Summary
Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.
Abstract
Intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) zijn lang een uitdaging structurele biologen vanwege hun gebrek aan stabiele secundaire structuurelementen. Waterstof deuterium uitwisseling (HDX) gemeten bij snelle tijdschalen is bij uitstek geschikt voor structuren en waterstofbinding netwerken die kort worden bevolkt detecteren, waardoor de karakterisering van voorbijgaande conformeren in natieve ensembles. Koppeling van HDX aan massaspectrometrie biedt een aantal belangrijke voordelen, waaronder een hoge gevoeligheid, lage monster consumptie en geen beperking op eiwit grootte. Deze techniek is sterk gevorderd in de afgelopen tientallen jaren, inclusief de mogelijkheid om HDX etikettering de gaten te houden op de milliseconde tijdschaal. Bovendien, door het opnemen van de HDX werkstroom naar een microfluïdisch platform behuizing een zuur protease microreactor, kunnen wij dynamische eigenschappen lokaliseren peptideniveau. In deze studie tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie (Tresi-MS) gekoppeld aan HDX was gebruikt om een gedetailleerd beeld van de resterende structuur in het tau-eiwit, alsook de conformationele veranderingen geïnduceerd na hyperfosforylering verschaffen.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn aanzienlijke vooruitgangen geboekt bij de ontwikkeling van analytische technieken ter eiwitstructuur en dynamica 1, 2, 3, 4 meten. Terwijl röntgenkristallografie blijft het principe voor het bepalen van eiwitstructuur worden hoge concentraties van eiwitten nodig en uitgebreide optimalisering vereist diffractie Kristallen produceren. Eiwitten die moeilijk te kristalliseren zijn, zoals membraangeassocieerd en intrinsiek ontvouwen eiwitten zijn klassiek bestudeerd door waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) NMR 5. Echter, de laatste decennia koppeling van electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) naar HDX is snel aan populariteit 6, 7.
Massaspectrometrie biedt een oplossingveel van de beperkingen veroorzaakt door röntgen kristallografie en NMR. Vooral MS zeer gevoelig (nM tot pM concentraties vereist), en er vrijwel geen grens aan eiwitgrootte. Daarnaast is de hoge inschakelduur MS analyse maakt de mogelijkheid bestuderen eiwitten ze enzymatisch omzet, verkeerd vouwen, complexering en andere biologisch relevante processen ondergaan. Deze processen treden vaak op de milliseconde tweede tijdschaal en vereisen snel mengen van reagentia voorafgaand aan analyse.
De ontwikkeling van tijdsopgeloste elektrosprayionisatie (Tresi) door Wilson en KONERMANN in 2003 toegestaan reacties te kunnen houden in pseudo-real time door ESI-MS. Hun opstelling opgenomen een capillair mixer met een traploos verstelbare reactiekamer volume 8. De inrichting bestaat uit twee concentrische capillairen, met binnencapillair afgesloten en een inkeping in de zijkant gesneden om voor het mengen in de smalle inter-capillairy ruimte van de inkeping aan het uiteinde van de binnenste capillair (typisch 2 mm). Toegepast op HDX experimenten, de binnencapillair draagt het eiwit van belang, de uitwendige capillaire draagt het etiket D2O oplossing, die vervolgens ondergaat mengen met het eiwit alvorens de instelbare reactiekamer waardoor HDX etiket vóór directe overdracht in de ESI bron.
In het kort HDX voert backbone amide waterstoffen ondergaan uitwisseling met deuterium atomen in oplossing 9, 10. De uitwisseling van base gekatalyseerde bij fysiologische pH, met een zuur-katalyse steeds heersende pH beneden ongeveer 2,6. De koers is gebaseerd op vier factoren: pH, temperatuur, oplosmiddel toegankelijkheid en intramoleculaire waterstofbinding. Als de eerste twee factoren gedurende het experiment, de koers, vooral in peptide hoofdketen amide posities constant worden gehouden, primair dependentaan eiwitstructuur 11. Strak gevouwen gebieden met uitgebreide, stabiele waterstofbinding netwerken α-helices en β-sheets zal nemen deuterium in hoofdzaak langzamer vergeleken met lussen en ongeordende gebieden (en soms helemaal niet) 12. Dit maakt globale eiwitanalyse, waarbij verstoringen in structuur (bijv., Na aggregatie of substraatbinding) leiden tot verschillende deuterium opname (figuur 1).
