Summary
コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。
Abstract
本質的に無秩序なタンパク質（国内避難民）は、長い安定な二次構造要素の欠如のために、構造生物学者への課題となっています。迅速な時間スケールで測定し、水素 - 重水素交換（HDX）を一意に簡単にネイティブアンサンブルにおける一過性配座異性体の特徴付けを可能にする、移入された構造と水素結合ネットワークを検出するために適しています。質量分析にHDXの結合は、高感度、低サンプル消費及びタンパク質サイズには制限を含むいくつかの重要な利点を提供します。この手法は、ミリ秒の時間スケールでHDXラベリング時間を監視する機能など、過去数十年で大幅に進歩しています。また、酸性プロテアーゼマイクロリアクタを収容するマイクロ流体プラットフォームにHDXワークフローを組み込むことによって、我々は、ペプチドレベルでの動的特性を局在化することができます。本研究では、時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析（TRESI-MS）は、HDX WAに結合されSは、タウタンパク質、ならびに過剰リン酸化の際に誘導されるコンフォメーションシフトの残留構造の詳細な画像を提供するために使用されます。
Introduction
過去数十年にわたり、重要な進歩は、タンパク質の構造とダイナミクス1、2、3、4を測定するために設計された分析技術の開発に行われています。 X線結晶学は、タンパク質の構造を決定するための原則ツールまま、タンパク質の高い濃度が必要とされ、大規模な最適化は、回折品質結晶を生成するために必要とされます。このような膜結合と本質的に無秩序なタンパク質として結晶化することが困難であるタンパク質は、古典的水素-重水素交換（HDX）NMR 5によって研究されています。しかし、最近数十年で、HDXにエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）のカップリングは、急速に人気6、7を得ました。
質量分析は、ソリューションを提供していますX線結晶学およびNMRによってもたらされる制限の多くに。具体的には、MSは、高感度の（必要μM濃度までnm）であり、タンパク質の大きさに制限は事実上存在しません。加えて、MS分析の高デューティサイクルは、それらは、酵素代謝回転、ミスフォールディング、錯体および他の生物学的に関連したプロセスを経るようなタンパク質を研究する可能性を可能にします。これらのプロセスは、多くの場合、第二時間スケールにミリ秒で発生し、分析前に試薬の迅速な混合を必要とします。
2003年にウィルソンとKonermannによって時間分解エレクトロスプレーイオン化（TRESI）の開発は、反応はESI-MSにより擬似リアルタイムで監視することを可能にしました。それらの設定は、連続的に調整可能な反応チャンバ容積8と毛細管ミキサーを組み込みました。デバイスは、狭間capillar内の混合を可能にするために密封され、内側毛細管とその側に切断ノッチを有する2本の同心の毛管から成り内側毛細管（典型的には2 mm）の終了までのノッチからY空間。 HDX実験に適用した場合、内側毛細管は、目的のタンパク質を運び、外側毛管は、次いでESIに先立って直接転写にHDX標識を可能にする調節可能な反応室に入る前にタンパク質と混合受け標識D 2 O溶液を、運びますソース。
簡単に言えば、HDXは、ソリューション9、10で重水素原子との交換を受けた骨格アミド水素に依存しています。交換が塩基触媒生理学的pHで、酸触媒は、約2.6以下のpHで優勢になりつつとなります。 pH、温度、溶媒アクセシビリティおよび分子内水素結合：為替レートは、4つの主な要因に基づいています。前者の二つの要因は実験を通して一定に保たれるように、特にペプチド骨格のアミド位置の交換の速度は、主にdependenありますタンパク質構造11上のトン。 αヘリックスおよびβシートで広範囲、安定した水素結合ネットワークと緊密に折り畳まれた領域は、ループおよび無秩序化領域に比べて実質的に遅い速度で重水素を取り込む（時には全くない）であろう12。これは、構造における摂動（ 例えば 、凝集または基質結合時）は、異なる重水素取り込み（ 図1）に導くグローバルタンパク質分析を可能にします。
運動キャピラリーミキサーは、重水素の取り込みの局在化のためにタンパク質分解チャンバーを含むマイクロ流体プラットフォームに組み込むことができます。このタンパク質分解チャンバを効果的交換反応をクエンチするために、低pHで保持され、ローカライズされたペプチド（ 図2）にタンパク質を消化するために、固定化された酸性プロテアーゼを必要とします。第二の時間スケールにミリ秒で、バックボーン交換を監視するために特に重要ですループ領域を特徴付けることが困難内のコンホメーション変化、溶融小球、及び本質的に無秩序なタンパク質（のIDP）13、14の特徴付け。あるいは、TRESI-HDXは、現在COREXアルゴリズム（DX-COREX）アプローチ15、16に結合された重水素交換を使用して、X線結晶学およびNMRの方法によって解決原子構造を有していないタンパク質を特徴付けるために使用することができます。この詳細なプロトコルは、両方とも、それは天然の形態だだけでなく、それが病原性の過リン酸化状態だで、IDP、タウを研究するためにTRESI-HDXを適用します。ネイティブタウが最もよく研究の国内避難民の一つですが、少しはそのアミロイド形成性対応13について知られています。
