Summary
flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ordinate e disordinate.
Abstract
proteine intrinsecamente disordinate (IDP) sono stati a lungo una sfida per biologi strutturali a causa della loro mancanza di elementi di struttura secondaria stabili. Idrogeno-Deuterio Exchange (HDX) misurata su scale temporali rapidi è particolarmente adatto per rilevare strutture e reti legame idrogeno che vengono brevemente popolate, permettendo la caratterizzazione dei conformeri transitori in gruppi nativi. Accoppiamento di HDX per spettrometria di massa offre diversi vantaggi, tra cui l'alta sensibilità, basso consumo di campione e sono limiti alla dimensione proteina. Questa tecnica ha avanzato notevolmente negli ultimi decenni, tra cui la possibilità di monitorare i tempi di etichettatura HDX sulla scala temporale millisecondo. Inoltre, incorporando il workflow HDX su una piattaforma microfluidica alloggiante un microreattore proteasi acida, siamo in grado di localizzare le proprietà dinamiche a livello peptide. In questo studio, tempo risolto elettrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (Trési-MS) accoppiato a HDX was utilizzato per fornire un quadro dettagliato della struttura residua nella proteina tau, così come i cambiamenti conformazionali indotte su iperfosforilazione.
Introduction
Negli ultimi decenni, i progressi sono stati fatti significativi nello sviluppo di tecniche analitiche progettato per misurare la struttura della proteina e dinamiche 1, 2, 3, 4. Mentre cristallografia a raggi X rimane lo strumento principale per determinare la struttura proteica, sono necessarie alte concentrazioni di proteine ed è necessaria una vasta ottimizzazione per produrre cristalli di qualità diffrazione. Proteine che sono difficili da cristallizzare, come le proteine associate alla membrana e intrinsecamente disordinati sono classicamente studiate mediante scambio idrogeno-deuterio (HDX) NMR 5. Tuttavia, negli ultimi decenni, l'accoppiamento di ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI-MS) per HDX si è rapidamente guadagnato popolarità 6, 7.
La spettrometria di massa offre una soluzionea molte delle restrizioni poste dalla cristallografia a raggi X e NMR. In particolare, MS è altamente sensibile (nM a concentrazioni uM richiesto), e non v'è praticamente alcun limite alle dimensioni della proteina. Inoltre, l'elevato duty cycle di analisi MS prevede la possibilità di studiare proteine quanto sottoposti fatturato enzimatica, misfolding, complessazione e altri processi biologicamente rilevanti. Questi processi avvengono molto sul millisecondo in scala seconda volta e richiedono una rapida miscelazione dei reagenti prima dell'analisi.
Lo sviluppo di time-resolved ionizzazione elettrospray (Trési) da Wilson e Konermann nel 2003 reazioni permesso di essere monitorato in tempo reale da pseudo-ESI-MS. Loro configurazione incorporato un mixer capillare con un volume di camera di reazione regolazione continua 8. Il dispositivo è costituito da due capillari concentrici, con il capillare interna, chiusa e una tacca tagliata in un lato per consentire la miscelazione all'interno della stretta inter-capillarey spazio dalla tacca all'estremità del capillare interna (tipicamente 2 mm). Quando viene applicato agli esperimenti HDX, il capillare interna porta la proteina di interesse, il capillare esterno porta l'etichettatura D 2 O soluzione, che poi subisce miscelazione con la proteina prima di entrare nella camera di reazione regolabile consentendo etichettatura HDX prima trasferimento diretto in ESI fonte.
Brevemente, HDX deduce backbone idrogeni ammidici sottoposti a scambio con atomi di deuterio in soluzione 9, 10. Lo scambio è base-catalizzata a pH fisiologico, con acido-catalisi diventare prevalente a pH inferiore a circa 2,6. Il tasso di cambio si basa su quattro fattori principali: pH, temperatura, accessibilità solvente e legame idrogeno intramolecolare. Mentre i primi due fattori sono mantenute costanti durante tutto l'esperimento, il tasso di cambio, in particolare a posizioni ammidici peptide backbone, è soprattutto dependent sulla struttura proteica 11. Strettamente piegato regioni con ampie reti legame idrogeno stabili in alfa-eliche e beta-sheets porterà fino deuterio a tassi sostanzialmente più lenti rispetto agli anelli e regioni disordinati (e talvolta per nulla) 12. Questo permette l'analisi di proteine globale, dove perturbazioni nella struttura (per es., Su aggregazione o legame al substrato) portano a differenti deuterio assorbimento (Figura 1).