De kinetische capillaire menger in een microfluïdisch platform met een proteolytisch kamer voor lokalisatie van het deuterium opname worden opgenomen. Deze proteolytische kamer wordt gehouden bij lage pH om effectief blussen de uitwisselingsreactie en vereist een geïmmobiliseerd zuur protease om het eiwit te verteren in gelokaliseerde peptiden (figuur 2). Monitoring backbone uitwisseling op milliseconde naar tweede tijdschalen is vooral belangrijk voor dekarakterisering van conformationele veranderingen binnen moeilijk lusgebieden gesmolten globules en intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) 13, 14 te karakteriseren. Als alternatief kunnen Tresi-HDX ook worden gebruikt om eiwitten die momenteel een opgelost atoomstructuur door de werkwijzen van röntgenkristallografie en NMR geen kenmerkend gebruik deuterium uitwisseling gekoppeld met de COREX-algoritme (DX-COREX) benadering 15, 16. Deze gedetailleerde protocol Tresi-HDX gelden voor tau, een IDP bestuderen, zowel in het oorspronkelijke vorm, alsmede het pathogene hypergefosforyleerde toestand. Terwijl inheemse tau is een van de meest goed bestudeerd ontheemden, is er weinig bekend over de amyloïdogene tegenhanger 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Dampen door laserablatie van poly (methylmethacrylaat) (PMMA) kunnen giftig zijn. Zorg ervoor dat de laser graveur is aangesloten op een werkend ventilatiesysteem. Gebruik alle passende veiligheidsmaatregelen in acht bij het bouwen van de microfluïdische apparaat inclusief het gebruik van technische controles (zuurkast, slijpsel container) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, gezichtsmasker, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek, dichte schoenen). Het is van groot belang voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) rang reagentia te wenden, met welzijn van ACS kwaliteit of hoger om storende verontreinigingen te verminderen tijdens de analyse.
1. Bereiding van de microfluïdische inrichting
- De bouw van de PMMA microfluïdische Platform
- Verkrijgen van een standaard PMMA blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) en laser ablateren een ingangskanaal voor het inbrengen van de reagentia, een Proteolysis kamer, en een uitgangskanaal via een lasergraveerder 17, 18.
OPMERKING: Ets de proteolyse kamer in een langwerpige ovale vorm (30 x 5 x 0,05 mm). De ingangs- en uitgangskanaal moeten doorlopen tot het einde van de PMMA blok en niet groter dan 75 pm zowel breedte en diepte om een 30 GA capillair tegemoet. - Snijd een 30 GA, roestvrijstalen capillaire in twee stukken van ongeveer 10 cm elk een roterend gereedschap met een 1/64" dik cut-off disc. Gebruik schuurpapier aan de einden van de capillairen (dit kan worden vergemakkelijkt door het bekijken onder een glad lichte microscoop).
- Smelt de capillairen in de geëtste poly (methylmethacrylaat) blok met behulp van een soldeerbout. Het ingangskanaal wordt verbonden met automatische spuitpompen en het uitgangskanaal wordt gebruikt voor het koppelen naar het MS.
- Verkrijgen van een standaard PMMA blok (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) en laser ablateren een ingangskanaal voor het inbrengen van de reagentia, een Proteolysis kamer, en een uitgangskanaal via een lasergraveerder 17, 18.
- De bouw van de doorstroom Tijdsgeresolveerde Kinetic Mixer
- Het verkrijgen van een gefuseerdesilicaglas capillair (ID: 75 urn, OD: 150 um) van ongeveer 40 cm, en plaats deze in een 28 GA, roestvrijstalen capillair van ongeveer 15 cm. Afhankelijk van de reactietijd vereist, gebruik een langere buitenste metalen capillair of een met een grotere binnendiameter.
