Summary
flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.
Abstract
protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) ont longtemps été un défi pour les biologistes structurels en raison de leur manque d'éléments de structure secondaire stable. Hydrogène-deutérium Exchange (HDX) mesurée à des échelles de temps rapide est particulièrement bien adapté pour détecter des structures et des réseaux de liaison hydrogène qui sont brièvement peuplées, permettant la caractérisation de conformères transitoires ensembles natifs. Le couplage de HDX à la spectrométrie de masse offre plusieurs avantages clés, notamment une sensibilité élevée, une faible consommation d'échantillon et aucune restriction sur la taille des protéines. Cette technique a beaucoup progressé au cours des dernières décennies, y compris la possibilité de surveiller HDX temps d'étiquetage à l'échelle de temps de milliseconde. De plus, en intégrant le flux de travail HDX sur une plate-forme microfluidique logeant un microréacteur de protéase acide, nous sommes en mesure de localiser les propriétés dynamiques au niveau du peptide. Dans cette étude, en temps résolu spectrométrie de masse électrospray (Trési-MS) couplé à HDX was utilisé pour fournir une image détaillée de la structure résiduelle de la protéine tau, ainsi que les changements conformationnels induits sur hyperphosphorylation.
Introduction
Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de techniques analytiques conçues pour mesurer la structure des protéines et de la dynamique 1, 2, 3, 4. Alors que la cristallographie aux rayons X reste le principal outil pour la détermination de la structure des protéines, des concentrations élevées de protéines sont nécessaires est nécessaire et l'optimisation approfondie pour produire des cristaux de qualité de diffraction. Les protéines qui sont difficiles à cristalliser, telles que des protéines associées à la membrane et intrinsèquement désordonnées ont été étudiés de façon classique par échange hydrogène-deutérium (HDX) RMN 5. Toutefois, dans les dernières décennies, le couplage de la spectrométrie de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) à HDX a rapidement gagné en popularité 6, 7.
La spectrométrie de masse est une solutionà la plupart des restrictions posées par cristallographie aux rayons X et RMN. En particulier, MS est très sensible (nM à des concentrations uM) nécessaires, et il n'y a pratiquement aucune limite sur la taille des protéines. En outre, le grand cycle de travail d'analyse MS permet la possibilité d'étudier les protéines qu'ils subissent le chiffre d'affaires enzymatique, misfolding, complexation et d'autres processus biologiquement pertinents. Ces processus se produisent souvent sur la milliseconde à la seconde échelle de temps et nécessitent un mélange rapide des réactifs avant l'analyse.
Le développement du temps résolu ElectroSpray Ionisation (Trési) par Wilson et Konermann en 2003 des réactions autorisées à surveiller dans le temps pseudo-réel par ESI-MS. Leur configuration incorpore un mélangeur à capillaire avec un volume de chambre de réaction réglable en continu 8. Le dispositif est constitué de deux capillaires concentriques, avec le capillaire interne étanche et d'une encoche découpée dans le côté pour permettre le mélange à l'intérieur de l'espace inter-capillaire étroity espace de l'encoche à l'extrémité du tube capillaire interne (typiquement 2 mm). Lorsqu'il est appliqué à des expériences HDX, le capillaire interne porte la protéine d'intérêt, le capillaire externe porte la solution étiquetage D 2 O, qui subit ensuite le mélange avec la protéine avant d' entrer dans la chambre de réaction réglable permettant d'étiquetage HDX avant le transfert direct dans l'ESI la source.
En bref, HDX repose sur squelette hydrogènes d'amide subissant l' échange avec des atomes de deutérium dans la solution 9, 10. L'échange est catalysée par une base à un pH physiologique, avec catalyse acide devenant répandue à un pH inférieur à environ 2,6. Le taux de conversion est basé sur quatre facteurs principaux: pH, température, solvant et de l'accessibilité liaison hydrogène intramoléculaire. Alors que les deux premiers facteurs sont maintenus constants tout au long de l'expérience, le taux de conversion, en particulier au squelette peptidique positions amide, est principalement dependent sur la structure des protéines 11. Régions étroitement pliée avec de vastes réseaux de liaison hydrogène stables dans des hélices a et des feuillets bêta prendra deuterium à des taux sensiblement plus lents par rapport à des boucles et des régions désordonnées (et parfois pas du tout) 12. Cela permet une analyse globale de la protéine, où des perturbations dans la structure (par exemple., Sur l' agrégation ou la liaison au substrat) conduisent à différents absorption de deutérium (Figure 1).
