indgangskanal til indføring af reagenserne, et proteolysis kammeret og en udgangskanal hjælp af en laser gravør 17, 18.
- Konstruktion af Continuous-Flow Time-Løst Kinetic Mixer
- Opnå en kondenseretkvartsglas kapillar (ID: 75 pm, OD: 150 um) på ca. 40 cm, og indsætte det i en 28 ga rustfrit stål kapillar på ca. 15 cm. Afhængigt af reaktionstiden skal der bruges et længere ydre metal kapillær eller en med en større ID.
BEMÆRK: Bestemmelse af 'sande' indre diameter af metal kapillar er kritisk for at opnå nøjagtige reaktionstider. Dette kan gøres ved at fastgøre metal kapillar til en HPLC, strømmende opløsningsmiddel selvom kapillarrøret, og registrering af modtryk. En modtryk til beregning inderdiameter kan gøres, og den sande indre diameter af metallet kapillar bestemt. Dette kan beregnes ved hjælp af Molecular Weight Calculator software (til Windows Version 6.49). - Producere en 2 mm hak under anvendelse af lave effekt laser gravør indstillinger i den ene ende af det indre glas kapillarrør og forsegle denne ende af det indre glaskapillar (figur 2). Alternativt gør hakket under anvendelse af en glaskeramisk kapillary spåntagende værktøj eller en roterende kværn med en fin skæreblad.
- Line-up den indre glaskapillar med enden af metallet kapillær (dette kan lettes ved at se under et lysmikroskop).
- Vedhæfte denne kinetiske blander til den ene ende af blandings-T (figur 2).
- Vedhæfte en smeltet silica glaskapillær (ID: 75 pm, OD: 150 um) på ca. 40 cm til den modsatte ende af den kinetiske mixer mod blanding tee. Dette bruges til at levere syre (5% eddikesyre, pH 2,4) for at standse reaktionen.
BEMÆRK: Reaktanter tilføres til anordningen med gastætte sprøjter gennem polytetrafluorethylen (PTFE) rør under anvendelse af automatiserede infusionspumper.
- Opnå en kondenseretkvartsglas kapillar (ID: 75 pm, OD: 150 um) på ca. 40 cm, og indsætte det i en 28 ga rustfrit stål kapillar på ca. 15 cm. Afhængigt af reaktionstiden skal der bruges et længere ydre metal kapillær eller en med en større ID.
- Pepsin Aktivering
- Afvejes 20 mg pepsin fra porcin maveslimhinde og suspendere det i 1 ml koblingsbuffer (0,1 M natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
- Afvej 50 mg N-hydroxysuccinimid (NHS) aktiverede agaroseperler, tilføje til re-suspended protease og rotere forsigtigt natten over ved 4 ° C.
- Spin ned ved 1000 xg i 2 minutter ved stuetemperatur for at indsamle harpiksen.
- Aspirere ubundne protease.
- Inkubér agarose i 1 ml blokeringsbuffer (1 M Tris-HCI, pH 6,0) og rotere forsigtigt ved stuetemperatur i 1 time.
- Spin ned ved 1000 xg i 2 minutter ved stuetemperatur for at indsamle harpiksen.
- Aspirer blokeringsbufferen.
- Inkubere pepsin-agarose med 1 ml 5% eddikesyre, pH 2,4 i 5 minutter.
- Spin ned ved 1000 xg i 2 min for at opsamle harpiksen.
- Aspirere supernatanten.
- Gentage trin 1.3.8 - 1.3.10 for i alt tre vaske.
- Gemme perlerne i 1 ml eddikesyre ved 4 ° C til langvarig brug.
- Device Assembly
- Hans position proteolyse kammer med opslæmningen af aktiverede pepsin-agaroseperler i 5% eddikesyre under anvendelse af en steril spatel.
- Placer PMMA mikrofluid platform;m mellem to datoer PMMA blokke som et dæksel til at tætne indretningen, foret med silikonegummi for at skabe en væsketæt forsegling.
- Bruge metallisk klemplader til tryk-forsegling indretningen.
BEMÆRK: Klemmen blev specialfremstillede for at passe mikrofluid platform og er sammensat af to plader, der måler 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Flow 5% eddikesyre, pH 2,4 med en hastighed på 10 pi / min. Flow 50 mM ammoniumacetatpuffer (pH 6,9) selvom proteinet linje ved en hastighed på 1 pi / min.