Opmerking: Het bepalen van de 'echte' binnendiameter van de metalen capillaire kritisch is voor het verkrijgen van nauwkeurige reactietijden. Dit kan door het aanbrengen van de metalen capillair een HPLC, vloeiend oplosmiddel hoewel de capillair en het opnemen van de tegendruk. Een tegendruk berekening binnendiameter kan worden gemaakt, en de werkelijke binnendiameter van het capillair metaal bepaald. Dit kan worden berekend met behulp van de Moleculair gewicht Calculator software (voor Windows versie 6.49). - Maak een 2 mm inkeping behulp laagvermogen lasergraveur instellingen aan één uiteinde van de binnenste glazen capillair en sluit het uiteinde van de binnenste glazen capillair (figuur 2). Als alternatief maakt de inkeping met behulp van een keramische capillairy frees of een roterende molen met een fijne snijblad.
- Opstelling de binnenste glazen capillair met een uiteinde van de metalen capillaire (dit kan worden bevorderd door het bekijken onder een lichtmicroscoop).
- Bevestig deze kinetische menger om een uiteinde van de meng T (figuur 2).
- Bevestig een kwartsglas capillaire (ID: 75 urn, OD: 150 um) van ongeveer 40 cm aan het andere uiteinde van de kinetische mixer op het meng T-stuk. Dit wordt gebruikt om zuur (5% azijnzuur, pH 2,4) te leveren aan de reactie te blussen.
OPMERKING: Reactanten worden aan de inrichting met gasdichte spuiten met polytetrafluorethyleen (PTFE) buis met geautomatiseerde infuuspompen.
- Het verkrijgen van een gefuseerdesilicaglas capillair (ID: 75 urn, OD: 150 um) van ongeveer 40 cm, en plaats deze in een 28 GA, roestvrijstalen capillair van ongeveer 15 cm. Afhankelijk van de reactietijd vereist, gebruik een langere buitenste metalen capillair of een met een grotere binnendiameter.
- Pepsin Activation
- Weeg 20 mg pepsine van het varken maagslijmvlies en suspendeer in 1 ml koppelingsbuffer (0,1 M natriumfosfaat, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
- Weeg 50 mg N-hydroxysuccinimide (NHS)-geactiveerde agarose kralen, toevoegen re-suspended protease en draai overnacht voorzichtig bij 4 ° C.
- Spin down bij 1.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur aan de hars te verzamelen.
- Zuig het ongebonden protease.
- Incubeer de agarose in 1 ml blokkerende buffer (1 M Tris-HCl, pH 6,0) en draai voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spin down bij 1.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur aan de hars te verzamelen.
- Zuig het blokkeerbuffer.
- Incubeer de pepsine-agarose met 1 ml 5% azijnzuur, pH 2,4 gedurende 5 minuten.
- Spin down bij 1.000 xg gedurende 2 minuten om de hars te verzamelen.
- Zuig het supernatant.
- Herhaal stap 1.3.8 - 1.3.10 voor een totaal van drie wasbeurten.
- Bewaar de kralen in 1 ml azijnzuur bij 4 ° C gedurende langdurig gebruik.
- Device Assembly
- Vul het proteolyse kamer met de suspensie van geactiveerde pepsine-agarose kralen in 5% azijnzuur met een steriele spatel.
- Plaats de PMMA microfluïdische platform tussen twee lege blokken PMMA als deksel om de inrichting af te dichten, bekleed met siliconenrubber om een vloeistofdichte afdichting te creëren.
- Gebruik van metalen klemplaten druk-afdichting het apparaat.
OPMERKING: De klem is op maat gemaakt om de microfluïdische platform passen en bestaat uit twee platen meten 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Flow 5% azijnzuur, pH 2,4 met een snelheid van 10 pl / min. Flow 50 mM ammonium acetaat buffer (pH 6,9) hoewel het eiwit regel in een hoeveelheid van 1 pl / min.
Opmerking: Het is uiterst belangrijk dat het azijnzuur continu stroomt door de inrichting gedurende het geheel van het experiment. Er mogen geen lekkages zijn en fluïdum alleen verlaten van het uitgangskanaal, dat als ESI bron dient. - Koppelen van de inrichting aan de voorzijde van een gewijzigde quadrupool time-of-flight (Q-TOF) massaspectrometer via instelbare geïsoleerde stadium electrospray optimale omstandigheden te bereiken.