Le mélangeur capillaire cinétique peut être incorporé dans une plate-forme microfluidique contenant une chambre protéolytique pour la localisation de l'absorption de deutérium. Cette chambre protéolytique est maintenue à un faible pH afin d'étancher efficacement la réaction d'échange, et nécessite une protéase acide immobilisé afin de digérer la protéine en peptides localisées (figure 2). échange fédérateur de surveillance à milliseconde seconde échelles de temps est particulièrement important pour lala caractérisation des changements conformationnels au sein difficile de caractériser les régions de boucle, des globules fondus, et des protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) de 13, 14. En variante, Trési-HDX peut également être utilisée pour caractériser les protéines qui ne disposent pas de structure atomique résolu par les procédés de cristallographie aux rayons X et RMN, en utilisant l' échange de deutérium couplé à l'algorithme COREX d'approche (DX-COREX) 15, 16. Ce protocole détaillé appliquera Trési-HDX pour étudier la protéine tau, un PCI, tant sa forme native, ainsi que son état hyperphosphorylée pathogène. Alors que la protéine tau native est l' une des personnes déplacées les plus bien étudiés, on sait peu sur son homologue amyloidogène 13.
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Protocol
REMARQUE: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de sécurité des matières pertinentes (FS) avant utilisation. Fumées produites par ablation au laser de poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) peuvent être toxiques. Assurez-vous que le graveur laser est relié à un système de ventilation du travail. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la construction du dispositif microfluidique, y compris l'utilisation des contrôles techniques (hotte, collecteur de déchets) et de l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, masque, gants, blouse, pantalon pleine longueur, des chaussures fermées). Il est d'une importance capitale pour utiliser des réactifs de qualité chromatographie liquide à haute performance (HPLC) lorsque cela est possible, avec tous être de qualité ACS ou plus pour réduire les contaminants parasites lors de l'analyse.
1. Préparation du dispositif microfluidique
- La construction du PMMA plateforme microfluidique
- Obtenir un bloc PMMA standard (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) et laser-ablater un canal d'entrée pour l'introduction des réactifs, un protéola chambre de lyse, et un canal de sortie en utilisant un graveur laser 17, 18.
REMARQUE: graver la chambre de protéolyse dans une forme ovale allongée (30 x 5 x 0,05 mm). L'entrée et le canal de sortie doit prolonger jusqu'à l'extrémité du bloc de PMMA et pas être supérieure à 75 um en largeur et en profondeur afin d'accueillir un capillaire de 30 ga. - Couper une 30 ga capillaire métallique en acier inoxydable en deux morceaux d'environ 10 cm chacun au moyen d'un outil rotatif avec un disque de coupure d'épaisseur 1/64" . Utilisation du papier de verre pour lisser les extrémités des capillaires (ce qui peut être facilité par visualisation sous un microscope optique).
- Faire fondre les capillaires dans le bloc poly gravé (méthacrylate de méthyle) en utilisant un fer à souder. Le canal d'entrée est relié à des pompes à seringue automatique, et le canal de sortie est utilisé pour le couplage dans la MS.
- Obtenir un bloc PMMA standard (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) et laser-ablater un canal d'entrée pour l'introduction des réactifs, un protéola chambre de lyse, et un canal de sortie en utilisant un graveur laser 17, 18.
- La construction du temps résolu cinétique mélangeur à flux continu
- Obtenir une fusioncapillaire en silice vitreuse (ID: 75 pm, diamètre extérieur: 150 um) d'environ 40 cm, et l'insérer dans un tube capillaire métallique en acier inoxydable de 28 ga d'environ 15 cm. En fonction du temps de réaction nécessaire, utiliser un capillaire métallique externe plus ou avec un plus grand diamètre.