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Protocol
注：使用前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。ポリ（メチルメタクリレート）のレーザーアブレーション（PMMA）によって生成ヒュームは、毒性であることができます。レーザー彫刻機が作動し、換気システムに接続されていることを確認してください。エンジニアリング・コントロールの使用（ヒュームフード、シャープコンテナ）と個人用保護具（安全メガネ、フェイスマスク、手袋、白衣、完全長ズボン、クローズドつま先の靴）を含むマイクロ流体デバイスを構築する際にすべての適切な安全対策を使用してください。これは、可能な限り、分析中の干渉の汚染物質を減少させるために、ACS等級以上のすべてのビーイングで、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）グレードの試薬を使用することが最も重要です。
マイクロ流体デバイスの作製
- PMMAマイクロ流体プラットフォームの構築
- 標準PMMAブロック（8.9 X 3.8×0.6センチメートル）を取得し、試薬を導入するための入力チャンネル、プロテオをレーザーアブレーション溶解チャンバー、及びレーザー彫刻17、18を用いて出力チャネル。
注：細長い楕円形（30×5×0.05ミリメートル）でタンパク質分解チャンバをエッチングします。入力および出力チャネルがPMMAブロックの端まで延び、30 GA毛細管を収容するために、両方の幅と深さにはより大きい75μmであってはなりません。 - 1/64" の厚さのカットオフディスクと回転工具を用いて約10cmずつの2つの片に30 GAステンレス鋼金属キャピラリーを切断する。キャピラリの端部を滑らかにするためにサンドペーパーを使用して（これは下で見ることによって容易にすることができます光学顕微鏡）。
- はんだごてを用いてエッチングされ、ポリ（メチルメタクリレート）ブロックに毛細管を溶融します。入力チャンネルは、自動化されたシリンジポンプに接続され、出力チャネルは、MSに結合するために使用されるであろう。
- 標準PMMAブロック（8.9 X 3.8×0.6センチメートル）を取得し、試薬を導入するための入力チャンネル、プロテオをレーザーアブレーション溶解チャンバー、及びレーザー彫刻17、18を用いて出力チャネル。
- 連続フロー時間分解キネティックミキサーの構築
- 融合を入手シリカガラスキャピラリー（ID：75ミクロン、外径：150ミクロン）は、約40cmの、および約15センチ28 GAステンレス鋼金属キャピラリーに挿入。必要な反応時間に応じて、より長い外側金属キャピラリーまたはより大きいIDを持つものを使用します。
注：金属細管の「真」の内径を決定することは、正確な反応時間を得るために重要です。これは、キャピラリものの、溶剤流れ、および背圧を記録し、HPLCに金属キャピラリーを装着することにより行うことができます。内径計算に背圧を行うことができ、金属キャピラリーの真の内径を決定しました。これは、（Windowsのバージョン6.49のための）分子量計算ソフトを用いて計算することができます。 - 内側ガラスキャピラリーの一端に低出力レーザー彫刻の設定を使用して、2mmのノッチを生成し、内側ガラスキャピラリー（ 図2）のこの端部をシールします。あるいは、セラミックガラスcapillarを使用してノッチを作りますYカッターツールまたは微細切削ブレードとロータリーグラインダー。
- ラインアップ金属キャピラリーの端部と内側ガラスキャピラリー（これは、光学顕微鏡下で観察することによって容易にすることができます）。
- 混合ティー（ 図2）の一端に、この運動ミキサーを取り付けます。
- 混合ティー上の運動ミキサーの反対側の端部に約40cmの溶融シリカガラスキャピラリー（150ミクロン：75ミクロン、OD ID）を取り付けます。これは、反応をクエンチする酸（5％酢酸、pHは2.4）を送達するために使用されます。
注：反応物は、自動化された輸液ポンプを使用して、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）チューブを通してガスタイトシリンジで装置に供給されています。
- 融合を入手シリカガラスキャピラリー（ID：75ミクロン、外径：150ミクロン）は、約40cmの、および約15センチ28 GAステンレス鋼金属キャピラリーに挿入。必要な反応時間に応じて、より長い外側金属キャピラリーまたはより大きいIDを持つものを使用します。