LET OP: Een bypassschakelaarwordt ingevoerd om de aanwezigheid van een commerciële bron ESI simuleren. 17
2. Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange
- Overname van Pepsine en Protein Alleen Spectra
OPMERKING: ESI-MS verwerving uitgevoerd in positieve ion modus uitgevoerd met een spanning van 4500-5000, 60 V declustering potentieel en 250 V scherpstellen potentiaal. Spectra worden verworven over een bereik van 350-1,500 m / z met een scansnelheid van 1 s-1.- Het verwerven van een pepsine alleen spectrum. Pieken te zien zijn in dit spectrum worden afgetrokken wanneer het eiwit wordt toegevoegd.
- 50-100 pM tau / fosfo-tau-eiwit (zuiveren en bereiden zoals eerder beschreven 13, 19) met een snelheid van 1 ul / min waarbij de 50 mM ammoniumacetaat buffer eerder stroomde.
- Het verwerven van een eiwit alleen spectrum.
- acquisitie of Time Points
- Terwijl 100 pM tau / fosfo-tau-eiwit stroomt 1 uL / min, introduceren D2O met een snelheid van 3 pl / min via een T-connector en laten reageren in kinetische mixer. Mogelijk het systeem in evenwicht komen gedurende ten minste 10 minuten voor overname van het spectrum.
OPMERKING: Na de uitwisseling etikettering reactie wordt gedoofd door de stroom van azijnzuur pH 2,4 bij 10 pl / min en digestie van het gelabelde eiwit optreedt in het proteolytische kamer. - Om de kenmerken te verhogen, handmatig trek de positie van de binnenste glazen capillaire bereiken mengtijden van 42 ms tot 8 s. Mogelijk het systeem in evenwicht komen gedurende ten minste 10 minuten tussen elke pull-back.
- Terwijl 100 pM tau / fosfo-tau-eiwit stroomt 1 uL / min, introduceren D2O met een snelheid van 3 pl / min via een T-connector en laten reageren in kinetische mixer. Mogelijk het systeem in evenwicht komen gedurende ten minste 10 minuten voor overname van het spectrum.
3. De gegevens en statistische analyse
- Het identificeren van peptiden en berekening van het percentage van deuterium Exchange
- Voer MS spectra geanalyseerd met behulp van mMass software, versie 5.5.0 20
- Identificeren van peptiden met de ExPASy FindPept proteomische server en bevestigt botsing geïnduceerde dissociatie (CID) indien nodig 21.
LET OP: Hier, deuterium opname incorporatie werd gemeten met behulp van een in-house ontwikkelde FORTRAN software voor isotopenverdeling analyse 22, 23. - Bereken de theoretische intrinsieke gebaseerd zijn op de primaire sequentie met de GEBIED Webhulpmiddel 22, 24.
- Monteer de gegevens met behulp van enkele exponentiële non-lineaire regressie en normaliseren met behulp van een grafische en statistische software (bijv SigmaPlot).
OPMERKING: De verhouding k int / k obs geeft de beschermingsfactor (PF), een semi-kwantitatieve maat voor de mate waarin een bepaalde regio is gestructureerd in de conformationele ensemble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Digestie profielen van natieve en fosfo-tau waren vergelijkbaar, hetgeen een sequentie dekking van 77,1 en 71,7% respectievelijk. Deuterium opnamewaarden van elk peptide werd bepaald door het aanpassen van de waargenomen isotopische verdelingen met de theoretische verdelingen gegenereerd met behulp van een intern ontwikkelde FORTRAN software. De best passende verdelingen worden getoond (Figuur 3a) samen met de bijbehorende deuterium opnamewaarden. Opname kinetische profielen worden dan gegenereerd en werden goed beschreven door enkele exponentiële uitdrukkingen. Kinetische profielen voor alle peptiden waargenomen bij 3 of meer kenmerken malen (n = 3) werden geanalyseerd. Deze enkele exponentiële fit voor de waargenomen opname waarden opleveren uitwisseling snelheidsconstante k obs voor elk peptide. Dit wordt vergeleken met de primaire sequentie-afhankelijke "random coil" intrinsieke snelheidsconstante k int. De berekende PF (int k / k </ em> obs) en 1,52 s wordt afgebeeld op representatieve structuren van natieve en hypergefosforyleerd tau (Figuur 4).