Il mixer capillare cinetica può essere incorporato in una piattaforma microfluidica contenente una camera proteolitica per la localizzazione del captazione deuterio. Tale camera proteolitica viene mantenuta a pH basso per spegnere efficacemente la reazione di scambio, e richiede una proteasi acida immobilizzato per digerire le proteine in peptidi localizzate (Figura 2). Come monitorare i backbone al millisecondo a scale di seconda volta è particolarmente importante per laCaratterizzazione delle variazioni conformazionali all'interno difficile caratterizzare regioni loop, globulo fuso e proteine intrinsecamente disordinati (IDP) 13, 14. In alternativa, Trési-HDX può anche essere utilizzato per caratterizzare proteine che attualmente non hanno una struttura atomica risolti attraverso i metodi della cristallografia a raggi X e NMR, utilizzando lo scambio di deuterio accoppiato all'algoritmo COREX (DX-COREX) approccio 15, 16. Questo protocollo dettagliate si applica Trési-HDX per studiare tau, un IDP, sia nella sua forma nativa, così come è stato patogeno hyperphosphorylated. Mentre tau nativo è uno degli sfollati più ben studiati, poco si sa circa la sua controparte amyloidogenic 13.
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Protocol
NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Fumi prodotti da ablazione laser di poli (metilmetacrilato) (PMMA) possono essere tossici. Assicurarsi che l'incisore laser è collegato ad un sistema di ventilazione di lavoro. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguate durante la costruzione del dispositivo microfluidico compreso l'uso di controlli tecnici (cappa, apposito contenitore) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, maschera, guanti, camici, pantaloni lunghe, scarpe chiuse). E 'estremamente importante utilizzare liquida ad alta prestazione (HPLC) reagenti puri quando possibile, con tutti gli esseri ACS grado o superiore a diminuire contaminanti interferenti durante l'analisi.
1. Preparazione del dispositivo a microfluidi
- La costruzione del Microfluidic piattaforma PMMA
- Ottenere un blocco PMMA standard (8.9 x 3.8 x 0.6 cm) e laser ablazione un canale di ingresso per l'introduzione dei reagenti, un proteolisi camera, e un canale di uscita utilizzando un incisore laser 17, 18.
NOTA: Etch camera proteolisi in una forma ovale allungata (30 x 5 x 0,05 mm). Il canale di ingresso ed uscita deve estendersi fino alla fine del blocco PMMA ed essere non più grande di 75 micron di larghezza e profondità per ospitare un capillare 30 ga. - Tagliare a 30 ga inossidabile metallo capillare in due pezzi di circa 10 cm ciascuna con un utensile rotante con un disco di taglio spessa 1/64" . Usa carta vetrata per lisciare le estremità dei capillari (questo può essere facilitato da una visualizzazione sotto microscopio ottico).
- Sciogliere i capillari nella poli acidato (metil metacrilato) blocco utilizzando un saldatore. Il canale di ingresso sarà collegato a pompe a siringa automatizzate, e il canale di uscita sarà utilizzato per accoppiare nella MS.
- Ottenere un blocco PMMA standard (8.9 x 3.8 x 0.6 cm) e laser ablazione un canale di ingresso per l'introduzione dei reagenti, un proteolisi camera, e un canale di uscita utilizzando un incisore laser 17, 18.
- La costruzione del Mixer Kinetic a flusso continuo tempo risolto
- Ottenere un fusocapillare di silice vetro (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm e inserirla in un 28 ga inossidabile metallo capillare di circa 15 cm. A seconda del tempo di reazione richiesto, usare un capillare metallico più esterno o uno con un ID più grande.