REMARQUE: La détermination de la « vraie » diamètre intérieur du capillaire de métal est critique pour obtenir des temps de réaction précises. Ceci peut être réalisé en fixant le tube capillaire métallique à une HPLC, écoulement de solvant si le capillaire, et l'enregistrement de la pression de retour. Une contre-pression de calcul de diamètre intérieur peut être faite, et le véritable diamètre intérieur du capillaire métallique déterminée. Cela peut être calculé à l'aide du logiciel Poids moléculaire Calculator (pour Windows version 6.49). - Produire une encoche de 2 mm en utilisant de faibles paramètres de graveur laser de puissance sur une extrémité du capillaire de verre intérieure et sceller cette extrémité du capillaire de verre intérieure (figure 2). Vous pouvez également faire l'encoche en utilisant un Cappilar en verre céramiqueOutil de coupe y ou un broyeur rotatif avec une lame de coupe de précision.
- Alignement du capillaire de verre intérieure avec l'extrémité du tube capillaire métallique (ce qui peut être facilité par visualisation au microscope optique).
- Attacher ce mélangeur cinétique à une extrémité du mélangeur en T (Figure 2).
- Fixer un capillaire en verre de silice fondue (ID: 75 pm, diamètre extérieur: 150 um) d'environ 40 cm à l'extrémité opposée du mélangeur cinétique sur le té de mélange. Ceci est utilisé pour fournir l'acide (5% d'acide acétique, pH 2,4) pour tremper la réaction.
REMARQUE: Les réactifs sont fournis à l'appareil avec des seringues étanches aux gaz à travers un tube de polytétrafluoroéthylène (PTFE) en utilisant des pompes à perfusion automatique.
- Obtenir une fusioncapillaire en silice vitreuse (ID: 75 pm, diamètre extérieur: 150 um) d'environ 40 cm, et l'insérer dans un tube capillaire métallique en acier inoxydable de 28 ga d'environ 15 cm. En fonction du temps de réaction nécessaire, utiliser un capillaire métallique externe plus ou avec un plus grand diamètre.
- Activation de la pepsine
- Peser 20 mg de pepsine à partir de muqueuse gastrique de porc et de le suspendre dans 1 ml de tampon de couplage (0,1 M de phosphate de sodium, NaCl 0,15 M, pH 6,0).
- Peser 50 mg de N - hydroxysuccinimide (NHS) des billes d' agarose activées par , ajouter à la re-suspended protease et faire tourner doucement pendant une nuit à 4 ° C.
- Centrifuger à 1000 g pendant 2 min à température ambiante pour recueillir la résine.
- Aspirer la protéase non liée.
- Incuber la gélose dans 1 ml de tampon de blocage (1 M Tris-HCl, pH 6,0) et faire tourner doucement à la température ambiante pendant 1 h.
- Centrifuger à 1000 g pendant 2 min à température ambiante pour recueillir la résine.
- Aspirer le tampon de blocage.
- Incuber la pepsine-agarose avec 1 mL de 5% d'acide acétique, pH 2,4 pendant 5 min.
- Centrifuger à 1000 g pendant 2 min pour recueillir la résine.
- Aspirer le surnageant.
- Répétez les étapes 1.3.8 - 1.3.10 pour un total de trois lavages.
- Stocker les billes dans de l'acide acétique à 1 ml à 4 ° C pour une utilisation à long terme.
- Assemblée de l'appareil
- Remplir la chambre de protéolyse avec la suspension de billes d'agarose activées pepsine à 5% d'acide acétique à l'aide d'une spatule stérile.
- Placez le platfor microfluidique PMMAm entre deux blocs de PMMA blanc comme un couvercle pour sceller le dispositif, garni de caoutchouc de silicone pour créer un joint étanche aux liquides.
- Utiliser des plaques de serrage métallique à la pression du dispositif d'étanchéité.
REMARQUE: La pince a été fait sur mesure afin d'adapter la plate-forme microfluidique et se compose de deux plaques de mesure 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Couler 5% d'acide acétique, pH 2,4 à un débit de 10 ul / min. L'écoulement du tampon acétate d'ammonium 50 mM (pH 6,9), même si la ligne de protéine à un débit de 1 pl / min.
NOTE: Il est extrêmement important que l'acide acétique circule en continu à travers le dispositif tout au long de l'ensemble de l'expérience. Assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites et que le fluide est sortie uniquement à partir du canal de sortie, qui servira comme source ESI. - Coupler le dispositif à l'extrémité avant d'un spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol (Q-TOF) modifié à l'aide d'un étage isolé réglable pour obtenir des conditions optimales électronébulisation.