- ペプシンの活性化
- ブタ胃粘膜からペプシン20mgを秤量し、カップリング緩衝液（0.1Mリン酸ナトリウム、0.15MのNaCl、pH6.0）で1 mLにそれを停止します。
- 、N個のヒドロキシスクシンイミド（NHS）活性化アガロースビーズ50mgを秤量再Sに追加しますプロテアーゼをuspendedし、4℃で一晩ゆっくりと回転させます。
- 樹脂を収集するために室温で2分間1000×gでスピンダウン。
- 未結合のプロテアーゼを吸引します。
- ブロッキング緩衝液1mLにアガロースをインキュベート（1 Mトリス-HCl、pH6.0）で、1時間室温で穏やかに回転します。
- 樹脂を収集するために室温で2分間1000×gでスピンダウン。
- ブロッキングバッファーを吸引除去します。
- 1mLの5％酢酸、5分間、pHを2.4とペプシン - アガロースをインキュベートします。
- 樹脂を収集するために2分間1000×gでスピンダウン。
- 上清を吸引除去します。
- 合計3回の洗浄のための1.3.10 - を繰り返して、1.3.8を繰り返します。
- 長期使用のために4℃で1 mLの酢酸中のビーズを格納します。
- デバイスアセンブリ
- 滅菌スパチュラを用いて5％酢酸で活性化されたペプシン - アガロースビーズのスラリーを用いてタンパク質分解チャンバを満たします。
- PMMAマイクロ流体platforを置きますデバイスをシールするカバーのような2つのブランクPMMAブロック間でmは、液密シールを作成するために、シリコーンゴムで裏打ち。
- 圧力シールにデバイスを金属製のクランププレートを使用します。
注：クランプがカスタムマイクロ流体プラットフォームを合わせるために作られたと10.1センチメートルX 7.4センチメートルX 1.2センチメートルを測定する二つのプレートで構成されています。 - 10μL/分の速度で5％酢酸、pHが2.4を流れます。 1μL/分の速度でタンパク質線も50mMの酢酸アンモニウム緩衝液（pH 6.9）を流れます。
注：これは、酢酸を連続実験の全体にわたって装置を通して流れていることが非常に重要です。そこには漏れがないと、その流体はESI源となる出力チャネルからのみ出ていることを確認します。 - 最適なエレクトロスプレー条件を達成するために調節可能な絶縁ステージを使用して変更四重極飛行時間型（Q-TOF）質量分析計の前端部に結合装置。
注：バイパススイッチ商用ESI源の存在をシミュレートするために導入されます。 17
2.時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換
- ペプシンおよびタンパク質のみスペクトルの取得
注：ESI-MSの取得は60-Vデクラスタリング電位、5000に4500の電圧を正イオンモードで行われ、250-Vは電位を中心に説明します。スペクトルは、1秒の走査速度で350-1,500のm / zの範囲にわたって取得され-1。- ペプシンのみのスペクトルを取得します。タンパク質が添加されると、このスペクトルに現れる任意のピークが減算されます。
- タウ/リン酸化タウタンパク質を50mM酢酸アンモニウム緩衝液が以前に流れていた1μL/分の速度で（先に13、19に記載の精製および調製）50-100μMを導入します。
- タンパク質のみのスペクトルを取得。
- 買収OFの時点
- 100μMタウ/ホスホ-タウ蛋白質は1μL/分で流れている間、T字コネクタを介して3μL/分の速度でD 2 Oを導入し、運動混合機中で反応させます。スペクトルの取得前に少なくとも10分間平衡化システムを可能にします。
注：交換の後、標識化反応は、標識タンパク質のμL/ minで消化は、タンパク質分解チャンバ内に発生10における酢酸のpH 2.4の流れによってクエンチします。 - 8秒に42ミリ秒の混合時間を達成するために、内側ガラスキャピラリーの位置を手動で引き戻し、標識時間を増加させるために。各プルバックの間に、少なくとも10分間平衡化システムを可能にします。
- 100μMタウ/ホスホ-タウ蛋白質は1μL/分で流れている間、T字コネクタを介して3μL/分の速度でD 2 Oを導入し、運動混合機中で反応させます。スペクトルの取得前に少なくとも10分間平衡化システムを可能にします。
3.データと統計解析
- ペプチドを同定し、重水素交換のパーセンテージを計算します
- MSスペクトルはmMassソフトウェアを使用して分析を行う、バージョン5.5.0 20
- ExPASyプロテオミクスFindPeptサーバを使用してペプチドを同定および21を必要に応じて衝突誘起解離（CID）によって確認されます。
注：ここでは、重水素の取り込み取り込みは同位体分布解析22、23のための社内開発されたFORTRANのソフトウェアを使用して測定しました。 - SPHERE Webツール22、24を使用して一次配列に基づく理論本来の速度を計算します。