NOTA: Determinazione del 'vero' diametro interno del capillare metallo è essenziale per ottenere tempi di reazione accurati. Questo può essere fatto fissando il capillare metallico ad un HPLC, scorre solvente però il capillare, e registrando la contropressione. Una contropressione di calcolo diametro interno può essere fatto, e il vero diametro interno del capillare metallico determinato. Questo può essere calcolato utilizzando il software Molecular Weight Calculator (per Windows versione 6.49). - Produrre una tacca 2 mm mediante regolazioni dell'incisore laser a bassa potenza su un'estremità del capillare vetro interno e sigillare la fine del capillare vetro interno (figura 2). In alternativa, rendere la tacca usando un capillare di vetro ceramicafresa y o una smerigliatrice rotante con una lama di taglio fine.
- Formazione la capillare di vetro interno con l'estremità del capillare metallico (questo può essere facilitato mediante osservazione al microscopio ottico).
- Collegare questo mixer cinetica ad un'estremità del tee miscelazione (Figura 2).
- Collegare un capillare fusa di vetro di silice (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm dalla estremità opposta del miscelatore cinetica sul tee miscelazione. Questo è utilizzato per fornire l'acido (acido acetico al 5%, pH 2,4) per spegnere la reazione.
NOTA: reagenti vengono forniti al dispositivo con siringhe a tenuta di gas attraverso politetrafluoroetilene (PTFE) tubo utilizzando pompe di infusione automatizzati.
- Ottenere un fusocapillare di silice vetro (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm e inserirla in un 28 ga inossidabile metallo capillare di circa 15 cm. A seconda del tempo di reazione richiesto, usare un capillare metallico più esterno o uno con un ID più grande.
- Attivazione pepsina
- Pesare 20 mg di pepsina dalla mucosa gastrica suina o sospenderlo in 1 ml di tampone di accoppiamento (fosfato di sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0).
- Pesare 50 mg di N -hydroxysuccinimide (NHS) attivati agarosio, aggiungere alla re-sproteasi uspended e ruotare delicatamente notte a 4 ° C.
- Spin down a 1.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina.
- Aspirare la proteasi non legato.
- Incubare l'agarosio in 1 ml di tampone di bloccaggio (1 M Tris-HCl, pH 6,0) e ruotare delicatamente a temperatura ambiente per 1 h.
- Spin down a 1.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina.
- Aspirare il tampone di bloccaggio.
- Incubare la pepsina-agarosio con acido acetico 1 ml di 5%, pH 2,4 per 5 min.
- Spin down a 1.000 xg per 2 minuti per raccogliere la resina.
- Aspirare il surnatante.
- Ripetere i punti 1.3.8 - 1.3.10 per un totale di tre lavaggi.
- Conservare le perline in 1 ml di acido acetico a 4 ° C per un uso a lungo termine.
- Assemblea dispositivo
- Riempire la camera proteolisi con la sospensione di perline attivate pepsina-agarosio in acido acetico al 5% utilizzando una spatola sterile.
- Posizionare il platfor microfluidica PMMAm tra due blocchi di PMMA bianco come copertura per sigillare il dispositivo, rivestito in gomma di silicone per creare una tenuta ermetica liquido.
- Utilizzare piastre metalliche di fissaggio a pressione a tenuta del dispositivo.
NOTA: La pinza è stata personalizzata per adattarsi alla piattaforma microfluidica ed è composto da due piastre di misura 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. - Flusso di acido acetico 5%, pH 2,4 ad una velocità di 10 ml / min. Flusso 50 mM tampone di acetato di ammonio (pH 6.9) se la linea proteina ad una velocità di 1 ml / min.
NOTA: E 'estremamente importante che l'acido acetico viene continuamente fluisce attraverso il dispositivo durante l'intera dell'esperimento. Garantire che non vi siano perdite e che il fluido sta uscendo solo dal canale di uscita, che servirà come sorgente ESI. - Accoppiare il dispositivo alla estremità anteriore di una quadrupolo tempo di volo (Q-TOF) spettrometro di massa modificata utilizzando una fase isolata regolabile per ottenere condizioni ottimali elettrospray.