Zoals verwacht, waren geen PF waargenomen in het traject normaal zijn secundaire structuurelementen bevestigd dat natief tau vertoont zwakke interne waterstofbinding. Significante bescherming waargenomen bij de N- en C-termini, het centrale domein en het aggregerende (hexapeptiden I en II) gebieden (figuur 4). Na 1,52 s, is 90% van het eiwit gedeutereerd met volledige uitwisseling optreedt in minder dan 2 minuten.
Het natuurlijke eiwit kan worden vergeleken met een veranderde staat, in dit geval de amyloïdogene hypergefosforyleerde toestand, waar we een algemene verhoging van deuterium opname over het eiwit te observeren. Er zijn aanzienlijke toename in de N- en C-termini en de regio H2. De algemene stijging van de opname ondersteunt de cUIDIGE hypothese dat hyperfosforylering veroorzaakt dat het eiwit een uitgebreide structuur aan te nemen. Van de twee hexapeptiden, H2 toont de grootste toename in deuterium opname, van een van de meest beschermde gebieden in de natieve staat bijna geen bescherming in de hypergefosforyleerde toestand. Dit suggereert dat de blootstelling van de H2-domein is cruciaal voor amyloïdogenese. Aan de andere kant, sommige van de zones die een daling van de opname onder andere regio's verspreid over L114 tot Q124 en G326 naar S352. Laatstgenoemde gebied overeenkomt met het microtubule-geassocieerde R3 en R4 gebieden in het herhalende domein. Dit stuk van nieuw gevormde resterende structuur overeenkomt met eerdere onderzoeken die aantonen dat hypergefosforyleerd tau een verlaagde affiniteit voor microtubulibinding 25. De regio die L114 tot Q124 wordt in de natieve toestand dat zij een significante neiging tot helixstructuur, en de afname van de opname kan worden toegeschreven aan een hogere prevalentie van seco ndary structuur in de hypergefosforyleerde toestand.
Figuur 1. Schematische weergave van een eiwit ondergaan HDX vóór massaspectrometrie analyse. Het eiwit van belang wordt verdund in een oplossing van deuteriumoxide (D2O), waardoor backbone labiele waterstofatomen wisselen met deuterium tijd. Zeer dynamische regio's zal snel uit te wisselen, en moet worden gecontroleerd op de milliseconde naar de tweede tijdschaal. Andere gebieden met meer rigide secundaire structuren langzamer uitwisselen. De uitwisselingsreactie wordt beëindigd door blussen met zuur (pH 2,4), die eveneens ontvouwt het eiwit waardoor digestie met een zuur protease (zoals pepsine). Digestie lokaliseert het niveau van deuterium opname in verschillende gebieden van het eiwit. lank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Experimentele opstelling voor Tresi-HDX-MS. Een gedetailleerde weergave van de kinetische menger onderin. De menginrichting bestaat uit twee concentrische capillairen, een binnenste kwartsglas capillaire binnen een buitenste metalen capillair. Een inkeping gemaakt 2 mm van het uiteinde van de binnenste capillair met een uiteinde aangesloten, waardoor eiwitten aan de inkeping af te sluiten en meng met de binnenkomende deuterium. Deze kinetische menger om een meng T-stuk bevestigd. Aan de andere kant van de menger wordt een kanaal leveren 5% azijnzuur (pH 2,4) gevoegd. Na afschrikken van de reactie, de gedeutereerde eiwit door het Proteolyse kamer gevuld met pepsine-agarose korrels teneinde peptische peptiden. Het distale capillair wordt gebruikt als een ESI-bron.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Typische workflow van ruwe data kinetische plots voor geselecteerde peptiden van de natieve en hypergefosforyleerd eiwit. (A) ruwe spectrum vier peptiden (kolommen) zijn aangebracht voorspelde isotopische verdelingen% tot deuterium opname te bepalen op drie verschillende tijdstippen (rijen). (B) Waargenomen kinetische grafieken van% deuterium opname versus de tijd voor elk peptide (getrokken lijn) gebruikt om Kobs te extraheren. Kinetic percelen voor alle peptiden werd waargenomen bij 3 of meer kenmerken malen (n = 3), foutbalken SE De berekende "random coil" profiel (stippellijn) is ter vergelijking getoond. Gereproduceerd van Zhu et al. 8 met toestemming.Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. HDX beschermingsfactor data afgebeeld op representatieve structuren van (a) natief volledige lengte tau en (b) hypergefosforyleerd tau. Structuur van hypergefosforyleerd tau werd gegenereerd met behulp FRODAN simulatie met behulp daaropvolgende verfijning Vadar. Mate van beschermende factoren zijn gekleurd als een regenboog schema, zoals aangegeven in de legenda (links). Gereproduceerd van Zhu et al. 8 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel structurele biologie werkwijzen, zoals röntgen kristallografie en NMR zijn voordelig omdat zij zeer gedetailleerd structuren van eiwitten, deze beelden vaak statisch. De karakterisering van voorbijgaande soorten en zwak gestructureerde domeinen blijft ongrijpbaar wanneer onderzocht door deze conventionele werkwijzen. Daarom, met het oog op dynamische inzichten over dit soort systemen te krijgen is het belangrijk om te werken aan een snelle tijdschalen. We hebben met succes Tresi-HDX-MS toegepast op gedetailleerde inzichten over de conformationele veranderingen die zich in een goed bestudeerde IDP op een gelokaliseerde peptidische niveau te verkrijgen. Een van de belangrijkste beperkingen aan deze techniek is dat pepsine is een niet-specifieke protease en, op zijn eigen, produceert zelden volledige sequentie dekking. Een manier om te helpen bij het verbeteren volgorde dekking en specificiteit is om protease-type XIII combineren van Aspergillus saitoi naar de vertering kamer 26.
Het is cruciaal datde verteringskamer wordt bij een pH van 2,4 gehouden tijdens het gehele experiment om effectief blussen van de uitwisselingsreactie en de hoeveelheid back-centrale 11 verminderen. Het is noodzakelijk dat alle stappen proteolyse en daaropvolgende analyse zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Eerdere studies hebben de grootte van de verteringskamer geoptimaliseerd en stelde debieten om het niveau van back-uitwisseling tot verwaarloosbare niveaus (≤5%) bij kamertemperatuur 22 houden. Het wordt sterk aanbevolen dat de afmeting van de kamer is niet groter dan die genoemd worden in dit protocol maten. Een sterk gestructureerde proteïne neemt niet significant niveaus van deuterium op de milliseconde tweede tijdschaal en moeilijk te verteren in de daarvoor door de proteolyse kamer. Dergelijke eiwitten worden niet aanbevolen voor studie met behulp van deze techniek.
Terwijl raden wij het gebruik van 50 mM ammoniumacetaat-buffer (pH 6,9) voor tHij eiwitmonster zullen niet alle eiwitten geschikt voor deze concentratie of pH waarde. Het is belangrijk om de pI van het eiwit op, en stel de buffer dienovereenkomstig ten minste 1 pH-eenheid boven of beneden. Dit zal ervoor zorgen dat het eiwit heeft de vereiste oppervlakte lading die nodig zijn voor de juiste vouwing en aggregatie te voorkomen. De concentratie ammoniumacetaat wordt aanbevolen voor aggregatie gevoelige eiwitten om de oplosbaarheid te verhogen, maar concentraties boven 500 mM wordt vermeden.
Tresi-HDX-MS wordt het best toegepast op systemen bestaat uit grote lusgebieden gesmolten globules of voorbijgaande secundaire structuurelementen 22. Daarnaast zijn er verschillende economische voordelen aan deze techniek is eenvoudig en relatief goedkoop te implementeren. Onlangs is er een sterke stijging in het gebruik van HDX-MS in de farmaceutische industrie voor drug ontdekking en ontwikkeling van 27 geweest. In de afgelopen tien jaarTussen is er een snelle groei van biologische macromoleculen, vooral monoklonale antilichamen (mAbs), is goedgekeurd door de FDA. Vergeleken met kleine moleculen van hogere orde structuren van eiwitten en hun conformationele dynamiek spelen een grote rol bij het bepalen van drugdoeltreffendheid. HDX-MS is met succes gebruikt als een waarschuwingsfunctie voor de productie van antilichamen biosimilar 28, evenals de karakterisering van antilichaam-antigeen 29, 30, 31 en eiwit-ligand interacties 32. De vooruitgang in de ontwikkeling van software en automatisering van experimenten zullen versnellen analyse tijden waardoor verdere uitbreiding van deze techniek in de nabije toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization? Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