- 単一指数非線形回帰を使用してデータをフィットし、グラフや統計ソフトウェア（ 例えば 、SigmaPlotの）を使用して正規化します。
注：の比K INT / K OBS保護ファクター（PF）、特定の領域が立体配座のアンサンブル内に構成されている程度の半定量的尺度を与えます。
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Representative Results
ネイティブおよびホスホ - タウの消化プロファイルは、それぞれ77.1及び71.7パーセントの配列範囲を得、同様でした。各ペプチドの重水素取り込み値は、社内で開発FORTRANソフトウェアを使用して生成された理論的な分布で観察された同位体分布を当てはめることによって決定しました。最良フィッティング分布は関連重水素取り込み値とともに（ 図3a）に示されています。取り込み動態プロファイルが生成され、よく単一指数表現で記述されました。 3以上の標識時間で観察された全てのペプチドについての運動プロファイルは（n = 3）を分析しました。観察された取り込み値にこれらの単一指数関数フィットは、各ペプチドの為替レート定数k OBSをもたらします。これは、一次配列に依存する「ランダムコイル」固有速度定数k INTと比較されます。算出されたPF（K INT / K </ EM> OBS）、1.52 sで天然及び過リン酸化タウの代表的な構造（ 図4）にマッピングされます。
予想通り、全くPFSは、通常、天然タウは弱い内部水素結合を示すことを確認する二次構造要素に関連付けられている範囲では観察されませんでした。有意な保護は、N及びC末端、中央領域および凝集しやすい（ヘキサペプチドI及びII）領域（ 図4）で観察されます。 1.52秒後、タンパク質の90％が完全交換が2分未満で発生すると、重水素化されています。
天然のタンパク質は、変更された状態、我々はタンパク質間重水素取り込みの一般的な増加を観察し、この場合のアミロイド形成性過リンの状態と比較することができます。 N末端およびC末端でおよびH2領域における有意な増加があります。取り込みの一般的な増加は、cをサポートしています過剰リン酸化は、拡張された構造を採用するタンパク質の原因となるという仮説をurrent。 2つのヘキサペプチドのうち、H2は、天然の状態の中で最も高度に保護された地域の一つであることから、過リン酸化状態にあるほとんどの保護に、重水素取り込みの最大の増加を示しました。これは、H2ドメインの露出がアミロイド形成のために重要であることを示唆しています。一方、取り込みの減少を示す領域の一部は、Q124をL114にまたがる領域、及びS352のG326を含みます。後者の領域は、リピート領域における微小管関連R3及びR4領域に相当します。新たに形成された残留構造のこのストレッチは、以前の研究は、過リン酸化タウは、微小管25を結合するための減少親和性を有することを実証と一致します。 Q124をL114にまたがる領域は、らせん構造のための重要な傾向を有するように天然の状態で識別され、および取り込みの減少は、セコの高い有病率に起因し得ます過リン酸化状態のndary構造。
前に質量分析にHDXを受けるタンパク質の1概略図を図。目的のタンパク質は、不安定な主鎖の水素が経時的に重水素と交換することを可能にする、重水（D 2 O）の溶液中に希釈されます。非常に動的な領域は急速に交換する、第2の時間スケールにミリ秒で監視しなければなりません。より剛性の二次構造を含むその他の地域では、よりゆっくりと交換させていただきます。交換反応はまた、酸性プロテアーゼ（ 例えば 、ペプシン）で消化することを可能にするタンパク質をアンフォールド酸（pHは2.4）でクエンチによって終了されます。消化は、タンパク質の異なる領域間での重水素の取り込みのレベルを局在化します。柳 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TRESI-HDX-MS図2.実験のセットアップ。動力学的ミキサの詳細図は、底部に示されています。ミキサーは、二つの同心の毛管、外側金属キャピラリー内の内側石英ガラスキャピラリーから構成されています。ノッチは、ノッチを終了し、着信重水素と混合する蛋白質を可能にする、目封止端と内側毛細管の端から2mmとします。この動力学的ミキサは、混合ティーに取り付けられています。ミキサーの反対側に、5％酢酸を送達チャネル（pHは2.4）が取り付けられています。反応のクエンチング後、重水素化タンパク質は、消化ペプチドを生成するためにペプシン - アガロースビーズを充填したタンパク質分解チャンバを通過します。遠位キャピラリーをESI源として使用されます。ES / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