NOTA: un interruttore di bypassviene introdotto in modo da simulare la presenza di una sorgente ESI commerciale. 17
2. ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Scambio risolta nel tempo
- Acquisizione di pepsina e proteine Solo Spectra
NOTA: acquisizione ESI-MS viene effettuata in modalità ioni positivi con una tensione di 4500-5000, 60-V potenziale declustering e 250 V potenziale focalizzazione. Gli spettri vengono acquisiti su una gamma di 350-1,500 m / z con una velocità di scansione di 1 s -1.- Acquisire un solo spettro di pepsina. Eventuali picchi che compaiono in questo spettro sono sottratti una volta si aggiunge la proteina.
- Introdurre 50-100 pM tau / proteine fosfo-tau (purificare e preparare come descritto in precedenza 13, 19) ad una velocità di 1 ml / min in cui il tampone di acetato di ammonio 50 mM è stato precedentemente scorre.
- Acquisire una proteina solo spettro.
- acquisizione oPunti F Tempo
- Mentre la proteina / fosfo-tau 100 pM tau fluisce a 1 ml / min, introdurre D 2 O ad una velocità di 3 ml / min attraverso un connettore a T e lasciare reagire nel mixer cinetica. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti prima dell'acquisizione dello spettro.
NOTA: Dopo lo scambio, la reazione di marcatura viene raffreddata dal flusso di acido acetico pH acido 2,4 a 10 ml / min e la digestione della proteina marcata si verifica nella camera proteolitica. - Al fine di aumentare il tempo di etichettatura, manualmente tirare all'indietro la posizione del capillare di vetro interna per ottenere tempi di miscelazione di 42 ms a 8 s. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti tra ogni pull-back.
- Mentre la proteina / fosfo-tau 100 pM tau fluisce a 1 ml / min, introdurre D 2 O ad una velocità di 3 ml / min attraverso un connettore a T e lasciare reagire nel mixer cinetica. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti prima dell'acquisizione dello spettro.
3. I dati e l'analisi statistica
- Identificare Peptidi e calcolando la percentuale di Deuterio Scambio
- Eseguire MS analisi utilizzando il software mMass, versione 5.5.0 20
- Identificare i peptidi che utilizzano il server di proteomica ExPASy FindPept e confermare collisione indotta dissociazione (CID) quando richiesto 21.
NOTA: Qui, il deuterio assorbimento incorporazione è stata misurata utilizzando un software di FORTRAN in-house sviluppato per l'analisi isotopica di distribuzione 22, 23. - Calcolare la tariffa intrinseche teorici basati sulla sequenza primaria utilizzando lo strumento web SFERA 22, 24.
- Montare i dati utilizzando un'unica regressione non lineare esponenziale e normalizzare utilizzando una grafica e software statistico (ad esempio, SigmaPlot).
NOTA: Il rapporto k int / k obs produce l'Protection Factor (PF), una misura semi-quantitativa del grado che una regione particolare è strutturata all'interno dell'insieme conformazionale.
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Representative Results
profili di digestione-tau fosfo nativa e erano simili, ottenendo rispettivamente una copertura sequenza di 77,1 e 71,7%. valori deuterio assorbimento di ciascun peptide è stata determinata inserendo le distribuzioni isotopiche osservati con le distribuzioni teoriche generate utilizzando un software FORTRAN sviluppato in casa. Le migliori distribuzioni di montaggio sono mostrati (Figura 3a) insieme ai valori di assorbimento di deuterio associati. profili cinetici di captazione vengono generati, e sono stati ben descritti da singole espressioni esponenziali. profili cinetici per tutti i peptidi osservati a 3 o più volte di etichettatura (n = 3) sono stati analizzati. Questi singoli adatta esponenziali ai valori osservati uptake producono cambio costante k obs per ciascun peptide. Questo è confrontato con il primario-sequenza dipendente "random coil" frequenza intrinseca costante k int. La calcolato PF (k int / k </ em> obs) a 1,52 s mappato strutture rappresentative di tau nativa e hyperphosphorylated (Figura 4).