REMARQUE: Un commutateur de dérivationest introduit afin de simuler la présence d'une source commerciale ESI. 17
2. résolue en temps ElectroSpray Ionisation échange hydrogène-deutérium
- Acquisition de pepsine et de protéines seulement Spectra
REMARQUE: acquisition ESI-MS est effectuée en mode d'ions positifs à une tension de 4500 à 5000, le potentiel declustering 60-V, et la focalisation de 250 V potentiel. Les spectres sont acquis sur une plage de 350-1,500 m / z avec une vitesse de balayage de 1 s -1.- Acquérir une seule pepsine spectre. Tous les pics apparaissant dans ce spectre sont soustraites une fois que la protéine est ajouté.
- Introduire 50-100 uM tau / tau protéine phospho-(purifier et préparer de la manière décrite précédemment 13, 19) à un débit de 1 pl / min , où le tampon d'acétate d'ammonium 50 mM a été précédemment circule.
- L'acquisition d'une seule protéine spectre.
- acquisition of Points Temps
- Alors que 100 uM tau / tau protéine phospho-coule à 1 uL / min, introduire D 2 O à un débit de 3 ul / min au moyen d' un raccord en T et permettre de réagir dans le mélangeur cinétique. Laisser le système se stabiliser pendant au moins 10 min avant l'acquisition du spectre.
REMARQUE: Après l'échange, la réaction de marquage est arrêtée par l'écoulement du pH de l'acide acétique 2,4 à 10 ul / min et la digestion de la protéine marquée se produit dans la chambre protéolytique. - Afin d'augmenter le temps d'étiquetage, tirer manuellement en arrière de la position du capillaire en verre interne pour obtenir des temps de mélange de 42 ms à 8 s. Laisser le système se stabiliser pendant au moins 10 min entre chaque pull-back.
- Alors que 100 uM tau / tau protéine phospho-coule à 1 uL / min, introduire D 2 O à un débit de 3 ul / min au moyen d' un raccord en T et permettre de réagir dans le mélangeur cinétique. Laisser le système se stabiliser pendant au moins 10 min avant l'acquisition du spectre.
3. Les données et l'analyse statistique
- L'identification et Peptides calcul du pourcentage de Deutérium échange
- Effectuer des analyses MS spectres en utilisant le logiciel mMass, la version 5.5.0 20
- Identifier les peptides en utilisant le ExPASy FindPept serveur protéomiques et confirmer par dissociation induite par collision (CID) en cas de besoin 21.
REMARQUE: Ici, l' incorporation de l' absorption de deuterium a été mesurée à l' aide d' un logiciel développé FORTRAN en interne pour l' analyse de la distribution isotopique 22, 23. - Calculer les taux intrinsèques théoriques basés sur la séquence primaire à l' aide de l'outil Web SPHERE 22, 24.
- Ajuster les données en utilisant une régression non linéaire et exponentielle unique normaliser au moyen d' un graphique et un logiciel statistique (par exemple, SigmaPlot).
NOTE: Le rapport de k int / k obs donne le facteur de protection (PF), une mesure semi-quantitative du degré auquel une région donnée est structurée au sein de l'ensemble conformationnelle.
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Representative Results
des profils de digestion de la protéine tau-phospho native et étaient similaires, ce qui donne une couverture de séquence de 77,1 et 71,7%, respectivement. Les valeurs d'absorption de deutérium de chaque peptide a été déterminée en ajustant les distributions isotopiques observées avec les distributions théoriques générés en utilisant un logiciel développé FORTRAN en interne. Les meilleures distributions de montage sont représentés (figure 3a) ainsi que les valeurs d'absorption de deutérium associés. profils cinétiques Uptake sont alors générés, et ont été bien décrits par simples expressions exponentielles. les profils cinétiques pour tous les peptides observés à 3 fois ou plus d'étiquetage (n = 3) ont été analysés. Ces ajustements exponentiels simples aux valeurs d'absorption observées donnent le taux de change obs k constant pour chaque peptide. Ceci est comparée à la séquence primaire-dépendante « hélice aléatoire » taux intrinsèque constante k int. Le PF calculé (k int / k </ em> obs) à 1,52 s est mappée sur des structures représentatives de la protéine tau hyperphosphorylée et native (Figure 4).