天然及び過タンパク質から選択されたペプチドのための動力学的プロットに生データから図3の典型的なワークフロー。 4つのペプチド（列）のための（a）は、生スペクトルは、3つの異なる時点（行）での重水素の取り込みの％を決定するために予測された同位体分布に取り付けられています。 （B）各ペプチド（実線）の時間対％の重水素の取り込みの動力学的プロットを観察したk個のOBSを抽出するために使用されます。全てのペプチドの動態プロットは、3つの以上の標識時間で観察された（n = 3）を、エラーバーはSEザ算出「ランダムコイル」プロファイル（点線）は、比較のために示されている表します。 Zhu らから再生されました。権限を持つ8。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
（a）は、ネイティブ全長タウおよび（b）過リン酸化タウの代表的な構造にマッピングされ 、図4 HDX保護要因データ。過リン酸化タウの構造はVADAR使用して、後続の洗練されたFRODANシミュレーションを使用して生成されました。凡例（左）に示すように、保護因子の程度は、虹方式として着色されています。 Zhu らから再生されました。権限を持つ8。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
彼らは、タンパク質の非常に詳細な構造を提供するので、このようなX線結晶学およびNMRなどの構造生物学の方法が有利であるが、これらの写真は、多くの場合、静的です。これらの従来の方法により研究する際の過渡種弱構造ドメインの特徴付けは、とらえどころのないことを継続します。したがって、これらのタイプのシステム上の動的な洞察を得るためには、迅速な時間スケールで仕事をすることが重要です。我々は成功したローカライズされたペプチドのレベルでよく研究IDP内で発生する立体構造変化に関する詳細な洞察を得ることがTRESI-HDX-MSを適用しています。この技術の鍵制限の1つは、ペプシンは非特異的プロテアーゼであり、それだけで、めったにフルシーケンスカバレッジを生成しないということです。シーケンスのカバレッジと特異性を改善する一つの方法は、消化槽26にアスペルギルス・サイトイからプロテアーゼタイプXIIIを組み合わせることです。
それはすることが重要です消化チャンバを効果的に交換反応をクエンチし、バック交換11の量を低減するために、実験の全体中2.4のpHで維持されます。任意のタンパク質分解工程およびその後の分析が可能な限り迅速に行うことが不可欠です。以前の研究は、消化チャンバのサイズを最適化し、室温で22無視できるレベル（≤5％）のバック交換のレベルを維持するために流量を示唆しています。強く、チャンバのサイズは、このプロトコル内で列挙された寸法よりも大きくないことが推奨されます。高度に構造化されたタンパク質は、第二の時間スケールにミリ秒で重水素の有意なレベルを取るせず、タンパク質分解チャンバによって許容される時間内に消化することが困難になります。このようなタンパク質は、この手法を用いた研究にはお勧めしません。
我々は、T 50 mMの酢酸アンモニウム緩衝液（pH 6.9）の使用を推奨している間彼タンパク質サンプルではなく、全てのタンパク質が、この濃度またはpH値と互換性があります。タンパク質のpIに注意し、そして少なくとも1pH単位上または下であることに応じてバッファを調整することが重要です。これは、タンパク質が適切な折り畳みのために必要な必須の表面電荷を持っていることを確認し、凝集を防ぐことができます。酢酸アンモニウムの濃度は、溶解度を高めるために凝集しやすいタンパク質に推奨され、しかしの500mM以上の濃度増加させることは避けるべきです。
TRESI-HDX-MSは、最良の大きなループ領域、溶融小球、又は一過性の二次構造要素22から構成されるシステムに適用されます。それは単純で、実装も比較的安価であるとしてまた、この技術の様々な経済的な利点があります。最近では、薬剤の発見と開発27のための製薬業界でのHDX-MSの使用の急増がありました。過去数十年にわたって生体高分子の急速な成長があったS、最も顕著なモノクローナル抗体（mAb）は、FDAにより承認されています。小分子薬と比較して、より高次のタンパク質の構造とそのコンホメーションのダイナミクスは、薬効の決意に大きな役割を果たしています。 HDX-MSは、成功バイオシミラー抗体28の産生のための確認ツール、ならびに抗体-抗原29、30、31、及びタンパク質-リガンド相互作用32の特徴として使用されています。ソフトウェア開発と実験の自動化の進歩は、近い将来、この技術の更なる拡大を可能に分析時間をスピードアップします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µm, OD: 150 µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500 µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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