Come previsto, non sono state osservate FP nell'intervallo normalmente associati con gli elementi di struttura secondaria che conferma tau nativo presenta debole legame idrogeno interno. Protezione significativa è osservata nella N e C-terminali, il dominio centrale e l'aggregazione incline (hexapeptides I e II) regioni (Figura 4). Dopo 1,52 s, 90% della proteina è deuterato, con piena scambio avviene in meno di 2 min.
La proteina nativa può essere paragonato ad uno stato alterato, in questo caso lo stato iperfosforilata amiloidogenico, dove si osserva un aumento generale deuterio assorbimento attraverso la proteina. Ci sono aumenti significativi al N- e C-terminali e nella regione H2. Il generale aumento captazione sostiene il cATTUALE ipotesi che hyperphosphorylation fa sì che la proteina di adottare una struttura estesa. Dei due hexapeptides, H2 mostra il maggior incremento di deuterio captazione, di essere una delle regioni più altamente protette nello stato nativo a quasi nessuna protezione nello stato hyperphosphorylated. Questo suggerisce che l'esposizione del dominio H2 è cruciale per amiloidogenesi. D'altra parte, alcune delle aree che presentano una diminuzione della captazione includono regioni che abbracciano L114 a Q124, e G326 per S352. Quest'ultima regione corrisponde alle regioni associate ai microtubuli R3 e R4 nel dominio ripetizione. Questo tratto di struttura residua neoformato accordo con studi precedenti dimostrano che la proteina tau iperfosforilata ha una ridotta affinità per il legame dei microtubuli 25. La regione si estende L114 di Q124 è identificato nello stato nativo come avente una propensione significativa per struttura elicoidale, e la diminuzione di assorbimento può essere attribuita ad una maggiore prevalenza di seco Struttura ndary nello stato hyperphosphorylated.
Figura 1. Rappresentazione schematica di una proteina in fase HDX prima dell'analisi spettrometria di massa. La proteina di interesse viene diluita in una soluzione di ossido di deuterio (D 2 O), consentendo idrogeni labili backbone di scambiare con deuterio nel tempo. regioni altamente dinamici scambiare rapidamente, e devono essere monitorati in millisecondi in scala seconda volta. Altre regioni contenenti strutture secondarie più rigide si scambieranno più lentamente. La reazione di scambio è terminato da tempra con acido (pH 2,4), che svolge anche la proteina che consente per la digestione con proteasi acida (ad esempio, pepsina). Digestione localizza il livello del deuterio assorbimento attraverso diverse aree della proteina. lank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Set-up sperimentale per Trési-HDX-MS. Una vista dettagliata del mescolatore cinetica viene mostrato nella parte inferiore. Il miscelatore è composto da due capillari concentrici, un capillare di vetro di silice fusa interiore all'interno di un capillare metallico esterno. Una tacca è fatto 2 mm dall'estremità del capillare interno con un'estremità chiusa, consentendo proteine per uscire dalla tacca e mescolare con deuterio in entrata. Questo miscelatore cinetica è collegata a un tee miscelazione. Sul lato opposto del mixer, un canale fornendo acido acetico 5% (pH 2,4) è fissato. Seguendo spegnimento della reazione, la proteina deuterato passa attraverso la camera proteolisi imballato con perline pepsina-agarosio per produrre peptidi peptiche. Il capillare distale viene utilizzato come sorgente ESI.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Flusso di lavoro tipico dei dati grezzi a piazzole cinetici per peptidi selezionati dalla proteina nativa e iperfosforilata. (A) spettro grezzo per quattro peptidi (colonne) sono montati distribuzioni isotopiche previsti per determinare% deuterio uptake in tre diversi momenti (righe). (B) delle trame cinetici di deuterio% assorbimento in funzione del tempo per ogni peptide (linea continua) utilizzato per estrarre k oss. Terreni cinetici per tutti i peptidi sono stati osservati a 3 o più volte etichettatura (n = 3), le barre di errore rappresentano SE Il calcolata profilo "random coil" (linea tratteggiata) è indicata per il confronto. Tratto da Zhu et al. 8 con il permesso.Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Dati Figura fattore di protezione 4. HDX mappati su strutture rappresentativi di (a) nativo tau integrale e (b) tau iperfosforilata. Struttura di tau iperfosforilata stata generata utilizzando simulazione FRODAN con successivo affinamento usando Vadar. Grado di fattori di protezione sono colorati come schema arcobaleno come mostrato nella legenda (sinistra). Tratto da Zhu et al. 8 con il permesso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre i metodi di biologia strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR sono vantaggiosi perché forniscono strutture estremamente dettagliate di proteine, queste immagini sono spesso statica. La caratterizzazione di specie transienti e domini debolmente strutturati continua ad essere sfuggente quando è stato studiato da questi metodi convenzionali. Pertanto, al fine di acquisire conoscenze dinamici su questi tipi di sistemi è importante lavorare su scale temporali rapidi. Abbiamo applicato con successo Trési-HDX-MS per ottenere intuizioni dettagliate sui cambiamenti conformazionali che si verificano all'interno di un IDP ben studiato a livello peptidico localizzato. Uno dei limiti principali di questa tecnica è che la pepsina è una proteasi non specifico e, di per sé, raramente produce una copertura sequenza completa. Un modo per migliorare la copertura e la specificità di sequenza è di combinare proteasi tipo XIII da Aspergillus saitoi alla camera di digestione 26.
E 'fondamentale chela camera di digestione è mantenuta ad un pH di 2,4 per l'intera durata dell'esperimento per spegnere efficacemente la reazione di scambio e ridurre la quantità di back-scambio 11. E 'indispensabile che tutte le misure di proteolisi e successiva analisi essere fatto il più rapidamente possibile. Studi precedenti hanno ottimizzato le dimensioni della camera di digestione e suggerito portate al fine di mantenere il livello di back-scambio a livelli trascurabili (≤5%) a temperatura ambiente 22. È fortemente raccomandato che la dimensione della camera non è più grande rispetto alle dimensioni elencati in questo protocollo. Una proteina altamente strutturato non assumerà livelli significativi di deuterio al millisecondo in scala seconda volta e sarà difficile da digerire nel tempo consentito dalla camera proteolisi. Tali proteine non sono raccomandati per studio utilizzando questa tecnica.
Mentre si consiglia l'uso di 50 mM tampone acetato di ammonio (pH 6,9) per donnalui campione di proteina, non tutte le proteine sarà compatibile con questa concentrazione o pH. È importante sottolineare il pI della proteina, e regolare il buffer di conseguenza deve essere di almeno 1 unità di pH sopra o sotto. Ciò farà sì che la proteina ha la carica superficiale richieste per il corretto ripiegamento e prevenire l'aggregazione. Aumentando la concentrazione di acetato di ammonio è raccomandato per aggregazione proteine inclini al fine di aumentare la solubilità, tuttavia concentrazioni superiori a 500 mM è da evitare.
Trési-HDX-MS è meglio applicata a sistemi composti da grandi regioni loop, globulo fuso o transitori elementi di struttura secondaria 22. In aggiunta, ci sono vari vantaggi economici questa tecnica come è semplice e relativamente economico da implementare. Recentemente, c'è stato un aumento nell'uso di HDX-MS nell'industria farmaceutica per la scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo 27. Nel corso degli ultimi dieci annis c'è stata una rapida crescita di macromolecole biologiche, anticorpi monoclonali in particolare (mAbs), essendo approvati dalla FDA. Rispetto alla piccola molecola di droga, strutture di ordine superiore di proteine e le loro dinamiche conformazionale giocano un ruolo importante nella determinazione della efficacia dei farmaci. HDX-MS è stato utilizzato con successo come strumento di conferma per la produzione di anticorpi biosimilari 28, così come la caratterizzazione di anticorpi antigene-29, 30, 31, e le interazioni proteina-ligando 32. I progressi nello sviluppo di software e l'automazione di esperimenti di accelerare i tempi di analisi che consente per l'ulteriore espansione di questa tecnica in un prossimo futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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