Comme prévu, aucun PF ont été observées dans la fourchette normalement associée aux éléments de structure secondaire confirme que la protéine tau native présente une faible liaison hydrogène interne. Une protection significative est observée à l'extrémité N et C-terminales, le domaine central et les régions sujettes à l' agrégation (hexapeptides I et II) (figure 4). Après 1,52 s, 90% de la protéine est deutéré, avec échange complet se produisant en moins de 2 min.
La protéine native peut être comparé à un état modifié, dans ce cas, l'état amyloidogène hyperphosphorylée, où l'on observe une augmentation générale de l'absorption de deuterium à travers la protéine. Il y a une augmentation significative de la N- et C-terminales et dans la région H2. L'augmentation générale de l'absorption soutient le cdusyst hypothèse que la protéine provoque hyperphosphorylation d'adopter une structure étendue. Sur les deux hexapeptides, H2 montre la plus forte augmentation de l'absorption de deuterium, d'être l'une des régions les plus protégées à l'état natif à presque aucune protection dans l'état hyperphosphorylée. Cela donne à penser que l'exposition du domaine H2 est crucial pour amyloïdogénèse. D'autre part, certaines des zones présentant une diminution de l'absorption comprennent des régions couvrant L114 à Q124 et G326 à S352. Cette dernière région correspond aux régions R3 et R4 associées aux microtubules dans le domaine de répétition. Ce tronçon de nouvellement formée structure résiduelle est d' accord avec des études précédentes démontrant que la protéine tau hyperphosphorylée présente une affinité réduite pour l' attachement aux microtubules 25. La région couvrant L114 à Q124 est identifié à l'état natif comme ayant une propension importante pour la structure hélicoïdale, et la diminution de l'absorption peut être attribuée à une prévalence plus élevée du seco Structure Ndary à l'état hyperphosphorylée.
Figure 1. Représentation schématique d'une protéine subissant HDX avant l'analyse par spectrométrie de masse. La protéine d'intérêt est dilué dans une solution d'oxyde de deutérium (D 2 O), permettant hydrogènes labiles du squelette d'échanger avec le deutérium dans le temps. Les régions très dynamiques échangeront rapidement et doivent être surveillés sur la milliseconde à la seconde échelle de temps. D'autres régions contenant des structures secondaires plus rigides échangeront plus lentement. La réaction d'échange est terminée par une trempe avec de l' acide (pH 2,4), qui se déroule également la protéine permettant une digestion avec une protéase acide (par exemple, la pepsine). Digestion le niveau de localise l'absorption de deuterium dans les différents domaines de la protéine. Lank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Montage expérimental pour Trési-HDX-MS. Une vue détaillée du mélangeur cinétique est représenté en bas. Le mélangeur est constitué de deux capillaires concentriques, un capillaire en verre de silice fondue interne à l'intérieur d'un capillaire métallique externe. Une encoche est faite de 2 mm de l'extrémité du capillaire interne avec une extrémité bouchée, ce qui permet pour la protéine de sortir de l'encoche et mélanger avec le deuterium entrant. Ce mélangeur cinétique est attaché à un té de mélange. Sur le côté opposé de la table de mixage, un canal délivrant l'acide acétique à 5% (pH 2,4) est fixé. À la suite de la trempe de la réaction, la protéine deutéré passe à travers la chambre de protéolyse remplie de billes d'agarose-pepsine pour produire des peptides gastro-duodénaux. Le capillaire distal est utilisé comme une source ESI.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg » target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. flux de travail typique de données brutes à des parcelles cinétiques pour les peptides sélectionnés à partir de la protéine native et hyperphosphorylée. (A) spectre brut pour quatre peptides (colonnes) sont montés sur des distributions isotopiques prédites pour déterminer le % d'absorption de deutérium en trois points de temps différents (lignes). (B) Observé parcelles cinétiques de l' absorption de deutérium% en fonction du temps pour chaque peptide (trait plein) utilisé pour extraire k obs. Terrain cinétiques pour tous les peptides ont été observés à 3 fois ou plus d'étiquetage (n = 3), les barres d'erreur représentent SE calculé profil « hélice aléatoire » (ligne en pointillés) est représentée à titre de comparaison. Reproduit de Zhu et al. 8 avec la permission.S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Les données