BEMÆRK: Det er yderst vigtigt, at eddikesyre kontinuerligt strømmer gennem indretningen hele hele forsøget. Sikre, at der ikke findes nogen utætheder, og at fluid er spændende kun fra udgangskanalen, der vil tjene som ESI kilde. - Par enheden til den forreste ende af en modificeret kvadrupol-time-of-flight (Q-TOF) massespektrometer ved anvendelse af en justerbar isoleret stadium at opnå optimale elektrospray betingelser.
BEMÆRK: En bypass switchindføres for at simulere tilstedeværelsen af en kommerciel ESI kilde. 17
2. Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange
- Erhvervelse af Pepsin og protein kun Spectra
BEMÆRK: ESI-MS overtagelse gennemføres i positiv ion-mode med en spænding på 4500 til 5000, 60-V declustering potentiale, og 250-V fokuseringspotential. Spektre erhverves over et område af 350-1,500 m / z med en scanningshastighed på 1 s-1.- Erhverve en pepsin kun spektrum. Eventuelle toppe anført i dette spektrum subtraheres når proteinet tilsættes.
- Indføre 50-100 pM tau / phospho-tau protein (oprense og forberede som tidligere beskrevet 13, 19) med en hastighed på 1 pi / min, hvor 50 mM ammoniumacetatpuffer tidligere flyder.
- Erhverve en protein kun spektrum.
- erhvervelse of tidspunkter
- Mens 100 pM tau / phospho-tau protein strømmer med 1 pi / min, introducere D2O ved en hastighed på 3 uL / min via en tee stik og tillade at reagere i den kinetiske blander. Tillad for systemet at ligevægt i mindst 10 min før købet af spektret.
BEMÆRK: Når en udveksling reaktionen mærkning standset af strømmen af eddikesyre pH 2,4 ved 10 pl / min og fordøjelse af det mærkede protein forekommer i den proteolytiske kammer. - For at øge den tid mærkning, manuelt trække positionen af den indre glaskapillar tilbage at opnå blandingstider på 42 ms til 8 s. Tillad for systemet at ligevægt i mindst 10 minutter i mellem hver pull-back.
- Mens 100 pM tau / phospho-tau protein strømmer med 1 pi / min, introducere D2O ved en hastighed på 3 uL / min via en tee stik og tillade at reagere i den kinetiske blander. Tillad for systemet at ligevægt i mindst 10 min før købet af spektret.
3. Data og statistisk analyse
- Identifikation af peptider og beregne procentdelen af Deuterium Exchange
- Udfør MS spektre analyser ved hjælp mMass software-version 5.5.0 20
- Identificere peptider vha ExPASy FindPept proteomisk server og bekræfte ved kollision-induceret dissociation (CID) når han skal 21.
BEMÆRK: Her blev deuterium optagelse inkorporering målt ved hjælp af en in-house udviklet FORTRAN software til isotopisk fordeling analyse 22, 23. - Beregne de teoretiske iboende satser baseret på den primære sekvens ved hjælp af SPHERE webværktøjet 22, 24.
- Monter data ved hjælp af enkelt eksponentiel ikke-lineær regression og normalisere bruge en graftegning og statistisk software (fx SigmaPlot).
BEMÆRK: Forholdet mellem k int / kobs giver den beskyttelsesfaktor (PF), en semi-kvantitativ måling af den grad, at en bestemt region er struktureret i den konformationelle ensemble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fordøjelse profiler af nativt og phospho-tau var ens, hvilket giver en sekvens dækning på 77,1 og 71,7% henholdsvis. Deuterium uptake værdier af hvert peptid blev bestemt ved at tilpasse observerede isotopiske fordelinger med de teoretiske fordelinger genereret anvendelse af en in-house udviklet FORTRAN software. Den bedst tilpassede fordelinger er vist (figur 3a) sammen med de tilhørende deuterium optagelsesværdier. Optagelse kinetiske profiler er derefter genereres, og blev godt beskrevet af enkelte eksponentielle udtryk. Kinetiske profiler for alle peptider observeret ved 3 eller flere angivelser gange (n = 3) blev analyseret. Disse enkelt eksponentielle tilpasninger til de observerede optagelsesværdier opnåelse vekselkursen konstant kobs for hvert peptid. Dette er sammenlignet med den primære sekvens afhængig "random coil" iboende hastighedskonstant k int. Den beregnede PF (k int / k </ em> obs) ved 1,52 s er mappet repræsentative strukturer af nativ og hyperphosphoryleret tau (figur 4).