de facteur de protection HDX mis en correspondance avec les structures représentatives suivantes : (a) la protéine tau de pleine longueur native et (b) la protéine tau hyperphosphorylée. Structure de la protéine tau hyperphosphorylée a été généré en utilisant la simulation FRODAN avec raffinement ultérieure à l'aide Vadar. Degré de facteurs de protection sont colorés comme un système d'arc en ciel, comme indiqué dans la légende (à gauche). Reproduit de Zhu et al. 8 avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Bien que les méthodes de biologie structurale telles que cristallographie et RMN rayons X sont avantageux car ils fournissent des structures extrêmement détaillées des protéines, ces images sont souvent statiques. La caractérisation des espèces transitoires et les domaines faiblement structurés continue d'être difficile à atteindre quand on l'étudie par ces méthodes conventionnelles. Par conséquent, afin de mieux comprendre dynamiques sur ces types de systèmes, il est important de travailler à des échelles de temps rapides. Nous avons appliqué avec succès Trési-HDX-MS pour obtenir un aperçu détaillé sur les changements conformationnels qui se produisent au sein d'un IDP bien étudié à un niveau localisé peptidiques. L'une des principales limites de cette technique est que la pepsine est une protéase non spécifique et, lui-même, produit rarement une couverture complète de la séquence. Une façon d'améliorer la couverture de séquence et de spécificité est de combiner type protéase provenant d' Aspergillus saitoi XIII à la chambre de digestion 26.
Il est essentiel quela chambre de digestion est maintenue à un pH de 2,4 pendant toute la durée de l'expérience afin d'étancher efficacement la réaction d'échange et de réduire la quantité de retour d'échange 11. Il est impératif que toutes les étapes de protéolyse et une analyse ultérieure se faire le plus rapidement possible. Des études antérieures ont optimisé la taille de la chambre de digestion et a suggéré des débits afin de maintenir le niveau de retour d'échange à des niveaux négligeables (≤5 de%) à la température ambiante 22. Il est fortement recommandé que la taille de la chambre est pas plus grande que les dimensions indiquées dans ce protocole. Une protéine hautement structurée ne prendra pas des niveaux significatifs de deuterium sur la milliseconde à la seconde échelle de temps et sera difficile à digérer dans le délai imparti par la chambre de protéolyse. Ces protéines ne sont pas recommandées pour l'étude à l'aide de cette technique.
Bien que nous recommandons l'utilisation d'un tampon d'acétate d'ammonium 50 mM (pH 6,9) pour til échantillon de protéines, toutes les protéines sera compatible avec cette concentration ou de la valeur du pH. Il est important de noter le pI de la protéine, et d'ajuster en conséquence le tampon soit d'au moins 1 unité de pH au-dessus ou au-dessous. Cela garantira que la protéine a la charge de surface requis nécessaire pour le pliage correct et empêcher l'agrégation. L'augmentation de la concentration d'acétate d'ammonium est recommandé pour les protéines sujettes d'agrégation afin d'augmenter la solubilité, mais au-dessus de concentrations de 500 mM est à éviter.
Trési-HDX-MS est préférable de l' appliquer à des systèmes constitués de grandes régions de boucle, globule fondu, ou des éléments de structure secondaire transitoires 22. En outre, il existe plusieurs avantages économiques à cette technique car il est simple et relativement peu coûteux à mettre en œuvre. Récemment, il y a eu une augmentation de l'utilisation de HDX-MS dans l'industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments et le développement 27. Au cours des dernières annéess il y a eu une croissance rapide des macromolécules biologiques, notamment des anticorps monoclonaux (mAb), être approuvé par la FDA. Par rapport aux médicaments à petites molécules, des structures d'ordre supérieur de protéines et leur dynamique conformationnelle jouent un rôle important dans la détermination de l'efficacité des médicaments. HDX-MS a été utilisé avec succès comme outil de confirmation pour la production d'anticorps biosimilaires 28, ainsi que la caractérisation des anticorps-antigène 29, 30, 31, et les interactions protéine-ligand 32. Les progrès réalisés dans le développement de logiciels et l'automatisation des expériences permettra d'accélérer les temps d'analyse permettant d'expansion de cette technique dans un proche avenir.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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