Som forventet blev der ikke PF observeret i niveauer, der normalt er forbundet med sekundære strukturelementer bekræfter, at nativt tau udviser svag intern hydrogenbinding. Observeres signifikant beskyttelse ved N og C-terminalerne, det centrale domæne og aggregeringsreaktionerne-tilbøjelige (hexapeptider I og II) regioner (figur 4). Efter 1,52 s, er 90% af proteinet deutereret, med fuld udveksling forekommer i under 2 min.
Det native protein kan sammenlignes med en ændret tilstand, i dette tilfælde det amyloidogene hyperphosphoryleret tilstand, hvor vi observere en generel stigning i deuterium optagelse over proteinet. Der er betydelige stigninger ved N- og C-terminalerne og i H2-regionen. Den generelle stigning i optagelsen understøtter cNUVÆRENDE hypotese, at hyperphosphorylering får proteinet til at vedtage en udvidet struktur. Af de to hexapeptider, H2 viser den største stigning i deuterium optagelse, fra at være en af de mest beskyttede områder i den native tilstand til næsten ingen beskyttelse i hyperphosphoryleret tilstand. Dette antyder, at eksponering af H2 domæne er afgørende for amyloidogenese. På den anden side, nogle af de områder, der udviste et fald i optagelsen omfatter regioner spænder L114 til Q124, og G326 til S 352. Sidstnævnte område svarer til de mikrotubulus-associerede R3 og R4 regioner i gentagelsesdomæne. Denne strækning af nydannede resterende struktur enig med tidligere undersøgelser, der påviser, at hyperphosphoryleret tau har en reduceret affinitet for mikrotubulusbinding 25. Regionen spænder L114 til Q124 er identificeret i den native tilstand, havde betydelige tilbøjelighed til spiralformet struktur, og faldet i optagelse kan tilskrives en højere prævalens af seco ndary struktur i hyperphosphoryleret tilstand.
Figur 1. Skematisk afbildning af et protein undergår HDX før massespektrometrianalyse. Proteinet af interesse fortyndes til en opløsning af deuteriumoxid (D2O), giver mulighed for labile backbone hydrogener til at udveksle med deuterium over tid. Meget dynamiske regioner vil udveksle hurtigt, og skal overvåges på millisekund til anden tidsskala. Andre regioner, der indeholder mere stive sekundære strukturer udveksler langsommere. Udvekslingen Reaktionen afsluttes ved standsning med syre (pH 2,4), som også udfolder proteinet giver mulighed for spaltning med en sur protease (fx pepsin). Fordøjelsen lokaliserer niveauet af deuterium optagelse på tværs af forskellige områder af proteinet. lank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Eksperimentel set-up for Tresi-HDX-MS. En detaljeret afbildning af den kinetiske blander er vist ved bunden. Blanderen består af to koncentriske kapillærer, en indre kvartsglas glaskapillær inden i en ydre metal kapillær. En indskæring er lavet 2 mm fra enden af den indre kapillar med en sluttet ende, hvilket muliggør protein for at forlade hak og blandes med den indkommende deuterium. Denne kinetiske blander er fastgjort til et blandings-T. På den modsatte side af blanderen, en kanal leverer 5% eddikesyre (pH 2,4) fastgjort. Efter standsning af reaktionen, det deutererede protein passerer gennem proteolyse kammeret pakket med pepsin-agaroseperler for at producere peptiske peptider. Den distale kapillær anvendes som en ESI kilde.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Typisk arbejdsgang fra rådata til kinetiske grunde til udvalgte peptider fra det native og hyperphosphoryleret protein. (A) Raw frekvenser til fire peptider (kolonner) er monteret på forudsagte isotopiske fordelinger for at bestemme% af deuterium optagelse ved tre forskellige tidspunkter (rækker). (B) Observeret kinetiske plots af% deuterium optagelse mod tiden for hvert peptid (fast linie), der anvendes til at udtrække kobs. Kinetiske grunde til alle peptider blev observeret ved 3 eller flere angivelser gange (n = 3), fejlsøjler repræsenterer SE Den beregnede "random coil" profil (stiplet linje) er vist til sammenligning. Reproduceret fra Zhu et al. 8 med tilladelse.Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. HDX beskyttelse faktor data afbildet på repræsentative strukturer af (a) nativ fuld længde tau og (b) hyperphosphoryleret tau. Opbygning af hyperphosphoryleret tau blev genereret ved hjælp FRODAN simulering med efterfølgende raffinement hjælp Vadar. Grad af beskyttelse faktorer er farvet som en regnbue skema som vist i legenden (til venstre). Reproduceret fra Zhu et al. 8 med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens strukturelle biologi fremgangsmåder såsom røntgenkrystallografi og NMR er fordelagtige, fordi de giver ekstremt detaljerede strukturer af proteiner, disse billeder er ofte statisk. Karakteriseringen af transiente arter og svagt strukturerede domæner fortsat undvigende når undersøgt ved disse konventionelle fremgangsmåder. Derfor, for at få dynamiske indsigt på disse typer af systemer er det vigtigt at arbejde på hurtige tidsskalaer. Vi har med succes anvendt Tresi-HDX-MS for at få detaljerede indblik i de konformationelle forandringer inden for en velstuderet IDP på et lokaliseret peptid-niveau. En af de vigtigste begrænsninger for denne teknik er, at pepsin er en uspecifik protease og, på sin egen, sjældent producerer fuld sekvens dækning. En måde at hjælpe med at forbedre sekvensdækning og specificitet er at kombinere protease typen XIII fra Aspergillus saitoi til fordøjelsen kammeret 26.
Det er afgørende, atfordøjelsen kammeret holdes ved et pH på 2,4 under hele eksperimentet for effektivt standse udskiftningsreaktion og reducere mængden af back-udveksling 11. Det er bydende nødvendigt, at der gøres noget proteolyse trin og efterfølgende analyse så hurtigt som muligt. Tidligere undersøgelser har optimeret størrelse fordøjelseskammer og foreslog strømningshastigheder for at holde niveauet af back-udveksling til ubetydelige niveauer (≤5%) ved stuetemperatur 22. Det anbefales kraftigt, at størrelsen af kammeret ikke er større end dimensionerne anført under denne protokol. En meget struktureret protein vil ikke tage betydelige niveauer af deuterium på millisekund til anden tidsskala og vil være vanskeligt at fordøje i den tid tillades af proteolyse kammer. Sådanne proteiner kan ikke anbefales til undersøgelse under anvendelse af denne teknik.
Selvom vi anbefaler anvendelse af 50 mM ammoniumacetatpuffer (pH 6,9) til than proteinprøve, vil ikke alle proteiner være kompatible med denne koncentration eller pH-værdi. Det er vigtigt at bemærke pi af proteinet, og justere bufferen følgelig at være mindst 1 pH-enhed over eller under. Dette vil sikre, at proteinet har den krævede overfladeladning nødvendige for korrekt foldning og forhindre aggregering. Forøgelse af koncentrationen af ammoniumacetat anbefales til sammenlægning tilbøjelige proteiner for at forøge opløseligheden imidlertid koncentrationer over 500 mM skal undgås.
Tresi-HDX-MS er bedst egnet til systemer bestående af store loop regioner, smeltede kugler eller forbigående sekundære strukturelementer 22. Derudover er der forskellige økonomiske fordele ved denne teknik som den er enkel og relativt billigt at gennemføre. For nylig har der været en stigning i brugen af HDX-MS i den farmaceutiske industri til lægemiddelforskning og udvikling 27. I løbet af de sidste mange årtir der har været en hurtig vækst af biologiske makromolekyler, idet især monoklonale antistoffer (mAb'er), godkendt af FDA. Sammenlignet med lægemidler med små molekyler, højere ordens strukturer af proteiner og deres konformationelle dynamik spiller en stor rolle i bestemmelsen af lægemiddeleffektivitet. HDX-MS har med succes været anvendt som en bekræftelse værktøj til fremstilling af bioækvivalente antistoffer 28, samt karakteriseringen af antistof-antigen 29, 30, 31, og protein-ligand-interaktioner 32. Fremskridt inden for softwareudvikling og automatisering af eksperimenter vil fremskynde analyse gange giver mulighed for yderligere udvidelse af denne teknik i den nærmeste fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
